CN1593657A - 冻干水痘减毒活疫苗的生产方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种冻干水痘减毒活疫苗的生产方法及产品,以水痘减毒株OKa株为毒株,应用转瓶生产工艺,以人二倍体细胞2BS为培养基质生产的冻干水痘减毒活疫苗。应用旋转培养技术,不但疫苗病毒滴度稳定,而且疫苗的单瓶产量较静止培养显著提高了,降低了生产成本,能使更多的易感人群应用水痘疫苗,从而使该病的发病率降至最低点,采用转瓶生产工艺生产的水痘疫苗各项指标均符合《WHO水痘活疫苗规程》及《冻干水痘减毒活疫苗制造及检定规程》的要求。解决了静止培养工艺中产量低,生产占地大,牛血清蛋白残存量偏高及劳动强度大等弊端。
Description
技术领域:
本发明涉及一种水痘减毒活疫苗及产品,特别是公开了一种冻干水痘减毒活疫苗的生产方法,利用水痘病毒减毒株(Oka株)感染人胚肺二倍体细胞(2BS)采用旋转培养制备水痘减毒活疫苗的方法,属于疫苗生产制备工艺技术领域。
技术背景:
病毒疫苗的生产通常利用鸡胚细胞、幼鼠的脑细胞和哺乳动物的二倍体细胞作为宿主细胞。但由于病毒的低敏感性,复杂的纯化过程和由于存在外源蛋白污染引起的副作用,它们不具备优势。相反,使用起源于人的正常二倍体细胞能减少外源蛋白引起的副作用,所以,制备病毒疫苗时它们更优选。代表性的二倍体细胞包括MRC-5细胞株,WI-38细胞,HEL299细胞,和LBHEL细胞株。美国专利3,985,615中公开了通过由豚鼠初级胚胎细胞(GPEC)中多次减毒OKa病毒生产VZV疫苗;美国专利4,000.256叙述了将含有VZV病毒的人胚成纤维细胞WI-38株传代培养10-80次来生产VZV疫苗;美国专利5,360,736公开了MRC-5细胞株中生产VZV疫苗的改进方法,WO97.30147专利公开了利用LBHEL细胞培养VZV疫苗的生产方法。然而,GPEC细胞中VZV的产量是非常低的。WI-38和MRC-5细胞株有高的传代数,从而减低了它们生产VZV的能力。另外,以上专利中细胞及病毒繁殖过程中采用静止培养法,所以,上述方法限制了水痘疫苗的规模化生产。
发明内容:
本发明提供一种冻干水痘减毒活疫苗的生产方法及产品,适合于水痘疫苗的规模化生产。
本发明以水痘减毒株OKa株为毒株,以人二倍体细胞2BS为培养基质生产的冻干水痘减毒活疫苗,包括以下主要步骤:
首先取人胚肺二倍体细胞2BS按1∶2-1∶4的比例扩增传代(43代以内)。其中细胞扩增所用培养基是添加10-15%小牛血清的MEM,pH7.2-7.6。将细胞培养瓶置37℃下旋转培养3-5天(转速15-30转/小时),形成均匀、致密的细胞单层,然后弃去生长液。在培养瓶内按毒种与细胞1∶60~120比例加入毒种,对细胞进行感染,并于35-36℃旋转培养(转速15-30转/小时),培养时间为2-4天。当2BS细胞上出现75%以上典型病变时,倒去原维持液,用原维持液量二倍以上的Earle’s液冲洗细胞表面,洗去牛血清,加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中,
疫苗液中各成份质量比为:蔗糖1.5-2.5%、明胶2-5%、谷氨酸钠0.5%、尿素0.1-0.25%、精氨酸0.1%、山梨醇0.3-0.6%、人血白蛋白0.5-1%,余量为水。将收获的疫苗液经-70℃冻融,20KHz超声破碎细胞,4℃下1000rpm离心30分钟去除细胞碎片,经滤过澄清,上清液合并后即为半成品。
检定合格的半成品疫苗,置冰水浴中保冷分装,采用适宜的冻干曲线进行冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
与已有技术相比,本发明的积极效果在于:(1)在病毒宿主细胞增殖阶段,以旋转培养法代替静止培养法,如此可显著地扩大细胞培养面积,使细胞增殖率提高5倍以上,且可以比较容易地除去或减少牛血清残余量,减小疫苗制品的不良反应。(2)根据水痘VZV病毒的生物学特性,用Earle’s液冲洗细胞表面,可更加有利于病毒的吸附感染。(3)将含有稳定剂的疫苗液直接加入培养瓶内,可减小病毒的损失,提高疫苗的产率和滴度,并可改善病毒的稳定性。
通过使用本发明,水痘减毒活疫苗完成了几百万人的人体接种观察,在安全性及免疫原性方面进行了多指标详细考核,结果表明该疫苗是安全和有效的,阳转率为98.89%,GMT36.83。
2BS细胞株用于水痘减毒活疫苗的研究
1.染色体异常试验
对2BS细胞株(43代)进行染色体异常试验包括染色体多倍体试验、二倍体试验,形状异常试验,核型分析试验。
表1
异常 | 检查细胞数 |
500 | |
结构异常 | 8 |
染色单体和染色体断裂 | 2 |
超二倍体 | 4 |
亚二倍体 | 70 |
多倍体 | 3 |
上述表1结果符合2000年版《中国生物制品规程》《生物制品生产用人二倍体细胞株》染色体检查标准的要求。
2.致肿瘤性检查
将2BS细胞株和He P2-C细胞株各5×106个细胞颈后皮下注射到每组10只经抗胸腺血清处理(ATS)的乳鼠中。
结果:动物观察14天,2BS组小鼠全部健存,活泼喜食。He P2-C组毛色无光泽,颈部可见大小不等的肿瘤结节。试验组进行病理检查,无移植瘤形成。
3.VZV在细胞株中的繁殖
表2
细胞株(传代数) | 活性(PFU/ml) |
2BS(27) | 18270 |
2BS(32) | 21000 |
2BS(40) | 19000 |
MRC-5(8) | 2234 |
MRC-5(11) | 1895 |
MRC-5(12) | 2250 |
如表2所示,在本发明的2BS株中VZV的活性高于常规细胞株MRC-5的活性。
通过染色体异常试验、致肿瘤试验证明本发明的2BS细胞株是正常的二倍体细胞株并且在动物试验中它不会导致肿瘤。另外,它比常规细胞株如MRC-5生长得更快并对各种病毒具有增强的敏感性。甚至在43代传代培养后它仍保持同样的生长速度。此外,对2BS株进行了外源因子检查、细菌、真菌、支原体等项检查,结果均符合2000年版《中国生物制品规程》中《生物制品生产用动物细胞制备及检定规程》要求。该细胞同样也适用于甲肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗等病毒疫苗的生产。
按本发明方法制备的水痘疫苗(旋转培养)与采用克氏瓶(静止培养)制备疫苗的比较
1、疫苗成品滴度的比较
使用同一代次细胞、同一批毒种,分别用两种方法制备疫苗,成品滴度见表1
表4两种瓶型制备冻干水痘减毒活疫苗成品病毒滴度
克氏瓶(LgPFU/ml) 转瓶(LgPFU/ml)
编号 产品滴度 37℃7天 编号. 产品滴度 37℃7天
980336 4.0 3.6 1 4.0 3.7
980337 4.1 3.6 2 4.0 3.5
980338 4.3 3.6 3 4.0 3.6
980339 4.0 3.5 4 4.1 3.5
980340 3.9 3.3 5 3.9 3.5
平均 4.1 3.5 平均 4.0 3.6
表4中,旋转培养和静止培养两种方法制备的疫苗,冻干后病毒滴度和37℃7d病毒滴度经统计学处理,均无显著性差异。(具体结果:干后病毒滴度,t=1.348,p>0.05,差别无显著的统计学意义;37℃7d病毒滴度t=1.414,p>0.05,差别无显著的统计学意义。)
2、残余牛血清蛋白含量
克氏瓶及转瓶均使用相同量的洗涤液,其残余牛血清蛋白含量见表2。
表5不同瓶型残余牛血清蛋白含量比较
克氏瓶子(ng/ml) 转瓶(ng/ml)
编号 残余牛血清含量 编号. 残余牛血清含量
980336 48 1 36
980337 47 2 25
980338 49 3 32
980309 45 4 38
980440 46 5 29
平均 47 平均 32
表5中两种瓶型制备的疫苗中残余牛血清蛋白含量经统计学处理,结果是:t=6.124,p<0.001,差别有极显著的统计学意义。表明,应用旋转培养,可降低疫苗中的牛血清蛋白残留量。
3、疫苗的单瓶产量
设定克氏瓶单瓶产量为1(原倍),转瓶按克氏瓶的原倍至10倍量加疫苗液。结果显示,1~2倍加液量病毒滴度最好,但牛血清蛋白含量偏高。其他倍数加液量,随着疫苗液的增加,牛血清蛋白含量的降低,37℃7d热稳定性也呈递减趋势。故而,将转瓶疫苗加液量定为克氏瓶的3倍。(见图1、图2)
冻干水痘减毒活疫苗应用转瓶生产工艺,与传统的克氏瓶相比,不但疫苗病毒滴度稳定,而且疫苗的单瓶产量较静止培养显著提高了。解决了静止培养工艺中产量低,生产占地大,牛血清蛋白残存量偏高及劳动强度大等弊端。应用旋转培养技术,降低了生产成本,能使更多的易感人群应用水痘疫苗,从而使该病的发病率降至最低点,采用转瓶生产工艺生产的水痘疫苗各项指标均符合《WHO水痘活疫苗规程》及《冻干水痘减毒活疫苗制造及检定规程》的要求。
附图说明:
图1为加液量与病毒滴度的关系图。
图2为加液量与残余牛血清蛋白含量关系图。
具体实施方式:
实施例1
取人胚肺二倍体细胞2BS(32代)单层后按1∶4传代,转瓶机转速调至30转/小时,置37℃培养5天,长成致密单层后,在培养瓶内按毒种与细胞1∶60比例加入毒种,对细胞进行感染,(转速25转/小时)35℃培养3天至细胞病变达75%以上时,用原维持液量三倍的Earle’s液冲洗细胞表面,洗去牛血清,加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中疫苗液中各成份质量比为:蔗糖2.5%、明胶2%、谷氨酸钠0.5%、尿素0.1%、精氨酸0.1%、山梨醇0.3-%、人血白蛋白1%。将收获的疫苗液经-70℃冻融,20KHz超声破碎细胞,4℃下1000rpm离心30分钟去除细胞碎片,经滤过澄清,上清液合并后即为半成品。检定合格的半成品疫苗,置冰水浴中保冷分装,冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
实施例2
首先取人胚肺二倍体细胞2BS(31代)按1∶2传代。其中细胞扩增所用培养基是添加10%小牛血清的MEM,pH7.2。将细胞培养瓶置37。下旋转培养3天(转速20转/小时),形成均匀、致密的细胞单层,然后弃去生长液。在培养瓶内按毒种与细胞1∶80比例加入毒种进行感染,并于35℃旋转培养(转速20转/小时),培养4天。当2BS细胞上出现75%以上典型病变时,倒去原维持液,用原维持液量四倍的Earle’s液冲洗细胞表面,洗去牛血清,加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中疫苗液中各成份质量比为:蔗糖2.5%、明胶2%、谷氨酸钠0.5%、尿素0.1%、精氨酸0.1%、山梨醇0.3-0.6%、人血白蛋白0.5%。将收获的疫苗液经-70℃冻融,20KHz超声破碎细胞,4℃下1000rpm离心30分钟去除细胞碎片,经滤过澄清,上清液合并后即为半成品。检定合格的半成品疫苗,置冰水浴中保冷分装,冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
实施例3
首先取人胚肺二倍体细胞2BS(38代)按1∶2传代。其中细胞扩增所用培养基是添加12%小牛血清的MEM,pH7.2。将细胞培养瓶置37℃下旋转培养4天(转速25转/小时),形成均匀、致密的细胞单层,然后弃去生长液。在培养瓶内按毒种与细胞1∶90比例加入毒种进行感染,并于35℃旋转培养(转速15转/小时),培养4天。当2BS细胞上出现75%以上典型病变时,倒去原维持液,用原维持液量三倍的Earle’s液冲洗细胞表面,洗去牛血清,加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中疫苗液中各成份质量比为:蔗糖1.5%、明胶4%、谷氨酸钠0.5%、尿素0.2%、精氨酸0.1%、山梨醇0.4%、人血白蛋白0.5%。将收获的疫苗液经-70℃冻融,20KHz超声破碎细胞,4℃离心去除细胞碎片,经滤过澄清,上清液合并后即为半成品。检定合格的半成品疫苗,置冰水浴中保冷分装,冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
实施例4
首先取人胚肺二倍体细胞2BS(40代)按1∶4传代。其中细胞扩增所用培养基是添加15%小牛血清的MEM,pH7.2。将细胞培养瓶置37℃下旋转培养5天(转速15转/小时),形成均匀、致密的细胞单层,然后弃去生长液。在培养瓶内按毒种与细胞1∶100比例加入毒种进行感染,并于35℃旋转培养(转速25转/小时),培养4天。当2BS细胞上出现75%以上典型病变时,倒去原维持液,用原维持液量三倍的Earle’s液冲洗细胞表面,洗去牛血清,加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中疫苗液中各成份质量比为:蔗糖2.5%、明胶2%、谷氨酸钠0.5%、尿素0.14-%、精氨酸0.1%、山梨醇0.5%、人血白蛋白1%。将收获的疫苗液经-70℃冻融,20KHz超声破碎细胞,4℃离心去除细胞碎片,经滤过澄清,上清液合并后即为半成品。检定合格的半成品疫苗,置冰水浴中保冷分装,冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
实施例5
首先取人胚肺二倍体细胞2BS(43代)按1∶4传代。其中细胞扩增所用培养基是添加15%小牛血清的MEM,pH7.2。将细胞培养瓶置37℃下旋转培养5天(转速25转/小时),形成均匀、致密的细胞单层,然后弃去生长液。在培养瓶内按毒种与细胞1∶70比例加入毒种进行感染,并于35℃旋转培养(转速30转/小时),培养3天。当2BS细胞上出现75%以上典型病变时,倒去原维持液,用原维持液量三倍的Earle’s液冲洗细胞表面,洗去牛血清,加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中疫苗液中各成份质量比为:蔗糖2%、明胶3%、谷氨酸钠0.5%、尿素0.2%、精氨酸0.1%、山梨醇0.6%、人血白蛋白0.5%。将收获的疫苗液经-70℃冻融,20KHz超声破碎细胞,4℃离心去除细胞碎片,经滤过澄清,上清液合并后即为半成品。检定合格的半成品疫苗,置冰水浴中保冷分装,冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
表6按实施例1-5生产的冻干水痘减毒活疫苗的各项检定结果
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
病毒滴定(PFU/ml) | 31666 | 35666 | 39666 | 36000 | 35333 |
热稳定性试验(PFU/nl) | 7000 | 10000 | 6280 | 6500 | 8000 |
牛血清蛋白残余量(ng/ml) | 31 | 26 | 36 | 28 | 21 |
水分(%) | 1.7 | 2.0 | 1.8 | 2.0 | 1.6 |
外观 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 |
鉴别试验 | 确认为VZV | 确认为VZV | 确认为VZV | 确认为VZV | 确认为VZV |
无菌试验 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 |
上述结果表明,按本发明方法制备的冻干水痘减毒活疫苗病毒滴定高、热稳定性好,各项检测指标均符合2000年版《中国生物制品规程》及《冻干水痘减毒活疫苗制造及检定规程》要求。
Claims (3)
1、一种冻干水痘减毒活疫苗的生产方法,以水痘减毒株OKa株为毒株,以人二倍体细胞2BS为培养基质生产的冻干水痘减毒活疫苗,包括以下主要步骤:
取人胚肺二倍体细胞2BS按1∶2-1∶4的比例扩增传代;其中细胞扩增所用培养基是添加10-15%小牛血清的MEM,pH7.2-7.6;将细胞培养瓶置37℃下,以15-30转/小时旋转培养3-5天,形成均匀、致密的细胞单层,然后弃去生长液;在培养瓶内按毒种与细胞1∶60~120比例加入毒种,对细胞进行感染,并于35-36℃转速15-30转/小时旋转培养,培养时间为2-4天;当2BS细胞上出现75%以上典型病变时,倒去原维持液,用原维持液量二倍以上的Earle’s液冲洗细胞表面,洗去牛血清,加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获;
将收获的疫苗液经-70℃冻融,20KHZ超声破碎细胞,低温下离心去除细胞碎片,经滤过澄清,上清液合并后即为半成品疫苗;
检定合格的半成品疫苗,置冰水浴中保冷分装,采用适宜的冻干曲线进行冻干,制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗。
2、根据权利要求1所述方法制备的产品。
3、一种疫苗稳定剂,其特征在于它主要是由下述各成份质量比的原料制成的:
蔗糖1.5-2.5%、明胶2-5%、谷氨酸钠0.5%、尿素0.1-0.25%、精氨酸0.1%、山梨醇0.3-0.6%、人血白蛋白0.5-1%。
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