CN1634962A - 一种生产人造血增效因子的制备方法及所用的核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及一种生产人造血增效因子的制备方法，本发明还涉及所述的方法中使用的特异的核苷酸序列。

Description

一种生产人造血增效因子的制备方法及所用的核苷酸序列

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及一种生产人造血增效因子的制备方法，本发明还涉及所述的方法中使用的特异的核苷酸序列。

背景技术

造血干细胞移植按造血干细胞来源可分为：骨髓移植(BMT)、外周血造血干细胞移植(PBSCT)和脐血造血干细胞移植(CBSCT)。PBSCT可分为自体(Auto-PBSCT)和异基因PBSCT(Allo-PBSCT)。近十年来，PBSCT由于较BMT有以下优势而日益受到人们的重视：(1)移植后造血功能恢复迅速，减少了感染等并发症及住院时间：(2)辐射敏感性低，在体内植入率高：(3)采集方便，避免麻醉和手术，降低病人经费开支：(4)增加移植物中T细胞和NK细胞数量，使免疫功能迅速恢复：(5)对骨髓内有肿瘤细胞浸润、纤维化或骨盆局部接受放疗等原因无法采集骨髓时可采集PBSC。基于这些优势，近年来PBSC正在相当程度上有代替骨髓作为自体和异体移植主要干细胞来源的趋势。但是造血干细胞移植后造血功能恢复的速度依赖于植入的造血干/祖细胞(HSC/HPC)的数量。正常人外周血CD34⁺细胞只占单个核细胞的0.01-0.1％，而保证植入的CD34⁺细胞最低数为1×10⁶/Kg。从正常人或病人外周血中收集足够用于Auto-PBSCT或Allo-PBSCT的造血干细胞数，需要从数升甚至10余升血液体积中经多次浓集方可得到。多次采血不仅对医务人员和病人均很不利，且开支昂贵。目前临床上主要用造血细胞因子如G-CSF、SCF、GM-CSF等单用或几种细胞因子联合使用的方案，或化疗药物联合细胞因子方案对外周血干细胞动员。但是G-CSF、SCF和GM-CSF需多日给药(4-10天)，仍需要多次采集，费用高，难以预测最佳采集时间，临床上个体差异较大，且对有些个体不能有效动员。因此，寻找一种可使骨髓中存在的大量造血干细胞快速有效动员到外周血中的制剂或方案，有效提外周血中造血干细胞的含量来减少采集次数，提高采集效率，具有重要临床意义。

近年来趋化因子对造血干/祖细胞的动员作用日益引起重视。趋化因子(Chemokines)是一组对白细胞具有趋化作用的分泌型单链蛋白质，分子量为8-12KD，含两对二硫键，碱性，能结合肝素。GRO(growth related oncogene)家族是一类属于ELR⁺CXC族的趋化因子，包括GROα、GROβ、GROγ。GRO基因定位在4q12-13，由4个外显子和3个内含子组成。全长GROβ(1-73)含有73个氨基酸，主要生物学特性是趋化、激活中性粒细胞。1995年King等发现GROβN-端缺失4个氨基酸(APLA)的变异体GROβ-T或GROβ(5-73)为一种新型趋化因子，它由69aa组成，分子量为7550，理论等电点为9.75。

最近发现GROβ-T主要生物学功能为除比全长GROβ有更强趋化、动员和激活中性粒细胞效能外，还具有快速动员骨髓干细胞进入外周血液中效能和很强的造血增效活性(即刺激CFU-GM增殖)，故将其命名为造血增效因子(hematopoietic synergistic factor，简称HSF)，而全长GROβ这种活性很低。美国史密斯克莱思比彻姆(Smithkline Beecham Corporation)科研人员AG.King等是在研究造血调节肽SK&F107647化合物功能过程中发现HSF的，他们通过SK&F107647刺激人TF274骨髓基质细胞系和小鼠C6骨髓基质细胞系，利用肝素结合柱和抗GROβ亲和层析柱分别分离出人HSF和小鼠HSF。同时用RT-PCR方法克隆出编码人HSF和GROβ基因，亚克隆进原核表达质粒pEAKn上，并在E.coli中经化学诱导获得重组人HSF表达。他们为了得到N-末端无起始子甲硫氨酸(Met)的重组人HSF和便于纯化，在人HSF和GROβN端引入一个含有12个aa标签序列(DET-1)和肠激酶切割位点，即DET-1-DDDDK。融合蛋白DET-1-DDDDK-HSF(或DET-1-DDDDK-GROβ)在E.coli中几乎等量以包含体和可溶性形式表达。经过复性→抗DET-1单克隆抗体亲和层析柱分离→肠激酶切割→再次亲合柱分离→反相高效液相层析(RP-HPLC)分离，最后获得重组人HSF纯品。这种工艺较复杂，成本高。因此存在着简化人HSF制备工艺方法的需要。

发明内容

因此，基于上述需要，本发明一方面涉及如SEQ ID NO.：1所示的多核苷酸序列。所述的多核苷酸序列是在上述编码人HSF基因的69个密码子中，共有34个替换为人大肠杆菌偏爱密码子获得的，它们是第4、5、7、8、13、14、16、17、20、21、22、23、24、25、27、28、29、32、33、36、37、38、40、41、42、43、48、50、51、52、53、56、61、65。

本发明还涉及含有所述的多核苷酸序列的载体。

本发明还涉及含有所述的载体的阳性表达质粒。

本发明进一步涉及由所述的阳性表达质粒表达的造血增效因子。所述的因子主要以包含体的形式表达。

本发明进一步涉及一种生产人造血增效因子的方法，其包括以下步骤：

1)含有编码造血增效因子的多核苷酸序列亚克隆到表达载体上，筛选含有阳性表达质粒的克隆；

2)将所述的阳性表达质粒转入大肠杆菌中，诱导表达以包含体形式表达的造血增效因子；

3)将所述的包含体变性裂解，经Sephacryl S-100分离，回收目的蛋白；

4)目的蛋白复性后，用SP-SepharoseFF分离；

其特征在于所述的编码造血增效因子的多核苷酸序列为SEQ IDNO.：1所示的多核苷酸序列。

本发明进一步涉及所述的造血增效因子用于制备动员造血干细胞进入外周血的药物中的用途。

附图说明

图1显示引物扩增以后的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。

图2显示表达质粒pET30a-hHSF的构建。

图3显示阳性克隆pET30a-hHSF的酶切鉴定图谱。

图4显示pET30a-hHSF/BL21(DE3)诱导表达不同时间的SDS-PAGE蛋白电泳图谱。

图5显示Sephacryl S-100纯化rhHSF的分离曲线图。

图6显示SP Sepharose纯化rhHSF的分离曲线图。

图7显示纯化的rhHSF的SDS-PAGE图谱。

图8显示纯化的rhHSF的SDS-PAGE紫外扫描图。

图9显示SDS-PAGE测定的rhHSF的分子量。

图10显示MALDI-TOF-MS测定的rhHSF分子量。

图11显示rhHSF氨基酸组成分析图谱。

图12显示rhHSF的吸收光谱曲线。

本发明的最佳实施方式

以下的参考实施例和试验实施例详细描述了本发明多核苷酸和本发明的所述的制备HSF的方法，其目的是进一步例示本发明，而不是限定其范围。

实施例1

hHSF基因的获得

本发明将编码hHSF的DNA片段5‘端引入Ndel酶切位点，3’端引入BamHI酶切位点，连接到表达质粒pET30a(购自Invitrogene，美国)的NdeI与BamHI酶切位点之间，构建以ATG为起始密码子的表达质粒，得到如SEQ ID NO.：1所示的多核苷酸序列，其是在编码人HSF基因的69个密码子中，共有34个替换为大肠杆菌偏爱密码子获得的，它们是第4、5、7、8、13、14、16、17、20、21、22、23、24、25、27、28、29、32、33、36、37、38、40、41、42、43、48、50、51、52、53、56、61和65。其具体替换见表1。

表1

No	aa	Codon	optimal	No	aa	Codon	optimal	No	aa	Codon	optimal
												1	T	ACT		25	K	AAG	AAA	49	N	AAC
2	E	GAA		26	S	TCC		50	P	CCC	CCG
												3	L	CTG		27	P	CCC	CCG	51	A	GCA	GCT
4	R	CGC	CGT	28	G	GGA	GGT	52	S	TCG	TCC
												5	C	TGC	TGT	29	P	CCC	CCG	53	P	CCC	CCG
6	Q	CAG		30	H	CAC		54	M	ATG
												7	C	TGC	TGT	31	C	TGC		55	V	GTT
8	L	TTG	CTG	32	A	GCC	GCT	56	K	AAG	AAA
												9	Q	CAG		33	Q	CAA	CAG	57	K	AAA
10	T	ACC		34	T	ACC		58	I	ATC
												11	L	CTG		35	E	GAA		59	I	ATC
12	Q	CAG		36	V	GTC	GTT	60	E	GAA
												13	G	GGA	GGT	37	I	ATA	ATC	61	K	AAG	AAA
14	I	ATT	ATC	38	A	GCC	GCT	62	M	ATG
												15	H	CAC		39	T	ACA		63	L	CTG
16	L	CTC	CTG	40	L	CTC	CTG	64	K	AAA
												17	K	AAG	AAA	41	K	AAG	AAA	65	N	AAT	AAC
18	N	AAC		42	N	AAT	AAC	66	G	GGC
												19	I	ATC		43	G	GGG	GGT	67	K	AAA
20	Q	CAA	CAG	44	Q	CAG		68	S	TCC
												21	S	AGT	TCC	45	K	AAA		69	N	AAC
22	V	GTG	GTT	46	A	GCT		70		TGA	TAA
												23	K	AAG	AAA	47	C	TGT
24	V	GTG	GTT	48	L	CTC	CTG

一.质粒DNA的提取

1.质粒DNA的小量提取(碱裂解法)

从3ml过夜培养的菌液中取1.5ml倒入Eppendoff管中，7000rpm离心1min，弃去上清。沉淀加入100μL的Solution I(25mMTrisHCl，pH8.0，10mMEDTA，50mM的葡萄糖)，振荡悬浮，混匀。加入200μL的Solution II(0.2M NaOH，1％SDS)，混匀，冰上放置5min。加入150μL的Solution III(3M醋酸钾，pH4.8)，混匀，冰上放置10min。15000rpm离心10min，上清转入另一个Eppendoff中，加入1ml无水乙醇，室温放置30min。15000rpm离心10min弃上清。沉淀加入0.5ml75％乙醇洗一次，15000rpm离心5min，沉淀室温放置干燥。加入含20μg/ml RNase A(购自华美生物技术公司)的30μL TE中溶解备用。

2.质粒DNA的大量制备(碱裂解法)

将50ml过夜培养的菌液放入50ml离心管中，4℃，7000rpm离心5min，弃上清，菌体加入6ml Solution I，振荡混匀。加入9ml SolutionII，轻轻上下颠倒数次，混匀，冰浴5min。加入9ml Solution III，上下颠倒混匀，冰浴10min。4℃，15000rpm离心15min，上清转入另一个50ml离心管。加入等体积的异丙醇(北京化工厂)，混匀，室温放置10min，14000rpm室温离心15min。沉淀加入75％乙醇1ml，放置片刻，沉淀悬浮起来后，转入1.5ml Eppendoff管中。15000rpm离心2min，弃去上清。沉淀真空抽干后，加入含20μg/ml Rnase A的500μL TE中，37℃酶解RNA 1hr。用等体积的1∶1的酚/氯仿(北京化工厂)抽提两次，氯仿抽提两次。加入50μL的3mol/L NaAc(pH4.6)，1ml无水乙醇，混匀，-20℃放置10min，15000rpm离心10min，沉淀用75％乙醇洗涤，15000rpm离心2min，弃上清，两次，沉淀真空干燥，用480μL消毒水溶解，加入4mol/L NaCl 120μL和13％PEG 600μL，混匀，冰浴40min，4℃，15000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗两次，真空干燥。加入400μL TE溶解备用。

二.DNA重组

1.PCR扩增

以下是所述的PCR引物：

P1(38mers)：5’引入NdeI酶切位点

5’CC CAT ATG ACT GAA CTG CGT TGT CAG TGT CTG CAG ACC3’

P2(58mers)：

5’T AAC TTT AAC GGA CTG GAT GTT TTT CAG GTG GAT ACC CTG CAG GGTCTG CAG ACA CTG3’

P3(58mers)：

5’AG TCC GTT AAA GTT AAA TCC CCG GGT CCG CAC TGC GCT CAG ACCGAA GTT ATC GCT AC3’

P4(56mers)：

5’GA AGC CGG GTT CAG ACA AGC TTT CTG ACC GTT TTT CAG GGT AGC GATAAC TTC GGT3’

P5(58mers)：

5’T CTG AAC CCG GCT TCC CCG ATG GTT AAA AAA ATC ATC GAA AAA ATGCTG AAA AAC GGC3’

P6(38mers)：引入BamHI酶切位点

5’CG GGA TCC TTA TTA GTT GGA TTT GCC GTT TTT CAG CAT3’

将P1、P2、P3、P4、P5、P6配成50μmol/L浓度。第一轮进行两个片段拼接(依次P1与P2、P3与P4、P5与P6)。将P1与P2(P1、P2既是模板，又是引物)各取1μL，加入50μL的反应体系中(内含2.5mmol/LdNTP(Promega公司产品)8μL，10 x buffer 5μL，Taq酶1-2U，必要时可加入适量的镁离子，以消毒的重蒸水补足体积)，表面加一层矿物油，放入PCR仪中。P3与P4、P5与P6也如此处理，根据模板和引物的情况设定反应程序，所述的反应程序为本领域普通技术人员已知的技术，分别扩增出P1-2、P3-4、P5-6。再将P1-2与P3-4各取1μL为模板，分别加入P1、P4各0.5μmol/L进行第二轮PCR，扩增4片段拼接产物P1-4。然后将P1-4、P5-6PCR产物各取1uL为模板，分别加入P1、P6各0.5μmol/L进行第三轮PCR，扩增6片段拼接产物P1-6。PCR产物见图1。

2.DNA的琼脂糖电泳

称取适量琼脂糖，加入相应量的0.5xTBE，配成相应的浓度，融化后冷却至40-50℃，加入少量EB，倒入插有梳子的电泳槽中，待彻底凝固，拨出梳子，样品与加样缓冲液混合，加入加样孔，接通电源，50-80V电泳。

1)DNA的回收

在紫外灯下切下琼脂糖电泳中分离的DNA片段条带，用大连宝生物公司生产的DNA片段凝胶回收试剂盒回收。

2)DNA的酒精沉淀

含有目的DNA的溶液，加入10％体积的3mol/LNaAc(pH4.6)，二倍体积的无水乙醇沉淀DNA，离心，将沉淀再用75％乙醇洗涤一次，低温抽干，溶于TE备用。

3)DNA的酶切

50μL的反应体系含有质粒3～5μg，10 x buffer 5μL，NdeI和BamHI限制性内切酶5-10U(大连宝生物公司)，加水至所需体积，37℃保温3～4hr。

4)DNA的连接

20μL的反应体系，含有10 x buffer 2μL，DNA连接酶1U，线性载体和插入目的DNA片段克分子比一般为1∶4，混匀，4℃过夜(16hr)。

3.感受态菌的制备

将大肠杆菌接种于LB培养基平板上划线，37℃培养过夜。挑单菌落接种于3mlLB中，37℃培养16hr。取2.5ml培养物接于200ml LB中，37℃培养2～3hr，至OD₅₅₀＝0.55～0.65，以4000rpm离心10min，收集菌体，重悬于1/2体积预冷的0.1mol/L MgCl₂中，4000rpm离心5min，收集菌体悬浮于1/2体积预冷的0.1mol/L CaCl₂中，冰浴30min，4000rpm离心5min，菌体重悬于5-6ml的15-20％甘油-0.1mol/LCaCl₂中，200μL/管分装，-50℃保存。

4.质粒转化

取100μL感受态菌，加入适量质粒DNA或连接产物，轻轻混匀，冰浴40min，42℃热休克90秒，冰浴2min，加入0.6ml LB培养基，37℃振荡培养1.5hr，取适量菌体，涂布至含有抗生素的平板上，37℃培养过夜。

5.克隆筛选与鉴定

1)蓝白斑筛选

将T载体连接产物转化DH5α感受态菌。将含有1.5％琼脂糖的LB培养基用微波炉溶化，冷却至60℃左右加入氨苄青霉素(终浓度为100μg/ml)，倒入平板，待凝固后在其表面涂上20mg/mlX-gal 16μL和100mmol/L IPTG 4μL，37℃放置1～2hr，取转化产物200μL涂板，37℃过夜。长出的菌落出现蓝白斑，必要时可在4℃放置1-2hr以使其更清楚。挑白斑鉴定阳性克隆。阳性克隆pET30a-hHSF酶切图谱见图3。

具体的pET30a-hHSF的构建见图2。

2)限制性内切酶鉴定

用小量碱裂解法提取的质粒DNA，选用适当的内切酶酶切，适当浓度的琼脂糖电泳鉴定，确定酶切位点是否吻合，片段大小是否正确。

3)PCR方法鉴定

以小量碱裂解法提取的质粒DNA为模板，以引物P1和P6进行PCR，适当浓度的琼脂糖电泳鉴定，确定是否有特异区带，片段大小是否正确。

6.菌种保存

将菌种在LB平板上划线，次日长出单菌落，挑一单菌落至3ml LB培养基中，37℃振荡培养12-16hr，按比例1∶100接种至另一新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16hr，按比例1∶100接种至另一新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入甘油至终浓度15％～20％，-50℃保存。

三.重组蛋白在E.coli中的表达及纯化

1.重组蛋白的诱导表达

1)重组蛋白的小量诱导表达

挑单克隆菌落于含有卡那霉素(终浓度50μg/ml)的3ml培养基中，过夜培养，按1％接种到另一管3ml培养基中，培养至OD₆₀₀约为0.4-0.6，加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，Promega)，继续培养4hr左右，收集菌体，SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达。其表达结果见图4。

2)重组蛋白的大量诱导表达

挑单菌落接种于3mlLB培养基中，37℃培养12hr，按0.5％接种于100ml LB培养基中，37℃250rpm过夜培养，按4％接种于250ml高浓度肉汤培养基，37℃培养至对数生长期，加入诱导剂0.5mmol/L IPTG诱导表达4～5hr。收集菌体，超声破碎，分离纯化重组蛋白。

2.重组蛋白的纯化

1)菌体的超声破碎

菌体用10倍体积的溶液A(50mM Tris-HCl，pH8.0，1％Tritonx-100，10mM EDTA)悬浮，4℃超声破碎菌体，360W，每次工作时间20秒、间歇时间40秒，12次，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，将沉淀部分重复上述步骤两次，SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白在菌体中的存在形式(存在于上清为可溶形式，存在于沉淀中为包涵体形式)。

2)包涵体的洗涤

将沉淀部分加入等体积的包涵体洗涤液B(50mM Tris-HCl，pH8.0)，混匀，4℃12000rpm离心10min得沉淀，重复一次。

3)包涵体的溶解

洗涤后的包涵体加入包涵体裂解液(50mM Tris-HCl，4M盐酸胍，2M尿素，150mM NaCl，200mM β-巯基乙醇)40ml/L细菌培养液，溶解过夜，14000rpm，4℃离心30min，收集上清。SDS-PAGE鉴定包涵体纯度。

4)将包涵体溶解物过2倍柱体积平衡液平衡的Sephacryl S-100(法玛西亚公司，美国)。得到的分离曲线见图5。

5)包涵体的复性

在冰浴和搅拌情况下将从Sephacryl S-100分离收集的重组蛋白逐滴加入复性液中，4℃复性48hr后，用透析液A充分透析，换液7-8次，每次透析液量至少为透析样品体积的10倍，透析48hr。

6)过SP Sepharose柱：将透析后的样品上SP Sepharose柱分离，先以洗脱液A洗脱，再以洗脱液B洗脱。

7)以透析液B透析的样品用SP Sepharose柱分离的目的蛋白。其分离曲线见图6。

8)留取少量样品用于理化性质鉴定，其余样品内加入1％人白蛋白，混匀后除菌过滤，置-20℃保存备用。

9)树脂的处理

(1)CM-Sepharose FF的处理

用过的树脂先以2倍柱体积的2mol/L NaCl洗涤，流速快一些。然后用2倍体积的0.5mol/L NaOH-1.5mol/L NaCl处理20-40min。用水洗涤至pH7.0左右，用上样缓冲液平衡3-5个柱体积备用。短期保存加入少量NaN₃，长期保存于20％乙醇中。

(2)SP-Sepharose High Performance的处理

用过的树脂先以1倍柱体积的2.0mol/L NaCl洗涤，处理10-15min，然后用1.0mol/L NaOH处理0.5-1h，用水洗涤至pH7.0左右，用上样缓冲液平衡至少3个柱体积备用。长期保存于4℃20％乙醇-0.2mol/L乙酸钠中。

4.重组蛋白的鉴定

1)SDS-PAGE蛋白电泳

按下表配制浓缩胶和分离胶(单位ml)

表2

	H2O	30％Acr-Bis	1.5mol/L Tris-HCl Ph8.8	10％SDS	10％APS	TEMED
							5％浓缩胶	4.6	1	2*	0.08	0.07	0.008
15％分离胶	4.7	10	5.0	0.2	0.09	0.008
							18％分离胶	2.7	12	5.0	0.2	0.09	0.008

待分离胶聚合后上层灌入浓缩胶，完全聚合后拔出梳子，在加样孔内加入处现好的样品，电泳条件为恒流20mA。样品处理时加入适量上样缓冲液，煮沸10min。

2)蛋白含量测定

SDS-PAGE-染色-比色法：以准确量的rhSCF为标准，用考马斯亮蓝R-250对凝胶染色，经凝胶紫外扫描比对一定量的rhSCF与rhHSF的紫外光吸收值，推算出rhHSF含量。

所得的目的蛋白的纯度鉴定见图7。

使包涵体溶于变性剂后纯度为75％，经SP-Sepharose纯化及过滤后，非还原型rhHSF纯度为97％，见图8。

四.重组蛋白理化性质测定

1.分子量测定

1)SDS-PAGE法

制备18％的SDS-聚丙烯酰胺变性凝胶，对纯化的rhHSF进行SDS-PAGE分析，测定迁移距离。以小分子量蛋白质marker的不同分子量蛋白质的迁移距离为横坐标，以其分子量的对数位纵坐标作图，绘出一条蛋白质的分子量和其迁移距离之间关系的标准曲线。根据rhHSF的迁移距离，从标准曲线中查出对应分子量值，见图9。

2)由中国医学科学院基础医学研究所中心实验室用ABI公司的飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行测定，见图10。

2.氨基酸序列分析

由中国医学科学院基础医学研究所中心实验室用ABI公司Applied Biosystems Procise进行测定。结果显示N-末端10个氨基酸为TELRCQCLQT。

3.氨基酸组成分析

由中国医学科学院基础医学研究所中心实验室用Waters公司2690泵、996二极管阵列检测器、水解氨基酸分析柱AccQ.TagrM进行测定，见图11。

4.吸收光谱测定

用中国医学科学院基础医学研究所中心实验室C18RP-HPLC分离rhHSF，以WatersHPLC-UVmodel 996

二极管阵列检测器在波长210nm-300nm范围内检测rhHSF的吸收光谱曲线，见图12。

五.rhHSF对恒河猴外周血造血干/祖细胞的快速动员作用

这项实验由中国军事医学科学院放射医学研究所罗庆良主任实验室帮助完成，在恒河猴体内观察了rhHSF单独或与rhG-CSF联合应用对外周血CFU-GM数目、外周血CD34+细胞数目及外周血象的影响。

1.实验动物分组

八只恒河猴体重4.2±0.33(3.6-4.5)kg，经10天喂养后检查动物体质健壮、无外伤畸形及体表感染灶、体温及血象正常，动物质量合格证号：BDW95002。动物在缓冲隔离房内进行体外风淋清洁、肠道灭菌处理后置层流动物房独居笼养。层流房的室内温度为22±2℃，相对湿度为70％，日光灯控制昼夜节律。每闩给予标准块料、苹果、干玉米粒、花生米等，凉水置笼侧自由饮用，动物饲养设施合格证号：B98020。

实验分为rhHSF和rhG-CSF+rhHSF两组(因动物数量有限，未设不给药对照组)。

2.给药方法

rhG-CSF+rhHSF组动物先皮下注射10μg/kg rhG-CSF，每天一次，连续给药4天，第5天两组动物同时单次皮下注射500μg/kgrhHSF(原液0.3mg/ml)。

3.观察指标

1)外周血象(WBC，RBC，HGB，HCT，PLT，SCC，LCC)

用F-820血细胞计数仪检测

2)琼脂半固体外周血CFU-GM培养

3)用流式细胞仪检测外周血CD34+细胞数。

4)体温及一般状况

各组动物检测指标的检测时间见表2。

表2 rhHSF和rh-CSF+rhHSF给药后检测指标及检查时间

给药后时间(min)    外周血象    PB-CD34+细胞数    PB-CFU-GM    体温

0                  √          √                √           √

5                  √          √                √

10                 √          √                √           √

20                 √                                         √

30                 √          √                √           √

45                 √          √                √

60                 √          √                √           √

80                 √

90                 √          √                √

120                √          √                √           √

180                √          √                √

300                √                                         √

420                √

540                √                                         √

720                √                                         √

4.PBMC的分离

将3ml肝素抗凝外周血以等倍体积的RPMI-1640细胞培养液稀释后缓慢加入5ml淋巴细胞分离液中，2000rpm离心20min，吸取中间细胞层，以F-820自动血液分析仪进行细胞计数。

5.外周血CFU-GM的培养

CFU-GM培养体系见表2。每个样品用3个培养皿，置37℃ 5％CO₂孵箱中培养14天后计数集落数，以含50个以上细胞的细胞团为一个集落。

6.检测外周血CD34+细胞

将小鼠抗人CD34单克隆抗体及对照抗体与外周血孵育30min后以红细胞裂解液裂解红细胞15min，1500rpm离心5min，吸去上清，将细胞沉淀以PBS洗涤两次，1500rpm离心5min后以1mlPBS悬浮细胞，以FACSCalibur流式细胞仪检测外周血CD34+细胞。

恒河猴体内实验证明纯化的rhHSF能快速动员CD34+造血干/祖细胞、CFU-GM及中性粒细胞至外周血。

恒河猴试验结果表明，单次皮下注射rhHSF 250-1000μg/Kg能使恒河猴外周血CFU-GM增加3.8到11.2倍，持续2-4hr，与单独注射G-CSF 10μg/Kg/d×4d外周血CFU-GM升高幅度相当。单次注射hHSF 250μg/Kg后45min外周血CFU-GM增加加58倍。恒河猴给予G-CSF 10μg/Kg/d×4d后外周血CFU-GM增加11.2-17倍，第5天再给予单剂量hHSF 250μg/Kg后CFU-Meg升高到给药前26倍，较单用G-CSF时CFU-GM升高2倍，CFU-Meg升高200倍，说明hHSF与G-CSF对造血干组细胞动员有明显协同作用。人HSF可单独或与G-CSF联合用于动员造血细胞。与G-CSF联合应用可以缩短G-CSF的给药日期，减少G-CSF的日用量，减少采集干细胞的次数，从而减轻临床上应用G-CSF的副作用，减少开发症，并加速外周血造血干细胞移植后造血系统的恢复。申请人使用PCR方法人工合成编码人HSF基因，并以非融合蛋白形式在E.coli中获高达30％的表达，优化了复性条件和分离纯化工艺，最终获纯度达95％以上重组人HSF纯品，该产品N-末端不含甲硫氨酸。在恒河猴体内试验证明本发明产品能快速动员造血干细胞及中性粒细胞到外周血，并与G-CSF有明显协同作用。

虽然根据以上特定的实施方案描述了本发明，但应该认识到可以由本领域技术人员对本发明进行多种修改和改变，而这些修改或改变也包含在所附的权利要求所定义的本发明的范围内。

                               序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>一种生产人造血增效因子的制备方法及所用的核苷酸序列

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>292

<212>DNA

<213>人

<400>1

tgacttgacg caacagtcac agacgtctgg gacgtcccat aggtggactt ttacatccag    60

tccgttaaag ttaaatcccc gggtccgcac tgcgctcaga ccgaagttat cgtgtaggtc    120

aggcaatttc aatttagggg cccaggcgtg acgcgagtct ggcttcaata gcctaccctg    180

aaaaacggtc agaaagcttg tctgaacccg gcttccccga tggttaaaaa aagatgggac    240

tttttgccag tctttcgaac agacttgggc cgaaggggct accaattttt tt            292

Claims (7)

1.如SEQ ID NO.：1所示的多核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述的多核苷酸序列的载体。

3.含有权利要求2所述的载体的阳性表达质粒。

4.由权利要求3所述的阳性表达质粒表达的造血增效因子。

5.根据权利要求4所述的造血增效因子，其特征在于所述的因子以包含体的形式表达。

6.一种生产人造血增效因子的方法，其包括以下步骤：

1)将含有编码造血增效因子的多核苷酸序列亚克隆到表达载体上，筛选含有阳性表达质粒的克隆；

2)将所述的阳性表达质粒转入大肠杆菌中，诱导表达以包含体形式表达的造血增效因子；

3)将所述的包含体变性裂解，分离并回收目的蛋白；

4)目的蛋白复性后，进行分离纯化目的蛋白；

其特征在于所述的编码造血增效因子的多核苷酸序列为SEQ IDNO.：1所示的多核苷酸序列。

7.根据权利要求4所述的造血增效因子用于制备动员造血干细胞进入外周血的药物中的用途。

Images