CN1546673A - 含有阿特拉津氯水解酶基因的Ti载体的构建及转基因水稻的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有阿特拉津氯水解酶基因的Ti载体的构建、抗除草剂阿特拉津的转基因水稻的制备及在杂交制种中的应用，载体的构建是通过将阿特拉津氯水解酶基因插入质粒pCAMBIA1301实现的，得到可用于转化水稻的Ti载体p1301－atzA，将该Ti载体转化到农杆菌EHA105中，然后用农杆菌转化水稻，得到抗除草剂阿特拉津的水稻品系，用本发明制备的转基因水稻技术可用于杂交水稻的高纯度制种、机械化制种和杂草的防除，由于阿特拉津是国内外大量生产和使用的除草剂，而且价格便宜，所以使抗阿特拉津的转基因水稻更容易在农业生产中推广应用。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程，具体地说属于一种载体的构建及其转基因植物的制备。
背景技术
水稻是最重要的禾谷类作物之一，世界上大约40％的人口以水稻作为主食来源。随着人口的增加和人们对食物营养要求的提高，不断增加水稻的产量和提高水稻的品质，成为我们所面临的重要挑战。在解决这一问题的过程中，现代生物技术特别是转基因技术起着非常重要的作用。通过转基因技术获得抗除草剂的转基因水稻，是近年来发展迅速的植物生物技术[Giri C C，Laxmi G V.Production of transgenic rice with agronomically useful genes：anassessment.Biotechnology Advances，2000，18：653-683；段发平，梁承邺，黎垣庆：Bar基因和转Bar基因作物的研究进展。广西植物，200l，21(2)：166-172]。
抗除草剂转基因水稻的主要用途是：①将除草剂抗性基因用做植物遗传转化的标记基因，克服抗生素筛选的局限性(Rathore K S，Chowdhury V K，Hodges T K.Use of bar as aselectable marker gene and for the production of herbicide-resistant rice plants from protoplasts.Plant Mol Biol，1993，21：871-884)；②使生产品种带上除草剂抗性以后，可以施用除草剂防除稻田杂草[于志华，陈敏勇，顾红雅，等：抗除草剂旱稻转基因植株的获得。北京大学学报(自然科学)，1996，32(4)：499-504]。③在杂交制种中将抗除草剂基因导入恢复系，使杂交种产生除草剂抗性，在水稻秧田中喷洒除草剂杀死假杂种，能保证杂交水稻的纯度达到100％[Yan Wengui：Crop heterosis and herbicide.U.S.(M).Patent and Trademarker Office(PTO)，1997]。④在杂交制种中由于不育系与恢复系隔行相邻种植，所以只能用人工收割杂交稻，如果将抗除草剂基因导入保持系并进一步转育成不育系，在制种田里完成受粉后喷洒除草剂杀死恢复系，能够实现杂交水稻的机械化制种[傅亚萍，朱正歌，肖晗，等：抗除草剂基因导入培矮64S实现杂交水稻制种机械化的初步研究。中国水稻科学，2001，15(2)：97-100]。
目前，植物转基因技术已相当成熟，转化方法主要有农杆菌Ti载体介导法、基因枪法和电穿孔法。限制抗除草剂转基因水稻广泛应用的因素之一是可用的优良基因太少。虽然用抗Basta的bar基因已经得到一些转基因水稻品系，但由于Basta由德国Aventis公司所垄断，不在中国市场上销售，限制了bar基因的广泛应用[段发平，梁承邺，黎垣庆：Bar基因和转Bar基因作物的研究进展。广西植物，2001，21(2)：166-172]。来自于龙葵植物的抗除草剂阿特拉津的psbA基因虽然已经被转移到大豆中，但由于它必须在叶绿体中才能表达，使该基因的实际应用受到很大限制[岳绍先，傅俊骅，李连城，等：抗atrazine转基因大豆的抗性遗传及其某些生理、农艺性状。植物生理学报，1996，22(4)：385-391]。因此，获得具有自主知识产权的新的抗除草剂基因，以及构建新的含有抗除草剂基因的Ti载体，已经成为抗除草剂转基因水稻研究急需解决的关键技术。来自细菌的阿特拉津氯水解酶基因atzA所编码的酶，能够催化除草剂阿特拉津的水解脱氯反应，将有毒的阿特拉津转化成无毒的羟基阿特拉津，所以，该基因在转基因植物研究中有很大的应用潜力[de Souza M L，Sadowsky M J，Wackett L P.Atrazine chlorohydrolase from Pseudomonas sp.strain ADP：gene sequence，enzymepurification and protein characterization.J Bacteriol，1996，178：4894～4900]。蔡宝立等从节杆菌(Arthrobacter sp.)AD1菌株中分离到新的阿特拉津氯水解酶基因，为利用该基因转化水稻的研究和开发奠定了基础[Cai，B.，Han，Y.，Liu，B.，Ren，Y.，and Jiang，S.Isolation andcharacterization of an atrazine-degrading bacterium from industrial wastewater in China.Letters ofApplied Microbiology.2003，36：272-276]。
目前，尚没有用阿特拉津氯水解酶基因转化水稻并得到抗除草剂阿特拉津的转基因水稻的文献和专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有阿特拉津氯水解酶基因的Ti载体；
本发明的第二个目的是制备抗除草剂阿特拉津的转基因水稻；
本发明的第三目的是将抗除草剂阿特拉津的转基因水稻应用于杂交水稻的高纯度制种、机械化制种和杂草防除。
本发明的技术方案概述如下：
1.一种含有阿特拉津氯水解酶基因的Ti载体的构建，包括如下步骤：
①用EcoR I和Hind III消化含有阿特拉津氯水解酶基因的质粒pGEM-T-atzA，分离出阿特拉津氯水解酶基因；
②用EcoR I和HindIII消化质粒pBluscript SK(+/-)，分离载体片段，与所述阿特拉津氯水解酶基因连接，形成中间载体pBSSK(+/-)-atzA；
③用SalI和Sac I消化中间载体pBSSK(+/-)-atzA，分离含阿特拉津氯水解酶基因的小片段，用Sal I和Sac I消化质粒pCAMBIA1301，分离中间载体片段，与阿特拉津氯水解酶基因小片段连接，形成Ti载体p1301-atzA，构建结果见图1；
④将该Ti载体p1301-atzA先转化到大肠杆菌DH5α中，提取质粒，再转化到农杆菌EHA105中。
2.抗除草剂阿特拉津的转基因水稻的制备，包括如下步骤：
①根癌农杆菌介导的水稻转化：去壳成熟水稻种子进行表面灭菌，置于成熟胚愈伤诱导培养基上，20～30℃避光培养10～20天，剥下成熟胚盾片处长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基上继代培养3～5天；
将含有阿特拉津氯水解酶基因的EHA105菌株在含有50mg/mL卡那霉素的平板上划线，25～30℃黑暗培养2～5天，将其悬浮于液体培养基中，加入乙酰丁香酮，使其终浓度为100μmol/L，此为转化水稻用的农杆菌悬浮液；
挑选状态较好的继代一定时间的水稻愈伤组织放入无菌容器中，加入50～100mL农杆菌悬浮液，室温放置10～30分钟，取出愈伤组织，转移到铺有几层无菌滤纸的固体共培养培养基上，20～30℃黑暗培养2-3天；
将共培养的愈伤组织放在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上，20～30℃暗培养10～15天，转到新的筛选培养基上继续培养10～15天；
挑选生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，20～30℃黑暗培养3～5天，然后放在20～30℃，每天光照10～20小时的条件下培养；
当抗性愈伤组织分化出苗以后，将小苗转移到生根壮苗培养基上，培养两周左右，将生长旺盛的小苗移到温室培养；
②转基因水稻的抗性筛选
使用浓度为0.05％～0.25％的阿特拉津溶液均匀喷洒转基因植株一遍，2～5天后，生长完全正常未产生药害的为抗阿特拉津的T0代转基因植株(必要时应该进行分子检测加以验证)，对T0代抗性株产生的自交种子，继续进行T1代抗性筛选，接着进行T2代抗性筛选，便可得到基因纯合的能稳定遗传的转基因抗性株系。
3.转阿特拉津氯水解酶基因的水稻在杂交制种中的应用，包括如下步骤：
将阿特拉津氯水解酶基因转移到水稻的恢复系中，再以该恢复系进行杂交水稻制种，在杂交水稻秧田中喷洒除草剂阿特拉津可以杀死假杂种，确保杂交水稻的纯度；或将阿特拉津氯水解酶基因转移到水稻的保持系，并转育成不育系，可用于水稻的机械化制种，在恢复系完成受粉以后喷洒除草剂阿特拉津，杀死恢复系，待不育系的种子成熟后，可进行机械化收割；在转基因水稻的大田中喷洒除草剂阿特拉津可以杀死杂草。
阿特拉津氯水解酶基因可以转到恢复系中，也可以转到保持系与不育系中，但是不应该将该基因同时转到某杂交水稻组合的恢复系、保持系和不育系中，否则将不能达到本发明的效果。另外，在进行上述转基因水稻的应用时，应遵守国家关于转基因植物的相关法律和法规。
本发明的效果：
①应用含有阿特拉津氯水解酶基因的Ti载体已经成功地转化了多种水稻品种，都得到了抗除草剂阿特拉津的转基因水稻，说明该Ti载体具有很好的实用性。
②转基因水稻的阿特拉津抗性非常稳定，用于高纯度制种、机械化制种和稻田中杂草的防除都取得满意效果。
③因为阿特拉津是国内外大量生产和使用的除草剂，而且价格便宜，所以使抗阿特拉津的转基因水稻更容易在农业生产中推广应用。
附图说明
图1为本发明的含有阿特拉津氯水解酶基因的Ti载体
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1 一种含有阿特拉津氯水解酶基因的Ti载体的构建，包括如下步骤：
①用EcoR I和HindIII消化含有阿特拉津氯水解酶基因的质粒pGEM-T-atzA，分离出阿特拉津氯水解酶基因；
②用EcoR I和HindIII消化质粒pBluscript SK(+/-)，分离载体片段，与所述阿特拉津氯水解酶基因连接，形成中间载体pBSSK(+/-)-atzA；
③用Sal I和Sac I消化中间载体pBSSK(+/-)-atzA，分离含阿特拉津氯水解酶基因的小片段，用Sal I和Sac I消化质粒pCAMBIA1301，分离中间载体片段，与阿特拉津氯水解酶基因小片段连接，形成Ti载体p1301-atzA，构建结果见图1；
④将Ti载体p1301-atzA先转化到大肠杆菌DH5α中，提取质粒，再转化到农杆菌EHA105中。
实施例2 抗除草剂阿特拉津的转基因水稻的制备，包括如下步骤：
①根癌农杆菌介导的水稻转化：去壳成熟水稻种子进行表面灭菌，置于成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃避光培养15天，剥下成熟胚盾片处长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基上继代培养4天；
将含有阿特拉津氯水解酶基因的EHA105菌株在含有50mg/mL卡那霉素的平板上划线，28℃黑暗培养3天，将其悬浮于液体培养基中，加入乙酰丁香酮，使其终浓度为100μmol/L，此为转化水稻用的农杆菌悬浮液；
挑选状态较好的继代一定时间的水稻愈伤组织放入无菌容器中，加入70mL农杆菌悬浮液，室温放置20分钟，取出愈伤组织，转移到铺有几层无菌滤纸的固体共培养培养基上，28℃黑暗培养3天；
将共培养的愈伤组织放在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养13天，转到新的筛选培养基上继续培养13天；
挑选生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，26℃黑暗培养4天，然后放在26℃，每天光照16小时的条件下培养；
当抗性愈伤组织分化出苗以后，将小苗转移到生根壮苗培养基上，培养两周左右，将生长旺盛的小苗移到温室培养；
②转基因水稻的抗性筛选
使用浓度为0.05％～0.25％的阿特拉津溶液均匀喷洒转基因植株一遍，2天后，生长完全正常未产生药害的为抗阿特拉津的T0代转基因植株，对T0代抗性株产生的自交种子，继续进行T1代抗性筛选，接着进行T2代抗性筛选，便可得到基因纯合的能稳定遗传的转基因抗性株系。
实施例3 抗除草剂阿特拉津的转基因水稻的制备，包括如下步骤：
①根癌农杆菌介导的水稻转化：去壳成熟水稻种子进行表面灭菌，置于成熟胚愈伤诱导培养基上，20℃避光培养20天，剥下成熟胚盾片处长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基上继代培养5天；
将含有阿特拉津氯水解酶基因的EHA105菌株在含有50mg/mL卡那霉素的平板上划线，25℃黑暗培养5天，将其悬浮于液体培养基中，加入乙酰丁香酮，使其终浓度为100μmol/L，此为转化水稻用的农杆菌悬浮液；
挑选状态较好的继代一定时间的水稻愈伤组织放入无菌容器中，加入100mL农杆菌悬浮液，室温放置10分钟，取出愈伤组织，转移到铺有几层无菌滤纸的固体共培养培养基上，20℃黑暗培养3天；
将共培养的愈伤组织放在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上，20℃暗培养15天，转到新的筛选培养基上继续培养15天；
挑选生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，20℃黑暗培养3天，然后放在20℃，每天光照20小时的条件下培养；
当抗性愈伤组织分化出苗以后，将小苗转移到生根壮苗培养基上，培养两周左右，将生长旺盛的小苗移到温室培养；
②转基因水稻的抗性筛选
使用浓度为0.05％～0.25％的阿特拉津溶液均匀喷洒转基因植株一遍，3天后，生长完全正常未产生药害的为抗阿特拉津的T0代转基因植株，对T0代抗性株产生的自交种子，继续进行T1代抗性筛选，接着进行T2代抗性筛选，便可得到基因纯合的能稳定遗传的转基因抗性株系。
实施例4 抗除草剂阿特拉津的转基因水稻的制备，包括如下步骤：
①根癌农杆菌介导的水稻转化：去壳成熟水稻种子进行表面灭菌，置于成熟胚愈伤诱导培养基上，30℃避光培养10天，剥下成熟胚盾片处长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基上继代培养3天；
将含有阿特拉津氯水解酶基因的EHA105菌株在含有50mg/mL卡那霉素的平板上划线，30℃黑暗培养2天，将其悬浮于液体培养基中，加入乙酰丁香酮，使其终浓度为100μmol/L，此为转化水稻用的农杆菌悬浮液；
挑选状态较好的继代一定时间的水稻愈伤组织放入无菌容器中，加入50mL农杆菌悬浮液，室温放置30分钟，取出愈伤组织，转移到铺有几层无菌滤纸的固体共培养培养基上，30℃黑暗培养2天；
将共培养的愈伤组织放在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上，30℃暗培养10天，转到新的筛选培养基上继续培养10天；
挑选生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，30℃黑暗培养5天，然后放在30℃，每天光照10小时的条件下培养；
当抗性愈伤组织分化出苗以后，将小苗转移到生根壮苗培养基上，培养两周左右，将生长旺盛的小苗移到温室培养；
②转基因水稻的抗性筛选
使用浓度为0.05％～0.25％的阿特拉津溶液均匀喷洒转基因植株一遍，5天后，生长完全正常未产生药害的为抗阿特拉津的T0代转基因植株，对T0代抗性株产生的自交种子，继续进行T1代抗性筛选，接着进行T2代抗性筛选，便可得到基因纯合的能稳定遗传的转基因抗性株系。
实施例5 转阿特拉津氯水解酶基因的水稻在杂交制种中的应用，包括如下步骤：
将阿特拉津氯水解酶基因转移到水稻的恢复系中，再以该恢复系进行杂交水稻制种，在杂交水稻秧田中喷洒除草剂阿特拉津可以杀死假杂种，确保杂交水稻的纯度；或将阿特拉津氯水解酶基因转移到水稻的保持系，并转育成不育系，可用于水稻的机械化制种，在恢复系完成受粉以后喷洒除草剂阿特拉津，杀死恢复系，待不育系的种子成熟后，可进行机械化收割；在转基因水稻的大田中喷洒除草剂阿特拉津可以杀死杂草。
(本发明受到天津市农业生物技术研究中心的资助。)
Claims (3)
1.一种含有阿特拉津氯水解酶基因的Ti载体的构建，其特征包括如下步骤：
①用EcoR I和HindIII消化含有阿特拉津氯水解酶基因的质粒pGEM-T-atzA，分离出阿特拉津氯水解酶基因；
②用EcoRI和HindIII消化质粒pBluscript SK(/-)，分离载体片段，与所述阿特拉津氯水解酶基因连接，形成中间载体pBSSK(/-)-atzA；
③用Sal I和Sac I消化中间载体pBSSK(+/-)-atzA，分离含阿特拉津氯水解酶基因的小片段，用Sal I和Sac I消化质粒pCAMBIA1301，分离中间载体片段，与阿特拉津氯水解酶基因小片段连接，形成Ti载体p1301-atzA，构建结果见图1；
④将该Ti载体p1301-atzA先转化到大肠杆菌DH5α中，提取质粒，再转化到农杆菌EHA105中。
2.抗除草剂阿特拉津的转基因水稻的制备，其特征包括如下步骤：
①根癌农杆菌介导的水稻转化：去壳成熟水稻种子进行表面灭菌，置于成熟胚愈伤诱导培养基上，20～30℃避光培养10～20天，剥下成熟胚盾片处长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基上继代培养3～5天；
将含有阿特拉津氯水解酶基因的EHA105菌株在含有50mg/mL卡那霉素的平板上划线，25～30℃黑暗培养2～5天，将其悬浮于液体培养基中，加入乙酰丁香酮，使其终浓度为100μmol/L，此为转化水稻用的农杆菌悬浮液；
挑选状态较好的继代一定时间的水稻愈伤组织放入无菌容器中，加入50～100mL农杆菌悬浮液，室温放置10～30分钟，取出愈伤组织，转移到铺有几层无菌滤纸的固体共培养培养基上，20～30℃黑暗培养2-3天；
将共培养的原愈伤组织放在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上，20～30℃暗培养10～15天，转到新的筛选培养基上继续培养10～15天；
挑选生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，20～30℃黑暗培养3～5天，然后放在20～30℃，每天光照10～20小时的条件下培养；
当抗性愈伤组织分化出苗以后，将小苗转移到生根壮苗培养基上，培养两周左右，将生长旺盛的小苗移到温室培养；
②转基因水稻的抗性筛选
使用浓度为0.05％～0.25％的阿特拉津溶液均匀喷洒转基因植株一遍，2～5天后，生长完全正常未产生药害的为抗阿特拉津的T0代转基因植株，对T0代抗性株产生的自交种子，继续进行T1代抗性筛选，接着进行T2代抗性筛选，便可得到基因纯合的能稳定遗传的转基因抗性株系。
3.转阿特拉津氯水解酶基因的水稻在杂交制种中的应用，其特征包括如下步骤：
将阿特拉津氯水解酶基因转移到水稻的恢复系中，在秧田中喷洒除草剂阿特拉津可以杀死假杂种，用于水稻的高纯度制种；或将阿特拉津氯水解酶基因转移到水稻的保持系，并转育成不育系，可用于水稻的机械化制种，在恢复系完成受粉以后喷洒除草剂阿特拉津，杀死恢复系，待不育系的种子成熟后，可进行机械化收割；在转基因水稻的大田中喷洒除草剂阿特拉津可以杀死杂草。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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