KR100979898B1 - 증식성 내피 세포에 대한 ｄｎａ 백신 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

내피 세포 증식을 억제하기에 효과적인 DNA 백신은 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 DNA 작제물을 포함한다. 본 발명은 VEGF 수용체-2(KDR, 서열번호 2), VEGF 수용체-1(Flt-1, 서열번호 4) 또는 Flk-1(KDR의 쥐 상동체, 서열번호 6)을 암호화하는 DNA 백신, 각각 서열번호 1, 3 및 5의 DNA 서열뿐만 아니라 이러한 DNA 백신을 사용하여 종양 미세환경에서 내피 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 항혈관신생 및 후속적인 종양 성장과 전이의 감소가 달성된다.

혈관 내피 성장 인자 수용체 단백질, DNA 백신, 내피 세포 증식, 혈관신생

Description

증식성 내피 세포에 대한 ＤＮＡ 백신 및 이를 포함하는 약제학적 조성물{DNA vaccine against proliferating endothelial cells and a pharmaceutical composition comprising the same}

정부의 권리

본 발명은 미국국립보건연구원에 의해 계약서 제5-70373-COLON호하에 정부 지원에 따라 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정한 권리를 갖는다.

발명의 분야

본 발명은 증식성 내피 세포에 대한 면역반응을 유도하기에 효과적인 적합한 분자를 암호화하는 데옥시리보핵산(DNA) 백신에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 수용체를 암호화하는 DNA 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당해 DNA 백신을 이용하여 혈관 내피 세포 증식, 종양 성장 및 혈관신생(angiogenesis)을 억제하는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

백신은 질병 병원체가 증식하여 병리학적 효과를 유발시킬 수 있기 전에 이 질병 병원체를 파괴시키기 위해 유기체의 면역계를 자극하는 예방제의 매우 제한된 투여에 의해 다수의 질병 상태에 대한 장기간의 보호를 제공하기 위해 사용되어 왔다. 백신 및 백신접종에 대한 다양한 접근법은 문헌[참조: Bernard R. Glick and Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, Second Edition, ASM Press pp. 253-276 (1998)]에 기재되어 있다.

백신접종은 신체 자체의 면역계를 감염 인자가 병리학적 반응을 유발시키기 전에 이를 찾아내어 파괴하도록 유도하는 수단이다. 통상적으로, 백신은 살아있지만 약독화된 감염성 인자(바이러스 또는 세균) 또는 사멸된 형태의 인자이다. 살아있는 세균 또는 바이러스로 이루어진 백신은 비병원성이어야 한다. 통상적으로, 세균 또는 바이러스 배양물은 물리적 또는 화학적 처리에 의해 약독화(약화)된다. 인자가 비병독성이라 해도, 이는 백신 처리된 피험자에서 여전히 면역 반응을 유도할 수 있다.

면역반응은 특정 거대분자 또는 감염성 인자인 항원에 의해 유도된다. 이러한 항원은 일반적으로 B 세포 및 T 세포로서 공지된 림프구에 의해 "외래물질"로서 인식되는 단백질, 폴리사카라이드, 지질 또는 당지질이다. 림프구의 두 유형 모두가 항원에 노출되면 세포 분열 및 분화 반응을 유도하여 노출된 림프구의 클론 형성을 초래한다. B 세포는 혈장 세포로 분화하고 감염성 인자에 존재하는 항원에 선택적으로 결합하는 항체(Ab)로 지칭되는 단백질을 생산하여 병원체를 중화시키거나 불활성화시킨다(체액성 면역). 일부 경우에서, B 세포는 CD4+ 헬퍼 T 세포의 도움을 필요로 한다.

항원 노출에 반응하여 형성되는 특수화된 T 세포 클론은 항원을 제공하는 병원체 및 조직에 결합하여 이를 제거할 수 있는 세포독성 T 림프구(CTL)이다(세포-매개된 또는 세포성 면역). 일부 경우에서, 수지상 세포와 같은 항원 제공 세포(APC)는 병원체 또는 기타 외래 세포를 내포작용(endocytosis)에 의해 둘러쌀 수 있다. 이어서, APC는 세포로부터 항원을 처리하고, 이들 항원을 CTL상의 T 세포 수용체(TCR)에게 조직적합 분자:펩타이드 복합체의 형태로 제공함으로써 면역반응을 자극한다.

특이적 항체의 형성을 특징으로 하는 체액성 면역은 일반적으로 급성 세균 감염 및 반복적 바이러스 감염에 대해 매우 효과적인 반면에, 세포 매개된 면역은 바이러스 감염, 만성 세포내 세균 감염 및 진균 감염에 대해 가장 효과적이다. 세포성 면역은 또한 암으로부터 보호하며 기관 이식 거부를 초래하는 것으로 공지되어 있다.

이전 감염으로부터의 항원에 대한 항체는 매우 장기간 동안 혈중에서 검출가능한 상태로 유지되어 병원체에 노출되기 전에 검출할 수 있는 수단을 제공한다. 동일한 병원체에 재노출시, 면역계는 병원성 인자가 증식하여 병원성 반응을 유발하기 전에 병원성 인자를 제거함으로써 재감염을 효과적으로 예방한다.

병원체에 의해 유도될 수 있는 동일한 면역반응은 또한 때때로 동일한 항원을 병원체로서 제공하는 비병원성 인자에 의해 유발될 수 있다. 이러한 방식으로, 피험자는 감염에 대해 미리 싸워서 물리치지 않고도 병원체로의 후속적 노출로부터 보호될 수 있다.

그러나, 모든 감염성 인자가 백신 형성을 위해 요구되는 정도로 쉽게 배양되고 불활성화될 수 있는 것은 아니다. 최신의 재조합 DNA 기술은 이러한 한계를 극복하고자 새로운 백신을 조작할 수 있도록 한다. 병원성 유전자가 결여되어 백신으로서 사용될 유기체의 살아있는 비병원성 형태를 가능케하는 감염성 인자를 생성시킬 수 있다. 또한, 이. 콜라이(E. coli)와 같은 비교적 비병원성인 유기체를 병원성 운반체의 세포 표면 항원을 제공하도록 조작할 수 있다. 이러한 형질전환된 운반체로 처리된 피험자의 면역계를 "속여서(tricked)" 병원체에 대한 항체를 형성하도록 한다. 병원성 인자의 항원성 단백질을 조작하고 비병원성 종에서 발현시킬 수 있으며, 상기 항원성 단백질을 분리 및 정제하여 "서브유닛 백신(subunit vaccine)"을 제조할 수 있다. 서브유닛 백신은 안정하고 안전하며 화학적으로 잘 정의된다는 잇점을 갖지만, 이의 제조는 고비용일 수 있다.

백신에 대한 신규 접근법이 최근에 나타나고 있으며 광범위 유전자 면역화로 지칭된다. 상기 접근법에서는, 병원성 인자의 항원을 암호화하는 유전자를 면역화하고자 하는 피험자의 세포내로 작동적으로 삽입시킨다. 처리된 세포는 형질전환되어 병원체의 항원성 단백질을 생산한다. 이어서, 이렇게 생체내 생산된 항원은 숙주에서 목적하는 면역 반응을 유발한다. 이러한 유전자 백신에서 사용되는 유전자 물질은 DNA 또는 RNA 작제물일 수 있다. 흔히 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 유전자의 삽입, 복제 또는 발현을 증가시키는 다른 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열과 함께 도입된다.

항원 유전자를 암호화하는 DNA 백신은 다양한 발현 시스템으로 피험자의 숙주 세포내로 도입시킬 수 있다. 상기 발현 시스템으로는 원핵, 포유동물 및 효모 발현 시스템이 포함된다. 예를 들어, 한가지 접근법은 새로운 유전자 물질을 통합시키는 우두 바이러스와 같은 바이러스 벡터를 사용하여 숙주 세포에 접종시키는 것이다. 대안으로, 유전자 물질을 벡터에 통합시키거나 "나출형" 폴리뉴클레오타이드, 즉 단순히 정제된 DNA로서 숙주 세포에 직접 전달할 수 있다. 또한, DNA는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)과 같은 약독화된 세균내로 안정하게 형질감염시킬 수 있다. 환자가 형질전환된 살모넬라로 경구 백신접종되는 경우, 세균은 창자내의 파이어소절(Peyer's patch)(즉, 2차 림프조직)으로 운반된 다음, 면역반응을 자극한다.

DNA 백신은 유전자 질환 및 암과 같은 통상적 병원체에 의해 유발되지 않은 질환 상태를 면역화시키는 기회를 제공한다. 통상적으로, 유전자 암 백신에서, 특정 유형의 종양 세포에 대한 항원은 분리된 다음에 백신내로 도입되어야 한다. 따라서, 다수의 암에 대한 효과적인 일반 백신은 면역화하고자 하는 암 세포의 각각의 유형에 대한 수많은 개별 백신의 개발을 수반할 수 있다.

종양 치료에 대한 한가지 일반적 접근법은 혈관신생 억제 화합물을 종양이 성장중인 환자에게 투여함을 포함한다. 혈관신생은 새로운 모세혈관 및 혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생은 배아 발달, 조직 성장, 조직 복구 및 조직 재생에서 중요하다. 이러한 정상적이고 필수적인 과정 이외에, 혈관신생은 종양 성장, 종양 전이 및 안구 혈관 질환, 예를 들어, 당뇨병성 망막병증과 같은 다수의 비정상적 병리학적 과정에도 관여한다.

혈관신생은 (a) 혈관 내피 세포의 활성화, (b) 프로테아제 활성을 발현하는 내피 세포에 의한 세포 매트릭스 단백질의 분해, (c) 내피 세포의 잠재적 성장 부위로의 이동, (d) 내피 세포의 증식 및 (e) 내피 세포의 분화에 의한 관 형성을 포함하는 다수의 상호의존적 과정을 포함한다. 이러한 과정들 각각은 섬유모세포 성장 인자(FGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 다양한 촉진 물질에 의해 영향을 받는다. 혈관 내피 성장 인자(총칭하여 VEGF)는 내피 세포 성장과 분화에서 중요한 역활을 한다. VEGF는 내피 세포 막에 존재하는 수용체 단백질-티로신 키나제에 결합하고 이어서 세포 성장을 자극하는 시그날 전달(signal transduction) 반응의 다단계를 개시함으로써 작용한다.

병리학적 혈관신생의 억제는 종양 치료 방법으로서 제안된 바 있다[참조: Folkman et al. Science, 221, 719, (1983)]. 상기 치료의 개본 개념은, 종양이 성장하기 위해 혈관형성을 필요로 하기 때문에, 혈관신생 억제 화합물의 투여를 통한 혈관 형성의 억제가 종양으로의 혈액 공급을 결핍시킴으로서 종양 성장을 차단할 것이라는 것이다. 이러한 접근법의 단점은 혈관신생 억제제가 종양 성장을 차단하기 위해 비교적 연속적으로 투여되어야 한다는 점이다. 억제제 전달의 중단은 종양 성장의 재개를 유도할 수 있다. 혈관신생의 억제에 있어 효과적인 백신은 종양 형성에 대한 흥미로운 차단제일 수 있다.

특정 종양 항원을 표적화할 필요 없이 다양한 종양의 성장을 억제할 수 있는, 혈관신생에 대한 면역화를 위해 일반적으로 효과적인 백신에 대한 요구가 지속되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.

발명의 요약

내피 세포 증식을 억제하기에 효과적인 DNA 백신은 VEGF 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 DNA 작제물을 포함한다. DNA 백신은 VEGF에 대한 수용체 단백질, 예를 들어, 각각 VEGFR-2(KDR; 서열번호 2), VEGFR-1(Flt-1; 서열번호 4) 및 Flk-1(서열번호 6: KDR의 쥐 상동체)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 DNA 서열을 포함한다. 백신은 정제된 DNA 작제물과 같은 선형 핵산 또는 플라스미드 벡터내에 통합된 DNA 작제물을 포함할 수 있다. 본 발명의 DNA 백신은 VEGFR-2를 과발현하는 증식성 내피 세포에 대해 활성인 CTL의 형성을 자극한다.

내피 세포는 포유동물 혈관 조직의 내층을 형성한다. 내피 세포의 증식은 혈관신생에서 중요한 과정이다. 본 발명의 백신은 증식성 내피 세포에 대한 면역반응을 유도함으로써 백신으로 처리된 유기체에서 혈관신생을 장기간 억제하는 방법을 제공한다. 확립된 혈관의 내층과 같은 비증식성 내피 세포는 상당량의 VEGF 수용체 항원을 제공하지 않으므로, 백신에 반응하여 생성되는 CTL에 의해 실질적으로 영향을 받지않는 상태로 유지된다.

본 발명의 방법 양상에서, DNA 백신은 백신접종된 환자에서 내피 세포 증식의 장기간 억제를 제공하기 위해 사용된다. 하나의 방법 양태에서, VEGF 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 포함하는 DNA 백신은 내피 세포 증식의 억제가 필요한 환자에게 증식성 내피 세포에 대한 면역반응을 유도하기에 충분한 양으로 경구 투여한다.

본 발명은 또한 DNA 백신으로 백신접종된 환자에서 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법 양태에서, VEGF 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 DNA 작제물을 포함하는 백신의 면역반응 유도량을 혈관신생 관련 질병을 앓는 환자에게 투여한다.

본 발명의 또 다른 방법 양상에서, 종양 성장은 환자를 DNA 백신으로 백신접종함으로써 억제한다. 이러한 방법 양태에서, VEGF 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 DNA 작제물을 포함하는 백신의 면역반응 유도 유효량을 성장 종양을 갖는 환자에게 투여한다. 백신접종은 종양 성장 정지를 야기한다. 환자의 면역계에 의한 증식성 내피 세포의 파괴는 종양의 혈관형성을 차단하여 본질적으로 종양을 아사시킨다.

본 발명의 방법 양태에서, DNA 백신은 경구 투여와 같이 장내 투여하거나 주사 또는 정맥내 주입과 같이 비경구 투여할 수 있다.

본 발명의 백신은 다수의 질병 상태의 치료 및 예방에 유용하다. 예를 들어, 암 및 당뇨병성 망막병증 등을 앓는 환자는 본 발명의 백신에 의한 면역화로부터 이익을 얻을 수 있다.

도면의 간단한 설명

도면에서, 도 1은 사람 KDR을 암호화하는 DNA 서열, 서열번호 1을 도시한 것이다.

도 2는 사람 KDR의 단백질 서열, 서열번호 2를 도시한 것이다.

도 3은 사람 Flt-1을 암호화하는 DNA 서열, 서열번호 3을 도시한 것이다.
도 4는 사람 Flt-1의 단백질 서열, 서열번호 4를 도시한 것이다.

도 5는 마우스 Flk-1을 암호화하는 DNA 서열, 서열번호 5를 도시한 것이다.

도 6은 사람 Flk-1의 단백질 서열, 서열번호 6을 도시한 것이다.

도 7은 50%를 초과하는 종양 확산범위(3으로 표시) 내지 10% 미만의 종양 확산범위(1로 표시)인 다양한 수준의 종양 확산범위를 갖는 마우스 폐의 그림 설명이다.

도 8은 본 발명의 DNA 백신으로 백신접종되고(검은 굵은 실선) CT-26 결장 암종 세포의 정맥내 주사로 챌린지(challenge)된 마우스가 두 마우스 대조군에 비해 현저하게 감소된 사망율을 나타냄을 입증하는 데이터의 그래프 설명이다(비감작(naive) 마우스; 가는 실선; 대조군 백신: 점선).

도 9는 D121 루이스 폐 암종 종양 성장이 두 마우스 대조군에 비해 본 발명의 DNA 백신으로 백신접종된 마우스(pcDNA3.1-FLK-1)에서 억제됨을 입증하는 데이터의 그래프 설명이다.

도 10은 B16 흑색종 종양 성장이 대조군(○)에 비해 본 발명의 DNA 백신으로 백신접종된 마우스(●)에서 억제됨을 입증하는 데이터의 그래프 설명이다.

도 11은 CD25, CD69 및 CD2 양성 CD8+ T 세포가 마우스 대조군에 비해 본 발명의 DNA 백신으로 백신접종된 마우스에서 상향조절됨을 입증하는 데이터의 그래프 설명이다.

바람직한 양태의 상세한 설명

내피 세포 증식을 억제하기에 효과적인 DNA 백신은 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 DNA 작제물을 포함한다. 본원 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 "DNA 작제물"이란 용어는 표적 세포에서 전사될 수 있는 합성 DNA 작제물을 의미한다. 작제물은 정제된 DNA와 같은 선형 핵산 또는 바람직하게는 플라스미드 벡터내에 통합된 DNA를 포함할 수 있다. DNA는 또한 바이러스 또는 세균 벡터, 바람직하게는 비병원성의 약독화된 바이러스 또는 세균 벡터내에 통합될 수 있다. 적합한 DNA는 VEGFR-2(KDR; 서열번호 2), VEGFR-1(Flt-1; 서열번호 4) 및 Flk-1(서열번호 6)과 같은 VEGF 수용체 단백질을 암호화하는 DNA, 예를 들어, 각각 DNA 서열 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5이다.

VEGF-1(VEGF-A로서도 공지됨), VEGF-2(VEGF-C로서도 공지됨), VEGF-B, VEGF-D 및 VEGF-E를 포함하는 5개의 VEGF 아형이 확인되었다[참조: 미국 특허 제6,235,713(Achen et al.) 및 상기 특허에서 인용된 참조문헌]. VEGF 수용체는 내피 세포에 특이적인 단백질-티로신 키나제이다. Flt-1(VEGF 수용체 1; VEGFR-1), KDR(VEGFR-2), Flk-1(KDR의 쥐 상동체), Flt-4(VEGFR-3), Tie, Tie-2 및 Tek를 포함하는 내피 세포에 특이적인 몇몇 수용체 단백질-티로신 키나제가 확인되었으며, 이중 일부는 VEGF 수용체이다.

본 발명의 DNA 백신은 VEGFR-2를 과발현하는, 증식성 내피 세포에 대해 활성인 CTL의 형성을 자극한다. VEGF 수용체가 증식성 내피 세포에서만 상당량으로 발현되기 때문에, 백신에 반응하여 형성되는 CTL은 활발한 혈관신생(예: 혈관형성)이 발생하는 조직만을 실질적으로 표적화할 것이다. 확립된 혈관의 내층과 같은 비증식성 내피 세포는 VEGF 수용체 항원이 실질적으로 결여되어 있으므로 당해 백신에 의해 유도된 CTL에 의해 영향을 받지 않는다.

바람직한 양태에서, DNA 백신은 VEGF 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 백신은 수지상세포의 개입을 통해 비감작 T 세포(naive T cell)의 활성화를 직접적으로 및 간접적으로 촉진시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 "면역"이란 용어는 감염성 인자 또는 종양 항원의 병독성 형태로부터의 장기간의 면역학적 보호를 의미한다. "면역화"란 용어는 처리된 피험자에서 병원체에 대한 면역을 초래하는, 비병독성 공급원으로부터 유래된 병원성 인자의 항원에 대한 예방적 노출을 의미한다.

본 발명의 DNA 작제물은 바람직하게는 유전자 발현에 필요한 조절 요소에 작동적으로 연결된 VEGF 수용체 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

유용한 DNA 작제물은 뉴클레오타이드의 발현에 필수적인 조절 요소를 포함한다. 이러한 조절 요소로는 예를 들어, 프로모터, 개시 코돈, 종결 코돈 및 폴리아데닐화 시그날이 포함된다. 또한, 인핸서가 면역원성 표적 단백질을 암호화하는 서열의 발현을 위해 흔히 요구된다. 당해 분야에 공지되어 있는바와 같이, 이러한 요소들은 바람직하게는 목적하는 단백질을 암호화하는 서열에 작동적으로 연결된다. 조절 요소는 바람직하게는 이를 투여하고자 하는 종에서 작동가능한 것을 선택한다.

개시 코돈 및 종결 코돈은 바람직하게는 본 발명의 유전자 백신내에 VEGF 수용체 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로서 포함된다. 개시 및 종결 코돈은 암호화 서열과 함께 프레임내에 존재해야 한다.

본 발명의 백신내에 포함되는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날은 바람직하 게는 면역화하고자 하는 피험자의 세포내에서 작용성인 것으로 선택한다.

본 발명의 백신, 특히 사람용 유전자 백신의 제조시에 유용한 프로모터의 예로는 시미안 바이러스 40(SV40), 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 예를 들어, HIV 긴 말단 반복부(Long Terminal Repeat; LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 예를 들어, CMV 조기발현 프로모터(immediate early promoter), 엡스타인 바르 바이러스(EBV), 라우스 육종 바이러스(RSV)로부터의 프로모터뿐만 아니라 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴 및 사람 메탈로티오네인과 같은 사람 유전자 유래의 프로모터가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 백신, 특히 사람용 유전자 백신의 제조시에 유용한 폴리아데닐화 시그날의 예로는 SV40 폴리아데닐화 시그날 및 LTR 폴리아데닐화 시그날이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

DNA 발현에 요구되는 조절 요소 이외에, 다른 요소도 DNA 분자내에 포함될 수 있다. 이러한 추가의 요소로는 인핸서가 포함된다. 인핸서는 예를 들어, 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴 및 바이러스 인핸서, 예를 들어, CMV, RSV 및 EBV로부터의 바이러스 인핸서일 수 있다.

조절 서열 및 코돈은 단백질 생산을 최대화하도록 일반적으로 종 의존적이고, 조절 서열 및 코돈은 바람직하게는 면역화하고자 하는 종에서 효과적이도록 선택한다. 당해 분야의 숙련가는 소정의 피험자 종에서 기능적인 DNA 작제물을 제조할 수 있다.

본 발명의 백신의 DNA 작제물은 관련 내용이 본원에서 참조로 인용되는 문헌[참조: Restifo et al. Gene Therapy 7, 89-92 (2000)]에서 정의된 바와 같은 "나출형" DNA일 수 있다. 대안으로, DNA는 벡터내에 작동적으로 통합될 수 있다. 유용한 전달 벡터로는 생분해성 미세캡슐, 면역-자극 복합체(ISCOM) 또는 리포좀, 및 바이러스 또는 세균과 같은 유전자 조작된 약독화된 살아있는 벡터를 포함한다.

적합한 약독화된 살아있는 세균 벡터의 예로는 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 시겔라(Shigella), 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 바실레 칼메테-구에린(Bacille Calmette-Guerin(BCG)), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 캄필로박터(Campylobacter) 또는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 다른 적합한 세균 벡터가 포함된다. 살아있는 세균 벡터를 외인성 DNA 작제물로 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 잘 기술되어 있다[참조: Joseph Sambrook and David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)].

바람직한 바이러스 벡터로는 박테리오파지, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 폴리오 바이러스, 우두 바이러스 및 아비폭스 바이러스가 포함된다. 바이러스 벡터를 외인성 DNA 작제물로 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 익히 기술되어 있다[참조: Sambrook and Russell].

리포좀 벡터는 친유성 물질로 형성된 막 부분과 내부 수성 부분을 갖는 단일층 또는 다중층 소포이다. 표적 세포로 전달될 폴리뉴클레오타이드 물질을 함유하는 수성 부분이 본 발명에서 사용된다. 리포좀 형성 물질은 4급 암모늄 그룹과 같은 양이온성 그룹 및 탄소수 약 6 내지 약 30의 포화 또는 불포화 알킬 그룹과 같은 하나 이상의 친유성 그룹을 갖는 것이 일반적으로 바람직하다. 적합한 물질의 한가지 그룹은 유럽 공개특허공보 제0187702호에 기재되어 있으며 미국 특허 제6,228,844호(Wolff et al.)에 추가로 기재되어 있으며, 이들 문헌의 관련 내용은 본원에서 참조로 인용된다. 다수의 기타 적합한 리포좀 형성 양이온성 지질 화합물이 문헌에 기재되어 있다[참조: L. Stamatatos, et al., Biochemistry 27:3917-3925 (1988); and H. Eibl, et al., Biophysical Chemistry 10:261-271 (1979)]. 대안으로, 폴리락타이드-코글리코라이드 생분해성 미세구와 같은 미세구를 사용할 수 있다. 핵산 작제물은 당해 분야에 공지된 바와 같은 핵산을 조직으로 전달하기 위한 리포좀 또는 미세구로 캡슐화되거나 이와 복합체화된다.

본 발명의 방법 양상은 DNA 폴리뉴클레오타이드를 사람과 같은 포유동물의 조직에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, DNA 폴리뉴클레오타이드는 경구, 근육내, 비내, 복강내, 피하, 피내 또는 국소 투여한다.

본 발명의 방법 양상에서, DNA 백신은 백신으로 처리된 환자에서 내피 세포 증식의 장기간 억제를 제공하는데 사용할 수 있다. 하나의 바람직한 방법 양태에서, VEGF 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 포함하는 DNA 백신은 내피 세포 증식의 억제가 필요한 포유동물에게 증식성 내피 세포에 대한 면역반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여한다.

본 발명은 또한 DNA 백신으로 처리된 포유동물에서 혈관신생을 억제하는 방 법을 제공한다. 이러한 방법 양태에서, VEGF 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 DNA 작제물을 포함하는 백신은 혈관신생 관련 질환을 앓는 포유동물에게 증식성 내피 세포에 대한 면역반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여한다.

본 발명의 또 다른 방법 양태에서, 종양 성장은 포유동물을 DNA 백신으로 처리함으로써 억제한다. 이러한 방법 양태에서, VEGF 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 DNA 작제물을 포함하는 백신의 면역반응 유도량은 성장 종양을 갖는 포유동물에게 투여한다. 백신에 의한 처리는 포유동물을 증식성 내피 세포에 대해 면역화시킴으로써 종양 성장 정지를 초래한다. 포유동물의 면역계에 의한 증식성 내피 세포의 파괴는 종양의 혈관형성을 차단하거나 적어도 최소화시킨다.

본 발명의 방법 양태에서, 백신은 경구 투여와 같이 장내 투여하거나 근육내 주사에 의해 투여한다. 바람직하게는, 본 발명의 백신으로 처리된 포유동물은 사람이다. 폐 또는 결장 암종과 같은 암 또는 전립선 종양 및 당뇨병성 망막병증 등을 앓는 환자는 본 발명의 백신에 의한 면역화로부터 이득을 얻을 수 있다.

본 발명의 백신은 바람직하게는 물, 식염수, 덱스트로스 및 글리세롤 등과 같은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제 및 이들의 배합물과 함께 제형화한다. 백신은 또한 습윤제, 유화제 및 완충제 등과 같은 보조 물질을 함유할 수도 있다.

본 발명의 백신은 바람직하게는 사람과 같은 포유동물에게 약제학적으로 허용되는 담체 중의 용액 또는 현탁액으로서 ㎖당 약 1 내지 약 10㎍의 범위의 DNA 농도로 경구 투여한다. 적절한 용량은 백신접종하고자 하는 피험자에 따라 및 부분적으로는 백신의 투여를 시행하거나 요청하는 주치의의 판단에 따라 좌우될 수 있다.

본 발명의 백신은 앰풀, 병 또는 바이알과 같은 적합하게 멸균된 다중용량 또는 단일 용량 형태인 용기내로 포장될 수 있다. 용기는 바람직하게는 백신 제제로 충전된 후에 기밀 밀봉된다. 바람직하게는, 백신은, 당해 백신을 확인시키며 적절한 법하에 백신의 승인을 반영하는 미국 식품의약청과 같은 정부 기관에 의해 지시된 형태의 통지서 및 용량 정보 등을 보유하는 라벨이 부착된 용기내에 포장된다. 라벨은 바람직하게는 환자에게 백신을 투여하는 건강 전문가에게 유용한 백신에 관한 정보를 함유한다. 포장재는 또한 바람직하게는 백신의 투여에 관한 인쇄된 정보 자료, 지침서, 지시서 및 임의의 필수적으로 요구되는 경고서를 함유한다.

바람직하게는, 본 발명의 백신은 예를 들어, Flt-1, KDR, Flk-1 및 이의 기능적 상동체를 포함하는, 내피 세포에 특이적인 티로신 키나제와 같은 하나 이상의 VEGF 수용체 단백질을 암호화하는 DNA 작제물을 포함한다. 기능적 상동체는 바람직하게는 상기한 VEGF 수용체 단백질과 약 80% 이상의 상동성을 공유한다.

VEGF 수용체 단백질의 아미노산 서열은 이러한 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 마찬가지로 당해 분야에 기술되어 있다. KDR을 암호화하는 핵산 서열(도 1, 서열번호 1) 및 이의 상응하는 단백질 서열(도 2, 서열번호 2)은 내용이 본원에서 참조로 인용되는, 유럽 생물정보학 기관(European Bioinformatics institute), 웰컴 트러스트 게놈 캠퍼스(Wellcome Trust Genome Campus, 영국 캠브릿지 CB10 1SD 힌크스톤 소재)(EMBL 승인 번호 제EMBL:AF063658호)의 EMBL 데이타베이스에 유(Yu) 등에 의해 공개되었다. Flt-1을 암호화하는 핵산 서열(도 3, 서열번호 3) 및 이의 상응하는 단백질 서열(도 4, 서열번호 4)은 유럽 생물정보학 기관, 웰컴 트러스트 게놈 캠퍼스(영국 캠브릿지 CB10 1SD 힌크스톤 소재)(EMBL 승인 번호 제EMBL:AF063657호)의 EMBL 데이타베이스에 유(Yu) 등에 의해 공개되었다. Flk-1을 암호화하는 핵산 서열 및 이의 상응하는 단백질 서열은 문헌[참조: Mathews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88:9026-9030]에 의해 공개되었으며, 구조는 관련 내용이 본원에서 참조로 인용되는 문헌[참조: Quinn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 90:7533-7537]에 의해 교정되었다. Flk-1의 교정된 DNA 서열은 도 5에 서열번호 5로서 제공되며, Flk-1의 교정된 단백질 서열은 도 6에 서열번호 6으로서 제공된다.

유전자 코드의 고유의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, KDR, Flk-1 및 Flt-1와 같은 VEGF 수용체 단백질과 실질적으로 동일하거나 기능적으로 등가인 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 이러한 DNA 서열은 VEGF 수용체 서열에도 하이브리드화할 수 있는 서열도 마찬가지로 포함한다. 바람직하게는, VEGF 수용체 단백질 DNA의 기능적으로 등가인 상동체는 상기한 VEGF 수용체 단백질을 암호화하는 DNA와 약 80% 이상의 상동성을 공유한다.

본 발명에 따라 사용할 수 있는 변경된 DNA 서열은 동일하거나 기능적으로 등가인 유전자 산물을 암호화하는 서열을 유도하는 상이한 뉴클레오타이드 잔기의 결실, 첨가 또는 치환을 포함한다. 유전자 산물은 그 자체로, 침묵 변화(silent change)를 초래하여 기능적으로 등가인 VEGF 수용체 단백질을 생성시키는, VEGF 수용체 서열내의 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환을 함유할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 관여하는 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성 성질에서의 유사성을 기본으로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되며, 양전하 아미노산으로는 라이신 및 아르기닌이 포함되고, 유사한 친수성 값을 갖는 비하전된 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산으로는 류신, 이소류신, 발린; 글리신, 알라닌; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 페닐알라닌, 티로신이 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 기능적으로 등가인 VEGF 수용체는 VEGF 또는 이의 단편에 결합하지만, 반드시 이의 대응되는 천연 KDR, Flk-1 또는 Flt-1와 반드시 동일한 결합 친화도를 갖지는 않는 수용체를 의미한다.

본 발명의 DNA 서열은 유전자 산물의 처리 및 발현을 변형시키는 변경을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 목적을 위해 VEGF 수용체 암호화 서열이 변되도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 당해 분야에 익히 공지된 기술, 예를 들어, 부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여 돌연변이를 도입시킴으로써 새로운 제한 부위를 삽입시켜 글리코실화 패턴, 인산화 등을 변경시킬 수 있다.

마우스 Flk-1(서열번호 6)은 사람 KDR(서열번호 2)와 약 85%의 상동성을 공유하며 마우스 생리에서 사람에서의 KDR의 역활과 유사한 역활을 한다. 사실상, VEGFR-2는 흔히 KDR/Flk-1로서 언급되며, 이는 두 VEGF 수용체 상동체 간의 밀접한 유사성을 반영한다. 이러한 이유로 인해, Flk-1를 암호화하는 본 발명의 DNA 백신(예: 서열번호 5의 DNA)으로 마우스를 처리하는 것이 KDR을 암호화하는 사람 DNA 백신용으로 적합한 모델로서 선택되었다.

다음 실시예는 본 발명의 특징 및 양태를 추가로 설명하며 이를 제한하는 것으로 의미되지 않는다.

재료, 방법 및 실시예

재료: C57/BL/6J 및 Balb/C 마우스를 스크립스 리서치 인스티튜트의 사육 시설로부터 입수하였다. 평가용으로 사용된 쥐 종양 세포주는 흑색종 세포주 B16 및 결장 암종 세포주 CT26을 포함하고, 이는 모두 피들러 박사(I. J. Fidler, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX)로부터 입수하였다. 쥐 루이스 폐 암 세포주 D121은 리 아이젠바흐 박사(Lea Eisenbach, Weizmann Institute, Rehovot, Israel)로부터 입수하였다. Flk-1을 암호화하는 DNA는 친절하게도 레미슈카 박사(Lemischka, Princeton University, Princeton, NJ)가 제공하였으며, 이를 제한 부위 KpnI 및 Xbal을 사용하여 pcDNA3.1 진핵 발현 벡터(공급원: Invitrogen, Huntsville, Alababa)내로 클로닝시켰다. 살모넬라 티피무리움의 약독화된 균주는 스토커(B.A.D., Stocker, Stanford University, Stanford, CA)에 의해 공급되었다. 항체는 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences, 마이애미주 베드포드 소재)로부터 입수하였다. T-STIM 배양 보충물은 BD 바이오사이언시즈(마이애미주 베드포드 소재)로부터 입수하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 R-피코에리트린(PE)는 말레큘라 프로브(Molecular Probes, 오레곤주 유진 소재)로부터 입수하였다. FITC-표지된 및 PE-표지된 항체를 제조업자의 권장 프로토콜에 따라서 제조하였다.

실시예 1: Flk-1을 암호화하는 DNA 백신의 제조

Flk-1 DNA(서열번호 5, pDNA 약 10pg 내지 약 0.1㎍)를 함유하는 pcDNA3.1 벡터를 제조업자의 권장 과정에 따라서 2.5kV, 25μF 및 200Ω에서 Bio-Rad Pulser를 사용하여 갓 제조된 약독화된 살모넬라 티피무리움내로 전기천공시켰다. 상기 벡터를 함유하는 살모넬라는 암피실린 함유 플레이트에서 선택하였다. 다음날 콜로니를 선별하여 암피실린이 첨가된 LB 브로쓰(제조원: EM Science, Gibbstown, NJ)에서 밤새 배양하였다. 세균을 분리하고 포스페이트 완충된 식염수(PBS)로 세척하였다. 이어서, 세척된 세균을 PBS ㎖당 재조합 살모넬라 약 1×10⁹개의 농도로 PBS 배지속에 현탁시켜 이후에 사용하기 위한 백신 용액을 형성시켰다. 백신을 사용할 때까지 밀봉된 앰풀에서 저장하였다. pcDNA3.1 벡터로만 형질감염된 살모넬라로 이루어진 "대조군 백신"(Flk-1 DNA를 함유하지 않음)을 동일한 과정에 따라서 또한 제조하였다. 플라스미드 DNA를 살모넬라를 형질전환시키기 전에 약 -80℃에서 저장하였다.

실시예 2: Flk-1을 암호화하는 DNA 백신을 이용한 마우스의 백신접종

Balb/C 마우스(처리군당 약 6마리의 마우스)를 경구 위관영양에 의해 실시예 1의 DNA 백신(PBS 약 100㎕ 중의 약 1×10⁸개 재조합 살모넬라)으로 2주의 간격으로 3회 백신접종시켰다. 또 다른 마우스 그룹을 본 발명의 백신으로 백신접종된 마우스와 동일한 스케쥴에 따라서 대조군 백신(공 벡터를 함유하는 약독화된 살모넬라로 이루어짐)으로 백신접종시켰다.

실시예 3: 백신접종된 마우스의 종양 내성의 평가

제3 백신접종한지 약 2주 후에, 실시예 2의 Balb/C 마우스(처리군당 약 6마리의 마우스)를 약 1×10⁵개 B16 흑색종 세포(피하 투여), 약 1×10⁵개 D121 루이스 폐 암종 세포(피하 투여) 또는 약 7.5×10⁴개 CT26 결장 암종 세포(근육내 투여)로 챌린지시켰다. 피하 루이스 폐 종양을 약 2주 동안 성장시켜 자발적으로 폐로 전이시킨 후에 수술로 제거하였다. 피하 종양 성장을 격일로 2차원적으로 측정하였으며 종양 용적은 다음 식에 따라서 각 종양에 대해 계산하였다: 용적= (넓이²)(길이/2). D121의 폐로의 자발적 전이의 양을 피하 1차 종양을 제거한지 약 30일 후에 평가하였다. 마우스를 치사시키고 부검하고, 폐의 종양 존재량을 종양으로 덮인 폐 표면의 백분율에 따라 평가하고, 종양이 없음에 대해서는 "0"으로, 약 20% 미만의 종양 확산범위에 대해서는 "1"로, 약 20 내지 약 30%의 종양 확산범위에 대해서는 "2"로, 약 50%를 초과하는 종양 확산범위에 대해서는 "3"으로 스코어를 매겼다. 도 7은 D121 루이스 폐 암종 세포로 챌린지된 3마리의 마우스로부터의 폐의 사진을 도시한 것이다. 하단의 폐는 1로서 스코어가 매겨진 반면에, 종양으로 덮인 폐 표면의 비율이 큰 상단의 2개의 폐는 3으로 스코어를 매겼다. 평가하기 30일 전에 사망한 동물은 "+" 스코어로 기재하였다.

상기 평가의 결과는 표 1 내지 4 및 도 8 내지 10에 제공되며 하기에서 상세히 논의된다.

D121 루이스 폐 암종 세포로 챌린지된 Balb/C 마우스에서 종양 전이

마우스 백신처리군	전이성 스코어
대조군-형질감염되지 않은 살모넬라로 백신접종	3,3,3,3,+,+
대조군- 대조군 백신(공 벡터를 함유함)으로 백신접종	3,3,3,3,+,+
실시예 1의 DNA 백신(Flk-1을 함유함)에 의한 백신접종	0,0,1,1,1,2,2

CT-26 결장 암종 세포를 정맥내 주사하여 챌린지시킨 Balb/C 마우스를 약 63일(7주) 기간에 걸쳐 사망율에 대해 평가하였다. 사망율 정보는 하기 표 2에 제시하며 도 8에서 그래프로서 도시한다.

도 8에서, 실시예 1의 본 발명의 백신으로 처리된 마우스의 생존율(%)은 100%의 생존율에서 굵은 실선으로 표시되어 있다. C26 세포로 챌린지된 비감작 마우스(백신처리하지 않음)의 생존율(%)은 가는 실선으로 표시되어 있으며, 대조군 백신(Flk-1 DNA를 함유하지 않음)으로 처리된 마우스의 생존율(%)은 점선으로 표시되어 있다.

실시예 1의 백신으로 면역화되고 CT26 암종으로 챌린지된 Balb/C 마우스에서 사망율의 억제

처리	30일째의 생존율(%)	36일째의 생존율(%)	63일째의 생존율(%)
대조군, 백신 처리하지 않음	50	0	0
대조군 백신	33	0	0
실시예 1의 백신	100	100	100

D121로 챌린지된 Balb/C 마우스에서 1차(피하) 종양 성장의 억제는 챌린지 후 14일째에 1차 종양 용적을 측정하여 평가하였다. 결과는 하기 표 3에 제시하며 도 9에 그래프로서 도시한다.

도 9에서, "PBS"로 표지된 첫번째 막대는 백신접종되지 않은 마우스(비감작 마우스)를 나타내며, "공 벡터"로 표지된 중간 막대는 대조군 백신으로 처리된 마우스를 나타내며, "pcDNA3.1-FLK1"로 표지된 세번째 막대는 실시예 1의 본 발명의 백신으로 면역화된 마우스를 나타낸다.

실시예 1의 백신으로 면역화된 Balb/C 마우스에서 피하 D121 암종 종양의 억제

처리	종양 용적(mm3)	표준 편차
대조군, 백신처리하지 않음	665	227
대조군 백신	641	157
실시예 1의 백신	183	35

피하 B16 흑색종 종양 성장의 억제는 종양 챌린지 후 약 17일의 기간에 걸쳐서 피하 종양 용적을 모니터링함으로써 평가하였다. 결과는 표 4에 제시하며 하기 도 10에 그래프로서 도시한다. 도 10에서, (●)로 나타낸 평균 종양 용적 데이터는 실시예 1의 본 발명의 백신으로 면역화된 마우스를 의미하며, (○)로 나타낸 데이터는 대조군 백신으로 처리된 마우스를 나타낸다.

실시예 1의 백신으로 면역화된 Balb/C 마우스에서 피하 B16 흑색종 종양의 억제

	종양 용적(mm3)
처리	0일째	9일째	14일째	17일째
대조군 백신	0	907	1273	4213
실시예 1의 백신	0	447	462	1063
종양 억제율(%)	-	51%	64%	75%

실시예 4: 백신접종된 마우스로부터의 비장세포(CD8+ T 세포)에서 CD25, CD69 및 CD2 활성화 마커의 상향조절

C5/7BL/6J 마우스(처리군당 약 4마리의 마우스)를 실시예 1의 DNA 백신 및 실시예 2에 기재한 대조군 백신(Flk-1을 함유하지 않음)으로 백신접종하였다. 세번째 백신접종한지 약 6주 후에 면역화된 마우스 및 대조군 마우스 그룹으로부터 비장세포를 분리하였다. 상기 비장세포를 Flk-1을 발현하도록 형질도입된 B16 흑색종 세포주 및 형질전환되지 않은 B16 세포와 함께, T-STIM 배양 보충물(카탈로그 번호 제354115호, BD Biosciences, Bedford MA) 약 4용적%를 함유하는 T 세포 배지(배양물당 약 5mL)에서 배양하였다. 이어서, 세포를 CD25, CD69 및 CD2의 FITC-접합된 CD8+ 항체 및 PE-접합된 항체로 염색하였다. 세포 현탁액을 벡톤 디켄슨 FAC 스캔(Becton Dickenson FAC scan)을 사용하여 평가함으로써 각 비장세포/B16 흑색종 세포 조합체에 대한 CD25 및 CD69에 대해 양성인 CD8+T 세포의 백분율을 측정하였다. 결과는 표 5에 제시하며 도 11에 그래프로서 도시한다.

백신접종된 마우스로부터의 비장세포에서 CD25, CD69 및 CD2 활성화 마커의 상향조절

처리	% CD25 양성	% CD69 양성	CD2 양성 평균 형광
대조군 백신+B16-Flk-1 세포	9	18	570mfu
DNA 백신+B16 세포	12	29	550mfu
DNA 백신+B16-Flk-1 세포	21	35	700mfu
mfu: 평균 형광 단위

표 1 내지 5 및 도 8 내지 11에 제시된 결과는 KDR의 쥐 유사체인 Flk-1을 암호화하는 DNA를 포함하는 실시예 1의 DNA 백신이 다양한 종양 형성 암 세포로부터 마우스를 효과적으로 면역화시킬 수 있음을 입증한다. 이론으로 국한시키고자 하는 것은 아니나, 백신은 종양에서의 혈관신생을 억제함으로써, 즉 새로운 혈관 형성을 차단하고 종양을 효과적으로 아사시킴으로써 작용하는 것으로 사료된다.

표 1의 데이터는 실시예 1의 본 발명의 백신이 D121 루이스 폐 암종으로 챌린지된 마우스의 폐로의 종양 전이의 억제를 유도함을 입증한다. 실시예 1의 백신으로 면역화된 어떠한 마우스도 사망하지 않았으며, 모두 폐상에 약 50% 미만의 종양 확산범위를 나타냈다(2마리는 20% 미만을 나타냈다). 대조적으로, 각 대조군 중 2마리의 마우스는 사망하였으며, 나머지 마우스는 모두 폐상에 약 50%를 초과하는 종양 확산범위를 나타냈다.

실시예 1의 본 발명의 백신은 표 2 및 도 8의 데이터로 입증되는 바와 같이, CT-26 결장 암종 세포로 정맥내 챌린지된 Balb-C 마우스의 사망율도 현저하게 감소 시켰다. 실시예 1의 백신으로 면역화된 모든 마우스는 챌린지 후 전체 63일의 관찰 기간 동안 생존하였다. 그러나, 대조군에서, 모든 마우스는 챌린지 후 36일째까지 사망하였다.

표 3 및 도 9의 데이타로 입증되는 바와 같이, 피하 D121 루이스 폐 암종 종양 성장은 실시예 1의 본 발명의 백신에 의한 면역화에 의해서, 백신으로 처리하지 않았거나 대조군 백신으로 처리한 대조군 마우스 그룹에 비해서 약 4.3 내지 약 4.5의 인수만큼 억제되었다.

유사하게, 표 4 및 도 10에 도시한 바와 같이, 피하 B16 흑색종 종양 성장은 대조군에서의 종양 성장에 비해서 실시예 1의 본 발명의 백신으로 면역화된 마우스에서 약 4의 인수만큼 억제되었다.

표 5 및 도 11의 데이터는 실시예 1의 DNA 백신으로 백신접종된 C57/BL/6J 마우스로부터 분리된 비장세포가 Flk-1 항원을 제시하도록 형질전환된 B16 흑색종 세포와 함께 배양하는 경우에 대조군 마우스에 비해서 CD2, CD25 및 CD69 활성화 마커의 상향조절을 나타냄을 제시한다.

상기한 양태의 수많은 변화 및 변형이 본 발명의 신규한 특징의 취지 및 범주에서 벗어남이 없이 이루어질 수 있다. 본원에서 설명하는 구체적 양태로의 제한이 의도되거나 추측되지 않아야 함이 이해될 것이다. 물론, 모든 이러한 변형이 첨부된 청구의 범위의 범주내에 있는 바와 같이 청구의 범위에 의해 포함된다.

<110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE <120> DNA vaccine against proliferating endothelia cells and methods of use thereof <130> 5-1998-061838-8 <150> US 10/090,183 <151> 2002-03-02 <160> 6 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 4071 <212> DNA <213> human <400> 1 atggagagca aggtgctgct ggccgtcgcc ctgtggctct gcgtggagac ccgggccgcc 60 tctgtgggtt tgcctagtgt ttctcttgat ctgcccaggc tcagcataca aaaagacata 120 cttacaatta aggctaatac aactcttcaa attacttgca ggggacagag ggacttggac 180 tggctttggc ccaataatca gagtggcagt gagcaaaggg tggaggtgac tgagtgcagc 240 gatggcctct tctgtaagac actcacaatt ccaaaagtga tcggaaatga cactggagcc 300 tacaagtgct tctaccggga aactgacttg gcctcggtca tttatgtcta tgttcaagat 360 tacagatctc catttattgc ttctgttagt gaccaacatg gagtcgtgta cattactgag 420 aacaaaaaca aaactgtggt gattccatgt ctcgggtcca tttcaaatct caacgtgtca 480 ctttgtgcaa gatacccaga aaagagattt gttcctgatg gtaacagaat ttcctgggac 540 agcaagaagg gctttactat tcccagctac atgatcagct atgctggcat ggtcttctgt 600 gaagcaaaaa ttaatgatga aagttaccag tctattatgt 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Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp Ser Arg 515 520 525 Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val Gly Thr Val 530 535 540 Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn Gly Phe His 545 550 555 560 Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser 565 570 575 Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp Ile Leu Leu 580 585 590 Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser Ile Ser Lys Gln Lys 595 600 605 Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met 610 615 620 Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn 625 630 635 640 Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys Glu Ile Thr Ile Arg 645 650 655 Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Val 660 665 670 Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Val Pro 675 680 685 Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile Gln Gln Glu 690 695 700 Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg 705 710 715 720 Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln 725 730 735 Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser 740 745 750 Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr Cys Thr Cys Val Ala 755 760 765 Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Phe Ile Arg Lys Met Lys 770 775 780 Arg Ser Ser Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr Leu Ser Ile Ile Met Asp 785 790 795 800 Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp 805 810 815 Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser 820 825 830 Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Gln Ala Ser Ala Phe Gly 835 840 845 Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys 850 855 860 Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys 865 870 875 880 Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly 885 890 895 Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Tyr Cys 900 905 910 Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe 915 920 925 Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys 930 935 940 Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Val 945 950 955 960 Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gln Glu Asp Lys Ser 965 970 975 Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu 980 985 990 Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg 995 1000 1005 Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala 1010 1015 1020 Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys Ile Cys Asp 1025 1030 1035 1040 Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr Val Arg Lys 1045 1050 1055 Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe 1060 1065 1070 Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Leu 1075 1080 1085 Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gln 1090 1095 1100 Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu Arg Glu Gly Met Arg Met Arg 1105 1110 1115 1120 Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu Ile Tyr Gln Ile Met Leu Asp Cys 1125 1130 1135 Trp His Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu 1140 1145 1150 Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gln Ala Asn Val Gln Gln Asp Gly Lys Asp 1155 1160 1165 Tyr Ile Pro Ile Asn Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr 1170 1175 1180 Ser Thr Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala 1185 1190 1195 1200 Pro Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala 1205 1210 1215 Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu 1220 1225 1230 Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gln Gly Asp Ser Ser Thr 1235 1240 1245 Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser Lys 1250 1255 1260 Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys Ser Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys His Ser Ser 1285 1290 1295 Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr Tyr Asp His Ala 1300 1305 1310 Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro Pro Pro Asp Tyr Asn 1315 1320 1325 Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile 1330 1335 <210> 5 <211> 5390 <212> DNA <213> mouse <400> 5 ctgtgtcccg cagccggata acctggctga cccgattccg cggacaccgc tgcagccgcg 60 gctggagcca gggcgccggt gccccgcgct ctccccggtc ttgcgctgcg ggggccatac 120 cgcctctgtg acttctttgc gggccaggga cggagaagga gtctgtgcct gagaaactgg 180 gctctgtgcc caggcgcgag gtgcaggatg gagagcaagg cgctgctagc tgtcgctctg 240 tggttctgcg tggagacccg agccgcctct gtgggtttga ctggcgattt tctccatccc 300 cccaagctca gcacacagaa agacatactg acaattttgg caaatacaac ccttcagatt 360 acttgcaggg gacagcggga cctggactgg ctttggccca atgctcagcg tgattctgag 420 gaaagggtat tggtgactga atgcggcggt ggtgacagta tcttctgcaa aacactcacc 480 attcccaggg tggttggaaa tgatactgga gcctacaagt gctcgtaccg ggacgtcgac 540 atagcctcca ctgtttatgt ctatgttcga gattacagat caccattcat cgcctctgtc 600 agtgaccagc atggcatcgt gtacatcacc gagaacaaga acaaaactgt ggtgatcccc 660 tgccgagggt cgatttcaaa cctcaatgtg tctctttgcg ctaggtatcc agaaaagaga 720 tttgttccgg atggaaacag aatttcctgg gacagcgaga taggctttac tctccccagt 780 tacatgatca gctatgccgg catggtcttc tgtgaggcaa agatcaatga tgaaacctat 840 cagtctatca tgtacatagt tgtggttgta ggatatagga tttatgatgt gattctgagc 900 cccccgcatg aaattgagct atctgccgga gaaaaacttg tcttaaattg tacagcgaga 960 acagagctca atgtggggct tgatttcacc tggcactctc caccttcaaa gtctcatcat 1020 aagaagattg taaaccggga tgtgaaaccc tttcctggga ctgtggcgaa gatgtttttg 1080 agcaccttga caatagaaag tgtgaccaag agtgaccaag gggaatacac ctgtgtagcg 1140 tccagtggac ggatgatcaa gagaaataga acatttgtcc gagttcacac aaagcctttt 1200 attgctttcg gtagtgggat gaaatctttg gtggaagcca cagtgggcag tcaagtccga 1260 atccctgtga agtatctcag ttacccagct cctgatatca aatggtacag aaatggaagg 1320 cccattgagt ccaactacac aatgattgtt ggcgatgaac tcaccatcat ggaagtgact 1380 gaaagagatg caggaaacta cacggtcatc ctcaccaacc ccatttcaat ggagaaacag 1440 agccacatgg tctctctggt tgtgaatgtc ccaccccaga tcggtgagaa agccttgatc 1500 tcgcctatgg attcctacca gtatgggacc atgcagacat tgacatgcac agtctacgcc 1560 aaccctcccc tgcaccacat ccagtggtac tggcagctag aagaagcctg ctcctacaga 1620 cccggccaaa caagcccgta tgcttgtaaa gaatggagac acgtggagga tttccagggg 1680 ggaaacaaga tcgaagtcac caaaaaccaa tatgccctga ttgaaggaaa aaacaaaact 1740 gtaagtacgc tggtcatcca agctgccaac gtgtcagcgt tgtacaaatg tgaagccatc 1800 aacaaagcgg gacgaggaga gagggtcatc tccttccatg tgatcagggg tcctgaaatt 1860 actgtgcaac ctgctgccca gccaactgag caggagagtg tgtccctgtt gtgcactgca 1920 gacagaaata cgtttgagaa cctcacgtgg tacaagcttg gctcacaggc aacatcggtc 1980 cacatgggcg aatcactcac accagtttgc aagaacttgg atgctctttg gaaactgaat 2040 ggcaccatgt tttctaacag cacaaatgac atcttgattg tggcatttca gaatgcctct 2100 ctgcaggacc aaggcgacta tgtttgctct gctcaagata agaagaccaa gaaaagacat 2160 tgcctggtca aacagctcat catcctagag cgcatggcac ccatgatcac cggaaatctg 2220 gagaatcaga caacaaccat tggcgagacc attgaagtga cttgcccagc atctggaaat 2280 cctaccccac acattacatg gttcaaagac aacgagaccc tggtagaaga ttcaggcatt 2340 gtactgagag atgggaaccg gaacctgact atccgcaggg tgaggaagga ggatggaggc 2400 ctctacacct gccaggcctg caatgtcctt ggctgtgcaa gagcggagac gctcttcata 2460 atagaaggtg cccaggaaaa gaccaacttg gaagtcatta tcctcgtcgg cactgcagtg 2520 attgccatgt tcttctggct ccttcttgtc attgtcctac ggaccgttaa gcgggccaat 2580 gaaggggaac tgaagacagg ctacttgtct attgtcatgg atccagatga attgcccttg 2640 gatgagcgct gtgaacgctt gccttatgat gccagcaagt gggaattccc cagggaccgg 2700 ctgaaactag gaaaacctct tggccgcggt gccttcggcc aagtgattga ggcagacgct 2760 tttggaattg acaagacagc gacttgcaaa acagtagccg tcaagatgtt gaaagaagga 2820 gcaacacaca gcgagcatcg agccctcatg tctgaactca agatcctcat ccacattggt 2880 caccatctca atgtggtgaa cctcctaggc gcctgcacca agccgggagg gcctctcatg 2940 gtgattgtgg aattctgcaa gtttggaaac ctatcaactt acttacgggg caagagaaat 3000 gaatttgttc cctataagag caaaggggca cgcttccgcc agggcaagga ctacgttggg 3060 gagctctccg tggatctgaa aagacgcttg gacagcatca ccagcagcca gagctctgcc 3120 agctcaggct ttgttgagga gaaatcgctc agtgatgtag aggaagaaga agcttctgaa 3180 gaactgtaca aggacttcct gaccttggag catctcatct gttacagctt ccaagtggct 3240 aagggcatgg agttcttggc atcaaggaag tgtatccaca gggacctggc agcacgaaac 3300 attctcctat cggagaagaa tgtggttaag atctgtgact tcggcttggc ccgggacatt 3360 tataaagacc cggattatgt cagaaaagga gatgcccgac tccctttgaa gtggatggcc 3420 ccggaaacca tttttgacag agtatacaca attcagagcg atgtgtggtc tttcggtgtg 3480 ttgctctggg aaatattttc cttaggtgcc tccccatacc ctggggtcaa gattgatgaa 3540 gaattttgta ggagattgaa agaaggaact agaatgcggg ctcctgacta cactacccca 3600 gaaatgtacc agaccatgct ggactgctgg catgaggacc ccaaccagag accctcgttt 3660 tcagagttgg tggagcattt gggaaacctc ctgcaagcaa atgcgcagca ggatggcaaa 3720 gactatattg ttcttccaat gtcagagaca ctgagcatgg aagaggattc tggactctcc 3780 ctgcctacct cacctgtttc ctgtatggag gaagaggaag tgtgcgaccc caaattccat 3840 tatgacaaca cagcaggaat cagtcattat ctccagaaca gtaagcgaaa gagccggcca 3900 gtgagtgtaa aaacatttga agatatccca ttggaggaac cagaagtaaa agtgatccca 3960 gatgacagcc agacagacag tgggatggtc cttgcatcag aagagctgaa aactctggaa 4020 gacaggaaca aattatctcc atcttttggt ggaatgatgc ccagtaaaag cagggagtct 4080 gtggcctcgg aaggctccaa ccagaccagt ggctaccagt ctgggtatca ctcagatgac 4140 acagacacca ccgtgtactc cagcgacgag gcaggacttt taaagatggt ggatgctgca 4200 gttcacgctg actcagggac cacactgcgc tcacctcctg tttaaatgga agtggtcctg 4260 tcccggctcc gcccccaact cctggaaatc acgagagagg tgctgcttag attttcaagt 4320 gttgttcttt ccaccacccg gaagtagcca catttgattt tcatttttgg aggagggacc 4380 tcagactgca aggagcttgt cctcagggca tttccagaga agatgcccat gacccaagaa 4440 tgtgttgact ctactctctt ttccattcat ttaaaagtcc tatataatgt gccctgctgt 4500 ggtctcacta ccagttaaag caaaagactt tcaaacacgt ggactctgtc ctccaagaag 4560 tggcaacggc acctctgtga aactggatcg aatgggcaat gctttgtgtg ttgaggatgg 4620 gtgagatgtc ccagggccga gtctgtctac cttggaggct ttgtggagga tgcggctatg 4680 agccaagtgt taagtgtggg atgtggactg ggaggaagga aggcgcaagt cgctcggaga 4740 gcggttggag cctgcagatg cattgtgctg gctctggtgg aggtgggctt gtggcctgtc 4800 aggaaacgca aaggcggccg gcagggtttg gttttggaag gtttgcgtgc tcttcacagt 4860 cgggttacag gcgagttccc tgtggcgttt cctactccta atgagagttc cttccggact 4920 cttacgtgtc tcctggcctg gccccaggaa ggaaatgatg cagcttgctc cttcctcatc 4980 tctcaggctg tgccttaatt cagaacacca aaagagagga acgtcggcag aggctcctga 5040 cggggccgaa gaattgtgag aacagaacag aaactcaggg tttctgctgg gtggagaccc 5100 acgtggcgcc ctggtggcag gtctgagggt tctctgtcaa gtggcggtaa aggctcaggc 5160 tggtgttctt cctctatctc cactcctgtc aggcccccaa gtcctcagta ttttagcttt 5220 gtggcttcct gatggcagaa aaatcttaat tggttggttt gctctccaga taatcactag 5280 ccagatttcg aaattacttt ttagccgagg ttatgataac atctactgta tcctttagaa 5340 ttttaaccta taaaactatg tctactggtt tctgcctgtg tgcttatgtt 5390 <210> 6 <211> 1345 <212> PRT <213> mouse <400> 6 Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Phe Cys Val Glu 1 5 10 15 Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Thr Gly Asp Phe Leu His Pro Pro 20 25 30 Lys Leu Ser Thr Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Leu Ala Asn Thr Thr 35 40 45 Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro 50 55 60 Asn Ala Gln Arg Asp Ser Glu Glu Arg Val Leu Val Thr Glu Cys Gly 65 70 75 80 Gly Gly Asp Ser Ile Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Arg Val Val 85 90 95 Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Ser Tyr Arg Asp Val Asp Ile 100 105 110 Ala Ser Thr Val Tyr Val Tyr Val Arg Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile 115 120 125 Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Ile Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys 130 135 140 Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Arg Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn 145 150 155 160 Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly 165 170 175 Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Glu Ile Gly Phe Thr Leu Pro Ser Tyr 180 185 190 Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp 195 200 205 Glu Thr Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg 210 215 220 Ile Tyr Asp Val Ile Leu Ser Pro Pro His Glu Ile Glu Leu Ser Ala 225 230 235 240 Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val 245 250 255 Gly Leu Asp Phe Thr Trp His Ser Pro Pro Ser Lys Ser His His Lys 260 265 270 Lys Ile Val Asn Arg Asp Val Lys Pro Phe Pro Gly Thr Val Ala Lys 275 280 285 Met Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Glu Ser Val Thr Lys Ser Asp Gln 290 295 300 Gly Glu Tyr Thr Cys Val Ala Ser Ser Gly Arg Met Ile Lys Arg Asn 305 310 315 320 Arg Thr Phe Val Arg Val His Thr Lys Pro Phe Ile Ala Phe Gly Ser 325 330 335 Gly Met Lys Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Ser Gln Val Arg Ile 340 345 350 Pro Val Lys Tyr Leu Ser Tyr Pro Ala Pro Asp Ile Lys Trp Tyr Arg 355 360 365 Asn Gly Arg Pro Ile Glu Ser Asn Tyr Thr Met Ile Val Gly Asp Glu 370 375 380 Leu Thr Ile Met Glu Val Thr Glu Arg Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Val 385 390 395 400 Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Met Glu Lys Gln Ser His Met Val Ser 405 410 415 Leu Val Val Asn Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ala Leu Ile Ser 420 425 430 Pro Met Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Met Gln Thr Leu Thr Cys Thr 435 440 445 Val Tyr Ala Asn Pro Pro Leu His His Ile Gln Trp Tyr Trp Gln Leu 450 455 460 Glu Glu Ala Cys Ser Tyr Arg Pro Gly Gln Thr Ser Pro Tyr Ala Cys 465 470 475 480 Lys Glu Trp Arg His Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys Ile Glu 485 490 495 Val Thr Lys Asn Gln Tyr Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val 500 505 510 Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr Lys Cys 515 520 525 Glu Ala Ile Asn Lys Ala Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser Phe His 530 535 540 Val Ile Arg Gly Pro Glu Ile Thr Val Gln Pro Ala Ala Gln Pro Thr 545 550 555 560 Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Leu Cys Thr Ala Asp Arg Asn Thr Phe 565 570 575 Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Ser Gln Ala Thr Ser Val His 580 585 590 Met Gly Glu Ser Leu Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Ala Leu Trp 595 600 605 Lys Leu Asn Gly Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile Leu Ile 610 615 620 Val Ala Phe Gln Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr Val Cys 625 630 635 640 Ser Ala Gln Asp Lys Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Leu Val Lys Gln 645 650 655 Leu Ile Ile Leu Glu Arg Met Ala Pro Met Ile Thr Gly Asn Leu Glu 660 665 670 Asn Gln Thr Thr Thr Ile Gly Glu Thr Ile Glu Val Thr Cys Pro Ala 675 680 685 Ser Gly Asn Pro Thr Pro His Ile Thr Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr 690 695 700 Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Arg Asp Gly Asn Arg Asn Leu 705 710 715 720 Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Cys Gln 725 730 735 Ala Cys Asn Val Leu Gly Cys Ala Arg Ala Glu Thr Leu Phe Ile Ile 740 745 750 Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Val Ile Ile Leu Val Gly 755 760 765 Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile Val Leu 770 775 780 Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Glu Gly Glu Leu Lys Thr Gly Tyr Leu 785 790 795 800 Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu Arg Cys Glu 805 810 815 Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu 820 825 830 Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val Ile Glu 835 840 845 Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Lys Thr Val Ala 850 855 860 Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala Leu 865 870 875 880 Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu Asn Val 885 890 895 Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met Val 900 905 910 Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg Gly 915 920 925 Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Ser Lys Gly Ala Arg Phe Arg 930 935 940 Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Glu Leu Ser Val Asp Leu Lys Arg Arg 945 950 955 960 Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe Val 965 970 975 Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Ser Glu Glu 980 985 990 Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr Ser Phe 995 1000 1005 Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His 1010 1015 1020 Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val Val 1025 1030 1035 1040 Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp 1045 1050 1055 Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro 1060 1065 1070 Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser 1075 1080 1085 Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr 1090 1095 1100 Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly 1105 1110 1115 1120 Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr 1125 1130 1135 Met Leu Asp Cys Trp His Glu Asp Pro Asn Gln Arg Pro Ser Phe Ser 1140 1145 1150 Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln 1155 1160 1165 Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Met Ser Glu Thr Leu Ser Met 1170 1175 1180 Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met 1185 1190 1195 1200 Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala 1205 1210 1215 Gly Ile Ser His Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro Val 1220 1225 1230 Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu Val Lys 1235 1240 1245 Val Ile Pro Asp Asp Ser Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu Ala Ser 1250 1255 1260 Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Asn Lys Leu Ser Pro Ser Phe 1265 1270 1275 1280 Gly Gly Met Met Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser Glu Gly 1285 1290 1295 Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp Asp Thr 1300 1305 1310 Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Asp Glu Ala Gly Leu Leu Lys Met Val 1315 1320 1325 Asp Ala Ala Val His Ala Asp Ser Gly Thr Thr Leu Arg Ser Pro Pro 1330 1335 1340 Val 1345

Claims (32)

1. 약제학적으로 허용되는 담체 중에 VEGF 수용체 단백질을 작동적으로 암호화하는 DNA 작제물을 포함하고, 당해 DNA 작제물이 약독화된 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 벡터에 작동적으로 통합되어 있는 항-종양 DNA 백신.
2. 제1항에 있어서, VEGF 수용체 단백질이 VEGF-2 수용체 단백질인 DNA 백신.
3. 제1항에 있어서, VEGF 수용체 단백질이 서열번호 2의 서열을 갖는 VEGFR-2, 서열번호 4의 서열을 갖는 VEGFR-1 및 서열번호 6의 서열을 갖는 Flk-1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 DNA 백신.
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9. 제1항에 있어서, DNA 작제물이 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 정제된 DNA인 DNA 백신.
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32. 제1항에 따른 백신을 확인시키는 인쇄물을 보유하고 당해 백신을 환자에게 개별 투여하는데 유용한 정보를 제공하는 라벨이 부착된 기밀 밀봉된 멸균 용기에 포장된 제1항에 따른 백신을 포함하는 제품.

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