ES2650269T3 - Método para producir cepas atenuadas de salmonela de alto rendimiento - Google Patents

Método para producir cepas atenuadas de salmonela de alto rendimiento Download PDF

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Abstract

Un método para cultivar una cepa mutante atenuada de Salmonella typhi que alberga una mutación con pérdida de función en el gen galE y que comprende al menos una copia de una molécula de ADN que comprende un casete de expresión eucariota, que comprende la etapa de cultivar la cepa en una medio regulado que comprende peptona a un valor de pH de inicio aproximadamente neutro a escala de fermentación, en el que no se agrega glucosa al medio durante la fermentación y la cantidad inicial de glucosa se agota antes de alcanzar la fase estacionaria, y en el que el volumen del medio es al menos aproximadamente 10 litros.

Description

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angiogénesis parece estar mediado por la interacción de esta proteína con VEGFR-2. VEGFR-2, también conocido como receptor que contiene el dominio de inserción de quinasa (KDR), es un receptor de alta afinidad de 1.356 aminoácidos de longitud, 200-230 kDa de peso molecular, para VEGF así como para VEGF-C y VEGF-D. Identificado en humanos mediante el cribado de ADNc endotelial para receptores de tirosina quinasa, VEGFR-2 comparte una identidad de secuencia del 85% con el VEGFR-2 murino descubierto previamente, también conocido como cinasa hepática fetal 1 (Flk-1). El VEGFR-2 se expresa normalmente en precursores endoteliales y hematopoyéticos, así como en células endoteliales, células madre hematopoyéticas nacientes y el estroma del cordón umbilical. Sin embargo, en la vasculatura adulta inactiva, el ARNm de VEGFR-2 parece estar subregulado.
El dominio extracelular de VEGFR-2 contiene 18 posibles sitios de glicosilación unidos a N. El VEGFR-2 se sintetiza inicialmente como una proteína de 150 kDa y se glicosila rápidamente en una forma intermedia de 200 kDa, y luego se glicosila aún más a una rata más lenta a una proteína madura de 230 kDa que se expresa en la superficie celular.
La secuencia de aminoácidos de la secuencia de ADNc que codifica VEGFR-2 humano clonado en el plásmido pVAX10.VR2-1 se presenta en la Figura 1.
3) Fabricación de Salmonella typhi Ty21a vacía y manipulada
El proceso de fabricación de la cepa mutante atenuada de Salmonella typhi como se lleva a cabo de acuerdo con la invención comprende cultivar la cepa mutante atenuada de Salmonella typhi en un medio que comprende peptona como fuente de aminoácidos y péptidos. Los medios adecuados para el método de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, medio TSB estándar así como medio TSB de origen no animal. Tanto el TSB estándar como el TSB de origen no animal comprenden 2,5 g/l de glucosa. Usualmente, la cantidad de glucosa inicial en TSB, o medio de tipo TSB se consume más o menos por completo después de 3-5 horas de cultivo de una cepa de Salmonella typhi atenuada, y debe sustituirse por glucosa fresca cada 3-5 horas para mantener un nivel de glucosa más o menos constante en el medio de cultivo. La observación de que omitir la adición de glucosa durante el cultivo de cepas mutantes atenuadas de Salmonella typhi que albergan opcionalmente una molécula de ADN recombinante que codifica un antígeno heterólogo conduce a un aumento del crecimiento celular en comparación con el cultivo con adición de glucosa es muy sorprendente y sugiere que rutas metabólicas específicas en las células bacterianas se desencadenan por la ausencia de glucosa. El efecto descrito también se puede observar, si el medio TSB o similar a TSB no contiene glucosa al comienzo del proceso de cultivo. Por lo tanto, el método de acuerdo con la invención tiene, además de mayores rendimientos celulares y por lo tanto mayores rendimientos de la vacuna de ADN final, la ventaja adicional de ser de menos coste y más simple haciendo innecesarios los pasos de alimentación de glucosa durante la fermentación.
El proceso de fabricación de la cepa mutante atenuada de Salmonella typhi Ty21a como se lleva a cabo de acuerdo con la invención se describe a modo de ejemplo en la siguiente Tabla 1:
Células I (Salmonella Typhi Ty21a, WT) o Células II (Salmonella Typhi Ty21apVAX10.VR2-1)
↓
2 x 500 ml TSB + kanamicina (500µL)
(OD600 > 0,3)
↓
10 x 1000 ml TSB + kanamicina (75mL)
(OD600 ≥ 0,5)
100 L volumen de fermentación
TSB + galactosa al 0,001 %
-30 °C
-flujo de aire 100L/min (1 vvm)
Células I (Salmonella Typhi Ty21a, WT) o Células II (Salmonella Typhi Ty21apVAX10.VR2-1)
-presión no controlada
-pH 7,0 controlado con NaOH
-espuma controlada (Corning)
-pO2 ≥ 40% regulado por mezclador
-mezclador a mínimo 200 rpm
-sin alimentación de glucosa
-OD600nm final (final de la fase de crecimiento exponencial)
-Enfriamiento a al menos 25 °C antes de la cosecha
filtrado de flujo cruzado
-10 veces concentración
-10 veces intercambio de regulador en diafiltración con sacarosa al 15%, solución de ascorbato al 0,45% pH 7,2, seguido por concentración adicional hasta 1/20 vol. de cosecha original
almacenar a 2-8 °C hasta llenar por aproximadamente 24 horas
En más detalle: los cultivos (medio TSB mas 25 µg/ml de kanamicina) se inoculan cada uno con diferentes muestras de cepas de salmonella (Ty21a vacío y Ty21a recombinante (pVAX10.VR2-1). En las muestras de células de producción se utiliza medio TSB que contiene 2,5-3,0 g/l de glucosa, preferiblemente 2,5 g/l. En un medio de control
5 se omite la glucosa. Además, el medio contiene kanamicina, preferiblemente 25 µg/ml. Los cultivos se incuban a 30 °C ± 2 °C con agitación hasta que se alcanza una densidad óptica de OD600nm> 0,1. Se describen más detalles en la sección de Ejemplos.
Controles en proceso para el primer y segundo pasos de precultivo, al finalizar los tiempos de incubación, incluye análisis del crecimiento bacteriano midiendo OD600nm, pH y CFU/ml, así como, si corresponde, determinación de la
10 estabilidad del plásmido (PST) y examen bacteriano. El último análisis se basa en un ensayo de agar sangre para determinar las reacciones hemolíticas de microorganismos patógenos exigentes. El valor de CFU se evalúa antes y después de la filtración de flujo cruzado (CFF). Tras la formulación del concentrado bacteriano final, se midieron las UFC y el índice de refracción en la formulación con la concentración bacteriana más baja.
El método de acuerdo con la invención, en el que se omite la alimentación con glucosa, requiere menos mano de obra 15 y es más eficiente, dando como resultado rendimientos celulares mayores.
4) Influencia de la alimentación con glucosa durante el cultivo de células
Se probó el crecimiento de células de Salmonella typhi Ty21a vacías y manipuladas, en un medio TSB o similar a TSB, cultivando las células entre 0 y 30 horas a 25-35 °C, preferiblemente 30 °C y un pH entre 6,5 y 7,5, preferiblemente 7,0. El crecimiento se midió en OD o en CFU/ml (unidades formadoras de colonias).
20 Los resultados de estos experimentos muestran que la adición de glucosa no da como resultado mayores valores de OD/rendimientos de masa celular de la cepa de tipo salvaje a pesar del consumo de glucosa. Por el contrario, los matraces sin adición de glucosa alcanzaron valores de OD más altos (6 para el precultivo 1, 8 para el precultivo 2). Aproximadamente 1 hora después de la adición de glucosa, la OD permaneció estática (o incluso ligeramente disminuida) en comparación con el crecimiento sin adición de glucosa. En pulsos repetidos, el consumo de glucosa
25 disminuyó, no se observó ningún efecto adicional/aditivo sobre el crecimiento. Los valores de pH también se vigilaron durante la fermentación, y en algunos experimentos se ajustaron al valor de pH inicial, si se podían observar cambios.
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invasivo del crecimiento celular, minimiza el riesgo de contaminación y elimina la necesidad de una extracción incómoda y laboriosa de muestras.
Sorprendentemente se descubrió que el crecimiento de cepas mutantes atenuadas de Salmonella typhi de acuerdo con el método de la presente invención produce valores de densidad óptica de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0 en el inicio de la fase estacionaria. En comparación, el cultivo de la misma cepa en un proceso de fermentación similar pero en el que se agrega glucosa durante la fermentación para mantener un nivel de glucosa aproximadamente estable de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 4 g/l produce valores de densidad óptica de aproximadamente 3 a aproximadamente 5,5. Por lo tanto, se encontró sorprendentemente que cultivar una cepa mutante atenuada de Salmonella typhi sin adición de glucosa al medio durante la fermentación y con una cantidad de glucosa inicial en el medio que se agota antes de alcanzar la fase estacionaria produce una densidad óptica incrementada en el inicio de la fase estacionaria en comparación con un proceso de fermentación con adición de glucosa.
En otra realización, el progreso del crecimiento se determina midiendo la densidad celular.
En una realización preferida, la densidad celular se determina microscópicamente o midiendo la resistencia eléctrica
o mediante citometría de flujo. La densidad celular puede determinarse microscópicamente contando manualmente las células usando una cámara de recuento o un hemocitómetro. La medición de la densidad celular con base en la resistencia eléctrica se realiza preferiblemente usando un contador Coulter. La medición de la densidad celular mediante citometría de flujo se logra permitiendo que las células pasen un rayo láser en una corriente estrecha, que las golpea una a una. Un detector de luz recoge la luz que se refleja desde las células.
Sorprendentemente se descubrió que el crecimiento de cepas mutantes atenuadas de Salmonella typhi de acuerdo con el método de la presente invención produce valores de densidad celular de aproximadamente 5 x 1014 a aproximadamente 8 x 1014 en el inicio de la fase estacionaria. En comparación, el cultivo de la misma cepa en un proceso de fermentación similar pero en el que se agrega glucosa durante la fermentación para mantener un nivel de glucosa aproximadamente estable de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 4 g/l proporciona valores de densidad celular de aproximadamente 5 x 1013 a 1 x 1014. Por lo tanto, se encontró sorprendentemente que cultivar una cepa mutante atenuada de Salmonella typhi sin adición de glucosa al medio durante la fermentación y con una cantidad de glucosa inicial en el medio que se agota antes de alcanzar la fase estacionaria produce un aumento de densidad celular al inicio de la fase estacionaria en comparación con un proceso de fermentación con adición de glucosa.
La densidad óptica de una suspensión celular por debajo de aproximadamente 0,4 es directamente proporcional a su densidad celular. Por lo tanto, se puede crear una curva de calibración trazando la densidad óptica contra la densidad de la célula. Dicha curva de calibración puede usarse para estimar la densidad celular de una suspensión celular midiendo su densidad óptica.
En otra realización, el progreso del crecimiento se determina midiendo el valor de unidades formadoras de colonias (CFU) tomando muestras y cultivando en placa de agar. Mediante este método, solo se cuentan las células viables ya que solo las células viables pueden formar colonias en una placa de agar.
Sorprendentemente se descubrió que cultivar cepas mutantes atenuadas de Salmonella typhi de acuerdo con el método de la presente invención produce valores de CFU de aproximadamente 6 x 109 a aproximadamente 8 x 109 en el inicio de la fase estacionaria. En comparación, el cultivo de la misma cepa en un proceso de fermentación similar pero en el que se agrega glucosa durante la fermentación para mantener un nivel de glucosa aproximadamente estable de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 4 g/l produce valores de CFU de aproximadamente 2 x 109 a 5 x 109. Por lo tanto, se encontró sorprendentemente que cultivar una cepa mutante atenuada de Salmonella typhi sin adición de glucosa al medio durante la fermentación y con una cantidad de glucosa inicial en el medio que se agota antes de alcanzar la fase estacionaria no solo produce un aumento de la densidad celular al inicio de la fase estacionaria, pero también produce un mayor número de células viables en comparación con un proceso de fermentación con adición de glucosa.
En una realización particular, las células se cosechan antes de alcanzar una densidad óptica de aproximadamente 6.
En una realización preferida, las células se cosechan a una densidad óptica de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.
El casete de expresión que codifica VEGFR-2 humano, bajo el control del promotor de CMV.
En una realización preferida, el VEGFR-2 humano tiene la secuencia de ácido nucleico que se encuentra en la SEQ ID NO 2.
También se describe aquí una cepa mutante atenuada de Salmonella typhi que carece de actividad galactosa epimerasa y que comprende al menos una copia de una molécula de ADN recombinante que comprende un casete de expresión, que puede obtenerse mediante un método para hacer crecer la cepa, que comprende la etapa de cultivar la cepa en un medio regulado que comprende peptona a un valor de pH inicial aproximadamente neutro a escala de
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Figura 12: Crecimiento de la cepa de tipo salvaje (precultivo 1) de Salmonella typhi Ty21a en comparación con la cepa de producción de vacunas contra el cáncer manipulada (Salmonella typhi Ty21a: pVAX10.VR2-1, VXM01) con pulso de glucosa (ajustado a la concentración final de glucosa de 2,5 g/l) y sin pulsos de glucosa. El crecimiento celular se midió como densidad óptica a 600 nm (OD600). Las flechas indican la adición de glucosa (pulsación). El eje X representa el tiempo de cultivo en horas (h); el eje y representa la densidad celular medida en unidades OD.
Figura 13: Crecimiento de la cepa de tipo salvaje (precultivo 2) de Salmonella typhi Ty21a en comparación con la cepa de producción de vacunas contra el cáncer manipulada (Salmonella typhi Ty21a: pVAX10.VR2-1, VXM01) con pulso de glucosa (ajustado a la concentración final de glucosa de 2,5 g/l) y sin pulso de glucosa. El crecimiento celular se determinó mediante medición de densidad óptica a 600 nm (OD600). Las flechas indican la adición de glucosa (pulsación). El eje X representa el tiempo de cultivo en horas (h); el eje y representa la densidad celular medida en unidades OD.
Tabla 1: Proceso de fabricación
Tabla 2: Proceso de fabricación
Tabla 3: Resultados de la medición de OD600 durante el proceso de fermentación
Tabla 4: Concentración de glucosa durante el proceso de fermentación
Tabla 5: cambio de valor de pH durante el proceso de fermentación
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento de la cepa Ty21a de Salmonella typhi para la preparación del Lote de Semillas de Investigación (RSL)
El primer paso en la preparación de la RSL consistió en el aislamiento de la cepa atenuada de Salmonella typhi Ty21a de las cápsulas Typhoral L® seguida de la transformación de las bacterias atenuadas con el ADN plasmídico (pVAX10.VR2-1).
Las cápsulas de Typhoral L® comercialmente disponibles, que contienen una cepa atenuada de Salmonella entérica serovar typhi Ty21a, se usaron para preparar el caldo de S. typhi para usar en los estudios recombinantes indicados a continuación. El proceso consistió en inocular un medio de cultivo líquido con parte del contenido de las cápsulas y luego cultivar en placa el cultivo líquido en un medio de agar con el fin de aislar las colonias bacterianas individuales. Se aislaron colonias individuales y se cultivaron en medio de cultivo líquido. Dos cultivos, específicamente, VAX.Ty211 y VAX.Ty21-2, se formularon a continuación con glicerol, se hicieron alícuotas (1 ml) y se almacenaron a -75 °C ± 5 °C en espera de su uso. La identidad de cada uno de los dos cultivos se confirmó posteriormente.
Ejemplo 2: construcción de plásmido
El principio de síntesis de plásmidos se basa en la síntesis de genes in vitro de doble cadena con los siguientes pasos:
•
La secuencia de plásmido pVAX10-VR2.1 completa de 7,58 kB se subdividió (mediante análisis de software) en 5 secciones de ~1,5 kB. Cada sección se subdividió en oligonucleótidos de 40-50 bp teniendo cada uno regiones superpuestas entre oligonucleótidos de ambas cadenas
•
Los oligonucleótidos sintetizados in vitro se fosforilaron luego mediante incubación con polinucleótido quinasa T4
•
Después del proceso de recocido de superposición de oligonucleótidos bajo condiciones apropiadas, la enzima Taq ADN ligasa conectó los oligonucleótidos alineados
•
Una vez completada la etapa de ligado, se realizó PCR usando cebadores recocidos en posiciones hacia afuera, para aumentar el rendimiento de los fragmentos del plásmido ligado (~1,5kB)
•
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa preparativa para aislar los productos de PCR
•
Los productos de PCR aislados se clonaron en vectores TOPO (Invitrogen K#4575-40) y se transformaron en células TOP10 de E. coli para la propagación
•
Después del aislamiento del plásmido TOPO, se realizó una restricción y verificación de la secuencia
•
Los fragmentos alineados aislados se ensamblaron mediante PCR solapada. Este proceso fue seguido por el ensamblaje lineal del plásmido pVAX10.VR2-1
•
Después de la restricción del digestor Xhol (el sitio de restricción simple está presente en el plásmido pVAX10.VR21, véase la Figura 2.1.S.1.2.2-1) y el enlace covalente mediante la ligasa T4, E. coli se transformó con el plásmido circular para la propagación
•
Después de la verificación final de la secuencia del plásmido, el plásmido pVAX10.VR2-1 se transformó en la cepa bacteriana S. typhi Ty21a.
El plásmido pVAX10.VR2-1 se sintetizó así con éxito (sin desviación a la secuencia de referencia). Este plásmido se usó adicionalmente para transformar los aislados de la cepa bacteriana de S. typhi Ty21a (Vax.Ty21-1 y Vax.Ty21-2).
Ejemplo 3: Procesos de fabricación La siguiente Tabla 2 resume los procesos de fabricación con/sin alimentación de glucosa durante la fermentación.
Etapa de producción
Proceso variante A: con alimentación con glucosa Proceso variante A: sin alimentación con glucosa
Precultivo
CÉLULAS (con/sin plásmido pVAX10.VR2-1) CÉLULAS (con o sin plásmido pVAX10.VR2-1)
↓
↓
350 mL TSB + kanamicina (1mL)
2 x 500 ml TSB + kanamicina (500µL) (OD600>0,3)
Cuarto limpio clase D y A en D
↓ ↓
5 x 550 mL TSB + kanamicina (50mL)
10 x 1000 ml TSB + kanamicina (75mL)
(OD600 ≥ 0,5)
(OD600 ≥ 0,5)
Fermentación
30L volumen de fermentación 100 L volumen de fermentación
TSB + 0,001 % galactosa
TSB + 0,001 % galactosa
-30 °C
-30 °C
-flujo de aire 2 l/min (0,07 wm)
-flujo de aire 100L/min (1 vvm)
-presión 1 bar
-presión no controlada
-pH 7,0 controlado con NaOH
-pH 7,0 controlado con NaOH
-pO2 ≥ 40% regulado por mezclador
-espuma controlada (Corning)
Cuarto limpio clase D
-alimentación con glucosa ∑ 5-8 g/l -pO2 ≥ 40% regulado por mezclador
-Final OD600nm ~ 2,7 (objetivo 6 -10)
-mínimo de mezclado 200 rpm
-enfriamiento a 15 °C antes de la cosecha
-sin alimentación con glucosa
-OD600nm final (fin de la fase de crecimiento exponencial)
-enfriamiento a al menos 25°C antes de la cosecha
cosecha/ concentración/ lavado
filtración de flujo cruzado filtración de flujo cruzado
-10 veces concentración
-10 veces concentración
10 veces intercambio de regulador en diafiltración con solución de sacarosa al 15%, seguido de
10 veces el intercambio de regulador en la diafiltración con sacarosa al 15%, solución de ascorbato al 0,45% pH 7,2,
Etapa de producción
Proceso variante A: con alimentación con glucosa Proceso variante A: sin alimentación con glucosa
concentración adicional a 1/15 vol. de cosecha original
seguido de una concentración adicional de 1/20 vol. de cosecha original
almacenamiento* a 2-8 °C hasta llenado aproximadamente 24 horas,
Cuarto limpio clase D
-Formulación agregando ascorbato a la concentración final de 0,45% imagen11
almacenamiento a 2-8 °C hasta llenado aproximadamente 24 horas
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Dilución/ llenado de frascos
Llenado manual de 150 frascos de 5 diluciones Llenado manual de 150 frascos de 5 diluciones
-Ajuste de CFU
-Ajuste de CFU
-300mL de suspensión → llenado de 150 frascos
-300mL de suspensión → llenado de 150 frascos
-Dilución de 30mL de suspensión 270 mL solución de formulación, llenado de 150 2 R frascos de vidrio
-Dilución de 30mL de suspención 270 mL solución de formulación, llenado de 150 2 R frascos de vidrio
-cuatro diluciones y llenado de 150 frascos hasta 1:10.000
Cuarto limpio clase A en B
-cuatro diluciones y llenado de 150 frascos hasta 1:10.000 -cerrar los frascos con tapones de caucho y tapas de aluminio
-cerrar los frascos con tapones de caucho y tapas de aluminio
-almacenamiento a ≤ -70 °C
-almacenamiento a -75°C ± 10°C
El proceso de crecimiento bacteriano se llevó a cabo en 2 x 350 ml de medio TSB que contenía además 25 µg/ml de kanamicina. Se inocularon dos matraces Erlenmeyer de 2L con deflectores, cada uno con una alícuota (1 ml) de Salmonella typhi Ty21a y Ty21a (pVAX10.VR2-1). Los cultivos se incubaron a 30 °C ± 2 °C con agitación (140 rpm) 5 hasta que se alcanzó una Densidad Óptica OD600nm>0,1. La cosecha bacteriana (50 ml) del primer cultivo se usó para inocular un segundo cultivo (precultivo 2), 6 x 550 ml de medio TSB con kanamicina (25 µg/ml) contenido en matraces Fernbach de 3L con deflectores. Los cultivos se incubaron a 30 °C ± 2 °C con agitación (180 rpm) hasta que una OD a 600 nm del cultivo bacteriano alcanzó un valor de ≥0,3. Al finalizar el tiempo de incubación, se inoculó el cultivo principal (medio TSB con galactosa al 0,001%) preparado en un fermentador de acero inoxidable controlado con un
10 volumen de trabajo de 27 litros, con el precultivo 2 (5 matraces de cultivo bacteriano agrupados) y se incubaron a 30 °C con la siguiente configuración: flujo de aire a 2 l/min, presión a 1 bar, pH 7,0, pO2 ≥ 40%.
Una mitad de las muestras de cultivo se alimentó con glucosa en una cantidad que dio una concentración final de 2,0 g/l a 3,0 g/l en el medio de cultivo inicial. La alimentación con glucosa se llevó a cabo después de 3-5 horas después del inicio de la fermentación y se repitió varias veces cada 3-5 horas.
15 La otra mitad de las muestras de cultivo se trataron de manera idéntica pero sin ninguna alimentación de glucosa durante el cultivo de las células de Salmonella. Como control, se probó un medio de cultivo que no contenía ninguna glucosa desde el primer comienzo (medio TSB sin glucosa).
El cultivo bacteriano se concentró por filtración de flujo cruzado (CFF)/diafiltración contra una solución de sacarosa al 15%. Se llevaron a cabo cinco diluciones del concentrado bacteriano final. El producto bacteriano final se dividió en 20 alícuotas (1 ml) en viales 2R, los viales se cerraron, se marcaron, se taparon y se almacenaron a -75 °C ± 5 °C.
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Tiempo de Cultivación
OD600-resultados
[h]
VK1 a VK1b VK2 VK1a k VK1b k VK2a k VK2b k
2,0
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3,0
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4,0
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6,0
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7,0
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7,5
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8,0
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14,0
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16,0
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17,0
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18,0
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24,0
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26,0
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Tiempo de Cultivación
OD600-resultados
[h]
VK1 a VK1b VK2 VK1a k VK1b k VK2a k VK2b k
27,0
7,3 imagen147 imagen148 imagen149 imagen150 imagen151 imagen152
28,0
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30,0
7,5 imagen159 imagen160 imagen161 imagen162 imagen163 imagen164
39,0
imagen165 7,0 imagen166 7,6 3,2 imagen167 imagen168
Tabla 4: Concentración de glucosa durante el proceso de fermentación
Tiempo de Cultivación
imagen169 Concentración de glucosa [g/l]
[h]
imagen170 VK1a k imagen171 VK1b k VK2a k VK2b k
0
2,4 imagen172 2,4 2,5 2,6
1
imagen173 imagen174 2,5
2,0
imagen175 imagen176 2,4
3,0
imagen177 imagen178 2,3
4,0
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5,0
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6,0
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7,0
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7,5
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8,0
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9,0
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10,0
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16,0
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Tiempo de Cultivación
imagen214 Concentración de glucosa [g/l]
[h]
imagen215 VK1a k imagen216 VK1b k VK2a k VK2b k
17,0
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18,0
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19,0
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20,0
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21,0
imagen230 1,6 imagen231 imagen232
22,0
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23,0
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24,0
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25,0
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27,0
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30,0
imagen259 imagen260 imagen261 imagen262
39,0
imagen263 0,0 imagen264 imagen265
Tabla 5: cambio de valor de pH durante el proceso de fermentación
Tiempo de incubación
Valores de pH
[h]
VK1a k pH VK1b k pH VK2a k pH VK2b k pH
0
6,8 6,8 6,5 6,5
1
imagen266 imagen267 6,4 6,4
2,0
imagen268 imagen269 6,4 6,4
3,0
imagen270 imagen271 6,5 6,5
4,0
imagen272 imagen273 6,0 6,0
5,0
imagen274 imagen275 6,2 6,2
6,0
imagen276 imagen277 5,8 5,91
7,0
imagen278 imagen279 imagen280 imagen281
Tiempo de incubación
Valores de pH
[h]
VK1a k pH VK1b k pH VK2a k pH VK2b k pH
7,5
imagen282 imagen283 imagen284 imagen285
8,0
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9,0
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10,0
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11,0
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12,0
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13,0
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14,0
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15,0
5,7 5,6 imagen312 imagen313
16,0
5,6 5,6 imagen314 imagen315
17,0
5,7 5,4 imagen316 imagen317
18,0
5,8 4,4 imagen318 imagen319
19,0
5,7 5,3 imagen320 imagen321
20,0
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24,0
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25,0
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26,0
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27,0
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30,0
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39,0
8,0 5,1 imagen356 imagen357

Claims (1)

  1. imagen1
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102090612B1 (ko) * 2012-07-05 2020-03-19 백심 아게 췌장암 환자용 dna 백신
HUE045567T2 (hu) * 2013-12-18 2020-01-28 Vaximm Gmbh MSLN-t célzó DNS vakcina rák immunterápiához
US20180153976A1 (en) 2015-06-18 2018-06-07 Vaximm Ag Novel cmv pp65 targeting dna vaccine for cancer immunotherapy
SI3310379T1 (sl) * 2015-06-18 2020-02-28 Vaximm Ag DNA cepivo, ki cilja VEGFR-2, za kombinacijsko terapijo
RU2019100079A (ru) 2016-07-13 2020-08-13 Факсимм Аг Способ получения днк-вакцины для иммунотерапии рака
EP3583200A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Vaximm AG Novel vegfr-2 targeting immunotherapy approach
US20220160797A1 (en) * 2019-04-01 2022-05-26 North Carolina State University Probiotic bacteria capable of adaptive response to pomegranate extract and methods of production and use thereof
US20230137174A1 (en) 2020-03-31 2023-05-04 Nec Oncoimmunity As Novel salmonella-based coronavirus vaccine

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH542928A (de) * 1971-04-29 1973-10-15 Schweiz Serum & Impfinst Verfahren zur Herstellung einer neuen Typhus-Vakzine
KR930001382B1 (ko) 1990-09-05 1993-02-27 보령신약 주식회사 경구용 장티프스 생균백신 및 그의 제조방법
ATE322288T1 (de) * 2001-01-03 2006-04-15 Epitopix Llc Zusammensetzungen zur immunisierung sowie deren verwendung
US7094410B2 (en) * 2002-03-02 2006-08-22 The Scripps Research Institute DNA vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof
EP1670505B1 (en) * 2003-09-18 2012-11-14 GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Dna promoters and anthrax vaccines
WO2010045620A1 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae
CN101985610A (zh) * 2010-10-26 2011-03-16 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种伤寒沙门氏菌菌蜕、制备方法及作为递送系统的应用

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