PT1487482E - Vacina de adn contra células endoteliais proliferantes e métodos para a sua utilização - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Vacina de ADN contra células endoteliais proliferantes e métodos para a sua utilização"

CAMPO DO INVENTO

Este invento refere-se a vacinas de ácido desoxirribonucleico (ADN) codificando moléculas adequadas eficazes para induzir uma resposta imunitária contra células endoteliais proliferantes. Mais particularmente, este invento refere-se a vacinas de ADN codificando o receptor de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). A vacina de ADN pode ser utilizada para inibir a proliferação de células endoteliais vasculares, o crescimento de um tumor e a angiogénese.

ANTECEDENTES DO INVENTO Têm sido utilizadas vacinas para proporcionar uma protecção de longo prazo contra vários estados de doença, pela administração muito limitada de um agente profiláctico que estimula o sistema imunitário de um organismo para destruir patogénios de uma doença antes de estes proliferarem e causarem um efeito patológico. Em Bernard R. Glick e Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies and

Applications of Recombinant DNA, Segunda Edição, ASM Press págs. 253-276 (1998), são descritas várias abordagens a vacinas e vacinações. A vacinação é um meio de induzir o sistema imunitário próprio do organismo para procurar e destruir um agente infectante antes de este causar uma resposta patológica. Tipicamente, as vacinas são quer agentes infecciosos (vírus ou bactérias) vivos, mas atenuados, quer uma forma morta do agente. Uma vacina consistindo de uma bactéria ou vírus vivos tem de ser não patogénica. Tipicamente, uma cultura bacteriana ou virai é atenuada (enfraquecida) por tratamento físico ou químico. Apesar de o agente ser não virulento, pode ainda induzir uma resposta imunitária num sujeito tratado com a vacina. 2

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Uma resposta imunitária é induzida por antigénios, quer macromoléculas especificas, quer um agente infeccioso. Estes antigénios são geralmente proteínas, polissacáridos, lípidos ou glicolípidos, que são reconhecidos como "estranhos" por linfócitos conhecidos como células B e células T. A exposição de ambos os tipos de linfócitos a um antigénio induz uma rápida resposta de divisão e diferenciação celular, resultando na formação de clones dos linfócitos expostos. As células B produzem células de plasma que, por sua vez, produzem proteínas denominadas anticorpos (Ab), que se ligam selectivamente aos antigénios presentes no agente infeccioso, assim neutralizando ou inactivando o patogénio (imunidade humoral). Em alguns casos, a resposta de células B requer a assistência de células T auxiliares CD4. 0 clone de células T especializado, que se forma em resposta à exposição ao antigénio, é um linfócito T citotóxico (CTL) , que é capaz de se ligar a e de eliminar patogénios e tecidos que apresentam o antigénio (imunidade celular ou mediada por células). Nalguns casos, uma célula de apresentação de antigénio (APC), tal como uma célula dendrítica, envolverá um patogénio ou outra célula estranha por endocitose. A APC processa então os antigénios a partir das células e apresenta estes antigénios na forma de um complexo de péptido:molécula de histocompatibilidade ao receptor de células T (TCR) nos CTL, estimulando assim uma resposta imunitária. A imunidade humoral caracterizada pela formação de anticorpos específicos é geralmente muito eficaz contra infecções bacterianas agudas e infecções repetidas por vírus, enquanto a imunidade mediada por células é muito eficaz contra infecções virais, infecções bacterianas intracelulares crónicas e infecções fúngicas. É também conhecido que a imunidade celular protege contra cancros e é responsável pela rejeição de transplantes de órgãos.

Anticorpos contra antigénios de infecções anteriores permanecem detectáveis no sangue durante períodos de tempo muito longos, proporcionando assim meios para determinação da exposição anterior a um patogénio. Após reexposição ao mesmo patogénio, o sistema imunitário impede eficazmente a 3 ΕΡ 1 487 482/ΡΤ reinfecção por eliminação do agente patogénico antes de este poder proliferar e produzir uma resposta patogénica. A mesma resposta imunitária que seria induzida por um patogénio pode também por vezes ser produzida por um agente não patogénico que apresenta o mesmo antigénio que o patogénio. Deste modo, o sujeito pode ser protegido contra exposição subsequente ao patogénio sem ter combatido previamente uma infecção.

Nem todos os agentes infecciosos podem ser prontamente cultivados e inactivados, como requerido para formação de vacinas. Contudo, as modernas técnicas de ADN recombinante têm permitido a engenharia de novas vacinas para procurar ultrapassar esta limitação. Podem ser criados agentes infecciosos que não possuem os genes patogénicos, permitindo assim a utilização de uma forma viva, não virulenta, do organismo a utilizar como vacina. É também possível produzir por engenharia um organismo relativamente não patogénico tal como E. coli para apresentar os antigénios da superfície celular de um transportador patogénico. 0 sistema imunitário de um sujeito tratado com um tal transportador transformado é "enganado" para formar anticorpos para o patogénio. As proteínas antigénicas de um agente patogénico podem ser transformadas por engenharia e expressas numa espécie não patogénica e as proteínas antigénicas podem ser isoladas e purificadas para produzir uma "vacina subunitária". As vacinas subunitárias têm a vantagem de serem estáveis, seguras e quimicamente bem definidas; contudo, a sua produção pode ser proibitiva em termos de custo.

Uma nova abordagem a vacinas tem emergido em anos recentes, denominada geralmente por imunização genética. Nesta abordagem, um gene codificando um antigénio de um agente patogénico é inserido operavelmente em células no sujeito a ser imunizado. As células tratadas são transformadas e produzem as proteínas antigénicas do patogénio. Estes antigénios produzidos in vivo despoletam então a resposta imunitária desejada no hospedeiro. 0 material genético utilizado nestas vacinas genéticas pode ser uma construção quer de ADN quer de ARN. Muitas vezes, o polinucleótido codificando o antigénio é introduzido em 4

ΕΡ 1 487 482/PT combinação com outras sequências de polinucleótido de promotor para melhorar a inserção, replicação ou expressão do gene.

As vacinas de ADN de genes codificando o antigénio podem ser introduzidas nas células hospedeiras do sujeito por uma variedade de sistemas de expressão. Estes sistemas de expressão incluem sistemas de expressão de procariotas, mamífero e levedura. Por exemplo, uma abordagem é utilizar um vector virai, tal como vírus vacínia incorporando o novo material genético, para inocular as células de hospedeiro. Alternativamente, o material genético pode ser incorporado num vector ou pode ser entregue directamente às células de hospedeiro como um polinucleótido "nu", i.e. simplesmente como ADN purificado. Adicionalmente, o ADN pode ser transfectado de modo estável em bactérias atenuadas tais como Salmonella typhimurium. Quando um paciente é vacinado oralmente com a Salmonella transformada, as bactérias são transportadas para placas de Peyer no intestino (i.e., tecidos linfóides secundários), que depois estimulam uma resposta imunitária.

As vacinas de ADN proporcionam uma oportunidade para imunização contra estados de doença que não são causados por patogénios tradicionais, tais como doenças genéticas e cancro. Tipicamente, numa vacina de cancro genético, antigénios para um tipo específico de células de tumor têm de ser isolados e depois introduzidos na vacina. Uma vacina geral eficaz contra vários cancros pode assim implicar o desenvolvimento de numerosas vacinas individuais para cada tipo de células de cancro contra as quais se pretende a imunização.

Uma abordagem geral ao tratamento de tumores envolve a administração de compostos inibidores de angiogénese a pacientes com tumores em crescimento. A angiogénese é o processo pelo qual se formam novos capilares e vasos sanguíneos. A angiogénese é importante no desenvolvimento embrionário, no crescimento de tecido, na reparação de tecido e na regeneração de tecido. Para além destes processos normais e essenciais, a angiogénese está também envolvida em muitos processos patológicos anormais tais como crescimento 5

ΕΡ 1 487 482/PT de tumores, metástase de tumores e doenças vasculares oculares tais como retinopatia diabética. A angiogénese envolve vários processos interdependentes, incluindo (a) activação de células endoteliais vasculares, (b) decomposição de proteínas da matriz celular por células endoteliais expressando actividade de protease, (c) migração de células endoteliais para locais de crescimento potencial, (d) proliferação de células endoteliais e (e) formação de tubo por diferenciação de células endoteliais. Cada um destes processos é afectado por uma variedade de substâncias promotoras tais como factor de crescimento de fibroblasto (FGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), e factores de crescimento endoteliais vasculares (VEGF). Os factores de crescimento endoteliais vasculares (colectivamente VEGF) desempenham um papel crucial no crescimento e diferenciação de células endoteliais. O VEGF actua ao ligar-se a receptores tirosina-quinases de proteína presentes nas membranas de células endoteliais, o que por sua vez inicia uma cascata de reacções de transdução de sinal que estimulam o crescimento celular. A inibição de angiogénese patológica tem sido proposta como um tratamento para tumores. Ver, por exemplo, Folkman et al. Science, 221, 719, (1983). 0 conceito básico destes tratamentos é que, uma vez que os tumores requerem vascularização para crescerem, a inibição da formação de vasos sanguíneos, através da administração de compostos inibidores de angiogénese, impedirá o crescimento de tumores privando o tumor do seu fornecimento de sangue. Uma desvantagem desta abordagem é que se têm de administrar inibidores de angiogénese numa base relativamente contínua para impedir o crescimento do tumor. A cessação na entrega do inibidor pode conduzir a uma retoma de crescimento do tumor. Uma vacina eficaz para inibição da angiogénese seria uma agente preventivo atractivo contra a formação de tumor.

Crystal R.G. Câncer Chemother. Pharmacol., 43(Supl.), S90, (1999) descreve estratégias de terapia génica in vivo e ex vivo para tratar tumores utilizando vectores de transferência de gene de adenovirus. A WO 99/45018 descreve imunização activa contra antigénios associados a angiogénese. 6 ΕΡ 1 487 482/ΡΤ

Existe uma necessidade continua de uma vacina geralmente eficaz para imunização contra angiogénese, que possa também inibir o crescimento de uma variedade de tumores sem a necessidade de direccionamento a antigénios de tumor específicos. 0 presente invento satisfaz esta necessidade.

SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona uma vacina de ADN eficaz para induzir uma resposta imunitária contra células endoteliais proliferantes compreendendo uma construção de ADN codificando operavelmente uma proteína de receptor de VEGF num transportador farmaceuticamente aceitável, onde a proteína de receptor de VEGF é seleccionada entre o grupo consistindo de VEGFR-2 possuindo a sequência SEQ ID NO: 2, Flk-1 possuindo a sequência SEQ ID NO: 6, e um receptor que se liga a VEGF ou seus fragmentos e que possui uma sequência que partilha pelo menos 80% de homologia com as sequências SEQ ID NO: 2 ou 6, e a construção de ADN é incorporada operavelmente num vector de Salmonella typhimurium ou Salmonella typhi atenuadas. Numa concretização, a construção de ADN é um ADN substancialmente purificado possuindo uma sequência de polinucleótido seleccionada entre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, e uma sequência de polinucleótido que partilha com estas pelo menos 80% de homologia e codifica um receptor que se liga a VEGF ou seus fragmentos. O presente invento proporciona também a utilização de uma construção de ADN codificando operavelmente uma proteína de receptor de VEGF e um seu transportador farmaceuticamente aceitável para a preparação de uma vacina de ADN para inibição do crescimento de tumor num mamífero, onde uma quantidade imunologicamente eficaz da referida vacina de ADN se destina a ser administrada oralmente ao referido mamífero, pela qual o referido mamífero exibe uma resposta imunitária induzida pela vacina e específica para células endoteliais proliferantes, resultando na paragem do crescimento de tumor, redução no tamanho de tumor ou inibição da disseminação do tumor, onde a proteína de receptor de VEGF é seleccionada entre o grupo consistindo de VEGFR-2 possuindo a sequência SEQ ID NO: 2, Flk-1 possuindo a sequência SEQ ID NO: 6, e um 7

ΕΡ 1 487 482/PT receptor que se liga a VEGF ou seus fragmentos e que possui uma sequência que partilha pelo menos 80% de homologia com as sequências SEQ ID NO: 2 ou 6, e a construção de ADN é incorporada operavelmente num vector de Salmonella typhimurium ou Salmonella typhi atenuadas. Numa concretização, o mamífero é um humano. O presente invento proporciona também um artigo fabricado compreendendo uma vacina do invento embalada num recipiente estéril, hermeticamente fechado, o recipiente possuindo um rótulo afixado nele, o rótulo suportando material impresso identificando a vacina e proporcionando informação útil para um indivíduo administrar a referida vacina a um paciente. A vacina pode compreender um ácido nucleico linear tal como uma construção de ADN purificado, ou uma construção de ADN incorporada num vector de plasmídeo. As vacinas de ADN do presente invento estimulam a formação de CTL activos contra células endoteliais proliferantes que sobreexpressam VEGFR-2.

As células endoteliais formam o revestimento do tecido vascular de mamífero. A proliferação de células endoteliais é um processo chave em angiogénese. As vacinas do presente invento proporcionam a longo prazo a produção de inibição de angiogénese num organismo tratado com a vacina por indução de uma resposta imunitária contra células endoteliais proliferantes. Células endoteliais não proliferantes, tais como os revestimentos de vasos sanguíneos estabelecidos, não apresentam quantidades significativas de antigénios de receptor de VEGF e assim permanecem substancialmente não afectadas pelos CTL que são produzidos em resposta à vacina. A vacina de ADN pode ser utilizada para proporcionar a inibição de longo prazo da proliferação de células endoteliais num paciente vacinado. Numa concretização, uma vacina de ADN compreendendo uma construção de polinucleótido codificando operavelmente uma proteína de receptor de VEGF é administrada oralmente a um paciente necessitado de inibição de proliferação de células endoteliais numa quantidade que é suficiente para induzir uma resposta imunitária contra células endoteliais proliferantes. 8

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Para inibição da angiogénese num paciente vacinado com uma vacina de ADN, uma quantidade inibidora da resposta imunitária da vacina, que inclui uma construção de ADN codificando operavelmente uma proteína de receptor de VEGF, pode ser administrada a um paciente padecendo de uma doença relacionada com angiogénese. 0 crescimento de tumores é inibido por vacinação de um paciente com uma vacina de ADN. Numa tal concretização, uma quantidade eficaz na indução de uma resposta imunitária de uma vacina compreendendo uma construção de ADN codificando operavelmente uma proteína de receptor de VEGF é administrada a um paciente possuindo um tumor em crescimento. A vacinação resulta na interrupção do crescimento do tumor. A destruição de células endoteliais proliferantes pelo sistema imunitário do paciente impede a vascularização do tumor, na essência privando o tumor até à morte.

As vacinas de ADN podem ser administradas entericamente, tal como por administração oral, ou parentericamente, tal como por injecção ou perfusão intravenosa.

As vacinas do presente invento são úteis para tratamento e prevenção de numerosos estados de doença. Por exemplo, um paciente padecendo de um cancro, retinopatia diabética e outros, pode beneficiar de imunização pelas vacinas do presente invento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Nos desenhos, a FIGURA 1 ilustra a sequência de ADN codificando KDR humano, SEQ ID NO: 1; A FIGURA 2 ilustra a sequência de proteína de KDR humano, SEQ ID NO: 2; A FIGURA 3 ilustra a sequência de ADN codificando Flt-1 humano, SEQ ID NO: 3; A FIGURA 4 ilustra a sequência de proteína de Flt-1 humano, SEQ ID NO: 4; 9

ΕΡ 1 487 482/PT A FIGURA 5 ilustra a sequência de ADN codificando Flk-1 de ratinho, SEQ ID NO: 5; A FIGURA 6 ilustra a sequência de proteína de Flk-1 humano, SEQ ID NO: 6; A FIGURA 7 é uma representação pictórica de pulmões de ratinho possuindo níveis variáveis de cobertura de tumor variando desde > 50% de cobertura (assinalado por 3) e < 10% de cobertura (assinalado por 1); A FIGURA 8 é uma representação gráfica de dados demonstrando que ratinhos vacinados com uma vacina de ADN do invento (linha a preto grossa, a cheio) e desafiados por injecção intravenosa de células de carcinoma do cólon CT-26, exibiram mortalidade significativamente reduzida em relação a dois grupos de controlo de ratinhos (ratinhos não expostos (nalf) : linha fina a cheio; vacina de controlo: linha traço-ponto) ; A FIGURA 9 é uma representação gráfica de dados demonstrando a supressão de crescimento de tumor de carcinoma do pulmão de Lewis D121 em ratinhos vacinados com uma vacina de ADN do invento (pcDNA3.1-FLK-1) em relação a dois grupos de ratinhos de controlo; A FIGURA 10 é uma representação gráfica de dados demonstrando a supressão de crescimento de tumor de melanoma BI6 em ratinhos vacinados com uma vacina de ADN do invento (·) em relação a um grupo de controlo (o); e A FIGURA 11 é uma representação gráfica de dados demonstrando a regulação ascendente de células CD8+ positivas em CD25, CD69 e CD2 em ratinhos vacinados com uma vacina de ADN do invento em relação a um grupo de ratinhos de controlo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS 0 termo "construção de ADN" como aqui utilizado e nas reivindicações apensas significa uma estrutura de ADN sintética que pode ser transcrita em células alvo. A construção pode compreender um ácido nucleico linear tal como 10

ΕΡ 1 487 482/PT um ADN purificado, ou preferivelmente, ADN incorporado num vector de plasmideo. O ADN pode também ser incorporado num vector virai ou bacteriano, preferivelmente um vector virai ou bacteriano atenuado que é não patogénico. ADN que codificam uma proteína de receptor de VEGF incluem VEGFR-2 (KDR; SEQ ID NO: 2), VEGFR-1 (Flt-1; SEQ ID NO: 4) e Flk-1 (SEQ ID NO: 6), e.g., sequências de ADN SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO 5, respectivamente.

Foram identificados cinco subtipos de VEGF, incluindo VEGF-1 (também conhecido como VEGF-A), VEGF-2 (também conhecido como VEGF-C), VEGF-B, VEGF-D e VEGF-E. Ver, por exemplo, Patente dos E.U.A. N.° 6235713 de Achen et al. e referências aí citadas. Os receptores de VEGF são tirosina-quinases de proteína específicas de células endoteliais. Têm sido identificados vários receptores tirosina-quinases que são específicos de células endoteliais, incluindo Flt-1 (receptor 1 de VEGF; VEGFR-1), KDR (VEGFR-2), Flk-1 (o homólogo murino de KDR), Flt-4 (VEGFR-3), Tie, Tie-2 e Tek, vários dos quais são receptores de VEGF.

As vacinas de ADN do presente invento estimulam a formação de CTL que são activos contra células endoteliais proliferantes, que sobreexpressam VEGFR-2. Porque os receptores de VEGF apenas são expressos substancialmente em células endoteliais proliferantes, um CTL que se forma em resposta à vacina apenas atingirá substancialmente tecidos onde está a ocorrer angiogénese activa (e.g., vascularização). Células endoteliais não proliferantes, tais como os revestimentos de vasos sanguíneos estabelecidos, estão substancialmente desprovidas de antigénios de receptor de VEGF e assim não são afectados por um CTL induzido pela vacina. A vacina pode promover activação de células T não expostas (nalf) , tanto directamente como indirectamente, através da intervenção de células dendríticas.

Como aqui utilizado, o termo "imunidade" refere-se a protecção imunológica de longo prazo contra uma forma virulenta do agente infeccioso ou antigénio de tumor. O termo "imunização" refere-se à exposição profiláctica a um 11

ΕΡ 1 487 482/PT antigénio de um agente patogénico derivado de uma fonte não virulenta, o que resulta em imunidade em relação ao patogénio no sujeito tratado. A construção de ADN utilizada no presente invento compreende preferivelmente uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de receptor de VEGF ligada operavelmente a elementos reguladores necessários para expressão génica.

Construções de ADN úteis incluem preferivelmente elementos reguladores necessários para expressão de nucleótidos. Estes elementos incluem, por exemplo, um promotor, um codão de iniciação, um codão de paragem e um sinal de poliadenilação. Adicionalmente, são muitas vezes requeridos intensificadores para expressão de uma sequência que codifica uma proteína alvo imunogénica. Como é conhecido da especialidade, preferivelmente estes elementos estão ligados operavelmente à sequência que codifica a proteína desejada. Preferivelmente, são seleccionados elementos reguladores que são operáveis na espécie à qual são administrados.

Incluem-se preferivelmente codões de iniciação e codões de paragem como parte de uma sequência de nucleótido que codifica a proteína de receptor de VEGF numa vacina genética do presente invento. Os codões de iniciação e terminação têm de estar em cadeia (in frame) com a sequência de codificação.

Promotores e sinais de poliadenilação incluídos numa vacina do presente invento são preferivelmente seleccionados para serem funcionais dentro das células do sujeito a ser imunizado.

Exemplos de promotores úteis nas vacinas do presente invento, especialmente na produção de uma vacina genética para humanos, incluem mas não estão limitados a promotores de Vírus de Símio 40 (SV40), promotores de Vírus de Tumor Mamário de Ratinho (MMTV), promotores de Vírus de Imunodeficiência de Humano (HIV) tais como o promotor da Repetição de Terminal Longo de HIV (LTR), promotores de vírus Moloney, promotores de Citomegalovírus (CMV) tais como o 12

ΕΡ 1 487 482/PT promotor precoce imediato de CMV, promotores de Vírus Epstein Barr (EBV), promotores de Vírus de Sarcoma de Rous (RSV) bem como promotores de genes humanos tais como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana e metalotioneína humana.

Exemplos de sinais de poliadenilação úteis nas vacinas do presente invento, especialmente na produção de uma vacina genética para humanos, incluem mas não estão limitados a sinais de poliadenilação de SV40 e sinais de poliadenilação de LTR.

Para além dos elementos reguladores requeridos para expressão de ADN, podem também ser incluídos na molécula de ADN outros elementos. Estes elementos adicionais incluem intensificadores. 0 intensificador pode ser, por exemplo, intensificador de actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana e intensificadores virais tais como os de CMV, RSV e EBV.

Sequências reguladoras e codões são geralmente dependentes da espécie pelo que, de modo a maximizar a produção de proteína, as sequências reguladoras e codões são preferivelmente seleccionados para serem eficazes na espécie a ser imunizada. Um técnico competente na especialidade pode produzir construções de ADN que são funcionais numa dada espécie sujeito. Métodos de transformação de vectores bacterianos vivos com uma construção de ADN exógena estão bem descritos na especialidade. Ver, por exemplo, Joseph Sambrook e David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3.a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) .

De acordo com o presente invento, podem-se administrar polinucleótidos de ADN a tecido de um mamífero, tal como um humano. Em algumas concretizações preferidas, os polinucleótidos de ADN são administrados oralmente, intramuscularmente, intranasalmente, intraperitonealmente, subcutaneamente, intradermicamente ou topicamente. 13

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De acordo com o presente invento, uma vacina de ADN pode ser utilizada para proporcionar inibição de longo prazo da proliferação de células endoteliais num paciente tratado com a vacina. Numa concretização preferida, uma vacina de ADN compreendendo uma construção de polinucleótido codificando operavelmente uma proteína de receptor de VEGF é administrada a um mamífero necessitado de inibição de proliferação de células endoteliais, numa quantidade que é suficiente para induzir uma resposta imunitária contra células endoteliais proliferantes.

Uma vacina de ADN do presente invento pode ser utilizada para inibir a angiogénese num mamífero tratado com a vacina de ADN. Numa tal concretização, uma vacina compreendendo uma construção de ADN codificando operavelmente uma proteína de receptor de VEGF é administrada a um mamífero padecendo de uma doença relacionada com angiogénese, numa quantidade suficiente para induzir uma resposta imunitária contra células endoteliais proliferantes.

Numa concretização, o crescimento de tumores é inibido por tratamento de um mamífero com uma vacina de ADN. Numa tal concretização, uma quantidade indutora de resposta imunitária de uma vacina compreendendo uma construção de ADN codificando operavelmente uma proteína de receptor de VEGF é administrada a um mamífero possuindo um tumor em crescimento. 0 tratamento com a vacina resulta na paragem de crescimento do tumor por imunização do mamífero contra células endoteliais proliferantes. A destruição de células endoteliais proliferantes pelo sistema imunitário de mamífero impede, ou pelo menos minimiza a vascularização do tumor.

De acordo com o presente invento, as vacinas podem ser administradas entericamente, tal como por administração oral, ou por injecção intramuscular. Preferivelmente, o mamífero tratado com a vacina inventiva é um humano. Um paciente padecendo de cancro, tal como carcinoma do pulmão ou do cólon, ou tumores da próstata, retinopatia diabética, e outros, podem beneficiar da imunização pelas vacinas do presente invento. 14

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Vacinas do presente invento são preferivelmente formuladas com transportadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como água, solução salina, dextrose, glicerol, e outros, e suas combinações. As vacinas podem também conter substâncias auxiliares tais como agentes molhantes, agentes emulsionantes, tampões, e outros.

As vacinas do presente invento são preferivelmente administradas oralmente a um mamífero, tal como um humano, como uma solução ou suspensão num transportador farmaceuticamente aceitável, para uma concentração de ADN na gama de cerca de 1 a cerca de 10 microgramas por mililitro. A dosagem apropriada dependerá do sujeito a ser vacinado, e em parte do discernimento do médico assistente que administra ou requer a administração da vacina.

As vacinas do presente invento podem ser embaladas em recipientes esterilizados adequadamente tais como ampolas, frascos ou frascos para injectáveis, em formas de dosagem quer multidose quer de dose unitária. Preferivelmente, os recipientes são fechados hermeticamente após serem cheios com uma preparação de vacina. Preferivelmente, as vacinas são embaladas num recipiente possuindo um rótulo afixado nele, rótulo que identifica a vacina e contém informação numa forma prescrita por uma agência governamental tal como a Food and Drug Administration dos E.U.A. reflectindo a aprovação da vacina de acordo com as leis apropriadas, informação de dosagem e outra informação. 0 rótulo contém preferivelmente informação sobre a vacina que é útil para um profissional de cuidados de saúde administrar a vacina a um paciente. A embalagem contém também preferivelmente material informativo impresso com informação referente à administração da vacina, instruções, indicações e quaisquer avisos requeridos necessários.

As proteínas de receptor de VEGF, tais como tirosina-quinases que são específicas de células endoteliais, incluem, por exemplo Flt-1, KDR, Flk-1, e seus homólogos funcionais. Os homólogos funcionais partilham preferivelmente pelo menos cerca de 80% de homologia com as proteínas de receptor de VEGF acima mencionadas. 15

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As sequências de aminoácidos de proteínas de receptor de VEGF têm sido reveladas na especialidade, bem como as sequências de ácidos nucleicos codificando estas proteínas. A sequência de ácido nucleico codificando KDR (FIG. 1, SEQ ID NO: 1), e a sua sequência de proteína correspondente (FIG. 2, SEQ ID NO: 2) foram publicadas por Yu et al. , na base de dados EMBL do European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK (o número de acesso EMBL é EMBL:AF063658) . A sequência de ácido nucleico codificando Flt-1 (FIG. 3, SEQ ID NO: 3) , e a sua sequência de proteína correspondente (FIG. 4, SEQ ID NO: 4) foram publicadas por Yu et al., na base de dados EMBL do

European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK (o número de acesso EMBL é EMBL:AF063657). A sequência de ácido nucleico codificando Flk-1, e a sua sequência de proteína correspondente foram publicadas por Mathews et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 1991, 88:9026-9030, e as estruturas foram corrigidas por Quinn et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1991, 90:7533-7537. A sequência de ADN corrigida de Flk-1 é fornecida na FIG 5 como SEQ ID NO: 5, e a sequência de proteína corrigida de Flk-1 é fornecida na FIG. 6 como SEQ ID NO: 6.

Devido à degeneração inerente do código genético, na prática do invento podem-se utilizar outras sequências de ADN que codificam substancialmente a mesma ou uma sequência de aminoácidos funcionalmente equivalente à das proteínas de receptor de VEGF KDR e Flk-1. Estas sequências de ADN incluem as que são capazes de se hibridizarem também com as sequências de receptor de VEGF. Os homólogos funcionalmente equivalentes do ADN de proteína de receptor de VEGF partilham pelo menos 80% de homologia com o ADN codificando as proteínas de receptor de VEGF acima mencionadas.

Sequências de ADN alteradas que podem ser utilizadas de acordo com o invento incluem deleções, adições ou substituições de diferentes resíduos de nucleótido resultando numa sequência que codifica o mesmo ou um produto genético funcionalmente equivalente. O próprio produto genético pode conter deleções, adições ou substituições de resíduos aminoácido dentro das sequências de receptor de VEGF, o que 16

ΕΡ 1 487 482/PT resulta numa alteração silenciosa, produzindo assim proteínas de receptor de VEGF funcionalmente equivalentes. Estas substituições de aminoácidos podem ser efectuadas com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobia, hidrofilia e/ou na natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina; aminoácidos com grupos-cabeça polares não carregados possuindo valores de hidrofilia similares incluem os seguintes: leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina. Como aqui utilizado, um receptor de VEGF funcionalmente equivalente refere-se a um receptor que se liga a VEGF ou seus fragmentos, mas não necessariamente com a mesma afinidade de ligação do seu correspondente nativo KDR, Flk-1 ou Flt-1.

As sequências de ADN podem ser transformadas por engenharia de modo a alterar a sequência de codificação do receptor de VEGF para uma variedade de propósitos incluindo, mas não limitados a, alterações que modificam o processamento e expressão do produto genético. Por exemplo, podem-se introduzir mutações utilizando técnicas que são bem conhecidas na especialidade, e.g. mutagénese dirigida, para inserir novos locais de restrição, para alterar padrões de glicosilação, fosforilação, etc. 0 Flk-1 de ratinho (SEQ ID NO: 6) partilha uma homologia de aproximadamente 85% com o KDR humano (SEQ ID NO: 2) e desempenha um papel na fisiologia do ratinho análogo ao papel de KDR em humanos. De facto, o VEGFR-2 é muitas vezes referido como KDR/Flk-1, reflectindo a estreita analogia entre estes dois homólogos de receptor de VEGF. Por esta razão, o tratamento de ratinhos com uma vacina de ADN do invento, codificando Flk-1 (e.g., ADN SEQ ID NO: 5) foi escolhida como um modelo adequado para vacinas de ADN humano codificando KDR.

Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar adicionalmente as particularidades e concretizações do presente invento, e não pretendem ser limitativos. 17

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Materiais, métodos e exemplos

Materiais. Ratinhos C57/BL/6J e Balb/C foram obtidos na instalação de criação do Scripps Research Institute. As linhas de células de tumor murinas utilizadas para avaliação incluíram a linha de células de melanoma B16 e a linha de células de carcinoma do cólon CT26, que foram ambas obtidas do Dr. I. J. Fidler, MD Anderson Câncer Center, Houston, TX. A linha de células de cancro do pulmão de Lewis murino D121 foi obtida do Dr. Lea Eisenbach, Weizmann Institute, Rehovot, Israel. 0 ADN codificando Flk-1 foi gentilmente fornecido pelo Dr. Lemischka (Princeton University, Princeton, NJ) , e foi clonado no vector de expressão eucariótico pcDNA3.1 fornecido pela Invitrogen, Huntsville, Alabama, utilizando os locais de restrição Kpnl e Xbal. Uma estirpe de Salmonella typhimurium atenuada foi fornecida por B.A.D. Stocker (Stanford University, Stanford, CA). Os anticorpos foram obtidos na BD Biosciences, Bedford, MA. 0 suplemento de cultura T-STIM foi obtido na BD Biosciences, Bedford, MA. Isotiocianato de fluoresceína (FITC) e R-ficoeritrina (PE) foram obtidos na Molecular Probes, Eugene, OR. Prepararam-se anticorpos marcados com FITC e marcados com PE de acordo com os protocolos recomendados pelo fabricante. EXEMPLO 1. Preparação de uma vacina de ADN codificando Flk-1. 0 vector pcDNA3.1 contendo ADN de Flk-1 (SEQ ID NO: 5; de cerca de 10 pg a cerca de 0,1 pg de pDNA) foi introduzido por electroporação em Salmonella typhimurium atenuada preparada de fresco, utilizando um pulsador BioRad a 2,5 kV, 25 pF, 200 Ohm de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante. Seleccionaram-se as Salmonella contendo o vector sobre placas contendo ampicilina. Recolheram-se as colónias no dia seguinte e cultivaram-se de um dia para o outro em caldo LB (EM Science, Gibbstown, NJ) com adição de ampicilina. Isolaram-se as bactérias e lavaram-se em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Suspenderam-se depois as bactérias lavadas em meio PBS com uma concentração de cerca de 1 x 109 Salmonella recombinantes por mililitro de PBS, para formar uma solução de vacina para utilização posterior. Armazenou-se a vacina em ampolas fechadas até à utilização. Preparou-se também uma "vacina de controlo" consistindo de 18

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Salmonella transformada com o vector pcDNA3.1 sozinho (nenhum ADN de Flk-1) de acordo com o mesmo procedimento. 0 ADN de plasmideo foi armazenado a cerca de -80°C antes da transformação da Salmonella. EXEMPLO 2. Vacinação de ratinhos com uma vacina de ADN codi fi cando Flk-1.

Ratinhos Balb/C (cerca de 6 ratinhos por grupo de tratamento) foram vacinados com a vacina de ADN do Exemplo 1 (cerca de 1 χ 108 Salmonella recombinantes em cerca de 100 μΐ de PBS) por sonda oral, três vezes com intervalos de duas semanas. Vacinou-se outro grupo de ratinhos com vacina de controlo (consistindo de Salmonella atenuada contendo o vector vazio) de acordo com o mesmo programa que os ratinhos vacinados com a vacina do invento. EXEMPLO 3. Avaliação de resistência a tumor de ratinhos vacinados.

Cerca de duas semanas após a terceira vacinação, desafiaram-se os ratinhos Balb/C do Exemplo 2 (cerca de 6 ratinhos por grupo de tratamento) com cerca de 1 χ 105 células de melanoma B16 (subcutaneamente), cerca de 1 χ 105 células de carcinoma do pulmão de Lewis D121 (subcutaneamente) ou cerca de 7,5 χ 104 células de carcinoma do cólon CT26 (intravenosamente). Removeram-se cirurgicamente os tumores de pulmão de Lewis subcutâneos após cerca de duas semanas de crescimento para permitir a disseminação espontânea até ao pulmão. Mediu-se o crescimento de tumores subcutâneos em duas dimensões dia sim, dia não, e calculou-se o volume de tumor de acordo com a fórmula: volume = (largura2) (comprimento/2) para cada tumor. Avaliou-se a quantidade de metástases espontâneas de D121 para os pulmões cerca de 30 dias após remoção do tumor subcutâneo primário. Sacrificaram-se os ratinhos e submeteram-se a necropsia, e avaliaram-se as cargas tumorais dos pulmões de acordo com a percentagem da superfície do pulmão que estava coberta por tumor e pontuaram-se como "0" para ausência de tumor, "1" para menos 19

ΕΡ 1 487 482/PT do que cerca de 20% de cobertura de tumor, "2" para cerca de 20 a cerca de 30% de cobertura de tumor e "3" para mais do que cerca de 50% de cobertura de tumor. A FIG. 7 mostra fotoqrafias de pulmões a partir de três ratinhos desafiados com células de carcinoma do pulmão de Lewis D121. O pulmão de baixo foi pontuado com 1, enquanto os dois pulmões de cima foram pontuados com 3, possuindo uma maior proporção da superfície de pulmão coberta por tumores. Aos animais que morreram antes da avaliação aos 30 dias foi-lhes atribuída uma pontuação " + ".

Os resultados destas avaliações são apresentados nas Tabelas 1-4, e nas FIGS. 8-10, a seguir aqui discutidas em detalhe.

Tabela 1. Metástase de tumores em ratinhos Balb/C desafiados com células de carcinoma do pulmão de Lewis D121.

Grupo de vacinação de ratinhos Pontuações metastáticas Controlo - vacinação com Salmonella não transformada 3, 3, 3, 3, +, + Controlo - vacinação com vacina de controlo (contendo vector vazio) 3 f 3 f 3 f 3 f +, + Vacinação com vacina de ADN do Exemplo 1 (contendo Flk-1) 0, 0, 1, 1, 1, 2, 2

Os ratinhos Balb/C que foram desafiados por injecção intravenosa de células de carcinoma do cólon CT-26 foram avaliados no que se refere à mortalidade durante um período de cerca de 63 dias (7 semanas) . A informação de mortalidade é apresentada na Tabela 2 abaixo, e ilustrada graficamente na FIG. 8.

Na FIG. 8, a % de sobrevivência de ratinhos tratados com a vacina inventiva do Exemplo 1 é indicada pela linha grossa, a cheio para 100% de sobrevivência. A % de sobrevivência de ratinhos não expostos (nalf) (sem vacinação) desafiados com as células C26 é indicada pela linha fina a cheio, enquanto a % de sobrevivência dos ratinhos tratados com uma vacina de 20

ΕΡ 1 487 482/PT controlo (sem ADN de Flk-1) é indicada pela linha traço-ponto .

Tabela 2. Supressão de mortalidade em ratinhos Balb/C imunizados com a vacina do Exemplo 1 e desafiados com carcinoma CT26.

Tratamento % de sobrevivência ao Dia 30 % de sobrevivência ao Dia 36 % de sobrevivência ao Dia 63 Controlo, sem vacina 50 0 0 Vacina de controlo 33 0 0 Vacina do Exemplo 1 100 100 100 A supressão do crescimento do tumor primário (subcutâneo) em ratinhos Balb/C desafiados com D121 foi avaliada por determinação do volume de tumor primário ao dia 14 após desafio. Os resultados são apresentados na Tabela 3 abaixo, e ilustrados graficamente na FIG. 9.

Na FIG. 9, a primeira barra, assinalada "PBS" indica ratinhos que não foram vacinados (ratinhos não expostos (nalf)) , a barra do meio, assinalada "vector vazio" indica ratinhos tratados com a vacina de controlo, e a terceira barra, assinalada "pcDNA3.1-FLK1" indica ratinhos imunizados com a vacina inventiva do Exemplo 1.

Tabela 3. Supressão de tumor subcutâneo de carcinoma D121 em ratinhos Balb/C imunizados com a vacina do Exemplo 1.

Tratamento Volume de tumor mm3 Desvio padrão Controlo, sem vacina 665 227 Vacina de controlo 641 157 Vacina do Exemplo 1 183 35 21

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Avaliou-se a supressão do crescimento de tumores subcutâneos de melanoma BI6 por monitorização do volume de tumor subcutâneo durante um período de cerca de 17 dias após desafio de tumor. Os resultados são apresentados na Tabela 4 e ilustrados graficamente na FIG. 10 abaixo. Na FIG. 10, os dados de volume de tumor médio indicados por (·) representam ratinhos imunizados com a vacina inventiva do Exemplo 1, enquanto dos dados indicados por (o) indicam ratinhos tratados com a vacina de controlo.

Tabela 4. Supressão de tumor subcutâneo de melanoma B16 em ratinhos Balb/C imunizados com a vacina do Exemplo 1.

Volume de tumor (mm3) ao Dia Tratamento 0 9 14 17 Vacina de controlo 0 907 1273 4213 Vacina do Exemplo 1 0 447 462 1063 % de supressão de tumor — 51% 64% 75% EXEMPLO 4. Regulação ascendente de marcadores de activagão CD25, CD69 e CD2 em esplenócitos (células T CD8+) de ratinhos vacinados.

Ratinhos C5/7BL/6J (cerca de 4 ratinhos por grupo de tratamento) foram vacinados com a vacina de ADN do Exemplo 1 e a vacina de controlo (sem Flk-1) como descrito no Exemplo 2. Isolaram-se esplenócitos dos ratinhos imunizados e do grupo de ratinhos de controlo cerca de seis semanas após a terceira vacinação. Cultivaram-se as células de esplenócitos durante 24 horas em conjunto com células de uma linha de células de melanoma B16 transduzidas para expressarem Flk-1 e com células B16 não transformadas em meio de células T (cerca de 5 mL por cultura) contendo cerca de 4% em volume de suplemento de cultura T-STIM (Cat. # 354115, BD Biosciences, Bedford, MA). Coraram-se depois as células com anticorpo CD8+ conjugado com FITC e anticorpos CD25, CD69 e CD2 conjugados com PE. Avaliaram-se as suspensões de células utilizando um equipamento FAC Scan Becton Dickenson para determinar a percentagem de células T CD8+ positivas em relação a CD25 e CD69 para cada combinação de esplenócito/célula de melanoma 22

ΕΡ 1 487 482/PT Β16. Os resultados são apresentados na Tabela 5 e são ilustrados graficamente na FIG. 11.

Tabela 5. Regulação ascendente de marcadores de activação CD25, CD69 e CD2 em esplenócitos de ratinhos vacinados.

Tratamento % de CD2 5 positivos % de CD69 positivos CD2 positivos fluorescência média Vacina de controlo + células B16-Flk-1 9 18 570 mfu Vacina de ADN + células B16 12 29 550 mfu Vacina de ADN + células B16-Flk-1 21 35 700 mfu mfu = unidades de fluorescência média.

Os resultados fornecidos na Tabelas 1-5 e FIGS. 8-11 demonstram que a vacina de ADN do Exemplo 1, compreendendo um ADN codificando Flk-1, o análogo murino de KDR, pode imunizar eficazmente ratinhos contra uma variedade de células de cancro formadoras de tumores. Embora sem pretender estar limitado pela teoria, crê-se que a vacina actua por inibição da angiogénese no tumor, i.e., impedindo a formação de novos vasos sanguíneos privando eficazmente o tumor.

Os dados na Tabela 1 demonstram que a vacina inventiva do Exemplo 1 conduz a uma supressão de metástase de tumores para os pulmões de ratinhos desafiados com carcinoma de pulmão de Lewis D121. Nenhum dos ratinhos imunizados com a vacina do Exemplo 1 morreu, e todos tinham menos de cerca de 50% de cobertura de tumor nos pulmões (2 tinham <20%) . Em contraste, de cada grupo de controlo dois ratinhos morreram e todos os ratinhos restantes tinham mais de cerca de 50% de cobertura de tumor nos pulmões. A vacina inventiva do Exemplo 1 diminuiu também significativamente a mortalidade de ratinhos Balb-C que foram desafiados intravenosamente por células de carcinoma do cólon 23

ΕΡ 1 487 482/PT CT-26, como demonstrado pelos dados na Tabela 2 e na FIG. 8. A totalidade dos ratinhos imunizados com a vacina do Exemplo 1 sobreviveu a todo o período de observação de 63 dias após desafio. Nos grupos de controlo, porém, todos os ratinhos tinham morrido ao dia 36 pós-desafio.

Como demonstrado pelos dados na Tabela 3 e FIG. 9, o crescimento de tumor subcutâneo de carcinoma do pulmão de Lewis D121 foi suprimido por imunização com a vacina inventiva do Exemplo 1 por um factor de cerca de 4,3 a cerca de 4,5, em relação aos grupos de ratinhos de controlo tratados sem vacina ou com a vacina de controlo.

Similarmente, como se mostra na Tabela 4 e na FIG. 10, crescimento de tumor subcutâneo de melanoma BI6 foi suprimido por um factor de cerca de 4 em ratinhos imunizados com a vacina inventiva do Exemplo 1, em relação ao crescimento de tumores no grupo de controlo.

Os dados na Tabela 5 e FIG. 11 mostram que esplenócitos isolados a partir de ratinhos C57/BL/6J vacinados com a vacina de ADN do Exemplo 1 exibiram uma regulação ascendente de marcadores de activação CD2, CD25, CD69, em relação ao grupo de ratinhos de controlo, quando cultivados com células de melanoma B16 transformadas para apresentar antigénio Flk-1.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> The Scripps Reasearch Institute Ralph A. Reisfeld Andrew G. Niethammer Rong Xiang

<120> VACINA DE ADN CONTRA CÉLULAS ENDOTELIAIS

PROLIFERANTES E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO

<130> TSRI-829.0 PCT <150> 10/090,183 <151> 2002-03-02 <160> 6 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 4071 24

ΕΡ 1 487 482/PT <212> ADN <213> humano <4 0 0> 1 atggagagca tctgtgggtt cttacaatta tggctttggc gatggcctct tacaagtgct tacagatctc aacaaaaaca ctttgtgcaa açcaagaagg gaagcaaaaa tataggattt aagcttgtct gaataccctt tctgggagtg gaccaaggat tttgtcaggg gaagccacgg gaaataaaat catgtactga accaatccca ccccagattg caaacgctga cagttggagg ccttgtgaag aaaaatcaat gcggcaaatg agggtgatct cccacCgagc ctcacatggt aggtgctgct tgcctagtgt aggctaatac ccaataatca tctgtaagac tctaccggga catttattgc aaactgtggt gatacccaga gctttactat ttaatgatga atgatgtggt taaattgtac cttcgaagca agatgaagaa tgtacacctg tceatgaaaa tgggggagcg ggtataaaaa cgattaCgga tttcaaagga gtgagaaatc catgtacggt aagagtgcgc aatggagaag ttgctctaat tgtcagcttt ccttceacgt aggagagcgt acaagcttgg ggccgtcgcc ttctcttgat aactcttcaa gagtggcagt actcacaatt aactgacttg ttctgttagt gattccatgt aaagagattt tcccagctac aagtcaccag tctgagtccg agcaagaact tcagcataag atttttgagc tgcagcatce accttttgtt Cgtcagaatc tggaataccc agtgagtgaa gaagcagagc tctaatctct ctatgccatt caacgagccc tgtggaggac tgaaggaaaa gtacaaatgt gaccaggggt gtctttgtgg cccacagcct ctgtggctct ctgcccaggc attacttgca gagcaaaggg ccaaaagtga gcctcggtca gaccaacatg ctcgggtcca gttcctgatg atgatcagct tctattatgt tctcatggaa gaactaaatg aaacttgtaa accttaacta agtgggctga gcttCtggaa cctgcgaagt cttgagtcca agagacacag catgtggtct cctgtggatt cctcccccgc agccaagctg ttccagggag aacaaaactg gaagcggtca cctgaaatta tgcactgcag ctgccaatcc gcgtggagac tcagcataca ggggacagag tggaggtgac tcggaaatga tttatgtcta gagtcgtgta tttcaaatct gtaacagaat atgctggcat acatagttgt ttgaactatc tggggattga accgagacct tagatggtgt tgaccaagaa gtggcatgga accttggtta atcacacaat gaaattacac ctctggttgt cctaccagCa atcacatcca tctcagtgac gaaataaaat taagtaccct acaaagtcgg ctttgcaacc acagatctac atgtgggaga ccgggccgcc 60 aaaagacata 120 ggacttggac 180 tgagtgcagc 240 cactggagcc 300 tgttcaagat 360 cattactgag 420 caacgtgtca 480 ttcctgggac 540 ggtcttctgt 600 cgttgtaggg 660 tgttggagaa 720 cttcaactgg 780 aaaaacccag 840 aacccggagt 900 gaacagcaca 960 acctctggtg 1020 cccaccccca 1060 taaagcgggg 1140 tgtcatcctt 1200 gtatgtccca 1260 cggcaccact 1320 ctggtattgg 1380 aaacccatac 1440 tgaagttaat 1500 tgttatccaa 1560 gagaggagag 1620 tgacatgcag 1680 gtttgagaac 1740 gttgcccaca 1800 25

ΕΡ 1 487 482/PT cctgtttgca acaaatgaca gtctgccttg gtcctagagc ggggaaagca tttaaagata aacctcacta agtgttcttg acgaacttgg cttcttgtca tacttgtcca ccttatgatg ggccgtggtg acttgcagga gctctcatgt cttctaggtg tttggaaacc aaaggggcac cggcgcttgg aagtccctca accttggagc tcgcgaaagt gtggttaaaa agaaaaggag gtgtacacaa ttaggtgctt gaaggaacta gactgctggc ggaaatctct tcagagactt tgtatggagg agtcagtatc gatatcccgt ggtatggttc

Ccttttggtg cagacaagcg agtgaggaag cagattctcc agaacttgga ttttgatcat ctcaagacag gtgtggcacc tcgaagtctc atgagaccct tccgcagagt gctgtgcaaa aaatcattat tcatcctacg tcgtcatgga ccagcaaatg cctttggcca cagtagcagt ctgaactcaa cctgtaccaa tgtccactta gattccgtca acagcatcac gtgatgtaga atctcatctg gtatceacag tctgtgactt atgctcgcct tccagagtga ctccatatcc gaatgagggc acggggagcc cgcaagctaa tgagcatgga aggaggaagt tgeagaacag tagaagaacc ttgcctcaga gaatggtgcc getaccagtc cagaacCttt agcctgactc tactctttgg ggagcttaag gaagaccaag cacgatcaca atgcacggca tgtagaagac gaggaaggag agtggaggca tctagtaggc gaccgttaag tccagatgaa ggaattcccc agtgattgaa caaaatgttg gatcctcatt gccaggaggg cctgaggagc agggaaagac cagtagccag agaagaggaa ttacagcttc ggacctggcg tggcttggcc ccctttgaaa cgtctggtct tggggtaaag ccctgattat cagtcagaga tgctcagcag agaggattct atgtgacccc taagcgaaag agaagtaaaa agagctgaaa cagcaaaagc cggatatcac aaagctgata ggggaccaca aaattgaatg aatgcatcct aaaagaca tt ggaaacctgg tctgggaatc tcaggcattg gacgaaggcc tttttcataa acggcggtga cgggccaatg ctcccattgg agagaccggc gcagatgcct aaagaaggag catattggtc ccacteatgg aagagaaatg tacgttggag agctcagcca gctcctgaag caagtggcta gcacgaaata cgggatattt tggatggccc tttggtgttt attgatgaag actacaccag cccacgtttt gatggcaaag ggactctctc aaattccatt agccggcctg gtaatcccag actttggaag agggagtctg tccgatgaca gagactggag ctgagctctc ccaccatgtt tgcaggacca gcgtggtcag agaatcagac ccccCccaca

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Met 1 Gin Ser Lys Vai 5 Leu Leu Ala Thr Arg Ala Ala 20 Ser Vai Gly Leu Arg Leu Ser 35 Ile Gin LyS Asp Ile 40 Leu Gin 50 Ile Thr Cys Arg Gly 55 Gin Asn 65 Asn Gin Ser Gly Ser 70 Glu Gin Asp Gly Leu Phe Cys 85 Lys Thr Leu

Vai Ala 10 Leu Trp Leu Cys Vai 15 Glu Pro 25 Ser Vai Ser Leu Asp 30 Leu Pro Leu Thr Ile Lys Ala 45 Asn Thr Thr Arg Asp Leu Asp 60 Trp Leu Trp Pro Arg Vai Glu 75 Vai Thr Glu Cys Ser 80 Thr Ile 90 Pro Lys Vai Ile Gly 95 Asn

26 ΕΡ 1 487 482/PT

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser 100 105 110 Vai Ile Tyr Vai Tyr Val Gin Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser 115 120 125 Vai Ser Asp Gin His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys 130 135 140 Thr Vai Vai Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser 145 150 155 160 Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg 165 170 175 Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile 180 185 190 Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser 195 200 205 Tyr Gin Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr 210 215 220 Asp Vai Vai Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 225 230 235 240 Lys Leu Vai Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 245 250 255 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gin His Lys Lys Leu 260 265 270 Vai Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gin Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 275 280 285 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gin Gly Leu 290 295 300 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 305 310 315 320 Phe Vai Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met 325 330 335 Glu Ser Leu Vai Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala 340 345 350 Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly 355 360 3 65 Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr 370 375 380 Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu 385 390 395 400 Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gin Ser His Val Val Ser Leu Val 405 410 415 Vai Tyr Vai Pro Pro Gin Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val 420 425 430 Asp Ser Tyr Gin Tyr Gly Thr Thr Gin Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr 435 440 445 Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gin Leu Glu Glu 450 455 460 Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gin Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr 465 470 475 480 Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gin Gly Gly Asn Lys 485 490 495 Ile Glu Vai Asn Lys Asn Gin Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys 500 505 510 Thr Vai Ser Thr Leu Val Ile Gin Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr 515 520 525 Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser 530 535 540 Phe His Vai Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gin Pro Asp Met Gin

27 ΕΡ 1 487 482/PT 545 550 555 560 Pro Thr Glu Gin Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser 565 57 0 575 The Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gin Pro Leu Pro 580 585 590 Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr S95 600 605 Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ue 610 615 620 Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gin Asp Gin Gly Asp Tyr 625 630 635 640 Vai Cys Leu Ala Gin Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val 64 5 6S0 655 Arg Gin Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn 660 665 670 Leu Glu Asn Gin Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys 675 680 685 Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gin Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn 690 695 700 Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg 705 710 715 720 Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr 725 730 735 Cys Gin Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe 740 745 750 Ile Ile Glu Gly Ala Gin Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu 755 760 765 Vai Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile 770 775 780 Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly 785 790 795 800 Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His 805 810 815 Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp 820 825 830 Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gin Val 835 840 845 Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr 850 855 860 Vai Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg 865 870 875 880 Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu 885 890 895 Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu 900 905 910 Met Vai Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu 915 920 925 Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg 930 935 940 Phe Arg Gin Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys 945 950 955 960 Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gin Ser Ser Ala Ser Ser Gly 965 970 975 Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro 980 985 990 Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr 995 1000 1005 28

ΕΡ 1 487 482/PT

Ser Phe Gin Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys 1010 1015 1020 Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn 1025 1030 1035 1040 Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp 1045 1050 1055 Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met 1060 1065 1070 Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gin Ser Asp Val 1075 1080 1085 Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser 1090 1095 1100

Pro Tyr Pro Gly Vai Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys 1105 1110 1115 1120

Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr 1125 1130 1135

Gin Thr Met Leu Asp Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gin Arg Pro Thr 1140 1145 1150

Phe Ser Glu Leu Vai Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gin Ala Asn Ala 1155 1160 1165

Gin Gin Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Vai Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu 1170 1175 1180

Ser Met Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Vai Ser 1185 1190 1195 1200

Cys Met Glu Glu Glu Glu Vai Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn 1205 1210 1215

Thr Ala Gly Ile Ser Gin Tyr Leu Gin Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg 1220 1225 1230

Pro Val Ser Vai Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu 1235 1240 1245

Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gin Thr Asp Ser Gly Met Val Leu 1250 1255 1260

Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu Ser Pro 1265 1270 1275 1280

Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser 1285 1290 1295

Glu Gly Ser Asn Gin Thr Ser Gly Tyr Gin Ser Gly Tyr His Ser Asp 1300 1305 1310

Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu Leu Lys 1315 1320 1325

Leu Ile Glu Ile Gly Val Gin Thr Gly Ser Thr Ala Gin Ile Leu Gin 1330 1335 1340

Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser Pro Pro Val 1350 1355 1345 <2 10> 3 <2 11> 4017 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 3 atggtcagct actgggacac acaggatcta gttcaggttc cacatcatgc aagcaggcca tggtctttgc ctgaaatggt tgtggaagaa atggcaaaca cggggtcctg aaaattaaaa gacactgcat gagtaaggaa attctgcagt ctgtgcgcgc gatcctgaac ctccaatgca agcgaaaggc actttaacct tgctcagctg tctgcttctc 60 tgagtttaaa aggcacccag 120 ggggggaagc agcccataaa 180 tgagcataac taaatctgcc 240 tgaacacagc tcaagcaaac 300 29

ΕΡ 1 487 482/PT cacactggct gaatctgcaa gaaatccccg acgtcaccta ggaaaacgca gaaatagggc ctcacacatc aaattactta agagttcaaa cgaattgacc atgcagaaca tctgttaaca cagCaggtgc gcatttccct gctcgctatt gggaattata actctaattg ccggctctct caacctacaa gacttttgtt agaattgaga accttggttg gttgggactg gttaacttgg aagttcttat cactacagCa cttaccatca gtatacacag ecatacctec gactgtcatg atacaacaag gtcacagaag gaaagCCcag actctaacat cgaaaaatga ccagatgaag gagtttgccc gtggttcaag aaaatgctga atcttgaccc caaggagggc ctcaagagca aagaaagaaa accagcagcg gaggaagagg tcttacagtt cgggacctgg tttggccttg cttcctctga gacgtgtggt ccaggagtac gctcctgagt ccaaaagaaa aatgtacaac gggtctacat ccgaagttta agcctggaaa tctacagctg tctatatatt aaattataca acatcactgt taatctggga ttctgacctg gacaaaccaa gaggccatac tgacctggag aaagcaattc aagacaaagg cctcagtgca ttgaaaccgt cgccggaagt tgactcgtgg caatcttgct tcaatgtgaa acccactggg tcaagtggtt ccaataatga gcatcactca tggctgactc tgggaagaaa aaaaaatgcc acagagacgt ttagcaagca tgaatgtttc gggaagaaat tgcgaaacct ctaatggtgt agcctggaat aggatgaagg catacctcac gcacctgtgt aaaggtcttc ttcctttgga gggagagact catcagcatt aagagggggc acattggcca ctctgatggt aacgtgactt aaatggagcc aaagctttgc aggattctga ttcaagtggc cagcgagaaa cccgggatat aatggatggc cttacggagt aaatggatga actctactcc ggccaagatt aggatggtaa actcaactcc attcaggaag gaatcaaaac caaatatcta tattagtgat catgactgaa tactttaaaa cagtagaaag tgaagcaaca tacaatcata tcttgtcctc ttaccctgat ccatgccaac actttatact tatatatgat agctggcaag tgtatggtta ctactcgtta gagcataaaa accccagatt cagcagacaa ctggcacccc agagtccttt gcgcatggca tagaatttct cataagcttt gacggaagga tacttggatt aaaaatggcc cctgcaagat cctccagaag cagtgatcac ccccgagcct tattttagga tgtctatcac tgttcaagga ggctgcgact tcctgaaata tgagcagtgt taaactgggc tggcattaag cacggccagc ccatctgaac gattgttgaa attttttctc aggcctggaa gagctccggc cggtttctac cagaggcatg cattctttta ttataagaac tcctgaatct attgctgtgg ggacttttgc tgaaatetat

Cgcagaactt agactacatc tgccttctct ctctgatgat ctttgaagaa gctgtaccta acaggtagac ggaagggagc aagtttccac ggcttcatca gtcaatgggc gatgtccaaa aattgtactg gaaaaaaata atattctaca tgtcgtgtaa aaagcattca cggtcttacc aaagatgggt attatcaagg cagtcaaatg tacgaaaagg atcctgactt tgtaaccata atcctggatg ataatagaag ggaatctaca tatatcacag gaggacctga ttactgcgga atcactaagg tcaggcacct aaagaaatta acagtggcca cagatcactt ccaggaagca tgcaaagcca acctcggaca ctcttctggc aagactgact gagcggctcc aaatcacttg aaatcaccta gagtacaaag gtggttaacc tactgcaaat aacaaggatg caaggcaaga tttcaggaag aaggagccca gagttcctgt tctgagaaca cccgattatg atctttgaca gaaatcttct agtcgcctga cagaEeatgc gtggaaaaac ccaatcaatg gaggacttct gtcagatatg cttttaccga cttcaaagaa ctttcgtaga tcgtcattcc

Ctgacacttt tatcaaatgc atttgtataa taagcacacc ctaccactcc agagagcttc gtgttcttac ggagtggacc tcactgtgaa ggctctctat tacctgcgac acgtaactga tgtttaaaaa ccgtgtcatc gtaccgcata atcattccga ctgacagcaa gaaagaataa tttgcatagc atgtgccaaa aactgtcttg cagttaataa agcactccat atgcctgcag caatcagaga tcagcagttc ggtttaaaaa gcacgctgtt ccaaccagaa agtctaatct tcctattaac acctatcaat cttatgatgc gaagaggggc cgtgccggac ctctgatgac tgctgggagc atggaaatct cagcactaca aaccaagact ataaaagtct tcactatgga cttccagaaa acgtggtgaa

Cgagaaaagg aaatctacag ccttaggtgg gggaaggcat tggactgctg taggtgattt ccatactgac tcaaggaaag taaatgcttt atgccacctc gaaggaaaca 360 gatgtacagt 420 ctgccgggtt 480 gatccctgat 540 aacgtacaaa 600 gacaaactat 660 acgcccagtc 720 cttgaacacg 780 cgtaaggcga 840 tattgacaaa 900 atcattcaaa 960 acatcgaaaa 1020 gaaagtgaag 1080 tgagaaatct 1140 agaggatgca 1200 cctcactgcc 1260 gtttccagac 1320 tggtatccct 1380 agcaaggtgt 1440 catgggaaac 1500 gatggctagc 1560 ttccaaCaaa 1620 tgggtttcat 1680 cacagttaac 1740 çagaacaatg 1800 cactcttaat 1860 agccaggaat 1920 tcaggaagca 1980 caccacttta 2040 caaccacaaa 2100 tattgaaaga 2160 gggctctgtg 2220 ggagctgatc 2280 cctctttatc 2340 tataatggac 2400 cagcaagtgg 2460 ttttggaaaa 2520 tgtggctgtg 2580 tgagctaaaa 2640 ctgcaccaag 2700 ctccaactac 2760 catggagcct 2820 agatagcgtc 2880 gagtgatgtt 2940 agatctgatt 3000 gtgcattcat 3060 gatttgtgat 3120 agatactcga 3180 caccaagagc 3240 gtctccatac 3300 gaggatgaga 3360 gcacagagac 3420 gcttcaagca 3480 aggaaatagt 3540 tatttcagct 3600 caagttcatg 3660 catgtttgat 3720 gactaccagg actgacagca gagtcggggc agcgaaggca tgctccccgc gcgacagcag aacccaaggc tgtctgatgt agcgcaggtt ccccagacta cactctgttg ctcgctcaag cagcaggccc cacctacgac caactcggtg gcctctccca attgacttga agtttctgcc cacgctgagc gtcctgtact tgctgaagcg cttcacctgg 3780 gagtaaccag taaaagtaag 3640 attccagctg tgggcacgtc 3900 tggaaaggaa aatcgcgtgc 3960 ccaccccacc catctag 4017 <210> 4 <211> 1338 <212> PRT <213> humano <400> 4 30 ΕΡ 1 487 482/ΡΤ

Met Vai Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro 20 25 30 Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gin His Ile Met Gin Ala Gly Gin Thr 35 40 45 Leu His Leu Gin Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro 50 55 60 Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala 65 70 75 80 Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gin Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr 85 90 95 Ala Gin Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val 100 105 110 Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile 115 120 125 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 130 135 140 Ile Ile HiS Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 145 150 155 160 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Tcp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 180 185 190 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 195 200 205 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 210 215 220 Gin Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gin Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val 225 230 235 240 Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr 245 250 255 Pro Leu Asn Thr Arg Val Gin Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys 260 265 270 Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gin Ser Asn Ser His 275 280 285 Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gin Asn Lys 290 295 300 Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys 305 310 315 320 Ser val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val 325 330 335 Lys His Arg Lys Gin Gin Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser 340 345 350 Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro ser Pro Glu Val Val 31

ΕΡ 1 487 482/PT

Trp Leu 355 Lys Asp Thr 370 Arg Gly Tyr 3Θ5 61 y Asn Tyr Thr Asn Leu Thr Ala Lys Ala Vai 420 Ser Arg Gin 435 Ile Leu Lys 450 Trp Phe Trp 465 Asp Phe Cys Ser Asn Met Gly Asn Glu Gly Lys 500 Asn Ile Ser 515 Gly Ile Gly 530 Arg Asn Ile 545 Vai Asn Leu Glu Cys Thr Vai Asn Arg Thr Vai 580 Asn Met Ala 595 Ile Thr Asn 610 Vai Ser Leu 625 Vai Tyr Thr Gly Asp Gin Glu Ala Ala Ile Ser 660 Ser Glu Pro 675 Gin Ile Pro 690 Gly Ile Ile 705 Vai Thr Glu Glu Lys Gly Ser Vai Asp Lys Ser 740 Asn Ala Thr 755 Leu Phe Arg 770 Ser Ser Ser 785 Pro Asp Glu Vai 360 Gly Leu Pro 375 Ala Ser Leu 390 Ile Ile Ile 405 Leu Leu Ser Thr Leu Ile Vai Ser Phe Pro Asp 440 Thr Cys Thr 455 Ala His Pro 470 Cys Asn Asn 485 Asn Glu Glu Arg Ile Glu Ser Lys Met Ala Ser 520 Tyr Ile Cys 535 Ile Ser Phe 550 Tyr Ile Lys 565 Met Pro Thr Lys Phe Leu Tyr Asn Arg Thr Met 600 Lys Glu His 615 Ser Gin Asp 630 Ser Gly Glu 645 Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Leu Ser Thr Thr Leu 680 Thr Trp Phe 695 Lys Leu Gly 710 Pro Gly Asp 725 Glu Gly Vai Glu Ser Ser Ala Leu Glu Leu Ile 760 Trp Leu Leu 775 Leu Glu Ile 790 Lys Thr Pro 805 Leu Asp Glu

Thr Glu Lys Ser 380 Lys Asp Vai 395 Thr Ile Lys 410 Gin Ser Asn 425 Vai Lys Pro Pro Ala Leu Tyr Tyr Gly Ile Pro 460 His Asn His 475 Ser Ser Phe 4 90 Ile Leu Ile 505 Thr Gin Arg Thr Leu Vai Vai Ala Ser Asn Lys 540 Thr Asp Vai 555 Pro Glu Gly 570 Glu Asp Arg 585 Asp Vai Thr His Tyr Ser Ile Ile Thr Leu Asn 620 Thr Tyr Ala 635 Cys Gin Lys 650 Lys Glu Arg 665 Asn Leu Ser Asp Cys His Ala Asn Asn His Lys 700 Ser Ser Thr 715 Leu Tyr His 730 Cys Lys Tyr 745 Leu Thr Vai Thr Leu Thr Cys Thr Leu Phe Ile 780 Asp Tyr Leu 795 Ser Gin Cys 810 Glu Arg 365 Ala Arg Tyr Leu Glu Glu Asp Ala 400 Asn Vai Phe 415 Lys Gin Ile 430 Tyr Glu Pro 445 Leu Gly Ser Gin Pro Thr Ile Glu Ala Arg Cys 480 Asp Ala Asp 495 Ser Met Ala 510 Ile Ile Ala 525 Asp Ser Arg Vai Gly Thr Vai Asn Gly Phe His 560 Leu Lys Leu 575 Ser Trp Ile 590 Leu Leu Ser 605 Lys Gin Lys Leu Thr Ile Met Arg Ala Arg Asn 640 Ile Thr Ile 655 Arg Asp His 67 0 Thr Vai Asn 685 Gly Vai Pro Ile Gin Gin Glu Phe Ile Glu Arg 720 Ala Thr Asn 735 Gin Gin Gly 750 Thr Ser Thr 765 Cys Vai Ala Arg Lys Met Lys Ile Ile Met Asp 800 Leu Pro Tyr 815 Asp 32

ΕΡ 1 487 482/PT

Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser 820 82S 830 Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Vai Vai Gin Ala Ser Ala Phe Gly 835 840 845 Ile Lys Lys 5er Pro Thr Cys Arg Thr Vai Ala Vai Lys Met Leu Lys 850 855 860 Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys 965 870 875 880 Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn Vai Vai Asn Leu Leu Gly 885 890 895 Ala Cys Thr Lys Gin Gly Gly Pro Leu Met Vai Ile Vai Glu Tyr Cys 900 905 910 Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe 915 920 925 Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys 930 935 940 Met Glu Pro Gly Leu Glu Gin Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Vai 945 950 955 960 Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gin Glu Asp Lys Ser 965 970 975 Leu Ser Asp Vai Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu 980 985 990 Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gin Vai Ala Arg 995 1000 1005 Gly Met. Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala 1010 1015 1020 Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Vai Vai Lys Ile Cys Asp 1025 1030 1035 1040 Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr Vai Arg Lys 1045 1050 1055 Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe 1060 1065 1070 Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Vai Trp Ser Tyr Gly Vai Leu 1075 1080 1085 Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Vai Gin 1090 1095 1100 Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu Arg Glu Gly Met Arg Met Arg 1105 1110 1115 1120 Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu Ile Tyr Gin Ile Met Leu Asp Cys 1125 1130 1135 Trp Hls Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Vai Glu 1140 1145 1150 Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gin Ala Asn Vai Gin Gin Asp Gly Lys Asp 1155 1160 1165 Tyr Ile Pro Ile Asn Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr 1170 1175 1180 Ser Thr Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala 1185 1190 1195 1200 Pro Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Vai Arg Tyr Vai Asn Ala 12 05 1210 1215 Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu 1220 1225 1230 Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gin Gly Asp Ser Ser Thr 1235 1240 1245 Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser Lys 1250 1255 1260 Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Vai Thr Ser Lys Ser Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Ser Gly Leu Ser Asp Vai Ser Arg Pro Ser Phe Cys His Ser Ser 1285 1290 1295 Cys Gly His Vai Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr Tyr Asp His Ala 1300 1305 1310 Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro Pro Pro Asp Tyr Asn 1315 1320 1325 Ser Vai Vai Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile 1330 1335 <210> 5 33

ΕΡ 1 487 482/PT

<211> 5390 <212> ADN <213> ratinho <400> 5 ctgtgtcccg gctggagcca cgcctctgtg gctctgtgcc tggttctgcg cccaagctca acttgcaggg gaaagggtat aCtcccaggg atagcctcca agtgaccagc tgccgagggt tttgttccgg tacacgatca cagtctatca cccccgcatg acagagctca aagaagattg agcaccttga cccagtggac attgctttcg atccctgtga cccattgagt gaaagagaCg agccacatgg tcgcctatgg aaccctcccc cccggccaaa ggaaacaaga gtaagtacgc aacaaagcgg actgtgcaac gacagaaata cacatgggcg ggcaccatgt ctgcaggacc tgcctggtca gagaatcaga cctaccccac gtactgagag cagccggata gggcgccggt acttctttgc caggcgcgag tggagacccg gcacacagaa gacagcggga tggtgactga tggttggaaa ctgtttatgt atggcatcgt cgatttcaaa atggaaacag gctatgccgg tgtacatagt aaattgagct atgtggggct taaaccggga caatagaaag ggatgatcaa gtagtgggat agtatctcag ccaactacac caggaaacta tctctctggt attcctacca tgcaccacat caagcccgta tcgaagtcac tggtcatcca gacgaggaga ctgctgccca cgtttgagaa aatcactcac tttctaacag aaggcgacta aacagctcat caacaaccat acattacatg atgggaaccg acctggctga gccccgcgct gggccaggga gtgcaggatg agccgcctct agacatactg cctggactgg atgcggcggt tgatactgga ctatgttcga gtacatcacc cctcaatgtg aatttcctgg catggtcttc tgtggttgta atctgccgga tgatttcacc tgtgaaaccc tgcgaccaag gagaaataga gaaatctttg ttacccagct aatgattgtt cacggtcatc tgtgaatgtc gtatgggacc ccagtggtac tgcttgtaaa caaaaaccaa agccgccaac gagggtcatc gccaactgag cctcacgtgg accagtttgc cacaaatgac tgtttgctct catcctagag tggcçagacc gttcaaagae gaaectgact cccgattccg ctccccggtc cggagaagga gagagcaagg gtgggtttga aeaattttgg ctttggccca ggCgacagta gcctacaagt gattacagat gagaacaaga tctctttgcg gacagcgaga tgtgaggcaa ggatatagga gaaaaacttg tggcactctc tttcctggga agtgaccaag acatttgtcc gtggaagcca cctgatatca ggcgatgaac ctcaccaacc ccaccccaga atgcagacat tggcagctag gaatggagac tatgccctga gtgtcagcgt tccttccatg caggagagtg tacaagcttg aagaacttgg atcttgattg gctcaagata cgcatggcac attgaagtga aacgagaccc ateegcaggg cggacaccgc ttgcgctgcg gCctgtgcct cgctgctagc ctggcgattt caaatacaac atgctcagcg tcttctgcaa gctcgtaccg caccattcat acaaaactgt ctaggtatcc taggctttac agatcaatga tttatgatgt tcttaaattg caccttcaaa ctgtggcgaa gggaatacac gagttcacac cagtgggcag aatggtacag tcaccatcat ccatttcaat tcggtgagaa tgacatgcac aagaagcctg acgCggagga ctgaaggaaa

Cgtacaaatg tgatcagggg tgtccctgtt gctcacaggc atgctctttg tggcatttca agaagaccaa ccatgatcac cttgcccagc tggtagaaga tgaggaagga tgcagccgcg 60 ggggccatac 120 gagaaactgg 180 tgtcgctctg 240 tctccatccc 300 ccttcagatt 360 tgattctgag 420 aacactcacc 480 ggacgtcgac 540 cgcctctgtc 600 ggtgatcccc 660 agaaaagaga 720 tctccccagt 780 tgaaacctat 840 gattctgagc 900 tacagcgaga 960 gtctcatcat 1020 gacgcttttg 1080 ctgtgtagcg 1140 aaagcctttt 1200 tcaagtccga 1260 aaatggaagg 1320 ggaagtgact 1380 ggagaaacag 1440 agccttgatc 1500 agtctacgcc 1560 ctcctacaga 1620 tttccagggg 1680 aaacaaaact 1740 tgaagccatc 1800 tcctgaaatt 1860 gtgcactgca 1920 aacatcggtc 1980 gaaactgaat 2040 gaatgcctct 2100 gaaaagacat 2160 cggaaatetg 2220 atctggaaat 2280 ttcaggcatt 2340 ggatggaggc 2400 34

ΕΡ 1 487 482/PT ctctacaccc atagaaggtg attgccatgt gaaggggaac gatgagcget ctgaaactag tttggaactg gcaacacaca caccatctca gtgattgtgg gaatttgttc gagctctccg agctcaggct gaactgtaca aagggcatgg attcCcctat tataaagacc ccggaaacca ttgctctggg gaattttgta gaaatgtacc tcagagtCgg gactatattg ctgcctacct tatgacaaca gtgagtgtaa gatgacagcc gacaggaaca gtggcctcgg acagacacca gttcacgctg tcccggctcc gttgttcttt tcagactgca tgtgttgact ggtctcacta tggcaacggc gtgagatgtc agccaagtgt gcggttggag aggaaacgca cgggttacag cttacgtgCc tctcaggctg cggggccgaa acgtggcgcc tggtgtcctt gtggcttcct ccagatttcg ttttaaccta gccaggcctg cccaggaaaa tcttctggct tgaagacagg gtgaacgctt gaaaacctct acaagacagc gcgagcatcg atgtggtgaa aattctgcaa cctataagag tggatctgaa ttgttgagga aggacttcct agttcttggc cggagaagaa cggattatgt tttttgacag aaatattttc ggagattgaa agaccatgct tggagcattt ttcttccaat cacctgtttc cagcaggaat aaacatttga agacagacag aattatctcc aaggctccaa cegtçtactc actcagggac gcccccaact ccaccacccg aggagcttgt ctactctctt ccagtCaaag acctctgtga ccagggccga taagtgtggg cctgcagatg aaggcggccg gcgagttccc tcctggcctg tgccttaatt gaattgtgag ctggtggcag cctctatctc gatggcagaa aaattacttt taaaactatg caatgtcctt gaccaacttg ccttcttgtc ctacttgtct gccttatgat tggccgcggt gacttgcaaa agccctcatg cctcctaggc gtttggaaac caaaggggca aagacgcttg gaaatcgetc gaccttggag atcaaggaag tgtggttaag cagaaaagga agtatacaca cttaggtgcc agaaggaact ggactgctgg gggaaacctc gtcagagaca ctgtatggag cagtcattat agatatccca tgggatggtc atcttttggt ccagaccagt cagcgacgag cacactgcgc cctggaaatc gaagtagcca cctcagggca tCcoattcat caaaagactt aactggatcg gtctgtctac atgtggactg cattgtgctg gcagggtttg tgtggcgttt gccccaggaa cagaacacca aacagaacag gtctgagggt cactcctgtc aaatcttaat ttagccgagg tctactggtt ggecgtgcaa gaagtcatta attgtcctac attgtcatgg gccagcaagt gccttcggcc acagtagccg tctgaáctca gcctgcacca ctatcaactt cgcttccgcc gacagcatca agtgatgtag catctcatct tgtatccaca atctgtgact gatgcccgac attcagagcg tccccatacc agaatgcggg catgaggacc ctgcaagcaa ctgagcatgg gaagaggaag ctccagaaca ttggaggaac cttgcatcag ggaatgatgc ggctaccagt gcaggacttt tcacctcctg acgagagagg catttgattt tttccagaga ttaaaagtcc ccaaacacgc aatgggcaat cttggaggct ggaggaagga gctctggtgg gttttggaag cctactccta ggaaatgatg aaagagagga aaactcaggg tctctgtcaa aggcccccaa tggttggttc ttatgataac tctgcctgtg gagcggagac tcctcgtcgg ggaccgttaa atccagatga gggaattccc aagtgattga tcaagatgtt agatcctcat agccgggagg acttacgggg agggcaagga ccagcagcca aggaagaaga gttacagctt gggacctggc tcggcttggc tccctttgaa atgtgtggtc ctggggtcaa ctcctgacta ccaaccagag atgcgcagca aagaggattc tgtgcgaccc gtaagcgaaa cagaagtaaa aagagctgaa ccagtaaaag ctgggtatca taaagatggt tttaaatgga tgctgcttag tcatttttgg agatgcccat catataatgt ggactctgtc gctttgtgtg ttgtgçagga aggcgcaagt aggtgggctt gtttgcgtgc atgagagttc cagcttgctc acgtcggcag tttctgctgg gtggcggtaa gtcctcagta gctctccaga atctactgta tgcttatgtt gctcttcata 2460 cactgcagtg 2520 gcgggccaat 2580 attgcccttg 2640 cagggaccgg 2700 ggcagacgct 2760 gaaagaagga 2820 ccacactggt 2880 gcctctcatg 2940 caagagaaat 3000 ctacgttggg 3060 gagctctgcc 3120 agcttctgaa 3180 ccaagtggct 3240 agcacgaaac 3300 ccgggacatt 3360 gtggatggcc 3420 tttcggtgtg 3480 gattgatgaa 3540 cactacccca 3600 accctcgttt 3660 ggatggcaaa 3720 tggactctcc 3780 caaattccat 3840 gagccggcca 3900 agtgatccca 3960 aactctggaa 4020 cagggagtcC 4080 ctcagatgac 4140 ggatgctgca 4200 agtggtcctg 4260 atttteaagt 4320 aggagggacc 4380 gacccaagaa 4440 gccctgctgt 4500 etceaagaag 4560 ttgaggatgg 4620 tgcggctatg 4680 cgctcggaga 4740 gtggcctgtc 4800 tcttcacagt 4860 cttccggact 4920 cttcctcatc 4980 aggctcctga 5040 gtggagaccc 5100 aggctcaggc 5160 ttttagcttt 5220 taatcactag 5280 tcctttacjaa 5340 5390 <210> 6 <211> 1345 <212> PRT <213> ratinho <400> 6

35 ΕΡ 1 487 482/PT

Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Phe Cys Val Glu 1 5 10 15 Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Thr Gly Asp Phe Leu His Pro Pro 20 25 30 Lys Leu Ser Thr Gin Lys Asp Ile Leu Thr Ile Leu Ala Asn Thr Thr 35 40 45 Leu Gin Ile Thr Cys Arg Gly Gin Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro 50 55 60 Asn Ala Gin Arg Asp Ser Glu Glu Arg Val Leu Val Thr Glu Cys Gly 65 70 75 80 Gly Gly Asp Ser Ile Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Arg Val Val 85 90 95 Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Ser Tyr Arg Asp Val Asp Ile 100 105 110 Ala Ser Thr Vai Tyr Val Tyr Val Arg Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile 115 120 125 Ala Ser Vai Ser Asp Gin His Gly Ile Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys 130 135 140 Asn Lys Thr Vai Val Ile Pro Cys Arg Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn 145 150 155 160 Vai Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly 165 170 175 Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Glu Ile Gly Phe Thr Leu Pro Ser Tyr 180 185 190 Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp 195 200 205 Glu Thr Tyr Gin Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg 210 215 220 Ile Tyr Asp Val Ile Leu Ser Pro Pro His Glu Ile Glu Leu Ser Ala 225 230 235 240 Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val 245 250 255 Gly Leu Asp Phe Thr Trp His Ser Pro Pro Ser Lys Ser His His Lys 260 265 270 Lys Ile Vai Asn Arg Asp Val Lys Pro Phe Pro Gly Thr Val Ala Lys 275 280 285 Met Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Glu Ser Val Thr Lys Ser Asp Gin 290 2 95 300 Gly Glu Tyr Thr Cys Val Ala Ser Ser Gly Arg Met Ile Lys Arg Asn 305 310 315 320 Arg Thr Phe Val Arg Val His Thr Lys Pro Phe Ile Ala Phe Gly Ser 325 330 335 Gly Met Lys Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Ser Gin Val Arg Ile 340 345 350 Pro Vai Lys Tyr Leu Ser Tyr Pro Ala Pro Asp Ile LyS Trp Tyr Arg 355 360 365 Asn Gly Arg Pro Ile Glu Ser Asn Tyr Thr Met Ile Val Gly Asp Glu 370 375 380 Leu Thr Ile Met Glu Val Thr Glu Arg Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Val 385 390 395 400 Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Met Glu Lys Gin Ser His Met Val Ser 405 410 415 Leu Vai Vai Asn Val Pro Pro Gin Ile Gly Glu Lys Ala Leu Ile Ser 420 425 430 Pro Met Asp Ser Tyr Gin Tyr Gly Thr Met Gin Thr Leu Thr Cys Thr 435 440 445

36 ΕΡ 1 487 482/PT

Vai Tyr Ala Asn Pro Pro Leu His His Ile Gin Trp Tyr Trp Gin Leu 4 50 455 460 Glu Glu Ala Cys Ser Tyr Arg Pro Gly Gin Thr Ser Pro Tyr Ala Cys 465 470 475 480 Lys Glu Trp Arg His Val Glu Asp Phe Gin Gly Gly Asn Lys Ile Glu 485 490 495 Vai Thr Lys Asn Gin Tyr Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val 500 505 510 Ser Thr Leu Val Ile Gin Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr Lys Cys 515 520 525 Glu Ala Ile Asn Lys Ala Gly Arg Gly Glu Arg val Ile Ser Phe His 530 535 540 Vai Ile Arg Gly Pro Glu Ile Thr Val Gin Pro Ala Ala Gin Pro Thr 545 550 555 560 Glu Gin Glu Ser Val Ser Leu Leu Cys Thr Ala Asp Arg Asn Thr Phe 565 570 575 Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Ser Gin Ala Thr Ser Val His 580 585 S90 Met Gly Glu Ser Leu Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp A.la Leu Trp 595 600 605 Lys Leu Asn Gly Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile Leu Ile 610 615 620 Val Ala Phe Gin Asn Ala Ser Leu Gin Asp Gin Gly Asp Tyr Val Cys 625 630 635 640 Ser Ala Gin Asp Lys Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Leu Val Lys Gin 645 650 655 Leu He Ile Leu Glu Arg Met Ala Pro Met Ile Thr Gly Asn Leu Glu 660 665 670 Asn Gin Thr Thr Thr Ile Gly Glu Thr Ile Glu Val Thr Cys Pro Ala 67 5 680 685 Ser Gly Asn Pro Thr Pro His Ile Thr Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr 690 695 700 Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Arg Asp Gly Asn Arg Asn Leu 705 710 715 720 Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Cys Gin 725 730 735 Ala Cys Asn Val Leu Gly Cys Ala Arg Ala Glu Thr Leu Phe Ile Ile 740 745 750 Glu Gly Ala Gin Glu Lys Thr Asn Leu Glu Val Ile Ile Leu Val Gly 755 760 765 Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile Val Leu 770 775 780 Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Glu Gly Glu Leu Lys Thr Gly Tyr Leu 785 790 795 800 Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu Arg Cys Glu 805 810 815 Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu 820 825 830 Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gin Val Ile Glu 835 840 845 Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Lys Thr Val Ala 850 855 860 Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala Leu 865 870 875 880 Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu Asn Val 885 890 895 Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met Val 37

ΕΡ 1 487 482/PT 900 90S 910 Ile Vai Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg Gly 915 920 925 Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Ser Lys Gly Ala Arg Phe Arg 930 935 940 Gin Gly Lys Asp Tyr Val Gly Glu Leu Ser Val Asp Leu Lys Arg Arg 945 950 955 960 Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gin Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe Val 965 970 975 Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Ser Glu Glu 980 985 990 Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr Ser Phe 995 1000 1005 Gin Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His 1010 1015 1020 Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val Val 1025 1030 1035 1040 Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp 1045 1050 1055 Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro 1060 1065 1070 Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gin Ser Asp Val Trp Ser 1075 1080 1085 Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr 1090 1095 1100 Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly 1105 1110 1115 1120 Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gin Thr 1125 1130 1135 Met Leu Asp Cys Trp His Glu Asp Pro Asn Gin Arg Pro Ser Phe Ser 1140 1145 1150 Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gin Ala Asn Ala Gin Gin 1155 1160 1165 Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Met Ser Glu Thr Leu Ser Met 1170 1175 1180 Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met 1185 1190 1195 1200 Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala 1205 1210 1215 Gly Ile Ser His Tyr Leu Gin Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro Val 1220 1225 1230 Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu Val Lys 1235 1240 1245 Vai Ile Pro Asp Asp Ser Gin Thr Asp Ser Gly Met Val Leu Ala Ser 1250 1255 12 60 Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Asn Lys Leu Ser Pro Ser Phe 1265 1270 1275 1280 Gly Gly Met Met Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser Glu Gly 1285 1290 1295 Ser Asn Gin Thr Ser Gly Tyr Gin Ser Gly Tyr His Ser Asp Asp Thr 1300 1305 1310 Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Asp Glu Ala Gly Leu Leu Lys Met Val 1315 1320 1325 Asp Ala Ala Val His Ala Asp Ser Gly Thr Thr Leu Arg Ser Pro Pro 1330 1335 1340

Vai 1345

Lisboa, 2011-12-12

Claims (5)

1. ΕΡ 1 487 482/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Vacina de ADN eficaz para induzir uma resposta imunitária contra células endoteliais proliferantes compreendendo uma construção de ADN codificando operavelmente uma proteína de receptor de VEGF num transportador farmaceuticamente aceitável, onde a proteína de receptor de VEGF é seleccionada entre o grupo consistindo de VEGFR-2 possuindo a sequência SEQ ID NO: 2, Flk-1 possuindo a sequência SEQ ID NO: 6, e um receptor que se liga a VEGF ou seus fragmentos e que possui uma sequência que partilha pelo menos 80% de homologia com as sequências SEQ ID NO: 2 ou 6, e a construção de ADN é incorporada operavelmente num vector de Salmonella typhimurium ou Salmonella typhi atenuadas.
2. 2. Vacina de ADN da reivindicação 1 onde a construção de ADN é um ADN substancialmente purificado possuindo uma sequência de polinucleótido seleccionada entre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, e uma sequência de polinucleótido que partilha com estas pelo menos 80% de homologia e codifica um receptor que se liga a VEGF ou seus fragmentos.
3. 3. Utilização de uma construção de ADN codificando operavelmente uma proteína de receptor de VEGF e um seu transportador farmaceuticamente aceitável para a preparação de uma vacina de ADN para inibição do crescimento de tumor num mamífero, onde uma quantidade imunologicamente eficaz da referida vacina de ADN se destina a ser administrada oralmente ao referido mamífero, pela qual o referido mamífero exibe uma resposta imunitária induzida pela vacina e específica para células endoteliais proliferantes, resultando na paragem do crescimento de tumor, redução no tamanho de tumor ou inibição da disseminação do tumor, onde a proteína de receptor de VEGF é seleccionada entre o grupo consistindo de VEGFR-2 possuindo a sequência SEQ ID NO: 2, Flk-1 possuindo a sequência SEQ ID NO: 6, e um receptor que se liga a VEGF ou seus fragmentos e que possui uma sequência que partilha pelo menos 80% de homologia com as sequências SEQ ID NO: 2 ou 6, e a construção de ADN é incorporada operavelmente num vector de Salmonella typhimurium ou Salmonella typhi atenuadas. ΕΡ 1 487 482/PT 2/2
4. 4. Utilização da reivindicação 3 onde o mamífero é um humano.
5. 5. Artigo fabricado compreendendo uma vacina da reivindicação 1 embalada num recipiente estéril, hermeticamente fechado, o recipiente possuindo um rótulo afixado nele, o rótulo contendo material impresso identificando a vacina e proporcionando informação útil para um indivíduo administrar a referida vacina a um paciente. Lisboa, 2011-12-12