CN1477965A - 用于肿瘤治疗和诊断的药物制品及制备血浆无脂质部分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于肿瘤治疗及随后护理的药物制品，其包含偶蹄类动物、优选未受到白血病致死性危及的牛的血浆或预先确定的血浆成分。预先确定的成分是物质“bovin 40”和/或“bovin 300”，它们构成了从患白血病的牛中提取的无脂质部分与从健康牛中提取的无脂质部分间的电泳可检测差异。在所需部分的分离方法中，可选地用抗凝血剂处理最初的血液及从中分离出血细胞，用第一有机溶剂处理血浆部分，然后在其中加入由细颗粒组成的表面活性剂物质，混合液体，然后通过离心从液体成分中分离出结合在颗粒上的无脂质部分，再次将分离的部分制成溶液。

Description

用于肿瘤治疗和诊断的药物制品 及制备血浆无脂质部分的方法

本发明涉及药物制品，其主要用于肿瘤治疗和诊断，也涉及分离血浆无脂质部分的方法。

已公布的国际专利申请WO 00/40256涉及从急性白血病(leucosis)患者获得的血浆的肿瘤抑制作用。在这个申请中，描述了大量实验，其中与对照组比较，所用制品在特定类型肿瘤方面导致了20％改善。这种改善与被认为具有显著性的改善的下限接近。

从急性白血病血液制得的药物制品的适用性首先受到可以用作供体的个体的数量少的限制，还受到现有与人类血液应用有关的严格伦理和法律考虑的限制。肿瘤治疗的突出重要性及全球在该领域的研究广度使得对看似有治疗前景或诊断前景的每一个新方法均进行全面分析是正确的。

上述专利申请提出了一种可能性，即急性白血病患者的血液中含有一种尚未确切阐明的具有通用的抗肿瘤作用的成分。

本发明目的是提供可以用于肿瘤治疗和诊断的新药物制品，包括有效分离具有抗肿瘤作用的血浆成分，再一目的是找到该血液的适宜供体群。

为达到目的，第一步，设计更有效的脱脂方法，其中有效成分被推测在血浆的无脂质部分中。公知可以通过优选方法进行血浆无脂质成分的分离，即，血浆部分先用第一有机溶剂处理，接着加入由非常细颗粒组成的表面活性剂，随后剧烈混合，通过离心从液体成分中分离出结合到颗粒上的无脂质部分，接着再次将分离的部分制成溶液。

如果采用第二有机溶剂和随后的重复离心来重复溶解和分离步骤，则可更有效地脱脂。

表面活性剂的量大约是血浆质量的0.5％，且颗粒大小在约200mm至400nm间。优选材料是，例如高岭土，活性碳或甲基纤维素。

离心可以优选以15000g的加速度进行。如果应用有机溶剂后将溶液在升高的温度下存放较长时间并间歇混合，则有利于溶解。

从无脂质成分中分离出表面活性剂颗粒不是绝对必要的，而且第二次分离后，颗粒可以与结合在其上的无脂质血浆成分一起被配制在例如生理溶液中。

根据另一纯化方法，将无脂质血浆成分与小量去污剂制成溶液，然后通过再次离心可以分离固体成分。

因为已证明从患急性白血病的供体获得并以这种方法分离的无脂质产品比上述专利申请描述的产品明显地更有效，所以本目的考虑的主要方面是：是否仅能在急性白血病血液中发现这样的抗肿瘤成分，或它也存在于肿瘤治愈患者的血液中。

已公认在肿瘤治愈患者血液中存在这样的成分，而且其存在于血浆无脂质部分中。通过应用上述脱脂方法，实验证实，使用从肿瘤治愈供体获得的制品时，患有S180肉瘤的小鼠的存活时间显著延长，而且效果似乎与肿瘤类型无关，而且从来自不同肿瘤的治愈供体的血浆混合物得到的无脂质部分也有类似有效的肿瘤抑制作用。

尽管肿瘤治愈供体的数量实质上比急性白血病患者的数量要高，而且对可从他们获得的血液量的限制较小，但由于上述的道德和法律限制，不可能期望广泛的医疗应用。

解决这个基本问题的进一步方法导致另一创造性发现。此发现是在对动物的肿瘤自发痊愈的研究中获得的。在偶蹄类动物中，逆转录病毒引起的肿瘤疾病相当特殊。在某些种中，这种疾病以肿瘤形式出现，而且感染的动物死亡，而在其它种中，主要在食用牛(牛属)中，这种疾病不表现为肿瘤或动物一般健康情况的任何降低。可以通过血液中抗体GP51的存在检测感染。

近来兽药学的通常观点是牛畜中必须清除患白血病的个体。在1992年出版的The Journal of Hungarian Veterinarians第4期题目为“本国中牛的白血病感染状况和使此家畜免于感染的可能性”的文章中公开的主张支持了这种观点，这个主张由匈牙利科学院兽医委员会(the VeterinaryCommittee of the Hungarian Academy of Sciences)提出。白血病感染的范围被发现接近50％。在1997年同样期刊的第9期上包括了Telkes，Lajos博士“使匈牙利的牛免受白血病困扰”的文章，它强调了使牛畜避免白血病的重要性。发现农场越大感染范围越大，在第二篇论文发表时，感染范围约是17％。

本发现的本质在于认识到，成功地无症状地战胜白血病的动物的血液，更具体地它们血液的血浆无脂质部分应该包含有用人供体血液进行实验时已证明有效的那些成分。在这个发现以后进行了大量的实验，它们已从几个方面证实了这个假说，并且为肿瘤抑制效果的存在提供了支持，所述肿瘤抑制效果是有效的而且自抗肿瘤开始以来是惊人的。

如下发现也证实了所述效果的存在，即从未患白血病的动物获得的类似血液成分不具有这样的效果。

对获自人和动物供体的无脂质血浆的电泳检测证实了在两个分子量范围内有类似组分存在，而这些组分没有出现在从健康供体获得的血浆中。第一个组分其后称作“bovin 40”，其分子量约是40000，第二个组分其后称作“bovin 300”，分子量落在300000和350000之间，它们应该是导致肿瘤抑制作用的原因。

基于本发明技术方案，对从牛畜中清除患白血病的个体的必要性进行整体修正看来是明智的。

本发明鉴定的bovin 40及bovin 300组分拥有优良的肿瘤抑制作用，同时检测它们的存在将有助于建立肿瘤诊断法。

现在参考附图及实验，结合具体实施例描述本发明。附图中：

图1是用0.15ml Bbo-f物质治疗的存活图；

图2是用Bbo-f物质治疗10次的存活图；

图3是用Bbo-b物质治疗6次的存活图；

图4是用Bbo-b物质治疗8次的存活图；

图5是用Bbo-b物质治疗10次的存活图；

图6是用0.1ml Bbo-b物质治疗的存活图；

图7是用0.15ml Bbo-b物质治疗的存活图；

图8显示第19天之前动物的体重；

图9是概括酶学检验结果的一系列柱形图；

图10显示结肠直肠肿瘤C₂₆植入后治疗的存活数据；

图11显示图10治疗时的相对肿瘤质量；

图12显示图10治疗情况下5’核苷酸酶的值；

图13显示治疗MXT乳腺癌时的存活图；

图14显示了图13治疗时的相对肿瘤质量；

图15是其它治疗类型情况下的图14版本；

图16所示是治疗L₁₂₁₀淋巴样白血病时的存活图；

图17所示是图16治疗时获得的绝对肿瘤质量值；和

图18显示图16治疗情况下5’核苷酸酶的值。

可以按实验进行的不同阶段的顺序了解本发明技术方案的不同细节。不以重要性排列顺序，首先需要说明实验所用材料的制备方法。

               分离和获得无脂质血浆成分

通过多步离心方法从用作起始材料的血液中获得无脂质血浆成分。优选的分离步骤如下：

采集起始血液后立即用抗凝血剂，优选肝素进行处理。

离心分离血细胞，优选4℃及5000g加速度(g：意思是正常重力加速度)的离心条件。如果血液采集后不立即进行离心，用凝血剂处理的血液可以在冷却温度下保藏，优选离心温度下保藏至多48小时。离心持继至少约10分钟。取上部液体作进一步处理。可将这样获得的血浆冷却至-20℃，而且可以将其与按类似方法从不同供体获得的血浆混合。当需要时，可以用更大量的血浆进行进一步处理。在本说明书描述的实施例中，从任何特定供体获得的血浆均没有与从不同供体获得的血浆混合，而且由此存在的任何区别都被单独报告。

作为除去脂质成分的第一步，用相同质量的第一有机溶剂，例如用纯度96％的乙醇稀释血浆，混合所获溶液。

在第二步中，在溶液中加入0.5％质量的表面活性物质(剂)。这个表面活性物质的任务是在其表面结合血浆无脂质成分。表面活性物质可是高岭土、活性碳或甲基纤维素，而且它的平均颗粒大小优选位于200nm和400nm间。在所述实施例中表面活性物质是高岭土。

通过室温下物理干预(混合)6小时，使这种血浆混合物持久保持悬浮状态，然后5℃下温育10-12小时。温育期间，每半小时分别短时地混合液体一次。

温育后，通过混合重新悬浮混合物，在4-5℃的同样温度下，15000g加速度离心悬浮液10分钟。

从离心液中分离出结合在表面活性剂颗粒上更为固体形式的成分以作进一步处理，除去液相。在分离相中加入与第一种有机溶剂等质量的第二种有机溶剂，典型的是乙醇与甲苯的50％质量-50％质量混合物。由此获得的混合物的处理过程与加入第一种溶剂后的处理过程相同。在这个过程中，室温下通过物理干预(混合)6小时，使这种血浆混合物持久保持悬浮状态，然后5℃温度下温育5-12小时。温育期间，每半小时分别短时地混合混合物一次。

温育后，通过混合重新悬浮混合物，在5℃的相同温度下，15000g加速度离心悬浮液10分钟。

从离心液中分离出结合在表面活性剂颗粒上的更为固体形式的成分以作进一步处理，除去液相。

将固体成分铺开形成薄层，然后在干燥器中置于真空下2小时除去所有剩余的有机溶剂。

之后在分离的沉淀中加入质量与起始血浆质量相同的生理盐溶液，通过混合重悬此物质。在下面说明书部分用字母“b”标记由此获得的血浆制品，“b”指表面活性物质高岭土的首字母。

为获得另一相对更纯净的可选择血浆制品，通过在混合物“b”中加入具有溶解血浆制品能力的组织相容性(tissue-friendly)去污剂以除去表面活性物质。典型地，去污剂是0.01％质量的十二烷基硫酸钠。为获得适当的悬浮液，该物质与加入其中的去污剂一起在持续混合下室温温育6小时，然后贮藏在冰箱中8-12小时。重新悬浮温育期间形成沉淀的物质，然后冷却状态下用15000g加速度离心。除去沉淀，上部液体包含有用物质，在下面说明书部分用字母“f”标记它，以示与物质“b”的区别并指明这种物质更纯。

为了有利于用小鼠进行的实验，两类产品各以1ml剂量喂食，然后将它们标记并冷冻贮藏。

产品及它们制备的环境都是无菌的，因此所述物质是无菌的并能肠胃外应用。

                 I.植入S180肉瘤的实验

用平均体重25g的同类型雌性BDF₁小鼠进行所有这些实验。在所检测动物及阳性对照动物中，通过皮下方法移植S180肉瘤。关于动物类型，植入的肉瘤类型及植入方法这些实验条件与前面提及的国际申请中所描述的相同。每个实验组包括至少5只小鼠，而且报告的数据涉及相关组中小鼠的平均值。这些小鼠根据适当的编号组来区分，而且它们都有各自的编号。

实验1

从急性白血病患者血液中制备“b”型血浆制品，实验组每只小鼠每隔一天皮下接受此制品0.1ml，总计8次。

阳性对照组平均寿命是19.6天，实验组是23.5天。这就存在可以看作达到显著改进的20％增加。在涉及相同类型肿瘤的上述国际申请中，最佳制品能引起5％存活率增加，而这仍旧低于显著性阈值。因此适当分离无脂质血浆成分是非常必要的。

实验2

这个实验包括6个独立实验的结果，它是以假定血浆无脂质成分中包含有有效抗肿瘤物质，而且这种有效抗肿瘤物质也出现在肿瘤治愈患者的血液中为基础的。选择自从发现肿瘤后存活了至少10年、至多27年而由此可以被认为得以治愈的个体做为供体。诊断的供体肿瘤类型顺次是喉、结肠、乳腺、淋巴样白血病、睾丸、前列腺及肺肿瘤。

制备所有6个供体的“b”型血浆制品，并用其治疗各组小鼠。再一次对照组的平均存活时间是19.6天，而治疗组的平均存活时间在25.5和27.3天之间变化，因此在治疗组间仅存在轻微差异。与对照组比较，这样的存活构成了30％到40％的改进，具有极显著性。

作为另一实验，除去血细胞后，从来自所有6个供体的等量血浆混合物中制备“b”型血浆产品。与对照比较，这种产品使存活增加了38％。

因此这些实验证实了如下假说，即肿瘤治愈患者的无脂质血浆成分中含有有效抑制肿瘤的物质。而且，也证明了这种物质的存在与肿瘤的实际类型无关(至少对于检验的肿瘤类型所言)，因此混合物也同样有效。

实验3

选择经血液检查证实患有牛白血病的牛(食用牛)做为供体。从这些供体的血液中制备“b”和“f”型血浆产品。相似地，从没有显示出患有白血病的牛的血液中制备此两种类型的血浆产品。

用几种方式进行实验，其中，作为变量，第一个参数是每隔一天施用的治疗次数，第二个参数是在0.1ml到0.15ml间变化的剂量，第三个参数是产品纯度，即或是“b”型或是“f”型。因为关于治疗剂量及次数发现分别存在最佳值，所以通过实际实验前的试点实验确定这些参数的优选检验范围。

因为不受可用供体数量及伦理和道德考虑的限制，所以从患白血病的牛血液中获得的产品可以满足大规模应用的标准。

存活数据明显超过了从人血液获得的制品的有利数据。这是对这些实验结果进行详细描述的原因。

在实验期间，检查动物的平均体重及平均存活时间，而且在实验预定阶段，对来自各组的不同小鼠采取1ml血液样品，检测样品中多种肿瘤标记的存在。因为已被采集血液的小鼠在抽取这样数量的血液后不能存活，所以在下面实验中排除它们。

                 与存活时间有关的数据

与存活时间有关的结果可以被分成两个大组，即用“b”或“f”型产品进行的治疗。患白血病的牛的来源缩写称为“Bbo”，因此第一大组的治疗用物质“Bbo-b”进行，第二大组的治疗用物质“Bbo-f”进行。

从肿瘤植入起计算天数。图1-图7所示的每个曲线与组内(包括至少5只小鼠)的平均值有关。

图1和图2表示用物质Bbo-f治疗的组的存活图。除了正常饲养外，植入后阳性对照组的小鼠没有得到任何治疗，而治疗组中的小鼠每2天接受确定质量的物质Bbo-f治疗。如图1所示，这些组的每次治疗剂量是0.15ml。两个治疗组的治疗次数互不相同。第一组有8次治疗，而第二组的治疗次数是10次，此后小鼠没有得到任何进一步治疗。可以观察到，获得10次治疗的组在终止治疗后，即20天后，死亡率突然增加。在获得8次治疗的组中也可以观察到这种突然增加，但有趣的是可以观察到这种增加发生延迟，同时有较轻微的斜率。与对照组19.6天的存活时间比较，获得8次治疗的组的平均存活时间是24.8天，而获得10次治疗的组是23.2天。

图2所示每个组进行了10次治疗，每2天1次。不同之处在于剂量不同。第一组小鼠每次治疗剂量是0.15ml，而第二组小鼠用0.1ml剂量治疗。当剂量减少时，差异非常明显。存活时间增加到30天，与阳性对照比较达到了153％的改进。

用物质Bbo-b治疗的结果如二组图中所示。图3到5变化的参数是剂量。图3所示的情况是治疗进行了6次，可以观察到存活时间几乎与所用剂量无关，低剂量稍微好些。然而，与物质Bbo-f相比，存活时间明显好，因为平均存活时间是37天，与阳性对照比较，有接近189％的改进。当考虑图4时，存活时间对剂量的依赖关系较为明显。这次治疗次数是8次。在0.15ml剂量的情况下，存活时间比6次治疗时所获得的存活时间少，这可能仅仅是过量用药的结果。相比之下，看起来0.1ml剂量进行8次治疗是最佳的，因为平均存活时间明显增加了，而且到59天时，图上还没有达到50％值。到此存活增加了300％以上，这是一个明显有利的数字。

图5所示是获得10次治疗的小鼠的平均存活时间。奇怪的是0.15ml剂量的特征，因为这组的存活突然减少，但平均值比接受类似治疗的先前的组要好。鉴于小鼠的数量少，可能由于一只或两只小鼠的或多或少的有利表现导致了此差异。0.1ml剂量的情况下，33天后死亡率突然增加，这也可能是过量给药的结果。

图6和7中可变参数是治疗次数。两个图比较也证明了应用0.1ml剂量进行8次治疗为最佳条件。从图7能得出这样的结果：在高剂量情况下，改进随着治疗次数的减少而增加，这也表明该剂量过高。

                 肿瘤的治愈和动物的平均体重

治疗组动物状态的改进并不仅仅可以基于平均存活时间被认识到。在起始体重为25g的动物中，形成重6-8g这样大的肿瘤，即接近动物总体重的三分之一。用0.1ml剂量的物质Bbo-b治疗8次的动物，到治疗循环结束时，肿瘤状态发生了非常显著的好转，肉瘤张开释放出湿软的物质。这种物质包含死肿瘤细胞。动物的“隆起”消失，而且开始增加体重。

图8所示是都获得8次治疗的Bbo-b和Bbo-f组与阳性对照组在头19天的动物平均体重值。该图正好与上述的状况报告相对应，特别是用物质Bbo-b治疗时。该图的缺点在于没有单独表示出肿瘤质量。我们不能获得肿瘤重量的精确数值，因此总体重也包括肿瘤重量。在治疗组中，典型的是最初减少，后来再增加，阳性对照组体重以波动方式增加，这主要是由肿瘤增加引起的。

使用从健康未患白血病的牛得到的物质对上述实验中看来是最好的实验进行重复。其结果与阳性对照组获得的结果无显著差异，这证实了仅有获自白血病患牛血液的物质才是有效的。

                 酶学肿瘤标记检测结果

对于伴随恶性化过程出现的新陈代谢变化的检测，在临床实践中有几个广泛检测的酶学肿瘤标记，而且从这些方法中可选择出大量能用于常规检查的类型。在选择方法时我们考虑到恶性化过程伴有复杂的生化失调，并常常通过该复杂的生化失调来维持。因此，鉴于这些考虑，看起来测定核酸代谢(血清碱性(碱性的)及酸性脱氧核糖核酸酶活性，5’-核苷酸酶活性)；多胺代谢(精氨酸酶活性)；肝线粒体功能(鸟氨酸氨甲酰基转移酶活性)；糖原异生(磷酸己糖异构酶活性)；及鉴定骨相关过程(骨特异性碱性磷酸酶活性)是必要的。所列酶的活性改变与伴随及维持恶性化过程的代谢改变和所用治疗的结果是相符的。

在实验期间，肿瘤植入后第8，15，19天从小鼠采取血液样品。数据总结如表1。数据与单独检测的5只小鼠的平均值有关。

表中一些列的含义：

β-Glyc：非特异性磷酸酶，β-甘油磷酸；应将该值从其它磷酸酶值中减去以便它们能被解释为肿瘤标记；

5’-AMP：5’-核苷酸酶家族，更具体地：5’-腺苷-5-单磷酸；

Alk.F：碱性磷酸酶；

5’-TMP：5’-胸苷-5-单磷酸；

PDE：磷酸二酯酶；

SDNaz：酸性脱氧核糖核酸酶(酸性DNAse)；

∑.5’-ND：所有5’-核苷酸酶的总值；

表1血浆血清Bbo-b和Bbo-f对患S-180肉瘤的小鼠的效果

动物组     β-Glyc   5′-AMP    Alk.F.  5′-TMP   PDE     SDNaz    E.5′-ND

246-251     2,12      5,45      14,7     4,67     31,2             45,7

271-275     5,76      7,12      23,5     7,89     44,6    100,7    53,4

276-280     6,78      8,92      19,9     10,78    54,6    98,3     55,67

281-290     2,67      10,23     23,9     13,6     55,9    123,1    67,3

385-390     4,56      16,8      32,8     11,7     67,2    98,9     72,4

391-395     3,56      19,9      34,7     17,3     66,8    134      77,9

396-400     2,45      21,8      33,5     20,76    67,9    145      78,5

41-50       3,33      21,3      32,78    19,43    86,8    359,1    97,8

101-105     2         24,7      21,72    21,45    78,9    189,1    69,9

151-155     1,56      29,4      31,32    13,42    65,7    201,6    76,1

106-110     1,15      3,67      10,39    5,67     43,2    35,2     35,2

56-60       2,91      3,4       13,6     5,8      36,8    40,8     40,3

51-55      -0,03      3,4       22,31    6'2      41,3    32,9     42,1

可以观察到表中有3个不同组。最后一组涉及未植入肿瘤的小鼠对照，第8天检查这组中的小鼠51-55，第15天检查小鼠56-60，第19天检查小鼠106-110。

中间组涉及阳性对照，第8天检查小鼠151-155，第15天检查小鼠101-105，第19天检查小鼠41-50。

第一组可分成两个小组，一个小组以数字2开头，接受物质Bbo-b治疗，另一小组以数字3开头，接受物质Bbo-f治疗。在Bbo-b小组中，第8天检查小鼠281-290，第15天检查小鼠276-280，第19天检查小鼠271-275，最后在第45天，就相当晚期时的实质性存活，检查小鼠246-250。

在第二小组中，用物质Bbo-f治疗的小鼠根据检查天数分布如下：396-400：第8天；391-395：第15天；385-390：第19天。

以图9柱形图的形式总结结果，其中水平轴所示各组小鼠与上方垂直轴上的数据相联系，其中柱的高度表示数据总和。在水平轴上各组小鼠分开表示，而且在每组中从左到右的顺序是采样日期增加的顺序。

左边三个柱与对照组有关，中间三个柱与阳性对照组有关，右边7个柱的前三个柱属于Bbo-f小组，而最后四个柱属于Bbo-b小组。

在对照组中，自然数据随时间不会有变化，它们的波动在自然范围内。在阳性对照组中，所有成分都极高，而且在垂死期(最后的柱子)它们有进一步增加。

与此相反，在两个治疗小组中，开始数值已比阳性对照组的数据小，而且随时间进一步减少。与有利的存活数据相一致，与物质Bbo-f治疗相比，物质Bbo-b提供了明显好的结果。第19天后继续减少，而且到实验结束时，数据接近对照组的正常值。

实验4

以前面实验期间所得的有利结果为基础，检查无脂质血浆的哪些成分与疗效有关。因为我们已有健康人血液，急性白血病患者的血液，肿瘤治愈患者的血液，及从患白血病及没患白血病的牛中采集的血液，所以从上面列出的各种血液中制备“b”型制品，并对它们分别进行电泳检测。对于检测而言，将起始物加样到所用聚丙稀酰胺凝胶的表面，在电泳作用下，根据分子量顺序分离物质的成分。

将从已证明在肿瘤治疗方面无效的血液(即正常人血液和取自无白血病的牛的血液)中提取的部分与从在肿瘤治疗方面有效的血液类型中得到的部分进行比较。在取自患白血病的牛的血液部分中检测到了最明显的差异，而且差异在于存在分子量约40000的组分，及分子量在300000到350000间的组分。这两个组分一起占样品质量的8-12％。在取自肿瘤治愈供体的血液制品的这些部分中包括这两个组分，然而，分子量约40000的组分的存在较明显，而且这些组分的量明显较低，约2-3％。在从急性白血病血液提取的制品的这些部分中，仅痕量存在分子量40000的成分，另一组分检测不到。

为了鉴定所述的两个组分，分子量约40000的组分称为“bovin 40”，分子量在300000到350000间的另一组分称为“bovin 300”。这里所述的方法足以无误地鉴定这两个组分。目前正在进行这两个组分的结构鉴定。根据所示结果的信息，可以有充足理由说：物质bovin 40及bovin 300的存在是导致所证明疗效的原因。

               II.植入C₂₆结肠直肠肿瘤的实验

用第一代内部杂交的Balb/c雄性小鼠进行实验。小鼠的起源地是TNOInstitute，Rijkswijk，荷兰，育种地是the National Institute of Oncology(匈牙利)，Department of Experimental Pharmacology。

饲养动物的条件是：macrolon材料的笼子，温度20-22℃，相对湿度45-55％，12小时周期变化的黑暗与光照。喂养可在高压灭菌器(型号：Altromin，德国)中灭菌的标准质量的小鼠饲料，并垫以木头刨花。饲养的卫生水平符合规定的SPF(无规定病原体)条件。根据有关“动物护理和使用的指导性原则”的Helsinki声明进行动物管理和饲养。

从SRI(Birmingham，Alabama，美国)得到结肠-26结肠腺癌。移植方法：在肩胛间区域皮下植入一片20mg的维持肿瘤。

在实验期间，10只小鼠分成一组，植入后，阳性对照组动物没有获得任何治疗。治疗组中，用前述Bbo-b物质进行治疗。这种物质在实验的文件记录期间也被称为ABB-7。利用实验系列I获得的经验，在1-9天间每天在相同时间进行一次治疗，共8次。各组间的差异在于治疗途径及所用实验物质的量。

总结存活数据，如图10所示。阳性对照组100％存活的时间是19天。第一组中，以0.1ml剂量腹膜内(lp1)治疗，第二组使用相同治疗途径，但是剂量是0.15ml，对这种物质的经口施用(口服，po)也进行了实验。用合适剂量的喂食器直接将这种物质递送至动物胃中。在第一个口服(po1)组中，剂量是0.2ml物质，而在第二个口服(po2)组中，剂量是0.3ml。还皮下(SC)治疗了另外一组，其中物质通过皮下(皮肤下)方式应用，剂量是0.1ml物质。存活数据表示了每组十只小鼠的组平均值。从图中可看出，每个治疗组都有明显改进，最有效的两个治疗组是腹膜内应用0.1ml及口服应用0.2ml物质的治疗组。

在另外的组(十只小鼠为一组)中重复这个实验，而且为了测量肿瘤质量，当动物达到垂死状态(即立即要死亡)时，取出肿瘤，称量肿瘤质量。

图11表示这些实验的结果。柱上方给出了相关的置信水平的值，在任何情况下均小于0.05，即数据非常可靠。

在采用类似方式治疗的另外的组(十只小鼠一组)中，如实验系列I所述的方式，在第8天，第16天(从肿瘤植入起计算)及垂死状态下的小鼠中采集样品，测定这些样品的5’-核苷酸酶活性。这些数据如图12所示。到第16天时，活性从最初的低值增加到非常高的值，当达到垂死状态时，活性实质性地低于从阳性对照组获得的数值。

               III.植入MXT乳腺肿瘤的实验

在实验II所述的饲养条件下，用所述来源的雌性BDF₁小鼠检测用物质Bbo-b治疗MXT乳腺肿瘤的疗效。所移植的肿瘤细胞的来源地是MASON Res.Inst.美国。在肩胛间区域皮下植入一小片1mm³体积的维持肿瘤。

如实验II，形成十只小鼠一组的动物组，而且每组内以同等方式治疗每个个体。正如实验II用物质Bbo-b进行治疗，即，每天在相同时间治疗一次，总共8天。阳性对照组的平均存活时间是24天。图13表示不同治疗组的存活时间。可以看出采用了相同的方法治疗多个不同组，例如用0.15ml剂量同样地腹膜内治疗ip1和ip2组，或用0.3ml剂量口服治疗po2和po3组。在这种类型的肿瘤中，存活时间增加约40％，口服治疗时最高。

如实验II所述，对垂死状态的动物进行肿瘤质量检测，结果总结如图14和15所示。水平轴所示数字与特定组中小鼠的序号相关，它们无特别的意义。柱形图中所示的垂直部分与相关组内的偏差有关。在这里肿瘤质量的减少同样也是在口服治疗中最显著。

对实验动物进行的5’-核苷酸酶检测显示出在治疗组中有实质性的降低，到现在为止，还没有完成这些检测的全部实验数据分析，故不能以表格的形式进行总结。

               IV.植入急性L₁₂₁₀淋巴样白血病的实验

检测物质Bbo-b对急性L₁₂₁₀淋巴样白血病的疗效。将如实验II和III所述饲养的雄性小鼠BDF₁按十只小鼠一组分组，将维持有急性L₁₂₁₀淋巴样白血病的DBA/2小鼠的腹水和生理盐溶液配制成液体，0.1ml这样的液体中含有10⁶个细胞。以腹膜内方式注射每只实验小鼠0.1ml这样的液体，在治疗组中，每天进行一次治疗，共进行8天，方式正如实验II和III所述。

图16表示存活数据。阳性对照组的平均存活时间是9.9天。从图16可以看出，依据物质的使用方式存活时间存在非常明显的差异。对应于腹膜内及皮下施用，存活时间是170％，相比较，口服施用0.2ml剂量引起的存活时间是320％，但是在这个治疗组中，各个动物间的差异很大，有些动物完全治愈。对于这种类型的肿瘤，无法测量相对肿瘤质量，而在腹膜腔内积集的腹水及出现在肠系膜中的肿瘤构成了绝对肿瘤质量。图17表示在垂死组中如此确定的绝对肿瘤质量的测量重量。存活到第30天的动物也属于这些组。从图17可以看到，在三组治疗组中没有可测量的肿瘤质量存在。

图18表示在第5天和第8天及垂死状态时5’-核苷酸酶活性的变化。从图中可以看出在所有治疗组中都出现了显著改善，在一些治疗组中获得了正常值。

在参与实验I至IV的其它小鼠组中，在几个不同的时间进行了组织学检查。检查包括17个不同器官的组织学分析。以此组织学检查为基础，能说明在所检查的所有肿瘤类型中均还没形成转移。然而，在阳性对照组中，发现了非常明显的转移活动。对于各种类型的肿瘤，检测结果如下：S₁₈₀肉瘤在淋巴腺及肝中；C₂₆在肝中及肠系膜淋巴腺中；MXT肿瘤在肝中；L₁₂₁₀在骨髓中。

上述实验结果使得以下情况具有可能性，即在本发明没有检查的肿瘤类型中也可发生这种显著改进。由于显著的重要性，覆盖所有类型的肿瘤的检查是必要的。但上述实验的范围已足够宽以能支持主要疗效的存在。

本发明技术方案不仅能有效地用于肿瘤治疗，也能用于随后的护理及转移的预防。

由于负责疗效的两个不同组分中至少组分bovin 40存在于肿瘤患者的血液中这一事实，这些组分的检查可以用于肿瘤的诊断。

用本发明制品获得的结果及它的诊断潜力为肿瘤的有效治疗和诊断提供了希望。患有白血病的牛畜基本上遍布全世界，这就允许大规模实施生产。此外，也存在找到物质bovin 40及bovin 300的合成方法的可能性，因为这些物质的彻底检测预期将可导致这样的生产。

Claims (18)

1、药物制品，其特征在于，其包含未被白血病致死危及的偶蹄类动物的血浆或预先确定的血浆成分。

2、权利要求1所述的药物制品，其特征在于，偶蹄类动物是牛。

3、权利要求1所述的药物制品，其特征在于，所述预先确定的成分是血浆的无脂质部分。

4、权利要求3所述的药物制品，其特征在于，其与结合其全部质量所必需的一定量的表面活性物质结合。

5、用于肿瘤治疗和/或诊断的药物制品，其特征在于，其包含物质bovin 40和bovin 300之任一种，所述物质bovin 40和bovin 300构成了从患白血病的牛中提取的无脂质部分与从健康牛中提取的无脂质部分间通过电泳可检测到的差异。

6、制备动物和/或人血液的无脂质部分的方法，包括可选地用抗凝血剂处理最初的血液及从中分离血细胞的步骤，并且该方法的特征在于如下步骤：用第一有机溶剂处理血浆部分，向其中加入由细颗粒组成的表面活性物质，混合此液体，然后通过离心从液体成分中分离出结合在所述颗粒上的无脂质部分，将所述分离的部分再配制成溶液。

7、权利要求6所述的方法，其特征在于，用第二有机溶剂实现将所述分离的部分再配制成溶液的所述步骤，混合该溶液，通过离心从液体成分中分离出结合在所述颗粒上的无脂质部分，并二次将所述分离的部分配制成溶液。

8、权利要求7所述的方法，其特征在于，在二次将所述分离的部分配制成溶液的所述步骤中，使用生理溶液。

9、权利要求7所述的方法，其特征在于，在二次将所述分离的部分配制成溶液的所述步骤中用液体作为所述无脂质部分的溶剂，然后通过重复离心从液体部分中除去所述表面活性剂颗粒。

10、权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表面活性物质颗粒的大小在200nm到400nm间。

11、权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表面活性物质的质量为所述血浆部分的质量的0.5％。

12、权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表面活性物质是高岭土。

13、权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一有机溶剂的质量与所述血浆部分的质量基本上相等。

14、权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第二有机溶剂的质量与所述第一有机溶剂的质量相等。

15、权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一有机溶剂是乙醇，而所述第二有机溶剂是乙醇和甲苯的等量混合物。

16、权利要求1所述的药物制品用于肿瘤治疗及随后的护理。

17、权利要求1所述的药物制品用于在原发性肿瘤后预防继发性肿瘤形成。

18、用于治疗S180肉瘤、C26结肠肿瘤、MXT乳腺肿瘤及急性淋巴样白血病之任一项的权利要求16的用途。

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