ES2371870T3 - Vacuna de adn contra las células endoteliales proliferativas y métodos de utilización de la misma. - Google Patents
Vacuna de adn contra las células endoteliales proliferativas y métodos de utilización de la misma. Download PDFInfo
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Abstract
Vacuna de ADN eficaz para provocar una respuesta inmunitaria contra las células endoteliales proliferativas, que comprende un constructo de ADN que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que la proteína receptora de VEGF se selecciona de entre el grupo constituido por VEGFR-2 que presenta la secuencia de SEC ID nº: 2, Flk-1 que presenta la secuencia de SEC ID nº: 6, y un receptor que se une al VEGF o a los fragmentos del mismo y que tiene una secuencia que comparte por lo menos 80% de homología con la secuencia de SEC ID nº: 2 ó 6 y el constructo de ADN se incorpora de manera operativa en un vector de Salmonella typhimurium o Salmonella typhi atenuadas.
Description
Vacuna de ADN contra las células endoteliales proliferativas y métodos de utilización de la misma. .
Campo de la invención
La presente invención se refiere a vacunas de ácido desoxirribonucleico (ADN) que codifican moléculas adecuadas eficaces para provocar una respuesta inmunitaria contra las células endoteliales proliferativas. Más particularmente, la presente invención se refiere a vacunas de ADN que codifican el receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). La vacuna de ADN se puede utilizar para inhibir la proliferación de las células endoteliales vasculares, el crecimiento tumoral y la angiogénesis.
Antecedentes de la invención
Las vacunas se han utilizado para proporcionar una protección de larga duración contra una serie de enfermedades mediante la administración muy limitada de un agente profiláctico que estimula la destrucción de los patógenos de dicha enfermedad por parte del sistema inmunitario del organismo antes de que los mismos puedan proliferar y provocar un efecto patológico. En Bernard R. Glick y Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, 2ª edición, ASM Press, pág. 253-276 (1998), se describen diversos aspectos sobre las vacunas y la vacunación.
La vacunación es un medio para inducir al sistema inmunitario del propio cuerpo a buscar y destruir un agente infeccioso antes de que el mismo provoque una respuesta patológica. Por lo general, las vacunas consisten en agentes infecciosos (virus o bacterias) vivos, aunque atenuados, o en una forma muerta de los mismos. Una vacuna compuesta por una bacteria o un virus vivos debe ser necesariamente apatógena. Por lo general, un cultivo bacteriano o vírico se atenúa (debilita) mediante un tratamiento físico o químico. Aunque el agente ya no es virulento, todavía puede provocar una respuesta inmunitaria en el individuo tratado con la vacuna.
La respuesta inmunitaria es provocada por antígenos, ya sean macromoléculas específicas o un agente infeccioso. Normalmente, dichos antígenos son proteínas, polisacáridos, lípidos o glucolípidos que son reconocidos como “extraños” por los linfocitos conocidos como linfocitos B y linfocitos T. La exposición de estos dos tipos de linfocitos a un antígeno provoca una rápida respuesta de división y diferenciación celular, lo que da lugar a la formación de clones de los linfocitos sometidos a dicha exposición. Los linfocitos B producen células plasmáticas que, a su vez, producen proteínas llamadas anticuerpos (Ac) que se unen selectivamente a los antígenos presentes en el agente infeccioso, neutralizando o desactivando de este modo el patógeno (inmunidad humoral). En algunos casos, la respuesta de los linfocitos B requiere la ayuda de linfocitos T CD4 cooperadores.
El clon de linfocitos T especializados que se forma como respuesta a la exposición al antígeno es un linfocito T citotóxico (CTL) que puede unirse a los agentes patógenos y tejidos que presentan el antígeno y eliminarlos (inmunidad celular o mediada por células). En algunos casos, una célula presentadora de antígeno (APC), tal como una célula dendrítica, envuelve el patógeno u otra célula extraña por endocitosis. A continuación, dicha APC procesa los antígenos de las células y los presenta en forma de complejo molécula de histocompatibilidad-péptido al receptor de linfocitos T (TCR) de los CTL, lo que estimula una respuesta inmunitaria.
En general, la inmunidad humoral caracterizada por la formación de anticuerpos específicos es la más eficaz contra las infecciones bacterianas agudas y las infecciones víricas recurrentes, mientras que la inmunidad celular es la más efectiva contra las infecciones víricas, las infecciones crónicas por bacterias intracelulares y las infecciones por hongos. Es conocido asimismo que la inmunidad celular protege frente a algunos cánceres y es responsable del rechazo en trasplantes de órganos.
Los anticuerpos de los antígenos de infecciones previas se siguen detectando en la sangre durante períodos muy prolongados, proporcionando unos medios para determinar la exposición anterior a un patógeno. Tras la exposición repetida al mismo patógeno, el sistema inmunitario previene eficazmente la reinfección mediante la eliminación del agente patógeno antes de que pueda proliferar y producir una respuesta patógena.
A veces, la misma respuesta inmunitaria provocada por un agente patógeno se puede producir mediante un agente apatógeno que presenta el mismo antígeno que el patógeno. De este modo, el sujeto puede resultar protegido frente a la posterior exposición a dicho patógeno sin haber tenido que combatir previamente su infección.
Sin embargo, no todos los agentes infecciosos son fáciles de cultivar e inactivar, lo que resulta necesario para la formación de una vacuna. Las técnicas modernas de ADN recombinante han permitido la obtención de nuevas vacunas por manipulación genética con el objetivo de tratar de superar esta limitación. Se pueden crear agentes infecciosos que carecen de los genes patógenos, lo que permite disponer de una forma viva no virulenta del organismo para utilizarla como vacuna. También es posible manipular un organismo relativamente apatógeno, tal como E. coli, para que presente los antígenos de superficie celular de un portador patógeno. El sistema inmunitario del individuo tratado con un portador transformado de este tipo es “engañado” para que genere anticuerpos contra el
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patógeno. Las proteínas antigénicas de un agente patógeno se pueden manipular y expresar en una especie apatógena y también se pueden aislar y purificar para producir una “vacuna de subunidades”. Las vacunas de subunidades presentan la ventaja de ser estables, seguras y químicamente bien definidas; sin embargo, su producción puede tener un coste prohibitivo.
En los últimos años ha surgido un nuevo enfoque en el ámbito de las vacunas que se ha bautizado de forma genérica como “inmunización genética”. En dicho enfoque, se inserta de manera operativa un gen que codifica un antígeno de un agente patógeno en las células del individuo que se quiere inmunizar. Las células tratadas se transforman y producen las proteínas antigénicas del patógeno. A continuación, dichos antígenos producidos in vivo provocan la respuesta inmunitaria deseada en el huésped. El material genético utilizado en estas vacunas genéticas puede ser un constructo de ADN o de ARN. A menudo, el polinucleótido que codifica el antígeno se introduce junto con otras secuencias polinucleótidas promotoras a fin de favorecer la inserción, replicación o expresión del gen.
Las vacunas de ADN que codifican genes de antígenos se pueden introducir en las células huésped del individuo mediante diversos sistemas de expresión. Los mismos comprenden sistemas de expresión procarióticos, de mamíferos y de levaduras. Por ejemplo, un enfoque consiste en utilizar un vector vírico, tal como un virus vaccinia que incorpora el nuevo material genético, para inocular dicho material en las células huésped. Alternativamente, el material genético se puede incorporar en un vector o se puede administrar directamente a las células huésped como un polinucleótido “desnudo”, es decir, simplemente como ADN purificado. Además, el ADN se puede transfectar de manera estable en bacterias atenuadas, tales como la Salmonella typhimurium. Cuando un paciente se vacuna por vía oral con la Salmonella transformada, las bacterias son transportadas a las placas de Peyer del intestino (es decir, a tejidos linfoides secundarios), que estimulan a continuación una respuesta inmunitaria.
Las vacunas de ADN ofrecen una oportunidad de inmunización frente a estados patológicos no causados por patógenos tradicionales, tales como las enfermedades genéticas y el cáncer. Por lo general, en una vacuna genética contra el cáncer se deben aislar antígenos de un tipo específico de células tumorales y a continuación introducirlos en la vacuna. Así, una vacuna general eficaz contra una serie de cánceres puede implicar el desarrollo de numerosas vacunas individuales para cada tipo de célula cancerosa frente al cual se pretende inmunizar al individuo.
Un enfoque general en el tratamiento de tumores consiste en la administración de compuestos inhibidores de la angiogénesis en pacientes que presentan tumores en crecimiento. La angiogénesis es el proceso por el cual se forman nuevos capilares y vasos sanguíneos. Se trata de un proceso importante en el desarrollo embrionario y en el crecimiento, reparación y regeneración de tejidos. Además de en estos procesos normales y esenciales, la angiogénesis también participa en muchos procesos patológicos anormales, tales como crecimiento tumoral, metástasis tumorales y enfermedades oculares vasculares como la retinopatía diabética.
La angiogénesis implica una serie de procesos interdependientes, entre los cuales se incluyen (a) la activación de células endoteliales vasculares, (b) la descomposición de proteínas de la matriz celular por parte de las células endoteliales que expresan actividad de proteasa, (c) la migración de las células endoteliales a los sitios de crecimiento potencial, (d) la proliferación de las células endoteliales y (e) la formación de tubos por diferenciación de las células endoteliales. Cada uno de estos procesos se ve afectado por una serie de sustancias promotoras, tales como el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y los factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Los factores de crecimiento del endotelio vascular (denominados conjuntamente VEGF) tienen un papel esencial en el crecimiento y la diferenciación de las células endoteliales. El VEGF actúa enlazándose a tirosina-cinasas receptoras presentes en las membranas de las células endoteliales, que a su vez inician una cascada de reacciones de transducción de señales que estimulan el crecimiento celular.
Se ha propuesto la inhibición de la angiogénesis patológica como tratamiento de los tumores. Véase, por ejemplo, Folkman et al, Science, 221, 719, (1983). El concepto básico de este tratamiento es que, dado que los tumores necesitan cierta vascularización para crecer, la inhibición de la formación de vasos sanguíneos mediante la administración de compuestos inhibidores de la angiogénesis impedirá el crecimiento del tumor interrumpiendo el suministro de sangre. Una desventaja de este enfoque es que los inhibidores de la angiogénesis se deben administrar de forma relativamente continua para impedir el crecimiento tumoral. La interrupción de la administración del inhibidor puede provocar la reanudación del crecimiento del tumor. Una vacuna eficaz en la inhibición de la angiogénesis constituiría un interesante agente preventivo contra la formación de tumores.
En Crystal R.G., Cancer Chemother. Pharmacol., 43 (supl.), S90, (1999), se describen estrategias de terapia génica in vivo y ex vivo para el tratamiento de tumores utilizando vectores de transferencia génica de adenovirus.
El documento WO 99/45018 describe la inmunización activa frente a antígenos asociados a angiogénesis.
Persiste la necesidad de descubrir una vacuna generalmente eficaz para la inmunización contra la angiogénesis que también pueda inhibir el crecimiento de una serie de tumores sin la necesidad de dirigirse a antígenos tumorales específicos. La presente invención satisface esta necesidad.
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Sumario de la invención
La presente invención da a conocer una vacuna de ADN eficaz para provocar una respuesta inmunitaria contra las células endoteliales proliferativas, que comprende un constructo de ADN que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha proteína receptora de VEGF se selecciona entre el grupo comprendido por VEGFR-2, que presenta la secuencia SEC ID nº: 2, Flk-1, que presenta la secuencia SEC ID nº: 6, y un receptor que se une al VEGF o fragmentos del mismo y que tiene una secuencia que presenta por lo menos un 80% de homología con respecto a la secuencia SEC ID nº: 2 ó 6 y en la que el constructo de ADN se incorpora de manera operativa en un vector de Salmonella typhimurium o Salmonella typhi atenuadas. En una forma de realización, el constructo de ADN es un ADN sustancialmente purificado que tiene una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 5, y una secuencia polinucleótida que presenta por lo menos un 80% de homología con respecto a las mismas y codifica un receptor que se une al VEGF o fragmentos del mismo.
La presente invención también da a conocer la utilización de un constructo de ADN que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma para la preparación de una vacuna de ADN para inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero, en la que se administra por vía oral una cantidad inmunológicamente eficaz de dicha vacuna de ADN a dicho mamífero, con lo que dicho mamífero muestra una respuesta inmunitaria inducida por la vacuna y específica para las células endoteliales proliferativas, lo que da lugar a la detención del crecimiento tumoral, la reducción del tamaño del tumor o la inhibición de la diseminación del mismo, seleccionándose la proteína receptora de VEGF entre el grupo comprendido por VEGFR-2, que presenta la secuencia SEC ID nº: 2, Flk-1, que presenta la secuencia SEC ID nº: 6, y un receptor que se une al VEGF o fragmentos del mismo y que tiene una secuencia que presenta por lo menos un 80% de homología con respecto a la secuencia SEC ID nº: 2 o 6 y en la que el constructo de ADN se incorpora de manera operativa en un vector de Salmonella typhimurium o Salmonella typhi atenuadas. En una forma de realización, el mamífero es un ser humano.
La presente invención también da a conocer un artículo manufacturado que comprende una vacuna de la invención 1 envasada en un recipiente estéril sellado herméticamente, presentando dicho recipiente una etiqueta que comprende un material impreso que identifica la vacuna y proporciona información útil para la persona que administra dicha vacuna al paciente.
La vacuna puede comprender un ácido nucleico lineal, tal como un constructo de ADN purificado o un constructo de ADN incorporado en un vector plasmídico. Las vacunas de ADN según la presente invención estimulan la formación de CTL activos contra las células endoteliales proliferativas, que sobreexpresan VEGFR-2.
Las células endoteliales forman el revestimiento del tejido vascular de los mamíferos. La proliferación de las células endoteliales es un proceso clave en la angiogénesis. Las vacunas según la presente invención proporcionan un método para producir una inhibición de larga duración de la angiogénesis en un organismo tratado con la vacuna en cuestión mediante el provocamiento de una respuesta inmunitaria contra las células endoteliales proliferativas. Las células endoteliales no proliferativas, tales como las que constituyen los revestimientos de los vasos sanguíneos consolidados, no presentan cantidades significativas de antígenos del receptor de VEGF y, por lo tanto, permanecen sustancialmente inalteradas por los CTL que se producen como respuesta a la vacuna.
La vacuna de ADN se puede utilizar para proporcionar una inhibición de larga duración de la proliferación de células endoteliales en un paciente vacunado. En una forma de realización, la vacuna de ADN que comprende un constructo polinucleótido que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF se administra por vía oral a un paciente que necesita inhibir la proliferación de células endoteliales en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra las células endoteliales proliferativas.
Para inhibir la angiogénesis en un paciente vacunado con una vacuna de ADN, se puede administrar una cantidad que puede provocar una respuesta inmunitaria de la vacuna que incluye un constructo de ADN que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF a un paciente que padece una enfermedad relacionada con la angiogénesis.
El crecimiento tumoral se inhibe mediante la vacunación de un paciente con una vacuna de ADN. En una forma de realización de este tipo, se administra una cantidad que puede provocar una respuesta inmunitaria de una vacuna que comprende un constructo de ADN que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF a un paciente que presenta un tumor en crecimiento. Dicha vacunación provoca la detención del crecimiento tumoral. La destrucción de las células endoteliales proliferativas por parte del sistema inmunitario del paciente impide la vascularización del tumor, en esencia matándolo por inanición.
Las vacunas de ADN se pueden administrar por vía enteral, por ejemplo por administración oral, o parenteral, por ejemplo por inyección o infusión intravenosa.
Las vacunas según la presente invención son útiles para el tratamiento y la prevención de una serie de estados
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patológicos. Por ejemplo, un paciente que padece cáncer, retinopatía diabética y similares se puede beneficiar de la inmunización con las vacunas según la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos, la figura 1 representa la secuencia de ADN que codifica el KDR humano, SEC ID nº: 1;
la figura 2 representa la secuencia proteínica del KDR humano, SEC ID nº: 2;
la figura 3 representa la secuencia de ADN que codifica el Flt-1 humano, SEC ID nº: 3;
la figura 4 representa la secuencia proteínica del Flt-1 humano, SEC ID nº: 4;
la figura 5 representa la secuencia de ADN que codifica el Flk-1 de ratón, SEC ID nº: 5;
la figura 6 representa la secuencia proteínica del Flk-1 humano, SEC ID nº: 6;
la figura 7 es una representación gráfica de unos pulmones de ratón con diversos niveles de cobertura tumoral comprendidos entre > 50% de cobertura (etiquetado con el número 3) y < 10% de cobertura (etiquetado con el número 1);
la figura 8 es una representación gráfica de los datos que ponen de manifiesto que los ratones vacunados con una vacuna de ADN según la presente invención (línea continua gruesa) y provocados mediante la inyección intravenosa de células de carcinoma de colon CT-26 muestran una mortalidad significativamente reducida en relación con dos grupos de control de ratones (ratones no tratados previamente: línea continua delgada; vacuna de control: línea discontinua);
la figura 9 es una representación gráfica de los datos que ponen de manifiesto la supresión del crecimiento de un tumor de tipo D121 de carcinoma pulmonar de Lewis en ratones vacunados con una vacuna de ADN según la invención (pcDNA3.1-FLK-1) en relación con dos grupos de control de ratones;
la figura 10 es una representación gráfica de los datos que ponen de manifiesto la supresión del crecimiento de un tumor de tipo B16 de melanoma en ratones vacunados con una vacuna de ADN según la invención (.) en relación con un grupo de control (o); y
la figura 11 es una representación gráfica de los datos que ponen de manifiesto el aumento de linfocitos T CD8+ positivos a CD25, CD69 y CD2 en los ratones vacunados con una vacuna de ADN según la invención en relación con un grupo de ratones de control.
Descripción detallada de las formas de realización preferidas
Tal como se utiliza en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, el término “constructo de ADN” se refiere a una estructura de ADN sintética que puede ser transcrita en las células diana. Dicho constructo puede comprender un ácido nucleico lineal, tal como un ADN purificado, o preferentemente un ADN incorporado en un vector plasmídico. El ADN también se puede incorporar en un vector vírico o bacteriano, preferentemente un vector vírico o bacteriano atenuado que sea apatógeno. Entre los ADN que codifican una proteína receptora de VEGF se incluyen VEGFR-2 (KDR; SEC ID nº: 2), VEGFR-1 (Flt-1; SEC ID nº: 4), y Flk-1 (SEC ID nº: 6), por ejemplo, las secuencias de ADN SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3 y SEC ID nº: 5, respectivamente.
Se han identificado cinco subtipos de VEGF, incluidos el VEGF-1 (también designado VEGF-A), el VEGF-2 (también designado VEGF-C), el VEGF-B, el VEGF-D y el VEGF-E. Véase, por ejemplo, la patente US nº 6.235.713, de Achen et al, así como las referencias citadas en la misma. Los receptores de VEGF son tirosina-cinasas específicas para las células endoteliales. Se han identificado diversas tirosina-cinasas receptoras específicas para células endoteliales, entre las cuales se incluyen Flt-1 (receptor 1 de VEGF; VEGFR-1), KDR (VEGFR-2), Flk-1 (homólogo murino del KDR), Flt-4 (VEGFR-3), Tie, Tie-2 y Tek, diversas de las cuales son receptores de VEGF.
Las vacunas de ADN según la presente invención estimulan la formación de CTL activos contra las células endoteliales proliferativas, que sobreexpresan VEGFR-2. Dado que los receptores de VEGF sólo se expresan significativamente en las células endoteliales proliferativas, un CTL generado como respuesta a la vacuna se dirigirá esencialmente sólo a los tejidos en los que tenga lugar una angiogénesis activa (por ejemplo, vascularización). Las células endoteliales no proliferativas, tales como las de los recubrimientos de los vasos sanguíneos consolidados, carecen esencialmente de antígenos de receptores de VEGF y, por lo tanto, no resultan afectadas por el CTL generado por la vacuna.
La vacuna puede promover la activación de linfocitos T indiferenciados ya sea directa o indirectamente, a través de la intervención de células dendríticas.
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Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “inmunidad” se refiere a una protección inmunitaria de larga duración frente a la forma virulenta del agente infeccioso o antígeno tumoral. El término “inmunización” se refiere a la exposición profiláctica a un antígeno de un agente patógeno derivado de una fuente no virulenta, proporcionando inmunidad frente al patógeno en el individuo tratado.
Un constructo de ADN utilizado en la presente invención comprende preferentemente una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína receptora de VEGF unida de manera operativa a elementos reguladores necesarios para la expresión génica.
Los constructos de ADN útiles incluyen preferentemente elementos reguladores necesarios para la expresión de nucleótidos. Dichos elementos incluyen, por ejemplo, un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada y una señal de poliadenilación. Además, a menudo se requieren potenciadores para la expresión de una secuencia que codifica una proteína inmunógena diana. Tal como es conocido en la técnica, estos elementos están preferentemente unidos de manera operativa a la secuencia que codifica la proteína deseada. Preferentemente, se seleccionan elementos reguladores que sean operativos en la especie a la que se pretenden administrar.
Preferentemente, los codones de iniciación y los codones de parada se incluyen como parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína receptora de VEGF en una vacuna genética según la presente invención. Los codones de iniciación y de parada deben estar en el mismo marco de lectura que la secuencia de codificación.
Los promotores y señales de poliadenilación incluidos en una vacuna según la presente invención se seleccionan preferentemente para que sean funcionales dentro de las células del individuo que se pretende inmunizar.
Los ejemplos de promotores útiles en las vacunas según la presente invención, particularmente en la preparación de una vacuna genética para los seres humanos, comprenden de manera no limitativa, promotores del virus del simio 40 (SV40), promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), promotor del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tal como repetición terminal larga (LTR) del VIH, virus de Moloney, citomegalovirus (CMV), tal como promotor inmediato temprano de CMV, virus de Epstein-Barr (VEB), virus del sarcoma de Rous (VSR), así como promotores de genes humanos, tales como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y metalotioneína humana.
Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles en las vacunas según la presente invención, particularmente en la producción de una vacuna genética para los seres humanos, comprenden de manera no limitativa, señales de poliadenilación de SV40 y señales de poliadenilación de LTR.
Además de los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN, se pueden incluir otros elementos en la molécula de ADN. Entre dichos elementos adicionales se incluyen los potenciadores. El potenciador puede ser, por ejemplo, actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y potenciadores víricos tales como los de CMV, VEB y VSR.
Generalmente, las secuencias reguladoras y los codones son especies dependientes, por lo que, a fin de maximizar la producción de proteínas, las secuencias reguladoras y los codones se seleccionan preferentemente de modo que sean eficaces en la especie que se pretende inmunizar. El experto en la materia será que puede preparar constructos de ADN funcionales en una determinada especie.
En la técnica se han descrito bien métodos de transformación de vectores bacterianos vivos con un constructo de ADN exógeno. Véase, por ejemplo, Joseph Sambrook y David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001).
Según la presente invención, se pueden administrar polinucleótidos de ADN a tejidos de un mamífero, por ejemplo, un ser humano. En algunas formas de realización preferentes, los polinucleótidos de ADN se administran por vía oral, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica o tópica.
Según la presente invención, una vacuna de ADN se puede utilizar para proporcionar una inhibición de larga duración de la proliferación de células endoteliales en un paciente tratado con la vacuna. En una forma de realización preferida, se administra una vacuna de ADN que comprende un constructo polinucleótido que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF a un mamífero que necesita inhibir la proliferación de células endoteliales en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra las células endoteliales proliferativas.
Una vacuna de ADN según la presente invención se puede utilizar para inhibir la angiogénesis en un mamífero tratado con la vacuna de ADN. En una forma de realización de este tipo, una vacuna que comprende un constructo de ADN que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF se administra a un mamífero que padece una enfermedad relacionada con la angiogénesis en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra las células endoteliales proliferativas.
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En una forma de realización, el crecimiento tumoral se inhibe mediante el tratamiento de un mamífero con una vacuna de ADN. En una forma de realización de este tipo, se administra una cantidad que puede provocar una respuesta inmunitaria de una vacuna que comprende un constructo de ADN que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF a un paciente que presenta un tumor en crecimiento. El tratamiento con la vacuna provoca la detención del crecimiento tumoral mediante la inmunización del mamífero frente a las células endoteliales proliferativas. La destrucción de las células endoteliales proliferativas por parte del sistema inmunitario del mamífero impide, o como mínimo minimiza, la vascularización del tumor.
Según la presente invención, las vacunas se pueden administrar por vía enteral, por ejemplo por administración oral,
- o por inyección intramuscular. Preferentemente, el mamífero tratado con la vacuna de la invención es un humano. Un paciente que padece cáncer, por ejemplo carcinoma de pulmón o de colon, o tumores de próstata, retinopatía diabética y similares, se puede beneficiar de la inmunización con las vacunas según la presente invención.
Preferentemente, las vacunas según la presente invención se formulan con vehículos farmacéuticamente aceptables
- o excipientes como agua, solución salina, dextrosa, glicerol y similares, y combinaciones de los mismos. Las vacunas también pueden contener sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, tampones y similares.
Las vacunas según la presente invención se administran preferentemente por vía oral a un mamífero, por ejemplo un ser humano, en forma de solución o suspensión en un vehículo farmacéuticamente aceptable, a una concentración de ADN comprendida entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 microgramos por mililitro. La dosis adecuada depende del individuo que se pretende vacunar y, en parte, del criterio del médico que lleve a cabo o prescriba la administración de la vacuna.
Las vacunas según la presente invención se pueden envasar en recipientes debidamente esterilizados, tales como ampollas, frascos o viales, en una formulación multidosis o monodosis. Preferentemente, los recipientes se cierran herméticamente después de llenarse con una preparación de vacuna. Preferentemente, las vacunas se envasan en un recipiente que presenta una etiqueta que identifica la vacuna y va acompañado de un texto en la forma prescrita por una agencia gubernamental como la United States Food and Drug Administration en el que se refleja la aprobación de la vacuna según la legislación correspondiente, información sobre la dosificación e indicaciones similares. Preferentemente, dicha etiqueta contiene información sobre la vacuna que resulta útil para el profesional sanitario encargado de administrar la vacuna a un paciente. El envase también contiene preferentemente materiales informativos impresos que se refieren a la administración de la vacuna, instrucciones, indicaciones y cualquier advertencia necesaria.
Las proteínas receptoras de VEGF, como las tirosina-cinasas específicas de las células endoteliales comprenden por ejemplo, Flt-1, KDR, Flk-1 y homólogos funcionales de las mismas. Preferentemente, los homólogos funcionales presentan por lo menos un 80% de homología con respecto a las proteínas receptoras de VEGF mencionadas anteriormente.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas receptoras de VEGF se han dado a conocer en la técnica, al igual que las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica el KDR (figura 1, SEC ID nº: 1) y su secuencia proteínica correspondiente (figura 2, SEC ID nº: 2) han sido publicadas por Yu et al en la base de datos EMBL del European Bionformatics Institute, en el Wellcome Trust Genoma Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, Reino Unido (el número de entrada EMBL es EMBL:AF063658). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica el Flt-1 (figura 3, SEC ID nº: 3) y su secuencia proteínica correspondiente (figura 4, SEC ID nº: 4) han sido publicadas por Yu et al en la base de datos EMBL del Instituto Europeo de Bioinformática, en Wellcome Trust Genoma Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, Reino Unido (el número de entrada EMBL es EMBL:AF063657). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica el Flk-1 y su correspondiente secuencia proteínica han sido publicadas por Mathews et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88:9026-9030, y las estructuras han sido corregidas por Quinn et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 90:7533-7537. La secuencia corregida de ADN del Flk-1 se indica en la figura 5 como SEC ID nº: 5, y la secuencia proteínica corregida de Flk-1 se indica en la figura 6 como SEC ID nº: 6.
Debido a la degeneración inherente del código genético, en la aplicación de la presente invención se pueden utilizar otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos, o un equivalente funcional de la misma, de las proteínas receptoras de VEGF KDR y Flk-1. Dichas secuencias de ADN incluyen las que son que pueden hibridarse también con las secuencias de los receptores VEGF. Los homólogos funcionalmente equivalentes del ADN de las proteínas receptoras de VEGF presentan como mínimo un 80% de homología con respecto al ADN que codifica las proteínas receptoras de VEGF mencionadas anteriormente.
Las secuencias de ADN modificadas que se pueden utilizar según la presente invención comprenden las resultantes de eliminaciones, adiciones o sustituciones de diferentes residuos nucleótidos que dan lugar a una secuencia que codifica el mismo producto génico o un equivalente funcional del mismo. El propio producto génico puede contener eliminaciones, adiciones o sustituciones de residuos aminoácidos en las secuencias de los receptores VEGF que
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dan lugar a un cambio silencioso, obteniéndose de este modo una proteína receptora de VEGF funcionalmente equivalente. Dichas sustituciones de aminoácidos se pueden llevar a cabo sobre la base de la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobia, la hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos en cuestión. Por ejemplo, entre los aminoácidos con carga negativa se incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico; entre los aminoácidos con carga positiva se incluyen la lisina y la arginina; entre los aminoácidos con grupos polares no cargados con valores de hidrofilia parecidos se incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “receptor de VEGF funcionalmente equivalente” se refiere a un receptor que se une al VEGF o fragmentos del mismo, aunque no necesariamente con la misma afinidad de unión que su homólogo nativo KDR, Flk-1 o Flt-1.
Las secuencias de ADN se pueden modificar a fin de alterar la secuencia de codificación del receptor de VEGF con una variedad de fines, que comprenden de manera no limitativa las mismas, las modificaciones que alteran el procesamiento y la expresión del producto génico. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones mediante técnicas bien conocidas en el sector de la invención, por ejemplo mutagénesis dirigida a sitio específico, para insertar nuevos sitios de restricción, modificar los patrones de glucosilación, fosforilación, etc.
El Flk-1 de ratón (SEC ID nº: 6) presenta aproximadamente un 85% de homología con el KDR humano (SEC ID nº: 2) y ejercer una función en la fisiología del ratón análogo a la función del KDR en los seres humanos. De hecho, el VEGFR-2 se designa a menudo KDR/Flk-1, lo que refleja la estrecha analogía existente entre estos dos homólogos del receptor de VEGF. Por este motivo se escogió el tratamiento de ratones con una vacuna de ADN según la invención, que codifica el Flk-1 (por ejemplo, la secuencia de ADN SEC ID nº: 5) como modelo adecuado para las vacunas de ADN para humanos que codifican el KDR.
Los ejemplos siguientes se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo de las características y formas de realización de la presente invención.
Materiales, métodos y ejemplos.
Materiales. se obtuvieron ratones C57/BL/6J y Balb/C a través del centro de cría del Scripps Research Institute. Las líneas celulares tumorales murinas utilizadas para la evaluación incluían la línea celular B16 de melanoma y la línea celular CT26 de carcinoma de colon, obtenidas a través del Dr. I. J. Fidler del MD Anderson Cancer Center, Houston, TX. La línea celular D121 de cáncer de pulmón murino de Lewis se obtuvo a través de la Dra. Lea Eisenbach del Instituto Weizmann, Rehovot (Israel). El ADN que codifica el Flk-1 fue proporcionado amablemente por el Dr. Lemischka (Princeton University, Princeton, NJ), y se clonó en el vector de expresión eucariótico pcDNA3.1 suministrado por Invitrogen, Huntsville (Alabama) utilizando los sitios de restricción KpnI y XbaI. Se obtuvo una cepa atenuada de Salmonella typhimurium a través de B. A. D. Stocker (Stanford University, Stanford, CA). Los anticuerpos se obtuvieron a través de BD Biosciences, Bedford, MA. El suplemento de cultivo T-STIM se obtuvo a través de BD Biosciences, Bedford, MA. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) y la R-ficoeritrina (PE) se obtuvieron a través de Molecular Probes, Eugene, OR. Los anticuerpos marcados con FITC y con PE se prepararon según los protocolos recomendados por el fabricante.
Ejemplo 1. Preparación de una vacuna de ADN que codifica Flk-1.
El vector pcDNA3.1 que contiene el ADN de Flk-1 (SEC ID nº: 5, entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 0,1 Ig de pDNA) se sometió a electroporación en Salmonella typhimurium atenuada recién preparada utilizando un generador de impulsos Bio-Rad a 2,5 kV, 25 IF y 200 Ohm, según los procedimientos recomendados por el fabricante. Las Salmonella que contenían el vector se seleccionaron en placas que contenían ampicilina. Las colonias se recogieron al día siguiente y se cultivaron durante una noche en caldo LB (EM Science, Gibbstown, NJ) con adición de ampicilina. Las bacterias se aislaron y lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, las bacterias lavadas se suspendieron en medio PBS a una concentración de aproximadamente 1 x 109 Salmonella recombinante por mililitro de PBS para formar una solución de vacuna para su uso posterior. La vacuna se almacenó en ampollas cerradas herméticamente hasta su utilización. También se preparó una “vacuna de control” de Salmonella transformada con el vector pcDNA3.1 solo (sin ADN de Flk-1) siguiendo el mismo procedimiento. El ADN plasmídico se almacenó aproximadamente a -80ºC antes de la transformación de la Salmonella.
Ejemplo 2. Vacunación de ratones con una vacuna de ADN que codifica el Flk-1.
Se vacunaron ratones Balb/C (aproximadamente 6 ratones por grupo de tratamiento) con la vacuna de ADN del ejemplo 1 (aproximadamente 1 x 108 Salmonella recombinante en aproximadamente 100 Il de PBS) mediante sonda oral, tres veces a intervalos de dos semanas. Otro grupo de ratones se vacunaron con la vacuna de control (compuesta por Salmonella atenuada que contenía el vector vacío) según la misma pauta que los ratones vacunados con la vacuna según la invención.
E03726007 16-11-2011
Ejemplo 3. Evaluación de la resistencia al tumor de los ratones vacunados.
Aproximadamente dos semanas después de la tercera vacunación, los ratones Balb/C del ejemplo 2 (aproximadamente 6 ratones por grupo de tratamiento) fueron provocados con aproximadamente 1 x 105 células B16 de melanoma (vía subcutánea), aproximadamente 1 x 105 células D121 de carcinoma pulmonar de Lewis (vía subcutánea) o aproximadamente 7,5 x 104 células CT26 de carcinoma de colon (vía intravenosa). Se extrajeron mediante cirugía los tumores pulmonares de Lewis subcutáneos tras aproximadamente dos semanas de crecimiento para permitir la difusión espontánea al pulmón. El crecimiento tumoral subcutáneo se midió en dos dimensiones cada dos días y el volumen tumoral se calculó según la fórmula:
volumen = (anchura2)(longitud/2)
para cada tumor. La cantidad de metástasis espontánea de las células D121 a los pulmones se evaluó aproximadamente 30 días después de la extirpación del tumor primario subcutáneo. Los ratones se sacrificaron y se les practicó una autopsia, y las masas tumorales de los pulmones se evaluaron según el porcentaje de superficie pulmonar cubierta por tumor, puntuándose con un “0” para ausencia de tumor, un “1” para una cobertura tumoral menor de aproximadamente el 20%, un “2” para una cobertura tumoral comprendida entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 30% y un “3” para una cobertura tumoral mayor de aproximadamente el 50%. La figura 7 muestra imágenes de los pulmones de tres ratones provocados con células D121 de carcinoma pulmonar de Lewis. El pulmón inferior tuvo una puntuación de 1, mientras que los dos pulmones superiores obtuvieron una puntuación de 3, puesto que presentaban una gran proporción de la superficie pulmonar cubierta por tumores. A los animales que murieron antes de la evaluación realizada a los 30 días se les dio una puntuación de “+”.
Los resultados de las evaluaciones se indican en las tablas 1-4 y en las figuras 8-10, consideradas con detalle a continuación.
Tabla 1. Metástasis tumoral en ratones Balb/C provocados con células D121 de carcinoma pulmonar de Lewis.
Grupo de vacunación de ratones Puntuaciones metastásicas
- Control: vacunación con Salmonella sin transformar
- 3,3,3,3,+,+
- Control: vacunación con la vacuna de control (que contiene el vector vacío)
- 3,3,3,3, +, +
- Vacunación con la vacuna de ADN del ejemplo 1 (que contiene Flk-1)
- 0,0,1,1,1,2,2
Se evaluó la mortalidad de los ratones Balb/C provocados mediante inyección intravenosa de células CT-26 de carcinoma de colon a lo largo de un periodo de aproximadamente 63 días (7 semanas). La información sobre la mortalidad se proporciona en la tabla 2 siguiente y se ilustra gráficamente en la figura 8.
En la figura 8, el % de supervivencia de los ratones tratados con la vacuna según la presente invención del ejemplo 1 está indicado por la línea continua gruesa con una supervivencia del 100%. El % de supervivencia de los ratones no tratados previamente (sin vacunación) provocados con las células C26 está indicado por la línea continua fina, mientras que el % de supervivencia de los ratones tratados con la vacuna de control (sin ADN de Flk-1) está indicado por la línea discontinua.
Tabla 2. Supresión de la mortalidad en ratones Balb/C inmunizados con la vacuna del ejemplo 1 y provocados con células CT26 de carcinoma.
% de supervivencia % de supervivencia % de supervivencia Tratamiento a los 30 días a los 36 días a los 63 días
- Control (sin vacuna)
- 50 0 0
- Vacuna de control
- 33 0 0
- Vacuna del ejemplo 1
- 100 100 100
La supresión del crecimiento del tumor primario (subcutáneo) en los ratones Balb/C provocados con D121 se evaluó mediante la determinación del volumen del tumor primario a los 14 días de la provocación. Los resultados se proporcionan en la tabla 3 siguiente y se ilustran gráficamente en la figura 9.
En la figura 9, la primera barra, etiquetada “PBS”, indica los ratones que no fueron vacunados (ratones no tratados previamente), la barra central, etiquetada “vector vacío”, indica los ratones tratados con la vacuna de control y la tercera barra, etiquetada “pcDNA3.1 FLK1”, indica los ratones inmunizados con la vacuna según la invención del ejemplo 1.
E03726007 16-11-2011
Tabla 3. Supresión del tumor subcutáneo D121 de carcinoma en ratones Balb/C inmunizados con la vacuna del ejemplo 1.
Tratamiento Volumen tumoral mm3 Desviación estándar
- Control (sin vacuna)
- 665 227
- Vacuna de control
- 641 157
- Vacuna del ejemplo 1
- 183 35
La supresión del crecimiento del tumor B16 subcutáneo de melanoma se evaluó mediante el control del volumen del tumor subcutáneo a lo largo de un periodo de aproximadamente 17 días tras la provocación del tumor. Los resultados se proporcionan en la tabla 4 siguiente y se ilustran gráficamente en la figura 10. En la figura 10, los datos de volumen tumoral promedio indicados con (.) representan los ratones inmunizados con la vacuna según la presente invención del ejemplo 1, mientras que los datos indicados con (o) representan los ratones tratados con la vacuna de control.
Tabla 4. Supresión del tumor subcutáneo B16 de melanoma en ratones Balb/C inmunizados con la vacuna del ejemplo 1.
- Volumen tumoral (mm3) en el día
- Tratamiento
- 0 9 14 17
- Vacuna de control
- 0 907 1.273 4.213
- Vacuna del ejemplo 1
- 0 447 462 1.063
- % de supresión tumoral
- --- 51% 64% 75%
Ejemplo 4. Aumento de los marcadores de activación CD25, CD69 y CD2 en esplenocitos (linfocitos T CD8+) en los ratones vacunados.
Se vacunaron ratones C5/7BL/6J (aproximadamente 4 ratones por grupo de tratamiento) con la vacuna de ADN del ejemplo 1 y la vacuna de control (sin Flk-1), tal como se ha descrito en el ejemplo 2. Se aislaron esplenocitos de los ratones inmunizados y del grupo de ratones de control aproximadamente seis semanas después de la tercera vacunación. Los esplenocitos se cultivaron durante 24 horas junto con células de una línea celular B16 de melanoma transducidas para que expresaran Flk-1 y con células B16 sin transformar en medio de linfocitos T (aproximadamente 5 ml por cultivo) que contenía aproximadamente 4% en volumen de suplemento de cultivo T-STIM (Cat. # 354115, BD Biosciences, Bedford, MA). A continuación, las células se marcaron con anticuerpo CD8+ conjugado con FITC y anticuerpos conjugados con PE de CD25, CD69 y CD2. Las suspensiones celulares se evaluaron utilizando un citómetro Becton Dickenson FACScan para determinar el porcentaje de linfocitos T CD8+ positivos a CD25 y CD69 para cada combinación esplenocito/células B16 de melanoma. Los resultados se proporcionan en la tabla 5 siguiente y se ilustran gráficamente en la figura 11.
Tabla 5. Aumento de los marcadores de activación CD25, CD69 y CD2 en esplenocitos de ratones vacunados.
positivos a CD2 Tratamiento % positivos a CD25 % positivos a CD69 fluorescencia media
- Vacuna de control +
- 9 18 570 mfu
- células B16-Flk-1
- Vacuna de ADN +
- 12 29 550 mfu
- células B16
- Vacuna de ADN +
- 21 35 700 mfu
- células B16-Flk-1
- mfu = unidades de fluorescencia media.
Los resultados representados en las tablas 1-5 y las figuras 8-11 ponen de manifiesto que la vacuna de ADN del ejemplo 1, que comprende un ADN que codifica Flk-1, el análogo murino del KDR, puede inmunizar eficazmente a los ratones frente a una variedad de células cancerosas formadoras de tumor. Sin pretender limitarse a ningún planteamiento teórico, se cree que la vacuna actúa inhibiendo la angiogénesis en el tumor, es decir, impidiendo la formación de nuevos vasos sanguíneos en el mismo y matándolo eficazmente por inanición.
Los datos proporcionados en la tabla 1 ponen de manifiesto que la vacuna según la invención del ejemplo 1 provoca la supresión de la metástasis tumoral en los pulmones de los ratones provocados con células D121 de carcinoma pulmonar de Lewis. Ninguno de los ratones inmunizados con la vacuna del ejemplo 1 murió, y todos presentaban menos de aproximadamente el 50% de cobertura tumoral de los pulmones (2 presentaban < 20%). En cambio, murieron dos ratones de cada grupo de control y todos los ratones restantes presentaban una cobertura tumoral de los pulmones superior al 50%.
La vacuna según la presente invención del ejemplo 1 también disminuyó significativamente la mortalidad de los ratones Balb/C provocados por vía intravenosa con células CT-26 de carcinoma de colon, tal como demuestran los datos de la tabla 2 y la figura 8. Todos los ratones inmunizados con la vacuna del ejemplo 1 sobrevivieron durante todo el período de observación de 63 días posteriores a la provocación. Sin embargo, en los grupos de control, todos los ratones murieron antes del día 36 tras la provocación.
5 Tal como ponen de manifiesto los datos de la tabla 3 y la figura 9, el crecimiento del tumor subcutáneo de tipo D121 de carcinoma pulmonar de Lewis se suprimió mediante la inmunización con la vacuna según la invención del ejemplo 1 en un factor comprendido entre aproximadamente 4,3 y aproximadamente 4,5 en relación con los grupos de ratones de control no tratados con ninguna vacuna o tratados con la vacuna de control.
10 De modo parecido, tal como se pone de manifiesto en la tabla 4 y la figura 10, el crecimiento del tumor subcutáneo de tipo B16 de melanoma se suprimió en un factor de aproximadamente 4 en los ratones inmunizados con la vacuna según la invención del ejemplo 1 en relación con el crecimiento tumoral observado en el grupo de control.
15 Los datos de la tabla 5 y la figura 11 muestran que los esplenocitos aislados de ratones C57/BL/6J vacunados con la vacuna de ADN del ejemplo 1 mostraron un aumento de los marcadores de activación CD2, CD25 y CD69 en relación con el grupo de ratones de control cuando se cultivaron con células B16 de melanoma transformadas para que presentaran el antígeno de Flk-1.
20 Listado de secuencias
<110> The Scripps Research Institute
Ralph A. Reisfeld
Andrew G. Niethammer
25 Rong Xiang
<120> VACUNA DE ADN CONTRA LAS CÉLULAS ENDOTELIALES PROLIFERATIVAS Y MÉTODOS DE UTILIZACIÓN DE LA MISMA
<150> 10/090.183
<151> 2002-03-02
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1 40 <211> 4071
<212> ADN
<213> humano
<400> 1 45
<210> 2
5 <211> 1356
<212> PRT
<213> humano
<400> 2 10
<210> 3
<211> 4017
<212> ADN
<213> humano
<400> 3
<210> 4
5 <211> 1338
<212> PRT
<213> humano
<400> 4 10
<210> 5 5 <211> 5390
<212> ADN
<213> ratón
<400> 5 10
<210> 6
<211> 1345
<212> PRT
<213> ratón
<400> 6
Claims (4)
- REIVINDICACIONES1. Vacuna de ADN eficaz para provocar una respuesta inmunitaria contra las células endoteliales proliferativas, que comprende un constructo de ADN que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF en un vehículo5 farmacéuticamente aceptable, en la que la proteína receptora de VEGF se selecciona de entre el grupo constituido por VEGFR-2 que presenta la secuencia de SEC ID nº: 2, Flk-1 que presenta la secuencia de SEC ID nº: 6, y un receptor que se une al VEGF o a los fragmentos del mismo y que tiene una secuencia que comparte por lo menos 80% de homología con la secuencia de SEC ID nº: 2 ó 6 y el constructo de ADN se incorpora de manera operativa en un vector de Salmonella typhimurium o Salmonella typhi atenuadas.
- 2. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el constructo de ADN es un ADN sustancialmente purificado que presenta una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 5, y una secuencia polinucleótida que comparte por lo menos 80% de homología con respecto a las mismas y codifica un receptor que se une al VEGF o fragmentos del mismo.
- 3. Utilización de un constructo de ADN que codifica de manera operativa una proteína receptora de VEGF y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma para la preparación de una vacuna de ADN para inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero, en la que se administra por vía oral una cantidad inmunológicamente eficaz de dicha vacuna de ADN a dicho mamífero, mostrando dicho mamífero una respuesta inmunitaria provocada por la 20 vacuna y específica para las células endoteliales proliferativas, lo que da lugar a la detención del crecimiento tumoral, la reducción del tamaño del tumor o la inhibición de la diseminación del tumor, en la que la proteína receptora de VEGF es seleccionada de entre el grupo constituido por VEGFR-2, que presenta la secuencia de SEC ID nº: 2, Flk-1, que presenta la secuencia SEC ID nº: 6, y un receptor que se une al VEGF o a los fragmentos del mismo y que presenta una secuencia que comparte por lo menos 80% de homología con la secuencia de SEC ID nº:25 2 ó 6 y el constructo de ADN se incorpora de manera operativa en un vector de Salmonella typhimurium o Salmonella typhi atenuadas.
- 4. Utilización según la reivindicación 3, en la que el mamífero es un ser humano.30 5. Artículo manufacturado que comprende una vacuna según la reivindicación 1 envasada en un recipiente estéril sellado herméticamente, presentando el recipiente una etiqueta fijada al mismo, presentando la etiqueta un material impreso que identifica la vacuna y proporciona información útil para la persona que administra dicha vacuna al paciente.
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