MXPA04008468A - Vacuna de dna contra celulas endoteliales proliferadoras y metodos de uso de la misma. - Google Patents

Vacuna de dna contra celulas endoteliales proliferadoras y metodos de uso de la misma.

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Abstract

Una vacuna de DNA efectiva para inhibir la proliferacion de celulas endoteliales comprende una construccion de DNA que codifica operablemente a una proteina receptora del factor de crecimiento endotelial (VEGF). Esta invencion proporciona vacunas de DNA que codifican a un receptor-2 del VEGF (KDR, SEC ID NO: 2), receptor-1 del VEGF (Flt-1, (SEC ID NO: 4), o Flk-1 (el homologo de roedor de KDR, SEC ID NO: 6), secuencias de DNA SEC ID NOS: 1, 3, y 5 respectivamente, asi como tambien metodos de usar una vacuna de DNA tal para inhibir la proliferacion de celulas endoteliales vasculares en el micro-ambito del tumor. Se logran la anti-angiogenesis y la subsecuente disminucion en el crecimiento y la diseminacion del tumor.

Description

VACUNA DE DNA CONTRA CELULAS ENDOTELIALES PROLIFERADORAS Y METODOS DE USO DE LA MISMA CAMPO DE LA INVENCION Esta invención concierne a vacunas del ácido desoxiribonucleico (DNA) que codifican a moléculas adecuadas efectivas para provocar una respuesta inmune contra células endoteliales proliferadotas . Más particularmente esta invención concierne a vacunas de DNA que codifican para el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . Esta invención también concierne a métodos de usar la vacuna de DNA para inhibir la proliferación de células endoteliales vasculares, crecimiento de tumor, y angiogénesis .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se han utilizado vacunas para proporcionar protección a largo plazo contra numerosas condiciones de enfermedades por medio de administración muy limitada de un agente profiláctico que estimula a un sistema inmune del organismo para destruir enfermedades patógenas antes de que puedan proliferar y causar un efecto patológico. Varios procedimientos para vacunas y vacunaciones se describen en Bernard R. Glick y Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies and Applications of Recombinant DNA, Segunda Edición, ASM Press pág 253-276 (1998) . La vacunación es un medio de inducir al sistema inmune propio del cuerpo para buscar y destruir un agente infeccioso antes de que cause una respuesta patológica. Típicamente, las vacunas son ya sea agentes infecciosos vivas, pero atenuados, (virus o bacterias) o bien en una forma muerta del agente. Una vacuna que consiste de una bacteria o virus vivos no deben de ser patógenas. Típicamente, un cultivo bacteriano o viral es atenuado (debilitado) por medio de tratamiento físico o químico. Aunque el agente no sea virulento, puede aún provocar una respuesta inmune en un sujeto tratado con la vacuna. Una respuesta inmune es provocada por antígenos, ya sea macromoléculas o un agente infeccioso específicos. Estos antígenos son generalmente ya sea proteínas, polisacáridos, lípidos, o glicolípidos, los cuales son reconocidos como "extraños" por linfocitos conocidos como células B y células T. La exposición de ambos tipos de linfocitos a un antígeno provoca una respuesta de división y de diferenciación celular rápida, que da como resultado la formación de clones de los linfocitos expuestos. Las células B producen células plasmáticas, las cuales a su vez, producen proteínas llamadas anticuerpos (Ab) , las cuales enlazan selectivamente a los antígenos presentes en el agente infeccioso, neutralizando o inactivando asi al patógeno (inmunidad humoral) . En algunos casos, la respuesta de células B requieren de la asistencia de células T auxiliares de CD4. El clon de células T especializados que se forman en respuesta a la exposición al antigeno es un linfocito T citotóxico (CTL) , el cual es capaz de enlazar a y eliminar patógenos y tejidos que presentan el antigeno (inmunidad celular o mediada por células) . En algunos casos, una célula que presenta antigeno (APC) tal como una célula dendritica, desarrollará un patógeno u otra célula extraña por medio de endocitosis. Los APC entonces procesan los antigenos desde las células, y presentan estos antigenos en la forma de un complejo de péptido ¡molécula de histocompatibilidad al receptor de células T (TRC) sobre CTLs, estimulando asi una respuesta inmune. La inmunidad humoral caracterizada por la formación de anticuerpos específicos es generalmente más efectiva contra infecciones bacterianas agudas e infecciones repetidas de virus, mientras que la inmunidad mediada por células es más efectiva contra la infección viral, infección bacteriana intracelular crónica, e infección fúngica. La inmunidad celular es también conocida por proteger contra cánceres y es responsable por el rechazo del trasplante de órganos.
Los anticuerpos para antígenos de infecciones previas permanecen detectables en la sangre por periodos de tiempo muy prolongados, dando asi como resultado un medio de determinar la exposición previa a un patógeno. Después de re-exposición al mismo patógeno, el sistema inmune efectivamente previene la re-infección por eliminación del agente patógeno antes de que pueda proliferar y producir una respuesta patógena. La misma respuesta inmune que podría ser provocada por un patógeno puede también algunas veces ser producida por un agente no patógeno que presenta el mismo antígeno como el patógeno. De esta manera, el sujeto puede ser protegido contra la exposición subsecuente al patógeno sin tener que emitir una infección. No todos los agentes infecciosos pueden ser cultivados e inactivados fácilmente, como se requiere para la formación de la vacuna, no obstante. Las técnicas DNA recombinantes modernas han permitido el diseño de nuevas vacunas para buscar superar esta limitación. Pueden crearse agentes infecciosos que carezcan de los genes patógenos, permitiendo así una forma viva, no virulenta del organismo a ser usado como una vacuna. Es también posible diseñar un organismo relativamente no patógeno tal como E. coli para presentar los antígenos de superficie celular de un portador patógeno. El sistema inmune de un sujeto tratado con un portador transformado tal es "truncado" al formar anticuerpos al patógeno. Las proteínas antigénicas de un agente patógeno pueden ser diseñadas y expresadas en unas especies no patógenas y las proteínas antigénicas pueden ser aisladas y purificadas para producir una "vacuna subunitaria" . Las vacunas subunitarias tienen la ventaja de ser estables, seguras, y bien definidas químicamente; sin embargo, su producción puede tener costo prohibitivo. Un nuevo procedimiento para vacunas ha surgido recientemente, ampliamente denominada inmunización genética. En este procedimiento, un gen que codifica a un antígeno de un agente patógeno es insertado operablemente en células en el sujeto a ser inmunizado. Las células tratadas son transformadas y producen las proteínas antigénicas del patógeno. Estos antígeno producidos in vivo entonces activan la respuesta inmune deseada en el huésped. El material genético utilizado en dichas vacunas genéticas puede ser ya sea una construcción de DNA o de RNA. A menudo el polinucleótido que codifica al antígeno es introducido en combinación con otras secuencias de polinucleótidas promotoras para mejorar la inserción, replicación, o expresión del gen. Vacunas de DNA que codifican a genes antigénicos pueden ser introducidas en las células huéspedes del sujeto por medio de una variedad de sistemas de expresión. Estos sistemas de expresión incluyen sistemas de expresión de procarióticos, mamíferos y levaduras. Por ejemplo, un procedimiento es utilizar un vector viral, tal como un virus de vacuna que incorpora el nuevo material genético, para inoculara las células huéspedes. Alternativamente, el material genético puede ser incorporado en un vector o puede ser liberado directamente en las células huéspedes como un polinucleótido "desnudo", es decir, simplemente como DNA purificado. Además, el DNA puede ser transfectado establemente en bacterias tales como Salmonella typhimuriu . Cuando un paciente es vacunado oralmente con la Salmonella transformada, las bacterias son transformadas a parches de Peyer en el intestino (es decir, tejidos linfoides secundarios), las cuales entonces estimulan una respuesta inmune. Las vacunas de DNA proporcionan una oportunidad para inmunizar contra estados de enfermedades que no son causados por patógenos tradicionales, tales como enfermedades genéticas y cáncer. Típicamente, en una vacuna para el cáncer genético, antígenos para un tipo específico de célula tumoral deben de ser aislados y luego ser introducidos en la vacuna. Una vacuna general efectiva contra un número de cánceres puede así ocasionar el desarrollo de numerosas vacunas individuales para cada tipo de célula cancerosa a ser inmunizada contra ella.
Un procedimiento general para el tratamiento de tumores involucra administrar compuestos que inhiben la angiogénesis a pacientes con tumores crecientes. La angiogénesis es el proceso por medio del cual forman nuevos vasos capilares y sanguíneos. La angiogénesis es importante en el desarrollo embrionario, crecimiento de tejido, reparación de tejido, y regeneración de tejido. Además, de estos procesos normales y esenciales, la angiogénesis está también involucrada en muchos procesos patológicos anormales tales como el crecimiento de tumores, metástasis de tumores, y enfermedades vasculares oculares tales como retinopatía diabética. La angiogénesis involucra numerosos procesos interdependientes, que incluyen (a) activación de células endoteliales vasculares, (b) descomposición de proteínas de matriz celular por medio de células endoteliales que expresan actividad proteasa, (c)migración de células endoteliales a un sitio de crecimiento potencial, (d) proliferación de células endoteliales y (e) formación tubular por diferenciación de células endoteliales. Cada una de estos procesos es afectado por una variedad de substancias promotoras tales como el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , y los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . Los factores de crecimiento endotelial vascular (colectivamente VEGF) desempeña un papel crucial en el factor de crecimiento endotelial y en la diferenciación. El VEGF actúa por enlace a las tirosinas quinases de la proteína receptora presente en las membranas celulares endoteliales, las cuales a su vez inician una cascada de reacciones de transducción de señal que estimula el crecimiento celular. La inhibición de la angiogénesis patológica ha sido propuesta como un tratamiento para tumores. Ver, por ejemplo, Folkman y colaboradores Science, 221, 719, (1983) . El concepto básico de dicho tratamiento es que, ya que los tumores requieren de la vascularización para el crecimiento, la inhibición de la formación de los vasos sanguíneos, a través de la administración de compuestos que inhiben la angiogénesis, prevendrán el crecimiento de tumor por hipoalimentación al tumor de su suministro de sangre. Una desventaja de este procedimiento es que los inhibidores de la angiogénesis deben de ser administrados sobre una base relativamente continua para prevenir el crecimiento de tumor. Un cese en la liberación del inhibidor puede conducir a una reanudación del crecimiento de tumor. Una vacuna efectiva para inhibir la angiogénesis deberá de ser un agente preventivo atractivo contra la formación de tumor.
Hay una necesidad continua por una vacuna generalmente efectiva para la inmunización contra la angiogénesis, la cual puede también inhibir el crecimiento de una variedad de tumores sin la necesidad de antigenos tumorales específicos objetivo. La presente invención satisface esta necesidad.
SUMARIO DE IA INVENCION Una vacuna de DNA efectiva para inhibir la proliferación celular endotelial comprende una construcción de DNA que codifica operablemente a una proteína receptora de VEGF. La vacuna de DNA comprende un polinucleótido que codifica a una proteína receptora para VEGF, tales como VEGFR-2 (KDR; SEC ID NO: 2), VEGFR-1 (Flt-1; SEC ID NO: 4), y Flk-1 (SEC ID NO: 6; el homólogo de KDR de roedor) , por ejemplo, las secuencias de DNA SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 5, respectivamente. La vacuna puede comprender un ácido nucleico lineal tal como una construcción de DNA purificado, o una construcción de DNA incorporado en un vector plásmido. Las vacunas de DNA de la presente invención estimula la formación de CTLs activas contra células endoteliales proliferadoras que sobre-expresan a VEGFR-2. Las células endoteliales forman el revestimiento interno de tejido vascular de mamíferos. La proliferación de células endoteliales es un proceso clave en la angiogénesis . Las vacunas de la presente invención proporcionan un método para producir la inhibición a largo plazo de la angiogénesis en un organismo tratado con la vacuna para provocar una respuesta inmune contra las células endoteliales proliferadoras . Las células endoteliales no proliferadoras, tales como las del revestimiento de los vasos sanguíneos establecidos, no presentan cantidades significativas de antígenos receptores de VEGF y permanecen asi substancialmente sin ser afectadas por los CTLs que son producidos en respuesta a la vacuna. En un aspecto del método de la presente invención, una vacuna de DNA es utilizada para proporcionar la inhibición a largo plazo de la proliferación celular endotelial en un paciente vacunado. En una modalidad del método, una vacuna de DNA que comprenda una construcción polinucleótida que codifica operablemente a una proteína receptora de VEGF, es administrada oralmente a un paciente en necesidad de la inhibición de la proliferación de células endoteliales en una cantidad que es suficiente para provocar una respuesta inmune contra células endoteliales proliferadoras. La presente invención también proporciona un método de inhibir la angiogénesis en un paciente vacunado con una vacuna de DNA. En una modalidad del método tal, una respuesta inmune que provoca la cantidad de una vacuna que incluye una construcción de DNA que codifica operablemente a una proteina receptora de VEGF es administrada a un paciente que sufre de una enfermedad relacionada con la angiogénesis . En aún otro aspecto del método de la presente invención, el crecimiento de tumor es inhibido al vacunar a un paciente con una vacuna de DNA. En una modalidad del método tal, una respuesta inmune que provoca la cantidad efectiva de una vacuna que comprende una construcción de DNA que codifica operablemente a una proteina receptora de VEGF es administrada a un paciente que tenga un tumor creciente. La vacunación da como resultado la detención del crecimiento tumoral. La destrucción de las células endoteliales proliferadoras por medio del sistema inmune del paciente previene la vascularización del tumor, en esencia la hipoalimentacón del tumor hasta la muerte. En las modalidades del método de la presente invención, las vacunas de DNA pueden ser administradas enteralmente, tal como por administración oral, o parenteralmente, tal como por inyección o infusión intravenosa . Las vacunas de la presente invención son útiles para el tratamiento y la prevención de numerosos estados de enfermedades. Por ejemplo, un paciente que sufre de un cáncer, retinopatia diabética, y los similares, pueden beneficiarse de la inmunización por las vacunas de la presente invención.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS En los dibujos la FIGURA 1 expone la secuencia de DNA que codifica al KDR humano, SEC ID NO: 1; La FIGURA 2 expone la secuencia proteinica de KDR humano, SEC ID NO: 2. La FIGURA 3, expone la secuencia de DNA que codifica al Flt-1 humano, SEC ID NO: 3; La FIGURA 4, expone la secuencia proteinica de Flt-1, humano, SEC ID NO: 4. La FIGURA 5, expone la secuencia de DNA que codifica a Flk-1 de ratón, SEC ID NO: 5; La FIGURA 6, expone la secuencia proteinica de Flk-1 humano, SEC ID NO: 6; La FIGURA 7, es una representación pictórica de pulmones de ratón que tiene niveles variables de la cobertura de tumor que varia desde > 50 % de cobertura (marcada 3) a < 10 % de cobertura (marcada 1) ; La FIGURA 8, es una representación gráfica de datos que demuestran que los ratones vacunados con una vacuna de DNA de la invención (línea negra gruesa, llena) y provocadas por inyección intravenosa de células de carcinoma de colon CT-26, exhibió mortalidad significativamente reducida en relación a dos grupos control de ratones (ratones nuevos: linea fina llena; vacuna control: linea punteada); La FIGURA 9 es una representación gráfica de datos que demuestran la supresión del crecimiento de tumor de carcinoma de pulmón de Lewis D121 en ratones vacunados con una vacuna de DNA de la invención (pcDNA3.1-FLK-l ) en relación a dos grupos control de ratones; La FIGURA 10, es una representación gráfica de datos que demuestran la supresión del crecimiento de tumor de melanoma de B16 en ratones vacunados con una vacuna de DNA de la invención (·) en relación a un grupo control (o); y La FIGURA 11, es una representación gráfica de datos que demuestran la sobreregulacion de CD25 (A) , CD69 (B) , y CD2 +¦ CD8 + células T en ratones vacunados con una vacuna de DNA de la invención en relación a un grupo control de ratones .
DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Una vacuna de DNA efectiva para inhibir la proliferación de células endoteliales comprende una construcción de DNA que codifica operablemente a una proteina receptora del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . El término "construcción de DNA", como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas significa una estructura de DNA sintético que puede ser transcrito en células objetivo. La construcción puede comprender un ácido nucleico lineal tal como un DNA purificado, o preferiblemente, DMA incorporado en un vector plásmido. El DNA puede también ser incorporado en un vector viral o bacteriano, preferiblemente un vector viral o bacteriano atenuado que no sea patógeno. DNAs adecuados son aquellos que codifican a una proteina receptora de VEGF tal como VEGF-2 (KDR; SEC ID NO: 2), VEGFR-1 (Flt-1; SEC ID NO: 4), y Flk-1 (SEC ID NO: 6), por ejemplo, las secuencias de DNA SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 5, respectivamente. Se han identificado, cinco sub-tipos de VEGF que incluyen el VEGF-1 (también conocido como VEGF-A) , VEGF-2 (también conocido como VEGF-C) , VEGF-B, VEGF-D y VEGF-E. Ver, por ejemplo, la Patente U.S. No. 6,235,713 de Achen y colaboradores, y las referencias citadas en la presente. Los receptores de VEGF son tirosina quinasas de proteínas especificas de células endoteliales . Se han identificado varias tirosinas quinasas de proteínas receptoras que son específicas para células endoteliales, que incluyen Flt-1 receptor 1 de VEGF; VEGFR-1), KDR (VEGFR-2), Flk-1 (el homólogo de KDR de roedor), Flt-4 (VEGFR-3) , Tie, Tie-2 y Tek, varios de los cuales son receptores de VEGF . Las vacunas de DNA de la presente invención estimula la formación de CTLs que son activas contra células endoteliales proliferadoras, las cuales sobre-expresan a VEGFR-2. A causa de que los receptores de VEGF son solamente substancialmente expresados en células endoteliales proliferadoras, un CTL que forma en respuesta a la vacuna termina solamente en tejidos en donde activa que la angiogénesis (por ejemplo, la vascularización) tenga lugar. Las células endoteliales no proliferadoras, tales como los revestimientos de los vasos sanguíneos establecidos, substancialmente carecen de antígenos receptores de VEGF y no son así afectados por un CTL provocado por la vacuna. En una modalidad preferida la vacuna de DNA comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica operablemente a una proteína receptora de VEGF. Esta vacuna puede promover la activación de células T nuevas, tanto directa como indirectamente, a través de la intervención de células dentriticas. Como se usa en la presente, el término "inmunidad" se refiere a protección inmunológica a largo plazo contra la forma virulenta del agente infeccioso o antígeno tumoral . El término "inmunización" se refiere a la exposición profiláctica a un antígeno de un agente patógeno derivado de una fuente virulenta, lo cual da como resultado la inmunidad al patógeno en el sujeto tratado. Una construcción de DNA de la presente invención comprende preferiblemente una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína receptora del VEGF enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para expresión genética. Los DNA útiles incluyen preferiblemente elementos reguladores necesarios para la expresión de nucleótidos. Dichos elementos incluyen, por ejemplo, un promotor, un codón de iniciación, un codón de detención, y una señal de poliadenilación. Además, los mejoradores son a menudo requeridos para la expresión de una secuencia que codifica a una proteína objetivo inmunogénica. Asi, se conoce en el arte, estos elementos están preferiblemente enlazados operablemente a la secuencia que codifica a la proteína deseada. Los elementos reguladores son seleccionados preferiblemente de modo que sean operables en las especies a las cuales serán administradas. Los codones de iniciación y los codones de detención se incluyen preferiblemente como parte de una secuencia de nucleótidos que codifica a la proteína receptora de VEGF en una vacuna genética de la presente invención. Los codones de iniciación y de terminación deben de estar en marco con la secuencia codificadora.
Los promotores y las señales de poliadenilación incluidos en una vacuna de la presente invención son seleccionados preferiblemente para ser funcionales en las células del sujeto a ser inmunizado. Ejemplos de promotores útiles en las vacunas de la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, incluyen pero no se limitan a promotores del Virus Simiano 40 (SV40) , promotores del Virus de Tumor Mamario de Ratón (MMTV) , promotor del Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV) tales como el promotor de Repetición Terminal Prolongado del HIV (LTR) , Virus de Maloney, promotor del Citomegalovirus (CMV) tal como el CMV intermediario precoz, del Virus de Epstein Barr (EBV) . Virus del Sarcoma de Rous (RSV) asi como también promotores de genes humanos tales como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano, y metalotioneina humana. Ejemplos de señales de poliadenilación útiles en las vacunas de la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, incluyen pero no se limitan a señales de poliadenilación de SV40 y señales de poliadenilación de LTR. Además, de los elementos reguladores requeridos para la expresión del DNA, pueden incluirse también otros elementos en la molécula de DNA. Dichos elementos adicionales incluyen mejoradores. Los mejoradores pueden ser, por ejemplo, actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y mejoradores virales tales como los de CMV, RSV y EBV. Las secuencias y codones reguladores son generalmente especies dependientes, a fin de maximizar asi la producción de proteina, las secuencias y codones reguladores son preferiblemente seleccionados por ser efectivos en las especies a ser inmunizadas. Un experto en la materia puede producir construcciones de DNA que sean funcionales en una especie de sujetos dada. Las construcciones de DNA de las vacunas de la presente pueden ser DNA "desnudos" como se define en Restifo y colaboradores Gene Therapy 7, 89-92 (2000), la descripción pertinente de los cuales se incorpora a la presente como referencia. Alternativamente, el DNA puede ser incorporado operablemente en un vector. Los vectores de liberación útiles incluyen microcápsulas biodegradables, complejos inmunoestimuladores (ISCOMs) o liposomas, y vectores vivos atenuados diseñados genéticamente tales como virus o bacterias. Ejemplos de vectores bacterianos vivos atenuados adecuados incluyen Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, Bacille Calmette-Guerin (BCG) , Escherichia coli, Vibrio cholerae, Campylobacter, o cualquier otro vector bacteriano adecuado, como se conocen en el arte. Métodos de transformar vectores bacterianos vivos con una construcción de DNA exógena son bien descritos en el arte. Ver, por ejemplo, Joseph Sambrook y David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) . Vectores virales preferidos incluyen Bacteriófagos, virus del Herpes, Adenovirus, virus de la Polio, Virus de Vaccinia, y Avipox . Los métodos de transformar vectores virales con una construcción de DNA exógena se describen bien también en el arte. Ver Sambrook y Russell, anterior. Los vectores de liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares, que tienen una porción de membrana formada de material lipofilico y una porción acuosa interior. La porción acuosa es usada en la presente invención para contener el material polinucleótido a ser liberado en la célula objetivo. Se prefiere de manera general que los materiales que forman el liposoma tienen un grupo catiónico, tal como un grupo amonio cuaternario, y uno o más grupos lipofílicos, tales como grupos alquilo saturado o insaturado que tienen aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. Se describe un grupo de materiales adecuados en la Publicación de Patente Europea No. 0187702, y adicionalmente discutida en la Patente U.S. No. 6,228,844 de Wolff y colaboradores, cuyas descripciones pertinentes se incorporan como referencia. Muchos otros compuestos lipidíeos catiónicos formadores de liposoma se describen en la literatura. Ver, por ejemplo, L. Stamatatos, y colaboradores, Biochemistry 27: 3917-3925 (1988); y H. Eibl, y colaboradores, Biophysical Chemistry 10: 261-271 (1979). Alternativamente, puede utilizarse una microesfera tal como una microesfera biodegradable de polilactida - coglicolida. Una construcción de ácido nucleico es encapsulada o de otra manera complejada con la microesfera o liposoma para liberación del ácido nucleico a un tejido, como se sabe en el arte. Los aspectos del método de la presente invención comprenden la etapa de administrar polinucleótidos de DNA al tejido de un mamífero, tal como un humano. En algunas modalidades preferidas, los polinucleótidos de DNA son administrados oral, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica, o tópicamente. En un aspecto del método de la presente invención, una vacuna de DNA puede ser utilizada para proporcionar la inhibición a largo plazo de la proliferación de células endoteliales en un paciente tratad con la vacuna. En una modalidad preferida del método, una vacuna de DNA que comprende una construcción de polinucleótidos que codifica operablemente a una proteina receptora de VEGF, es administrada a un mamífero en necesidad de la inhibición de la proliferación de células endoteliales, en una cantidad que sea suficiente para provocar una respuesta inmune contra células endoteliales proliferadoras . La presente invención también proporciona un método de inhibir la angiogénesis en un mamífero tratado con la vacuna de DNA. En una modalidad tal del método, una vacuna que comprende una construcción de DNA que codifica operablemente a una proteína receptora del VEGF es administrada a un mamífero que sufre de una enfermedad relacionada con angiogénesis, en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune contra células endoteliales proliferadoras. En aún otro aspecto del método de la presente invención, el crecimiento tumoral es inhibido por medio del tratamiento de un mamífero con una vacuna de DNA. En una modalidad tal del método, una respuesta inmune provocada por una cantidad de una vacuna que comprende una construcción de DNA, que codifica operablemente a una proteína receptora de VEGF es administrada a un mamífero que tiene un tumor creciente. El tratamiento con la vacuna da como resultado la detención del crecimiento del tumor al inmunizar al mamífero contra las células endoteliales proliferadoras. La destrucción de las células endoteliales proliferadoras por medio del sistema inmune del mamífero evita, o al menos minimiza la vascularización del tumor.
En las modalidades del método de la presente invención, las vacunas pueden ser administradas enteralmente, tal como por administración oral, o por inyección intramuscular. Preferiblemente, el mamífero tratado con la vacuna de la invención es un humano. Un paciente que sufre de cáncer, tal como carcinoma de pulmón o de colon, o tumores de próstata retinopatía diabética, y los similares, pueden beneficiarse de la inmunización por medio de las vacunas de la presente invención. Las vacunas de la presente invención son formuladas preferiblemente con portadores o excipientes aceptables farmacéuticamente tales como agua, solución salina, dextrosa, glicerol, y los similares, y combinaciones de los mismos. Las vacunas pueden también contener substancias auxiliares tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes, reguladores, y los similares. Las vacunas de la presente invención son administradas preferiblemente de manera oral a un mamífero, tal como un humano, como una solución o suspensión en un portador aceptable farmacéuticamente, a una concentración de DNA en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 microgramos por mililitro. La dosificación apropiada dependerá del sujeto a ser vacunado, y en parte del juicio del médico practicante que administra o que solicita la administración de la vacuna. Las vacunas de la presente invención pueden ser empacadas en contenedores esterilizados adecuadamente tales como ampolletas, botellas, o frasquitos, ya sea en forma de dosificación unitaria o multi-dosis. Los contenedores son preferiblemente sellados herméticamente después de ser llenados con una preparación de vacuna. Preferiblemente, las vacunas . son empacadas en un contenedor que tiene una etiqueta puesta en el mismo, dicha etiqueta identifica la vacuna, y una noticia de apoyo en una forma prescrita por una agencia del gobierno tal como la United States Food and Drugs Administration que refleja la aprobación de la vacuna bajo las leyes apropiadas, la información de dosificación, y los similares. La etiqueta preferiblemente contiene información acerca de la vacuna que es útil para un profesional en el cuidado de la salud que administra la vacuna a un paciente. El empaque también contiene preferiblemente materiales informativos impresos concernientes a la administración de la vacuna, instrucciones, indicaciones, y cualquier advertencia que se considere necesario. Preferiblemente, las vacunas para la presente invención comprende construcciones de DNA que codifican a una o más proteínas receptoras de VEGF, tales como tirosina quinasas que son especificas para las células endoteliales, que incluyen, por ejemplo Flt-1, KDR, Flk-l, y homólogos funcionales de los mismos. Los homólogos funcionales preferiblemente comparten al menos aproximadamente 80 % de homología con las proteínas receptoras de VEGF anteriormente mencionadas. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas receptoras de VEGF han sido descritas en el arte, como que tienen las secuencias de ácidos nucleicos que codifican a estas proteínas. La secuencia de ácido nucleico que codifica a KDR (FIG. 1, SEC ID NO: 1), y su secuencia de proteína correspondiente (FIG. 2, SEC ID NO: 2) han sido publicadas por Yu y colaboradores, en la base de datos de EMBL de la European Bioinformatics Institute, Welcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK (el Número de Acceso de EMBL es, EMBL :AF063658 ) , cuya descripción se incorpora a la presente como referencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica a Flt-1 (FIG. 3, SEC ID NO: 3), y su secuencia de la proteína correspondiente (FIG. 4, SEC ID NO: 4) han sido publicadas por Yu y colaboradores, en la base de datos de EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK (el Número de Acceso de EMBL es: EMBL:AF063657) , cuya descripción se incorpora a la presente como referencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica a Flk-1, y su secuencia de la proteína correspondiente han sido publicadas por Mathew y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 1991, 88: 9026-9030, y las estructuras fueron corregidas por Quinn y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1991, 90: 7533-7537, cuyas descripciones relevantes se incorporan a la presente como referencia. La secuencia de DNA de Flk-1 corregida se proporciona en la FIG. 5 como la SEC ID NO: 5, y la secuencia de la proteína de Flk-1 corregida se proporciona en la FIG. 6 como al SEC ID NO: 6. Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden usarse en la práctica de la invención otras secuencias de DNA que codifican substancialmente a la misma o a la secuencia de aminoácidos equivalente funcionalmente a las proteínas receptoras de VEGF tales como KDR, Flk-1 y Flt-1. Dichas secuencias de DNA incluyen aquellas que son capaces de hibricizar a las secuencias receptoras del VEGF también. Preferiblemente los homólogos equivalentes funcionalmente del DNA de la proteina receptora del VEGF comparte al menos 80 % de homología con el DNA que codifica a las proteínas receptoras del VEGF anteriormente mencionadas. Las secuencias del DNA alterado que pueden usarse de conformidad con la invención incluyen eliminaciones, adicionales o substituciones de diferentes residuos de nucleótidos dando como resultado que codifican al mismo o a un producto genético equivalente funcionalmente . El producto genético por si mismos puede contener eliminaciones, adiciones o substituciones de residuos de aminoácidos en las secuencias receptoras del VEGF, las cuales dan como resultado un cambio silencioso, produciendo asi unas proteínas receptoras de VEGF equivalentes funcionalmente. Dichas substituciones de aminoácidos pueden hacerse con base en la similaridad de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos principales polares sin carga que tengan valores de hidrofobicidad similares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina. Como se usa en la presente, un receptor del VEGF equivalente funcionalmente se refiere a un receptor que enlaza al VEGF o a fragmentos de los mismos, pero no necesariamente con la misma afinidad de enlace de su contraparte nativa KDR, Flk-1 o Flt-1. Las secuencias de DNA de la invención pueden ser diseñadas a fin de alterar el receptor del VEGF que codifica a la secuencia por una variedad de extremos que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones que modifican el procesamiento y la expresión del producto genético. Por ejemplo, las mutaciones pueden ser introducidas usando técnicas que son bien conocidas en el arte, por ejemplo mutagénesis en sitio dirigido, para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de glicosilación, fosforilación, etc. La Flk-1 (SEC ID NO: 6) de ratón comparten una homología de aproximadamente 85 % con KDR (SEC ID NO: 2) humana y desempeña un papel análogo en la fisiología del ratón al del papel de KDR en humanos. De hecho, VEGFR-2 es a menudo mencionado como KDR/Flk-1, reflejando la estrecha analogía entre estos dos homólogos del receptor de VEGF. Por esta razón, el tratamiento de ratones con una vacuna de DNA de la invención, Flk-1 codificador (por ejemplo, SEC ID NO: 5 de DNA) fue seleccionado como un modelo adecuado para vacunas de DNA humano que codifican a KDR.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar adicionalmente los aspectos y las modalidades de la presente invención, y no significa que sean limitantes de las mismas.
Materiales, Métodos y Ejemplos Materiales ¦ Ratones C57/BL/6J y Balb/C se obtuvieron desde la facilidad de reproducción del Scripps Research Institute. Las lineas celulares de tumor de roedores usadas para la evaluación incluyendo la linea celular B16 de melanoma y la linea celular CT26 de carcinoma de colon, todas las cuales se obtuvieron del Dr. I. J. Fidler, MD Anderson Cáncer Center, Houston, TX. La linea celular D121 de cáncer de pulmón de Lewis se obtuvo del Dr. Lea Eisenbach, Weizmann Institute, Rehovot, Israel. El DNA que codifica a Flk-l fue proporcionado amablemente por el Dr. Lemischka (Princeton University, Princeton, NJ) , y fue clonado en el vector de expresión eucariótico pcDNA3.1 proporcionado por Invitrogen, Huntsville, Alabama, usando los sitios de restricción Kpnl y Xbal. Una cepa atenuada de Salmonella typhimurium fue proporcionada por B.A.D. Stoker (Stanford University, Stanford, CA) . Se obtuvieron los anticuerpos de BD Biosciences, Bedford, MA. El suplemento de cultivo T- STIM se obtuvo de BD Biosciences, Bedford, MA. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) y R-Ficoeritrina (PE) se obtuvieron de Molecular Probes, Eugene, OR. Los anticuerpos marcados con PE y marcados con FITC se prepararon de conformidad con los protocolos recomendados por el fabricante . EJEMPLO 1. Preparación de una Vacuna de DNA que Codifica a Flk-1 El vector pcDNA3.1 que contiene el DNA de Flk-1 (SEC ID NO: 5; aproximadamente 10 pg a aproximadamente 0.1 pg de pDNA) fue electroporado en SaimoneJia typhimurium atenuada preparada recientemente, utilizando un Bio-Rad Pulser a 2.5 kV, 25 pF, y 200 Ohms de conformidad con los procedimientos recomendados por el fabricante. La Salmonella que contiene el vector fue seleccionada sobre placas que contenían ampicilina. Las colonias fueron picadas al día siguiente y cultivadas toda la noche en caldo LB (EM Science, Gibbstown, NJ) con ampicilina añadida. Se aislaron las bacterias y se lavaron en solución salina regulada con fosfato (PBS) . Las bacterias lavadas fueron entonces suspendidas en medio de PBS a una concentración de aproximadamente 1 x 109 de Salmonella recombinante por mililitro de PBS, para formar una solución de vacuna para uso posterior. La vacuna fue almacenada en ampolletas selladas hasta ser usadas. Se preparó también, una "vacuna control" que consiste de Salmonella transformada con el vector pcDNA3.1 solo (sin DNA de Flk-1), de conformidad con el mismo procedimiento. El DNA plásmido se almacenó a aproximadamente -80 °C antes de transformar la Salmonella. EJEMPLO 2.Vacunación de Ratones con una Vacuna de DNA que Codifica a Flk-1.
Se vacunaron ratones Balb/C (aproximadamente 6 ratones por grupo de tratamiento) , con la vacuna de DNA del Ejemplo 1 (aproximadamente 1 x 108 de Salmonella recombinante en aproximadamente 100 µ? de PBS) por sonda oral, tres veces a intervalos semanales. Otro grupo de ratones fueron vacunados con la vacuna control (que consistió de Salmonella atenuada, que contenia el vector vacio) de conformidad con el mismo programa que los ratones vacunados con la vacuna de la invención. EJEMPLO 3. Evaluación de la Resistencia del Tumor de Ratones Vacunados Aproximadamente dos semanas después de la tercera vacunación, los ratones Balb/C del Ejemplo 2 (aproximadamente 6 ratones por grupo de tratamiento) fueron provocados ya sea con aproximadamente 1 x 105 células B16 de melanoma (subcutáneamente), aproximadamente 1 x 105 de células D121 de carcinoma de pulmón de Lewis (subcutáneamente), o aproximadamente 7.5 x 104 células CT26 de carcinoma de colon (intravenosamente) . Los tumores de pulmón de Lewis subcutáneos fueron retirados quirúrgicamente después de aproximadamente dos semanas de crecimiento para permitir la diseminación espontánea en el pulmón. El crecimiento de tumor subcutáneo se midió en dos dimensiones cada segundo día, y se calculó el volumen del tumor de conformidad con la fórmula: Volumen = (ancho2) (largo /2) por cada tumor. La cantidad de metástasis espontánea de D121 a los pulmones se evaluó aproximadamente 30 días después de la remoción del tumor primario subcutáneo. Los ratones fueron sacrificados y sometidos a necropsia, y el peso del tumor de los pulmones fue evaluado de conformidad con el porcentaje de la superficie pulmonar que estaba cubierta por el tumor y se calificó como "0" para sin tumor, "1" para menos de aproximadamente 20 % de cobertura de tumor, "2" para aproximadamente 20 a aproximadamente 30 % de cobertura de tumor, y "3" para mayor de aproximadamente 50 % de cobertura de tumor. La FIGURA 7 muestra fotos de pulmones de tres ratones provocados con células D121 de carcinoma de pulmón de Lewis. El pulmón inferior fue calificado como de 1, mientras que los dos pulmones superiores fueron calificados de 3, teniendo una gran proporción de la superficie del pulmón cubierta por tumores. Los animales que murieron antes del día 30 de evaluación fueron dados como calificación "+". Los resultados de estas evaluaciones se proporcionan en las Tablas 1-4, y las FIGURAS 8-10, discutidas posteriormente en detalle. Tabla 1 ¦ Metástasis de Tumor en Ratones Balb/C Provocados con Células D121 de carcinoma de Pulmón de Lewis Grupo de Vacunación Calificaciones de Ratones Metastáticas Control- vacunación con Salmonela sin transformar 3, 3,3,3,+,+ Control- vacunación con vacuna control (que contenia el vector vacio ) 3,3,3,3,+,+ Vacunación con Vacuna de DNA del Ejemplo 1 (que contenia Flk-1) 0, 0, 1, 1, 1,2,2 Los ratones Balb/C que fueron provocados por medio de inyección intravenosa de células CT-26 de carcinoma de colon fueron evaluados por mortalidad durante un periodo de aproximadamente 63 días (7 semanas) . La información de mortalidad se presenta en la Tabla 2 posterior, y se ilustra gráficamente en la FIG. 8. En la FIGURA 8, el % de supervivencia de ratones tratados con la vacuna de la invención del ejemplo 1 se indicó por medio de la linea sólida llena, gruesa a 100 % de supervivencia. El % de supervivencia de ratones nuevos (sin vacunación) provocados con la célula C26 se indica por medio de la linea delgada, llena, mientras que, el % de supervivencia de los ratones tratados con la vacuna control (sin DNA de Flk-1) se indica por medio de la linea punteada. Tabla 2. Supresión de la Mortalidad en Ratones Balb/c Inmunizados con la Vacuna del Ejemplo 1 y Provocados con Carcinoma CT26 Tratamiento % de super- % de super- % de supervivencia vivencia vivencia 5 en el día 30 en el día 36 en el día 63 Control, sin vacuna 50 0 0 Vacuna Control 33 0 0 Vacuna del lOEjemplo 1 100 100 100 La supresión del crecimiento del tumor primario (subcutáneo) en ratones Balb/C provocados con D121 se evaluó por medio de la determinación del volumen del tumor primario en el dia 14 después de la provocación. Se 15 presentan los resultados en la Tabla 3 posterior, e ilustrado gráficamente en la Figura 9. En la FIGURA 9, la primera barra, marcada "PBS" indica ratones que no fueron vacunados (ratones nuevos) , la barra media, marcada "vector vacío" indica ratones 0 tratados con la vacuna control, y la tercera barra, marcada "pcDNA3.1-FLK1" indica ratones inmunizados con la vacuna del ejemplo 1 de la invención. Tabla 3. Supresión de Tumor de Carcinoma DI 21 Subcutáneo en Ratones Balb/C Inmunizados con la Vacuna del 5 Ej emplo 1 ¦ Tratamiento Volumen de Desviación Tumor (mm3) Estándar Control sin vacuna 665 227 Vacuna Control 641 157 Vacuna del Ejemplo 1 183 35 Se evaluó la supresión del crecimiento de tumor de melanoma B16 subcutáneo por medio del monitoreo del volumen del tumor subcutáneo durante un periodo de aproximadamente 17 días después de la provocación del tumor. Se presentan los resultados en la Tabla 4 y se ilustran gráficamente en la FIGURA 10 posterior. En la FIGURA 10, los datos del volumen promedio de tumor indicados por (·) representa ratones inmunizados con la vacuna de la invención del Ejemplo 1, mientras que los datos indicados por (o) indicaron ratones tratados con la vacuna control. Tabla 4. Supresión de Tumor de Melanoma B16 Subcutáneo en Ratones Balb/C Inmunizados Con la vacuna del Ejemplo 1. Volumen de Tumor (mm3) en el Día Tratamiento 0 9 14 17 Vacuna Control 0 907 1273 4213 Vacuna del Ejemplo 1 0 447 462 1063 % de Supresión de Tumor — 51 % 64 % 75 % EJEMPLO 4. Hiper-regulación de Marcadores de la Activación de CD25, CD69 y CD2 en Esplenocitos (CD8 + Células T) de Ratones Vacunados. Ratones C5/7BL/6J (aproximadamente 4 ratones por grupo de tratamiento) fueron vacunados con la vacuna de DNA del ejemplo 1 y la vacuna control (sin Flk-1) como se describe en el Ejemplo 2. Se aislaron los esplenocitos de los ratones vacunados y el grupo de ratones control aproximadamente seis semanas después de la tercera vacunación. Se cultivaron las células de esplenocitos por 24 horas junto con células de una linea celular de melanoma B16 transducida para expresar a Flk-1 y con células B16 sin transformar en medio de células T (aproximadamente 5 mi por cultivo) que contenía aproximadamente 4 % en volumen de suplemento de cultivo T-STIM (Cat. # 354115, BD Biosciences, Bedford, MA) . Las células fueron entonces teñidas con CD8 + anticuerpo conjugado con FITC y anticuerpos de CD25, CD69, y CD2 conjugados con PE. Las suspensiones celulares fueron evaluadas usando un explorador de FAC Becton Dickenson, para determinar el porcentaje CD6 + células T positivas para CD25 y CD69 por cada combinación de célula de melanoma B16/esplenocito. Se presentan los resultados en la Tabla 5 y se ilustran gráficamente en la FIGURA 11.
Tabla 5. Hiper-regulación de Marcadores de Activación de CD25, CD69 y CD2 en Esplenocitos de Ratones Vacunados Tratamiento % de CD25 % de CD69 CD positivo Positivo positivo fluorescencia Media Vacuna control + Células B16-Flk-1 9 18 570 mfu Vacuna de DNA + Células B16 12 29 550 mfu Vacuna de DNA + Células B16-Flk-1 21 35 700 mfu mfu = unidades de fluorescencia media Los resultados proporcionados en las Tablas 1-5 y en las FIGURAS 8-11 demuestran que la vacuna de DNA del ejemplo 1, que comprende un DNA que codifica a Flk-1, el análogo de roedor de KDR, efectivamente puede inmunizar contra una variedad de células cancerosas formadoras de tumor. Aunque no se pretende adoptar teoría alguna, se cree que la vacuna actúa por inhibición de la angiogénesis en el tumor, es decir, evitar la formación de nuevos vasos sanguíneos y efectivamente sub-alimentar el tumor. Los datos de la Tabla 1 demuestran que la vacuna del ejemplo 1 de la invención conduce a la supresión de metástasis tumoral en los pulmones de ratones provocados con carcinoma de puimón de Lewis D121. Ninguno de los ratones inmunizados con la vacuna del Ejemplo 1 murieron, y todos tuvieron menos que aproximadamente 50 % de cobertura de tumor en los pulmones (2 tuvieron < 20 ¾) . En contraste, dos ratones murieron de cada grupo control y todos los ratones que permanecieron tuvieron más que aproximadamente 50 ¾ de cobertura de tumor en los pulmones . La vacuna del Ejemplo 1 de la invención también disminuyó la mortalidad de ratones Balb-C que fueron provocados intravenosamente por medio de células CT-26 de carcinoma de colon, como se demuestra por los datos de la Tabla 2 y la FIGURA 8. Todos los ratones inmunizados con la vacuna del ejemplo 1 sobrevivieron el periodo completo de observación de 63 días después de provocación. En los grupos control, no obstante, todos los ratones murieron en el día 36 post-provocación. Como se demostró en los datos de la Tabla 3 y FIGURA 9, el crecimiento de tumor de carcinoma de pulmón de Lewis D121 subcutáneo fue suprimido por medio de la inmunización con la vacuna del Ejemplo 1 de la invención, por un factor de aproximadamente 4.3 a aproximadamente 4.5, en relación a los grupos de ratones control tratados sin vacuna o con la vacuna control. De manera similar, como se muestra en la Tabla 4 y la FIGURA 10, el crecimiento de tumor de melanoma B16 fue suprimido por un factor de aproximadamente 4 en ratones inmunizados con la vacuna del ejemplo 1 de la invención, en relación al crecimiento de tumor en el grupo control.
Los datos de la Tabla 5 y la FIGURA 11 muestran que esplenocitos aislados de ratones C57/BL/6J vacunados con la vacuna de DNA del Ejemplo 1 exhibieron una hiper-regulación de marcadores de la activación de CD2, CD25 y CD69 en relación al grupo de control de ratones, cuando se cultivaron con células de melanoma B16 transformadas para presentar el antigeno de Flk-1. Numerosas variaciones y modificaciones de las modalidades descritas anteriormente pueden ser efectuadas sin alejarse del espíritu y el alcance del nuevo aspecto de la invención. Se comprende que sin limitaciones con respecto a las modalidades específicas ilustradas en la presente son o serían inferidas. Se pretende, por supuesto, cubrir por las reivindicaciones todas las modificaciones que caen en el alcance de la invención.
LISTADO DE SECUENCIAS <110) The Scripps Research Institute Ralph A. Reisfeld Andrew G. Niethammer Rong Xiang <120> VACUNA DE DNA CONTRA CELULAS ENDOTELIALES PROLIFERADORAS Y METODOS DE USO DE LA MISMA <130> TSRI-829.0 PCT <150> 10/090,183 <151> 02-03-2002 <160> 6 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 4071 <212> DNA <213> humano atggagagca aggtgctgct ggccgtcgcc ctgtggctct gcgtggagac ccgggccgcc 60 tctgtgggtt tgcctagtgt ttctcttgat ctgcccaggc tcagcataca aaaagacata 120 cttacaatta aggctaatac aactcttcaa attacttgca ggggacagag ggacttggac 160 tggctttggc ccaataatca gagtggcagt gagcaaaggg tggaggtgac tgagtgcagc 240 gatggcctct tctgtaagac actcacaatt ccaaaagtga tcggaaatga cactggagcc 300 tacaagtgct tctaccggga aactgacttg gcctcggtca tttatgtcta tgttcaagat 360 tacagatctc catttattgc ttctgttagt gaccaacatg gagtcgtgta cattactgag 420 aacaaaaaca aaactgtggt gattccatgt ctcgggtcca tttcaaatct caacgtgtca 480 ctttgtgcaa gatacccaga aaagagattt gttcctgatg gtaacagaat ttcctgggac 540 agcaagaagg gctttactat tcccagctac atgatcagct atgctggcat ggtcttctgt 600 5 gaagcaaaaa ttaatgatga aagttaccag 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Asp Ser Asp Gly Phe Tyr . Lys Glu 980 9B5 990 Pro lie Thr Met Glu Asp Leu lie Ser Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg 995 .1000 1005 Gly Met. Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys lie His Arg Asp Leu Ala 1010 1015 1020 Ala Arg Asn lie Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys lie Cys Asp 1025 1030 1035 1040 Phe Gly Leu Ala Arg Asp lie Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr Val Arg Lys 1045 1050 1055 Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser lie Phe 1060 1065 1070 Asp Lys lie Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Leu 1075 1080 1085 Leu Trp Glu lie Phe Ser Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gln 1090 1095 1100 Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu Arg Glu Gly Met Arg Met Arg 1105 1110 1115 1120 Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu lie Tyr Gln lie Met Leu Asp Cys 1125 1130 1135 Trp His Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu 1140 1145 1150 Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gln Ala Asn Val Gln Gln Asp Gly Lys Asp 1155 1160 1165 Tyr lie Pro lie Asn Ala lie Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr 1170 1175 1180 Ser Thr Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser lie Ser Ala 1185 1190 1195 1200 Pro Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala 1205 1210 1215 Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg lie Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu 1220 1225 1230 Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gln Gly Asp Ser Ser Thr 1235 1240 1245 Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser Lys 1250 1255 ' 1260 Pro Lys Ala Ser Leu Lys lie Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys Ser Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys His Ser Ser 1285 1290 1295 Cys Gly His Val Ser Glu. Gly Lys Arg Arg Phe Thr Tyr Asp His Ala 1300 1305 1310 Glu Leu Glu Arg Lys lie Ala Cys Cys Ser Pro Pro Pro Asp Tyr Asn 1315 1320 1325 Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro lie 1330 1335 . <210> 5 <211> 5390 <212> DNA <213> ratón <400> 5 ctgtgtcccg cagccggata acctggctga cccgattccg cggacaccgc tgcagccgcg 60 gctggagcca gggcgccggt gccccgcgct ctccccggtc ttgcgctgcg ggggccatac 120 cgcctctgtg acttctttgc gggccaggga cggagaagga gtctgtgcct gagaaactgg 160 gctctgtgcc caggcgcgag gtgcaggatg gagagcaagg cgctgctagc tgtcgctctg 240 tggttctgcg tggagacccg agccgcctct gtgggtttga ctggcgattt tctccatccc 300 cccaagctca gcacacagaa agacatactg acaattttgg caaatacaac ccttcagatt 360 acttgcaggg gacagcggga c tggactgg ctttggccca atgctcagcg tgattctgag 420 gaaagggtat tggtgactga atgcggcggt ggtgacagta tcttctgcaá aacactcacc 480 attcccaggg tggttggaaa tgatactgga gcctacaagt gctcgtaccg ggacgtcgac 540 atagcctcca ctgtttatgt ctatgttcga gattacagat caccattcat cgcctctgtc 600 agtgaccagc atggcatcgt gtacatcacc gagaacaaga acaaaactgt ggtgatcccc 660 tgccgagggt cgatttcaaa cctcaatgtg tctctttgcg ctaggtatcc agaaaagaga 720 tttgttccgg atggaaacag aatttcctgg gacagcgaga taggctttac tctccccagt 780 taca gatca gctatgccgg catggtcttc tgtgaggcaa agatcaatga tgaaacct t T 0 cagtctatca tgtacatagt tgtggttgta ggatatagga tttatgatgt gattctgagc 900 ' cccccgcatg aaattgagct atctgccgga gaaaaacttg tcttaaattg tacagcgaga 960 acagagctca atgtggggct tgatttcacc tggcactctc cacct caaa gtc cateat 1020 aagaagattg taaaccggga tgtgaaaccc tttcctggga ctgtggcgaa gatgtttttg 1080 agcaccttga caatagaaag tgtgaccaag agtgaccaag gggaatacac ctgtgtagcg 1140 tccagtggac ggatgatcaa gagaaataga acatttgtcc gagttcacac aaagcctttt 1200 attgcCttcg gtagtgggat gaaatctttg gtggaagcca cagtgggcag tcaagtccga 1260 atccctgtga agtatctcag ttacccagct cctgatatca aatggtacag aaatggaagg 1320 cccattgagt ccaactacac aatgattgtt ggcgatgaac tcaccatcat ggaagtgact 1380 gaaagagatg caggaaacta cacggteate ctcaccaacc ccatttcaat ggagaaacag 1440 agccaca gg tctctctggt tgtgaatgtc ccaccccaga tcggtgagaa agccttgatc 1500 tcgcctatgg attcctacca gtatgggacc atgcagacat tgacatgcac agtctacgcc 1560 aaccctcccc tgcaccacat ccagtggtac tggcagctag aagaagcctg ctcctacaga 1620 cccggccaaa caagcccgta tgcttgtaaa gaatggagac acgtggagga tttccagggg 1680 ggaaacaaga tcgaagtcac caaaaaccaa tatgccctga ttgaaggaaa aaacaaaact 1740 gtaagtacgc tggtcatcca agctgccaac gtgtcagcgt tgtac aatg tgaagcca c 600 aacaaagcgg gacgaggaga gagggtcatc tccttccatg tgatcagggg tcctgaaatt 1T60 actgtgcaac ctgctgccca gccaactgag caggágagtg tgtccctgtt gtgcactgca 1920 gacagaaata cgtttgagaa cctcacgtgg tacaagcttg gctcacaggc aacatcggtc 1980 cacatgggcg aatcactcac accagtttgc aagaacttgg atgctctttg gaaactgaat 2040 ggcaccatgt tttctaacag cacaaatgac atcttgattg tggcatttca gaatgcctct 2100 ctgcaggacc aaggcgacta tgtttgctct gctcaagata agaagaccaa gaaaagacat 2160 tgcctggtca aacagctcat catcctagag cgcatggcac ccatgatcac cggaaatctg 2220 gagaatcaga caacaaccat tggcgagacc a tgaagtga cttgcccagc a ctggaaat 2280 cctaccccac acattacatg gttcaaagac aacgagaccc tgg agaaga ttcaggcatt 2340 gtactgagag atgggaaccg gaacctgact tccgcaggg tgagg agga ggatggaggc 400 ctctacacct gccaggcctg caatgtcctt ggctgtgcaa gagcggagac gctct ca a 2460 atagaaggtg cccaggaaaa gaccaac g gaagtcatta tcctcgtcgg cactgcagtg 2520 attgccatgt tcttctggct ccttcttgtc attgtcctac ggaccgttaa gcgggccaat 2S80 gaaggggaac tgaagacagg ctacttgtct attgtcatgg atccagatga attgcccttg 2640 gatgagcgct gtgaacgctt gccttatgat . gccagcaagt gggaattccc cagggaccgg 2700 ctgaaactag gaaaacctct tggccgcggt gccttcggcc aagtgattga ggcagacgct 2760 tttggaattg acaagacagc gacttgcaaa acagtagccg tcaagatgtt gaaagaagga 2620 gcaacacaca gcgagcatcg agccctcatg tctgaactca agatcctcat ccacattggt 2880 caccatctca atgtggtgaa cctcctaggc gcctgcacca agccgggagg gcctctcatg 2940 gtgattgtgg aattctgcaa gtttggaaac ctatcaactt acttacgggg caagagaaat 3000 gaatttgttc cc ataagag caaaggggca cgcttccgcc agggcaagga ctacgttggg 3060 gagctctccg tggatctgaa aagacgcttg gacágcatca ccagcagcca gagctctgcc 3120 agctcaggct ttgttgagga gaaatcgctc agtgatgtag aggaagaaga agcttctgaa 3180 gaactgtaca aggacttcct gaccttggag catctcatct gttacagctt ccaagtggct 3240 aagggcatgg agttcttggc atcaaggaag tgtatccaca gggacctggc agcacgaaac 3300 attctcctat cggagaagaa tgtggttaag atctgtgact tcggcttggc ccgggacatt 3360 tataaagacc cggattatgt cagaaaagga gatgcccgac tccctttgaa gtggatggcc 3420 ccggaaacca tttttgacag agtatacaca attcagagcg atgtgtggtc tctcggtgtg 3480 ttgctctggg aaatattttc cttag^gtgcc tccccatacc ctggggtcaa gattgatgaa 3540 gaattttgta ggagattgaa agaaggaact agaatgcggg ctcctgacta cactacceca 3600 gaaatgtacc agaccatgct ggactgctgg catgaggacc ccaa cagag accctcgttt 3660 tcagagttgg tggagcattt gggaaacctc ctgcáagcaa atgcgcagca ggatggcaaa 3720 gactatattg ttcttccaat gtcagagaca ctgagcatgg aagaggattc tggactctcc 3780 ctgcctacct cacctgtttc ctgtatggag gaagaggaag tgtgcgaccc caaattccat 3840 tatgacaaca cagcaggaat cagtcattat ctccagaaca gtaagcgaaa gagccggcca 3900 gtgagtgtaa aaacatttga agatatccca ttggaggaac cagaagtaaa agtgatccca 3960 gatgacagcc agacagacag tgggatggtc cttgcatcag aagagctgaa aactctggaa 4020 gacaggaaca aattatctcc atcttttggt ggaatgatgc ccagtaaaag cagggagtct 4080 gtggcctcgg aaggctccaa ccagaccagt ggctaccagt ctgggtatca ctcagatgac 4140 acagacacca ccgtgtactc cagcgacgag gcaggacttt taaagatggt ggatgctgca 4200 gttcacgctg actcagggac cacactgcgc tcacctcctg tttaaatgga agtggtcctg 4260 tcccggctcc gcccccaact cctggaaatc acgagagagg tgctgcttag attttcaagt 4320 gttgttcttt ccaccacccg gaágtagcca catttgattt tcatttttgg aggagggacc 4380 tcagactgca aggagcttgt cctcagggca tttccagaga agatgcccat gacccaagaa 4440 tgtgttgact ctactctctt ttccattcat ttaaaag cc t a aatgt gccctgc gt 500 ggtctcacta ccagttaaag caaaagactt tcaaacacgt ggactctgtc ctccaagaag 4560 tggcaacggc acctctgtga aactggatcg aatgggcaat gctttgtgtg ttgaggatgg 4620 gtgagatgtc ccagggccga gtctgtctac cttggaggct ttgtggagga tgcggctatg 4680 agccaagtgt taagtgtggg atgtggactg ggaggaagga aggcgcaagt cgctcggaga 4740 gcggttggag cctgcagatg cattgtgctg gctctggtgg aggtgggctt gtggcctgtc 4800 aggaaacgca aaggcggccg gcagggtttg gttttggaag gtttgcgtgc tcttcacagt 4T60 cgggttacag gcgagttccc tgtggcgttt cctactccta atgagagttc cttccggact 4920 cttacgtgtc tcctggcctg gccccaggaa ggaaatgacg cagcttgctc cttcctcatc 4980 tctcaggctg tgccttaatt cagaacacca aaagagagga acgtcggcag aggctcctga S040 cggggccgaa gaattgtgag aacagaacag aaactcaggg tttctgctgg gtggagaccc 5100 acgtggcgcc ctggtggcag gtctgagggt tctctgtcaa gtggcggtaa aggctcaggc 5160 tggtgttctt cctctatctc cactcctgtc aggcccccaa gtcctcagta ttttagcttt 5220 gtggcttcct gatggcagaa aaatcttaat tggttggttt gctctccaga . taatcactag 5280 ccaga tcg aaattacttt ttag cgagg ttatgataac atctactgta tcctttagaa 5340 ttttaaccta taaaactatg tctactggtt tctgcctgtg tgcttatgtt 5390 <210> 6 <211> 1345 <212> PRT <213> ratón <400> 6 Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Phe ys Val Glu 1 5 10 15 Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Thr Gly Asp Phe Leu His Pro Pro 20 25 30 Lys Leu Ser Thr Gln Lys Asp lie Leu Thr lie Leu Ala Asn Thr Thr 35 40 45 Leu Gln l e Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro 50 55. 60 Asn Ala Gln Arg Asp Ser Glu Glu Arg Val Leu Val Thr Glu Cys Gly 65 70 75 80 Gly Gly Asp Ser lie Phe Cys Lys Thr Leu Thr lie Pro Arg Val Val 85 90 95 Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Ser Tyr Arg Asp Val Asp lie 100 105 110 Ala Ser Thr Val Tyr Val Tyr Val Arg Ásp Tyr Arg Ser Pro Phe lie 115 120 125 Ala Ser Val Ser Asp Gln Hls Gly lie Val Tyr lie Thr Glu Asn Lys 130 135 140 Asn Lys Thr Val Val lie Pro Cys Arg Gly Ser lie Ser Asn Leu Asn 145 150 155 160 Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly 165 170 175 Asn Arg lie Ser Trp Asp Ser Glu lie Gly Phe Thr Leu Pro Ser Tyr 180 185 190 Met lie Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys lie Asn Asp 195 200 205 Glu Thr Tyr Gln Ser lie Met Tyr lie Val Val Val Val Gly Tyr Arg 210 215 220 lie Tyr Asp Val lie Leu Ser Pro Pro His Glu lie Glu Leu Ser Ala 225 230 235 240 Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val 245 250 255 Gly Leu Asp Phe Thr Trp His Ser Pro Pro Ser Lys Ser His His Lys 260 265 270 Lys lie Val Asn Arg As Val Lys Pro Phe P o Gly Thr Val Ala Lys 275 280 28S Met Phe Leu Ser Thr Leu Thr lie Glu Ser Val Thr Lys Ser Asp Gln 290 295 300 Gl Glu Tyr Thr Cys Val Ala Ser Ser Gly Arg Met lie Lys Arg Asn 305 310 315 320 Arg Thr Phe Val Arg Val His Thr Lys Pro Phe lie Ala Phe Gly Ser 325 330 335 Gl Me Lys Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Ser Gln Val Arg lie 340 345 350 Pro Val Lys Tyr Leu Ser Tyr Pro Ala Pro Asp lie Lys Trp Tyr Arg 35S 360 365 Asn Gly Arg Pro lie Glu Ser Asn Tyr Thr Met lie Val Gly Asp Glu 370 375 380 Leu Thr lie Met Glu Val Thr Glu Arg Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Val 385 390 395 400 lie Leu Thr Asn Pro lie Ser Met Glu Lys Gln Ser His Met Val Ser 405 10 415 Leu. Val Val Asn Val P o Pro Gln li Gly Glu Lys Ala Leu lie Ser 420 425 430 Pro Met Asp Ser Tyr Gln Ty Gly Thr Met Gln Thr Leu Thr Cys Thr 43 440 445 Val Tyr Ala Asn Pro Pro Leu His His lie Gln Trp Tyr Trp Gln Leu 450 455 460 Glu Glu Ala Cys Ser Tyr Arg Pro Gly Gln Thr Ser Pro Tyr Ala Cys 465 470 475 480 Lys Glu Trp Arg His Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys Tle Glu 485 490 495 Val Thr Lys Asn Gln Tyr Ala Leu lie Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val 500 505 510 Ser Thr Leu Val lie Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr Lys Cys 515 S20 525 Glu Ala lie Asn Lys Ala Gly Arg Gly Glu Arg Val lie Ser Phe His 530 535 540 Val lie Arg Gly Pro Glu lie Thr Val Gln Pro Ala Ala Gln Pro Thr 545 550 555 560 Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Leu Cys Thr Ala Asp Arg Asn Thr Phe 56S 570 575 Glu Asn Leu Thr rp Tyr Lys Leu Gly Ser Gln Ala Thr Ser Val His 580 585 590 Met Gly Glu Ser Leu Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu A p Ala Leu Trp 595 600 605 Lys Leu Asn Gl Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp lie Leu lie 610 615 620 Val Ala Phe Gln Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr Val Cys 625 630 635 640 Ser Ala Gln Asp Lys Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Leu Val Lys Gln 645 650 655 Leu lie lie Leu Glu Arg Met Ala Pro Met lie Thr Gly Asn Leu Glu 660 665 670 Asn Gln Thr Thr Thr lie Gly Glu Thr lie Glu Val Thr Cys Pro Ala 675 680 665 Ser Gly Asn Pro Thr Pro Hls lie Thr Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr 690 695 700 Leu Val Glu Asp Ser Gly lie Val Leu Arg Asp Gly A n Árg Asn Leu 705 710 715 720 Thr lie Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Cys Gln 725 730 735 Ala Cys Asn Val Leu Gly Cys Ala Arg Ala Glu Thr Leu Phe lie lie 740 745 7S0 Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Val lie lie Leu Val Gly 755 760 765 Thr Ala Val lie Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val lie Val Leu 770 775 780 Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Glu Gly Glu Leu Lys Thr Gly Tyr Leu 785 790 795 800 Ser lie Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu Arg Cys Glu 805 ' 810 815 Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu 820 825 830 Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val lie Glu 835 840 845 Ala Asp Ala Phe Gly lie Asp Lys Thr Ala Thr Cys Lys Thr Val Ala 850 855 860 Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala Leu 865 870 875 seo Met Ser Glu Leu Lys lie Leu lie His lie Gly His His Leu Asn Val 885 890 895 Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met Val 900 90S 910 lie Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg Gly 915 920 925 Lys Arg Asn Glu Phe Val. Pro Tyr Lys Ser Lys Gly Ala Arg Phe Arg 930 935 940 Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Glu Leu Ser Val Asp Leu Lys Arg Arg 945 950 955 960 Leu Asp Ser lie Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe Val 965 970 975 Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu,Glu Glu Glu Ala Ser Glu Glu 980 . .. 985 '·.¾..' 990 Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu lie Cys Tyr Ser Phe 995 1000 1005 Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys lie His 1010 1015 ; 1020 Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn lie Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val Val 1025 1030 1035 1040 Lys lie Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp lie Tyr Lys Asp Pro Asp 1045 1050 1055 Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro 1060 1065 1070 Glu Thr lie Phe Asp Arg Val Tyr Thr lie Gln Ser Asp Val Trp Ser 1075 1080 1085 Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu lie Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr 1090 1095 1100 Pro Gly Val Lys lie Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly 1105 1110 1115 1120 Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr . 1125 1130 . 1135 Met Leu Asp Cys Trp His Glu Asp Pro Asn Gln Arg Pro Ser Phe Ser 1140 1145 1150 Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln 1155- 1160 1165 Asp Gly Lys Asp Tyr lie Val Leu Pro Met Ser Glu Thr Leu Ser Met 1170 1175 1180 Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met 1185 1190 1195 1200 Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala 1205 1210 1215 Gly lie Ser His Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro Val 1220 1225 1230 Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp lie Pro Leu Glu Glu Pro Glu Val Lys 1235 1240 1245 Val lie Pro Asp Asp Ser Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu Ala Ser 1250 1255 1260 Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Asn Lys Leu Ser Pro Ser Phe 1265 1270 1275 1280 Gly Gly Met Met Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser Glu Gly 1285 1290 1295 Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp Asp Thr 1300 1305 . 1310 Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Asp Glu Ala Gly Leu Leu Lys Met Val 1315 1320 1325 Asp Ala Ala Val His Ala Asp Ser Gly Thr Thr Leu Arg Ser Pro Pro 1330 1335 1340 Val 1345

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una vacuna de DNA efectiva para provocar una respuesta inmune contra células endoteliales proliferadotas, caracterizada porque comprende una construcción de DNA que codifica operablemente a una proteina receptora del VEGF en un portador aceptable farmacéuticamente . 2. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina receptora del VEGA es una proteina receptora del VEGF-
2.
3. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina receptora de VEGF es seleccionada del grupo que consiste de VEGF-2 (KDR; SEC ID NO: 2), VEGF-1 (Flt-1; SEC ID NO: 4), Flk-l (SEC ID NO: 6) , y un equivalente funcional de la misma que comparta al menos 80 % de homología con ésta.
4. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la construcción de DNA es una construcción de DNA desnudo.
5. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la construcción de DNA es incorporada operablemente en un vector plásmido.
6. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la construcción de DNA es incorporada operablemente en un vector bacteriano atenuado.
7. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el vector bacteriano es seleccionado del grupo que consiste de Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, BCG, Escherichia coli, Vibrio cholerae, y Campylobacter atenuados.
8. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el vector bacteriano atenuado es una Salmonella typhimurium atenuada.
9. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la construcción de DNA es un DNA substancialmente purificado que tiene una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, y un homólogo funcional de la misma que comparte al menos aproximadamente 80 % de homología con ésta.
10. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la construcción de DNA es incorporada operablemente en un vector de Salmonella typhimurium atenuada,
11. Un método de inhibir la proliferación de células endoteliales en un mamífero, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al mamífero una 5 cantidad, que provoque una respuesta inmunológica efectiva de una vacuna de DNA que comprenda una construcción de DNA que codifica operablemente a una proteína receptora del VEGF y un portador aceptable farmacéuticamente para éste, por medio del cual el mamífero exhibe una respuesta inmune 10 provocada por la vacuna y específica para células endoteliales proliferadoras .
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el mamífero es un humano.
13. El método de conformidad con la reivindicación 15 11, caracterizado porque la proteína receptora del VEGF es seleccionada del grupo que consiste de VEGF-2 (KDR; SEC ID NO: 2), VEGFR-1 (Flt-1; SEC ID NO: 4), Flk-1 (SEC ID NO: 6) , y un homólogo funcional de la misma que comparte al menos 80 % de homología con ésta. 20 1 . El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la construcción de DNA es incorporada operablemente en un vector bacteriano atenuado . 15. El método de conformidad con la reivindicación 25 14, caracterizado porque el vector bacteriano atenuado es seleccionado de Salmonella typhimurium, Salmonella typhi , Shigella , Bacillus, Lactobacillus, BCG, Escherichia coli. Vibrio cholerae, y Campylobacter atenuados. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el vector bacteriano atenuado es una Salmonella typhimurium atenuada. 17. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la vacuna es administrada oralmente . 18. Un método de inhibir la angiogénesis en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva inmunológicamente de una vacuna de DNA que comprende una construcción de DNA que codifica operablemente a una proteína receptora del VEGF y un portador aceptable farmacéuticamente para ésta, con lo cual el mamífero exhibe una respuesta inmune provocada por la vacuna y específica para células endoteliales proliferadoras, dando como resultado una inhibición de la formación de vasos sanguíneos. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el mamífero es un humano. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la proteína receptora de VEGF es seleccionada del grupo que consiste de VEGF-2 (KDR; SEC ID NO: 2), VEGF-1 (Flt-1; SEC ID NO: 4), Flk-1 (SEC ID NO: 6) , y un homólogo funcional de la misma que comparte al menos aproximadamente 80 % de homología con ésta. 21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la construcción de DNA es incorporada operablemente en un vector bacteriano atenuado . 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el vector bacteriano atenuado es seleccionado de SalmonelJa typhimurium, Salmonella typhi , Shigella, Bacillus, Lactobacillus, BCG, Escherichia coli. Vibrio cholerae, y Campylobacter atenuados. 23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el vector bacteriano atenuado es una Salmonella typhimurium atenuada. 24. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la vacuna es administrada oralmente . 25. Un método de inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva inmunológica de una vacuna de DNA que comprende una construcción de DNA que codifica operablemente a una proteína receptora del VEGF y un portador aceptable para el mismo, con lo cual el mamífero exhibe una respuesta inmune provocada por la vacuna y específica para células endoteliales proliferadoras, dando como .resultado la detención del crecimiento tumoral, la reducción del tamaño del tumor, o la inhibición de la diseminación del tumor. 26. El método de conformidad con la reivindicación 5 25, caracterizado porque el mamífero es un humano. 27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la proteina receptora del VEGF, es seleccionada del grupo que consiste de VEGF-2 (KDR; SEC ID NO: 2), VEGFR-1 (Flt-1; SEC ID NO: 4), Flk-1 (SEC ID 10 NO: 6) , y un homólogo funcional de la misma que comparte al menos 80 % de homología con ésta. 28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la construcción de DNA es incorporada operablemente en un vector bacteriano 15 atenuado. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el vector bacteriano atenuado es seleccionado de Salmonella typhimurium, Salmonella typhi , Shigella, Bacillus, Lactobacillus, BCG, Escherichia coli, 20 Vibrio cholerae, y Campylobacter atenuados. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el vector bacteriano atenuado es una Salmonella typhimurium atenuada. 31. El método de conformidad con la reivindicación 25 25, caracterizado porque la vacuna es administrada oralmente . 32. Un articulo de fabricación caracterizado porque comprende una vacuna de conformidad con la reivindicación 1 empacado en un contenedor estéril, sellado herméticamente, el contenedor tiene una etiqueta · fijada a éste, la etiqueta posee material impreso que identifica a la vacuna y que proporciona información útil para administración individual de la vacuna a un paciente.
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