PREPARACIÓN FARMACEUTICA PARA EL TRATAMIENTO Y DIAGNÓSTICO DE TU MORES Y MÉTODOS PARA LA PREPARACIÓN DE LA FRACCIÓN LIBRE DE LÍPIDO DE PLASMA SANGUÍNEO
La invención se refiere a una preparación farmacéutica, básicamente para el tratamiento de tumores y a un método para la separación de la fracción libre de lípidos del plasma sanguíneo. La Solicitud de Patente Internacional Publicada WO 00/40256 se refiere a los efectos inhibidores de tumor del plasma sanguíneo obtenido de pacientes que sufren de leucemia aguda. En la solicitud se describe una multiplicidad de experimentos, en los cuales la preparación utilizada originó una mejora del 20% con relación al grupo de control en conexión con tipos particulares de tumores. Esta mejora es cercana al rango inferior de aquellos referido como significativo. La aplicabilidad de preparaciones farmacéuticas elaboradas a partir de sangre leucémica aguda se limita primero por el pequeño número de ios sujetos que pueden utilizarse como donadores y por la existencia de estrictas consideraciones éticas y legales en conexión con el uso de sangre humana. La importancia resultante de tratamiento de tumores y el grado de investigación realizado por todo el mundo en este campo justifican el concienzudo análisis de cada nuevo camino que aparece como perspectiva ya sea en terapia o diagnóstico. La solicitud de patente arriba referida ha hecho probable que la sangre de sujetos que sufren de leucemia aguda comprenda un componente no exactamente definido, el cual tiene un efecto anti-tumor general. El objeto de la invención es proporcionar una nueva preparación farmacéutica que puede utilizarse para la terapia de tumores, incluyendo el objeto de la separación eficiente del componente de plasma sanguíneo que tiene un papel en la lucha contra tumores, y un objeto adicional es encontrar grupos adecuados de donadores de tal sangre. Para el logro de los objetos en el primer paso, se ha previsto un proceso de limpieza más eficiente, en donde se supone que los componentes eficientes se encuentren en la fracción libre de lípidos del plasma sanguíneo. Se ha reconocido que la separación de los componentes libres de lípidos del plasma sanguíneo puede llevarse a cabo en una manera preferible si la fracción de plasma se trata por un primer solvente orgánico, que si se agrega un agente surfactante que se compone de granos muy finos y después de una mezcla intensiva, la fracción libre de lípidos que se ha unido a los granos se separa del componente líquido mediante centrifugación, después esta fracción separada se conduce nuevamente hacia una solución. La limpieza será más eficiente si las etapas de solución y separación se repiten mediante el uso de un segundo solvente orgánico seguido por una centrifugación repetida. La cantidad del agente surfactante es de aproximadamente 0.5% con relación a la masa del plasma y su tamaño de grano se encuentra entre aproximadamente 200 hasta 400 nm. Los materiales preferibles son, por ejemplo, el alba de bolo, carbono activado o metocel. La centrifugación puede ocurrir preferentemente con una aceleración de 15 000 g. La disolución se facilita si después de la aplicación del solvente orgánico la solución se almacena por un periodo más largo a una temperatura elevada con mezcla intermitente. La separación de los granos surfactantes del componente libre de lípidos no es un objetivo indispensable y después de la segunda separación, los granos junto con el componente de plasma libre de lípidos unido a los mismos puede conducirse, por ejemplo, hacia una solución fisiológica. De acuerdo a una manera adicional de purificación, el componente de plasma libre de lípidos se conduce hacia una solución con un detergente ligero y puede separarse mediante el uso de una centrifugación adicional del componente sólido. Ya que el producto libre de lípidos, separado de esta manera y obtenido de donadores que tienen leucemia aguda, se ha demostrado significativamente más eficiente que el producto descrito en la solicitud de patente arriba referida, se consideró el principal aspecto del objeto, es decir, si tal componente anti-tumor puede encontrarse solamente en la sangre leucémica aguda, o si se presenta también en la sangre de sujetos sanados de tumor. Aunque el número de donadores sanados de tumor es substancialmente mayor que el número de sujetos que tienen leucemia aguda, y se limita menos la cantidad de sangre que puede obtenerse de ellos, no puede utilizarse un amplio rango médico debido a las limitaciones morales y legales arriba referidas. Un enfoque adicional para resolver el objetivo básico ha V - 4 - conducido a un descubrimiento inventivo adicional. El camino a este descubrimiento ha surgido a través del estudio de la sanación espontánea de tumores en animales. En el caso de mamíferos con patas de número par de pezuñas, una enfermedad de tumor originada por retrovirus es más bien específica. En ciertas especies, la enfermedad se manifiesta en sí en el tumor y los animales infectados mueren, mientras que en otras especies, básicamente en bovinos (ganado) la enfermedad no se manifiesta en sí en tumores o en cualquier disminución del estado de salud general de los animales. La infección puede detectarse por la presencia del anti-cuerpo GP 51 en la sangre. La opinión general reciente de la medicina veterinaria es que el ganado debe liberarse de individuos que sufren de leucosis. Esta consideración se soporta por la opinión publicada en la 4a emisión del Journal of Hungarian Veterinarians en 1992, titulada: "el estado de infección de leucosis de vacas en el país y las posibilidades de liberar el ganado" y esta opinión se condujo por el Comité Veterinario de la Academia Húngara de Ciencias. La existencia de infección de leucosis se encontró en cerca del 50%. En una publicación posterior, la emisión No. 9, en 1997, el mismo periódico comprende el documento del Dr. Teikes, Lajos "Liberando a las vacas de leucosis en Hungría" que enfatiza la importancia de liberar al ganado de la leucosis. El grado de infección se encontró mayor en granjas más grandes y, al momento del segundo artículo, el grado de infección era de aproximadamente 17%. La esencia en el descubrimiento yace en el reconocimiento de que la sangre de animales que han peleado exitosamente y se encuentran libres de síntomas de leucosis, más particularmente la fracción de plasma libre de lípidos de su sangre, debe comprende aquellos componentes que se han probado eficientes en los experimentos llevados a cabo con la sangre de donadores humanos. Este descubrimiento fue seguido por un gran número de experimentos que han confirmado esta hipótesis desde varios lados y han proporcionado soporte a lo eficiente de la existencia de un efecto de inhibición de tumor ya que había sido inconcebible desde el inicio de la pelea contra tumores. La existencia del efecto se confirmó también por el hallazgo de que componentes sanguíneos similares obtenidos de animales que no sufren de leucosis no tuvieron tales efectos. La examinación de electroforesis del plasma libre de lípidos obtenido de donadores humanos y animales confirmó la existencia de fracciones similares en dos rangos de peso molecular y estas fracciones se encontraban faltantes en el plasma obtenido de donadores saludables. Una primer fracción con un peso molecular de aproximadamente 4000 referida en lo siguiente como "bovina 40" y una segunda fracción con peso molecular que cae en el rango entre 300000 y 350000, referida en lo siguiente como "bovina 300" deben se responsables del efecto de inhibición del tumor. En el conocimiento de la solución de acuerdo a la invención, la revisión general de la necesidad de liberar al ganado bovino de individuos que tienen leucosis parece previsible. Las fracciones bovina 40 y bovina 300, identificadas de acuerdo a la invención, poseen excelentes efectos inhibidores de tumor y, al mismo tiempo, la detección de su presencia ayuda a establecer el diagnóstico de tumores. La invención se describirá ahora en conexión con los ejemplos, en donde se hará referencia a los dibujos y los experimentos acompañantes. En los dibujos: La figura 1 es un diagrama de sobrevivencia de un tratamiento con 0.15 mi de material Bbo-f; La figura 2 es un diagrama de sobrevivencia de 10 tratamientos con material Bbo-f; La figura 3 es un diagrama de sobrevivencia de 6 tratamientos con material Bbo-b; La figura 4 es un diagrama de sobrevivencia de 8 tratamientos con material Bbo-b; La figura 5 es un diagrama de sobrevivencia de 10 tratamientos con material Bbo-b; La figura 6 es un diagrama de sobrevivencia de un tratamiento con 0.1 mi de material Bbo-b; La figura 7 es un diagrama de sobrevivencia de un tratamiento con 0.15 mi de material Bbo-b; La figura 8 muestra e! peso corporal de los animales hasta el día 19; La figura 9 es una serie de diagramas de columna que resume los resultados de examinaciones enzimáticas; La figura 10 muestra los datos de sobrevivencia de un tratamiento después de la implantación de un tumor colorectal C26;
La figura 1 1 muestra las masas de tumor relativas en el tratamiento de la figura 10; La figura 12 muestra los valores de 5'nucleotidasa en el caso del tratamiento de la figura 10; La figura 13 muestra el diagrama de sobrevivencia experimentado en el caso del tratamiento de carcinoma de mama MXT; La figura 14 ilustra las masas de tumores relativas en caso del tratamiento de la figura 13; La figura 15 es una versión de la figura 14 en caso de tipos adicionales de tratamiento; La figura 16 muestra el diagrama de sobrevivencia experimentado en el caso de tratamiento de leucemia linfoide L1 2i o; La figura 17 muestra valores absolutos de masa de tumor, obtenidos en el tratamiento de la figura 16; y La figura 18 muestra los valores de 5'nucleotidasa en el caso de tratamiento de la figura 16. Los detalles diferentes de la solución de acuerdo a la invención pueden aprenderse en el orden de estaciones diferentes de los experimentos realizados. Sin importar el orden de importancia se requiere primero la descripción del método de preparación del material utilizado en los experimentos. Separación y obtención de componentes de plasma libres de lípidos. De la sangre utilizada como material de inicio se obtienen los componentes de plasma libres de lípidos a través de un método de separación de múltiples etapas. Las etapas preferidas de la separación son las siguientes: Poco después de que se ha tomado la sangre de inicio, se trata por un anti-coagulante; siendo preferentemente heparina. La separación de los corpúsculos toma lugar mediante centrifugación, preferentemente a una temperatura de 4°C y con una aceleración de 5000 g [g : significa la aceleración de la gravedad normal]. En este caso, si la centrifugación no toma lugar inmediatamente después de que se ha tomado la sangre, la sangre tratada por el coagulante puede almacenarse a una temperatura enfriada, preferentemente a la temperatura de la centrifugación cuando mucho a través de 48 horas. La duración de la centrifugación es de al menos aproximadamente 10 minutos. Para el procesamiento ulterior, se utiliza el líquido superior. El plasma así obtenido puede enfriarse hasta una temperatura de -20°C y puede mezclarse con plasmas obtenidos de manera similar a partir de diferentes donadores. El procesamiento ulterior puede tomar lugar cuando se requiera, con una mayor cantidad de plasma. Durante los ejemplos descritos en la presente especificación, el plasma obtenido de cualquier donador en particular no se ha mezclado con aquel obtenido de diferentes donadores, y cualquier diferencia del mismo se reporta por separado. Como una primer etapa del retiro de los componentes lípidos, el plasma se ha diluido por la misma masa en un primer solvente orgánico, por ejemplo, con alcohol de 96% de pureza, y la solución así obtenida se mezcla. En la segunda etapa, un material surfactante (agente) se agrega a la solución en una cantidad de 0.5% en masa. La labor de este materia surfactante es unir los componentes libres de lípidos del plasma sobre su superficie. El material surfactante puede ser bolus alba, carbono activado o metocel, y el tamaño de grano promedio del mismo yace preferentemente entre 200 y 400 nm. En el caso de los ejemplos descritos, el material surfactante fue bolus alba. Esta mezcla de plasma se mantuvo permanentemente en un estado suspendido por medio de intervención física (mezclado) a temperatura ambiente a través de 6 horas, después se incubó a una temperatura de 5°C a través de 10 hasta 12 horas. En el periodo de incubación , el líquido se mezcló durante periodos cortos respectivos una vez cada hora y media. Después de la incubación, la mezcla se volvió a suspender mediante mezclado, y la suspensión se centrífugo a la misma temperatura de 4-5°C con una aceleración de 15000 g durante un periodo de 10 minutos. A partir del centrifugado, los componentes más sólidos unidos a las partículas surfactantes se separaron para procesamiento ulterior y la fase líquida se desechó. Se agregó un segundo solvente orgánico a la fase separada en una cantidad igual con la masa del primer solvente orgánico, el cual en el caso ejemplificativo fue la mezcla de 50% masa -50% masa de alcohol y tolueno. El procesamiento de la mezcla así obtenida fue idéntico al del tratamiento después del primer solvente. Durante este proceso, la mezcla de plasma se mantuvo permanentemente mediante intervención física (mediante mezclado) en estado suspendido a través de 6 horas a temperatura ambiente, después se incubó a 5°C a través de 5 hasta 12 horas. En el periodo de incubación, la mezcla se mezcló una vez cada hora y media durante periodos cortos respectivos. Después de la incubación, la mezcla volvió a suspenderse mediante mezclado y a la misma temperatura de 5°C la suspensión se centrífugo a través de 10 minutos con una aceleración de 15000 g. A partir del centrifugado, los componentes sólidos unidos a las partículas surfactantes se separaron para procesamiento ulterior y la fase líquida se desechó. El componente sólido se difundió para formar una capa delgada, después cualquier solvente orgánico restante se retiró en una secadora colocada bajo un vacío durante dos horas. Después, se agregó al sedimento separado una solución salina fisiológica con una masa igual a la masa de plasma de inicio, y el material volvió a suspenderse mediante mezclado. Las preparaciones de plasma así obtenidas se etiquetarán en la siguiente parte de la especificación con la letra "b"que se refiere a la inicial del material surfactante que es bolus alba. En la obtención de una segunda preparación de plasma alternativa, relativamente más refinada, el material surfactante se retiró de tal manera que se agregó un detergente adecuado al tejido a la mezcla "b", que es capaz de disolver la preparación de plasma. En el caos ejemplificativo, este detergente fue 0.01 % en masa de sulfato de laurilo de sodio. Por seguridad en la obtención de una suspensión adecuada, el material junto con el detergente agregado ai mismo se incubaron a temperatura ambiente a través de 6 horas bajo mezclado continuo, después se almacenó en un refrigerador a través de 8 hasta 12 horas. El material que formó un sedimento durante la incubación volvió a suspenderse, después, en un estado enfriado, se centrífugo con una aceleración de 15000 g. El sedimento se desechó y el líquido superior comprendió el material útil, el cual se etiquetará en la siguiente parte de la especificación con la letra "f" para distinción del material "b" y designando que este material es más fino. Para facilitar los experimentos llevados a cabo con ratones, ambos tipos de productos se alimentaron en dosis respectivas de 1 mi, después se etiquetaron y almacenaron en un estado congelado. Los productos y las circunstancias de su preparación fueron ambos estériles, por consiguiente, el material fue aséptico y capaz de aplicaciones parenterales. I. Experimentos con implantación de sarcoma S180 Todos estos experimentos se llevaron a cabo con ratones BDF1 hembras, de tipo idéntico, con un peso promedio de 25 g. Tanto en los animales examinados como en los de control positivo, el sarcoma S 180 se transplantó en una manera subcutánea. Las circunstancias de los experimentos con respecto al tipo de los animales, el tipo del sarcoma implantado y la manera de implantación fueron idénticas a aquellas descritas en la solicitud de patente internacional referida con anterioridad. Cada grupo experimental comprendió al menos cinco ratones y los datos reportados se relacionan con el promedio de los ratones en el grupo asociado. Los ratones se distinguieron de acuerdo a grupos de números adecuados y tuvieron números individuales. Experimento 1 A partir de la sangre de un paciente que sufre de leucemia aguda, se preparó una preparación de plasma de tipo "b" y en el grupo experimental cada ratón obtuvo 0.1 mi subcutáneo de la misma cada tercer día, todos juntos en ocho ocasiones. En el grupo de control positivo, el tiempo de vida promedio fue de 19.6 días y en el grupo experimental fue de 23.5 días. Esto es un incremento de 20% que puede considerarse como una mejora significativa. En la solicitud internacional arriba referida en conexión con el mismo tipo de tumor, la mejor preparación podría dar como resultado un incremento de 5% en la sobrevivencia, lo cual se encontraba aún por debajo del umbral de importancia. La separación adecuada del componente de plasma libre de lípidos es, por consiguiente, muy esencial. Experimento 2 Este experimento comprende los resultados de seis experimentos diferentes y se basa en la suposición de que el material eficiente contra tumores, el cual se supone está comprendido en el componente libre de lípidos del plasma, se presenta también en la sangre de sujetos sanados de un tumor. Tales personas se seleccionaron como donadores, quienes habían vivido al menos durante 10 y cuando mucho durante 27 años desde que se había descubierto su tumor, por consiguiente, pueden considerarse como sanados. El tipo de tumor diagnosticado de los donadores fue en secuencia laringe, colon, mama, leucemia linfoide, testículos y próstata, así como también tumores de pulmón. La preparación de plasma tipo "b" se realizó en el caso de los seis donadores y los grupos respectivos de ratones se trataron con la misma. El tiempo de sobrevivencia promedio del grupo de control fue nuevamente de 19.6 días, sin embargo, el promedio de los grupos tratados varió entre 25.5 y 27.3 días, por consiguiente, hubo solamente una ligera diferencia entre los grupos tratados. Tal sobrevivencia constituyó una mejora entre 30% y 40% con relación al grupo de control, lo cual es muy significativo. Como un experimento adicional, un producto de plasma de tipo
"b" se elaboró a partir de la mezcla igual de los plasmas obtenidos de los seis donadores después del retiro de corpúsculos. Este producto proporcionó un incremento en la sobrevivencia del 38% con relación al grupo de control. Estos experimentos confirmaron así la hipótesis de acuerdo a la cual el componente de plasma libre de lípidos de sujetos sanados de un tumor, incluye un material inhibidor de tumor eficiente. Además, también se comprobó que la existencia de tal material no depende (al menos en el caso del tipo de tumor examinado) del tipo real de tumor, por consiguiente, la mezcla es igualmente eficiente. Experimento 3 Tales vacas (reces) se seleccionaron como donadoras, en las cuales la examinación sanguínea confirmó la existencia de leucosis bovina. A partir de la sangre de tales donadores, se elaboraron productos de plasma de tipo "b" y "f". De manera similar, ambos tipos de productos de plasma se prepararon a partir de sangre de ganado, cuya sangre no mostró la presencia de leucosis. Las examinaciones se llevaron a cabo en varias versiones, en donde, como variable, el primer parámetro fue el número de tratamiento aplicados cada tercer día, el segundo parámetro fue la cantidad de dosis que cambió entre 0.1 y 0.15 mi, y el tercer parámetro fue la pureza del producto, es decir, siendo ya sea de tipo "b" o "f". El rango de examinación preferido de estos parámetros se determinó por experimentos piloto precedentes a los experimentos actuales, ya que los óptimos respectivos se encontraron con respecto tanto a la dosis como al número de tratamientos. El producto obtenido de la sangre de vacas que tienen leucosis satisface los criterios de aplicabílidad a gran escala, ya que no existen límites con respecto a la disponibilidad de donadores y con respecto a consideraciones éticas o morales. Los datos de sobrevivencia substancialmente exceden los datos favorables de otro modo de las preparaciones obtenidas de sangre humana. Esta es la razón de la descripción detallada de los resultados de estos experimentos. Durante los experimentos, el peso promedio de los animales y el tiempo de sobrevivencia promedio se examinaron, además, en fases predeterminadas de los experimentos, se tomaron muestras de sangre de 1 mi de los respectivos ratones de cada grupo y en las muestras se examinó la presencia de una pluralidad de marcadores de tumor. Los ratones de los cuales se tomaron las muestras de sangre, se retiraron de las siguientes examinaciones, ya que podrían no sobrevivir dada tal cantidad de sangre. Datos con relación al tiempo de sobrevivencia Los resultados con relación al tiempo de sobrevivencia pueden dividirse en dos grupos principales, es decir, si el tratamiento toma lugar con productos de tipo "b"o "f". El origen del ganado que tiene leucosis se designa por la abreviación "Bbo", por consiguiente, el tratamiento del primer grupo principal toma lugar con el material Bbo-b y el del segundo grupo principal toma lugar con el material Bbo-f. Los días se cuentan a partir de la implantación del tumor. Cada curva mostrada en las figuras 1 a 7 con relación al promedio de un grupo incluye al menos cinco ratones. Las figuras 1 y 2 muestran los diagramas de sobrevivencia de grupos tratados con el material Bbo-f. Los ratones en el grupo de control positivo no obtuvieron ningún tratamiento después de la implantación aparte de la alimentación normal, los ratones en el grupo tratado se trataron cada segundo día por el material de Bbo-f que tiene la masa definida, En cada tratamiento en los grupos mostrados en la figura 1 , la dosis fue de 0.15 mm. Los dos grupos tratados difieren entre sí en el número de tratamientos. En el primer grupo, se aplicaron 8 tratamientos, mientras que en el segundo grupo el número de tratamientos fue de 10, después de esto los ratones no obtuvieron ningún tratamiento adicional. En el caso del grupo que obtuvo 10 tratamientos, puede observarse que después de terminar el tratamiento, es decir, después del día 20, la tasa de mortandad se incrementó repentinamente. Este incremento repentino puede observarse también en el grupo que obtuvo 8 tratamientos, pero es interesante observar que el incremento toma lugar más tarde y con una pendiente más ligera. El tiempo de sobrevivencia promedio con relación al grupo de control con 19.6 días en el grupo que obtuvo 8 tratamientos es de 24.8 días mientras que en el grupo que obtuvo 10 tratamientos es de 23.2 días. En cada uno de los grupos mostrados en la figura 2, el tratamiento toma lugar 10 veces cada segundo día. La diferencia yace en la dosis. Los ratones en el primer grupo obtuvieron una dosis de 0.15 mi en cada tratamiento, mientras que los del segundo grupo se trataron con una dosis de 0.1 mi. La diferencia es bastante aparente cuando se disminuye la dosis. El tiempo de sobrevivencia se incrementó hasta 30 días, lo cual constituye una mejora de 153% con relación al grupo de control positivo. Los resultados de los tratamientos con el material de Bbo-b se muestran en 2 grupos de figuras. En el caso de las figuras 3 a 5, el parámetro cambiante es la dosis. En el caso mostrado en la figura 3, el tratamiento tomó lugar 6 veces, y puede observarse que el tiempo de sobrevivencia depende fuertemente de la dosis utilizada, mientras menor es la dosis es ligeramente mejor. Sin embargo, el tiempo de sobrevivencia fue substancialmente mejor en comparación con el material de Bbo-f, ya que el tiempo de supervivencia promedio fue de 37 días, lo cual es una mejora de casi 189% con relación al control positivo. La dependencia del tiempo de supervivencia respecto a la dosis será más aparente cuando se considere la figura 4. Aquí el número de tratamientos fue de 8. Bajo el efecto de la dosis de 0.15 mi, el tiempo de sobrevivencia disminuyó en comparación con el valor obtenido en 6 tratamientos y esto podría ser solamente la consecuencia de una sobredosis. Por el contrario, la dosis de 0.1 mi parece ser óptima con 8 tratamientos, ya que el tiempo de sobrevivencia promedio se incrementó substancialmente y por el día 59 el diagrama no había alcanzado aún un valor de 50%. Para tal día, la sobrevivencia se había incrementado más de 300%, lo cual es una figura notablemente favorable. La figura 5 muestra el tiempo de sobrevivencia promedio en caso de ratones que obtuvieron 10 tratamientos. Sorprendiendo aquí la propiedad de la dosis de 0.15 mi debido a que en este grupo la sobrevivencia disminuyó repentinamente pero el promed io es mejor que el grupo anterior con un tratamiento similar. Perteneciendo a un número menor de ratones, las diferencias podrían venir de un comportamiento más o menos favorable de uno o dos ratones. La mortandad repentina se incrementa en el caso de la dosis de 0.1 mi después del día 33, lo cual podría ser también la consecuencia de una sobredosis. En las figuras 6 y 7, el parámetro variable es el número de tratamientos. La comparación de las dos figuras demuestra aquí también la aplicación de 8 tratamientos con una dosis de 0.1 mi como óptima. De la figura 7 la consecuencia puede deducirse que en caso de una mayor dosis la mejora se incrementa con un número menor de tratamientos, lo cual también indica que la dosis fue demasiado elevada. La sanación del tumor y el peso promedio de los animales La mejora experimentada en el estado de los animales de los grupos tratados puede reconocerse no solamente sobre la base del tiempo de sobrevivencia promedio. En los animales con un peso de inicio de 25 g tal tumor grande se formó con pesos de 6 a 8 g, es decir, casi un tercio del peso total del animal. En los animales tratados con una dosis de 0.1 mi del material de Bbo-b ocho veces, al final del ciclo del tratamiento, un cambio muy reconocible tomó lugar en el estado del tumor, el sarcoma se abrió y se descargó un material esponjoso. Este material comprendió células de tumor muertas. La "joroba" de los animales desapareció y comenzaron a ganar peso. La figura 8 muestra el valor del peso corporal promedio de os animales en los primeros 19 días con respecto a los grupos Bbo-b y Bbo-f, ambos obtuvieron 8 tratamientos y el grupo de control positivo. Los diagramas se encuentran en buena correspondencia con el reporte de estado arriba descrito, especialmente en el caso del tratamiento con el material de Bbo-b. La desventaja del diagrama yace en que no muestra por separado la masa del tumor. No podríamos obtener un valor exacto para el peso del tumor, por consiguiente, el peso corporal completo también incluye el peso del tumor. En el grupo tratado, la disminución inicial seguida por un incremento regenerativo es típica, en el caso del grupo de control positivo el peso se incrementa en una marea fluctuante originada principalmente por el incremento del tumor. De los experimentos anteriores, los que aparecen como mejores se repitieron con tal material que se obtuvo de vacas saludables que no tuvieron leucosis. Los resultados no difieren significativamente de aquellos obtenidos en el grupo de control positivo y esto ha confirmado que solamente es efectivo el material obtenido de la sangre de ganado que tiene leucosis. Los resultados de exanimaciones de marcador de tumor enzimático Para le examinación de cambios metabólicos que acompañan los procesos malignos, existen varios marcadores de tumor enzimáticos que se terminan ampliamente en la práctica clínica y de estos métodos se seleccionan varios tipos que pueden utilizarse para examinaciones de rutina. En la selección de métodos, se ha tomado en cuenta que los procesos malignos se acompañan y con frecuencia se mantienen por complejas perturbaciones bioquímicas. Por consiguiente, debido a estas consideraciones parece necesario el llevar a cabo ensayos de metabolismo de ácido nucleico (suero alcálico(básico) y actividad de dezoxiribonucleasa acídica, actividad de 5'-nucleotidasa) ; de metabolismo de poliamina (actividad de arginasa); de la función de mitocondrias del hígado (actividad de transferasa de carbamoil de ornitina); de gluconeogénesis (actividad de izomerasa de fosfohexosa) ; y de la identificación de procesos relacionados con huesos (actividad de fosfatasa alcálica específica de hueso). Los cambios en la actividad de las enzimas listadas siguen a los cambios metabólicos que acompañan y mantienen los procesos malignos y los resultados de las terapias aplicadas. Durante los experimentos, las muestras sanguíneas se tomaron de ratones en los días 8, 15 y 19 después de la implantación del tumor. Los datos se resumen en la Tabla 1 . Los datos con relación al promedio de cinco ratones respectivos, se examinan todos por separado. El significado de ciertas columnas en la Tabla: ß-Glyc: fosfatasa no específica, ß-glicerofosfato; este valor debe substraerse del valor de otros valores de fosfatasa con objeto de que puedan interpretarse como marcadores de tumor; 5'-AMP: familia de enzima 5'nucleotidasa, más particularmente: 5'- adenosina-5-monofosfato Alk. F: fosfatasa alcálica 5'-TMP: 5'-timidina-5-monofosfato PDE: fosfodiesterasa SDNaz: dezoxiribonucleasa acídica (ADNasa acídica) ?.5'-ND: el valor total de todas las 5'-nucleotidasas
Tabla 1: Los efectos del suero de plasma Bbo-b y Bbo-f en ratones que tienen sarcoma S-180 Grupos ß-Glyc 5'-AMP Alk. F 5'-TMP PDE SDNaz ?.5'-ND animales 246-251 2,12 5,45 14,7 4,67 31,2 45,7
271-275 5,76 7,12 23,5 7,89 44,6 100,7 53,4
276-280 6,78 8,92 19,9 10,78 54,6 98,3 55,67
281-290 2,67 10,23 23,9 13,6 55,9 123,1 67,3
385-390 4,56 16,8 32,8 11,7 67,2 98,9 72,4
391-395 3,56 19,9 34,7 17,3 66,8 34 77,9
396-400 2,45 21,8 33,5 20,76 67,9 45 78,5
41-50 3,33 21,3 32,78 19,43 86,8 359,1 97,8
101-105 2 24,7 21,72 21,45 78,9 189,1 69,9
151-155 1,56 29,4 31,32 13,42 65,7 201,6 76,1
106-110 1,15 3,67 10,39 5,67 43,2 35,2 35,2
56-60 2,91 3,4 13,6 5,8 36,8 40,8 40,3
51-55 -0,03 3,4 22,31 6,2 41,3 32,9 42,1
En la tabla pueden observarse tres grupos diferentes. Los últimos grupos se refieren al control con ratones a los que no se ha implantado un tumor, y los ratones 51-55 en este grupo se examinaron el día 8, los ratones 56-60 se examinaron el día 15 y los ratones 106-1 10 se examinaron el día 19. El grupo medio se refiere al control positivo con ratones 151-155 examinándose el día 8, los ratones 101 -105 el día 15 y los ratones 41-50 el día 19. El primer grupo puede dividirse en dos sub-grupos, los que iniciaron con el dígito 2 obtuvieron tratamiento con el material de Bbo-b y los que iniciaron con el dígito 3 se trataron con el material de Bbo-f. En el sub-grupo de Bbo-b, la examinacion de los ratones 281-290 tomó lugar el día 8, de los ratones 276-280 el día 15, de los ratones 271-275 el día 19 y finalmente la examinacion de los ratones 246-250 tomó lugar con respecto a la sobrevivencia substancial mucho después, el día 45. En el segundo sub-grupo con ratones tratados con el material de Bbo-f, la distribución de acuerdo al día de la examinacion: 396-400: día 8; 391-395: día 15; 385-390: día 19. Los resultados se resumen en la forma de diagramas de columna en la figura 9, en la cual los grupos de ratones ilustrados sobre el eje horizontal se asociaron con datos en el eje vertical por encima unos de otros, en donde la altura de las columnas expresa la suma de los datos. En el eje horizontal los grupos de ratones se ilustraron por separado y dentro de cada grupo el orden de izquierda a derecha sigue el orden creciente de las fechas de muestreo. Las tres columnas de la izquierda se asocian con el grupo de control, las tres columnas del medio de asocian con el grupo de control positivo y las tres primeras columnas de las siete columnas de la derecha pertenecen al sub-grupo de Bbo-f y las últimas cuatro columnas pertenecen al sub-grupo de Bbo-b. En el segundo grupo de control los datos naturalmente no cambian con el tiempo, sus fluctuaciones se encuentran dentro del rango natural. En el caso del grupo de control positivo, todos los componentes son extremadamente elevados y por el periodo moribundo (última columna) tuvieron un incremento adicional. Por el contrario, en ambos sub-grupos tratados, los valores iniciales ya son más pequeños que los datos del grupo de control positivo y disminuyen aún más con el tiempo. El material de Bbo-b proporcionado de acuerdo con los datos de sobrevivencia favorables, substanctalmente da mejores resultados que el tratamiento con el material de Bbo-f. La disminución continúa después del día 19 y al final del experimento los datos se encuentran cerca de los valores normales del grupo de control. Experimento 4 En base a los resultados favorables obtenidos durante los experimentos previos, se examinó cuáles componentes del plasma libre de lípidos eran responsables del efecto. Ya que teníamos sangre humana saludable, la sangre de sujetos con leucemia aguda, sangre humana de sujetos sanados de tumor, además sangre tomada de ganado con y sin leucosis, la preparación de tipo "b" se elaboró a partir de cada una de las sangres listadas y experimentaron examinaciones de electroforesis respectivas. Para las examinaciones, el material de inicio se condujo a la superficie de un gel de poliacrilamida utilizado y bajo el efecto del tratamiento de electroforesis los componentes del material se separaron de acuerdo al orden de sus pesos moleculares. Las fracciones tomadas de la sangre que se probaron ineficientes desde el punto de vista de tratamiento de tumor, es decir, sangre huma a normal y sangre tomada de ganado libre de leucosis, se compararon con fracciones obtenidas de tipos de sangre que son eficientes desde el punto de vista de tratamiento de tumor. La diferencia más aparente se experimentó en las fracciones de sangre tomadas de ganado que tiene leucosis y permaneció en la presencia de una fracción con peso molecular de aproximadamente 40000 y una fracción adicional con un peso molecular de entre 300000 y 350000. Estas dos fracciones juntas representaron de 8 hasta 12% en masa de la muestra. Las fracciones de la preparación sanguínea tomada de donadores con tumor curado comprendieron ambos componentes, sin embargo, la presencia de la fracción alrededor del peso molecular de 40000 fue más aparente y la cantidad de las fracciones fue substancialmente inferior, de aproximadamente 2-3%. Entre las fracciones de la preparación tomada de sangre leucémica aguda, el componente con el peso molecular 40000 se presentó solamente en trazas, la otra fracción no fue detectable. Por razones de seguridad en la identificación de dichas dos fracciones, la de peso molecular de aproximadamente 40000 será referida como "bovina 40" y la otra fracción entre 300000 y 350000 se designará como "bovina 300". El método aquí descrito es suficiente para la identificación sin error de estas dos fracciones. La identificación estructural de estas fracciones se encuentra actualmente en camino. En el conocimiento de los resultados mostrados, puede declararse con buenas bases que la presencia de los materiales bovino 40 y bovino 300 es responsable de los efectos demostrados. II. Experimento con la implantación de tumor colorectal C26 Los experimentos se llevaron a cabo con la primer generación de ratones macho Balb/c internamente criados. El lugar de origen de los ratones fue el Instituto TNO, Rijkswijk, Países Bajos, su lugar de cría fue el Instituto Nacional de Oncología (Hungría), Departamento de Farmacología Experimental. Las circunstancias para manutención de los animales fueron: jaula de material macrolon, temperatura 20-22°C, humedad relativa 45-55%, manteniéndose el cambio de oscuridad y luz en periodos de 12 horas. La alimentación ocurrió con una alimentación para ratones de calidad estándar que puede esterilizarse en una autoclave (tipo: Altromin, Alemania), el lecho fue hecho de hojas de madera. El nivel higiénico de la crianza fue de acuerdo con las condiciones de SPF prescritas (Libre de Patógenos Especificados). El cuidado y mantenimiento de los animales tomó lugar de acuerdo con la declaración de Helsinki sobre "Principios Guía para el Cuidado y Uso de Animales". El adenocarcinoma de colon Colon-26 se tomó de SRI, Birmingham, Alabama, E. U.A. La manera de transplante: del tumor mantenido se implantó de manera subcutánea una pieza de 20 mg en la región interescapular. Durante los experimentos, los animales se dividieron en grupos de diez ratones, los animales en el grupo de control positivo no obtuvieron ningún tratamiento después de la implantación. En los grupos tratados, el tratamiento tomó lugar con el material de Bbo-b previamente descrito . Este material fue referido durante la documentación de los experimentos también como AAB-7. Las experiencias obtenidas a través del experimento de serie I se utilizaron y el tratamiento se aplicó una vez ai día al mismo tiempo, entre el día 1 y 9, juntas ocho veces. Las diferencias entre los grupos respectivos se encontraron en la manera del tratamiento y en la cantidad de material experimental aplicado. Los datos de sobrevivencia se resumen en la figura 10. En el caso del grupo de control positivo, el tiempo de sobrevivencia al 100% fue de 19 días. En el primer grupo, el tratamiento ocurrió de manera intra-peritoneal (ipl) con una dosis de 0.1 mi , en el segundo grupo la manera de aplicación fue la misma pero la dosis fue de 0.15 mi, y la aplicación de material a través de la boca (per os) también se ensayó. Aquí se utilizó un alimentador de dosis adecuada para conducir el material directamente en el estómago de los animales. En el primer grupo per os (po 1 ) una dosis fue de 0.2 mi de material y en segundo grupo per os (po2) la dosis fue de 0.3 mi. También se trató así un grupo adicional, donde el material se aplicó en una manera subcutánea (bajo la piel) con 0.1 mi de material. Los datos de sobrevivencia muestran los promedios de los grupos de diez ratones. A partir de la figura, puede observarse que en caso de que tome lugar una mejora substancial en cada grupo tratado, los dos tratamientos más eficientes fueron la aplicación ip con 0.1 mi y el tratamiento po con 0.2 mi de material . Los experimentos se repitieron en grupos adicionales de diez ratones y para medir la masa de tumor los tumores se retiraron cuando los animales alcanzaron sus estados mori bundos (es decir, directamente antes de la muerte) y se m idieron las masa de tumor. La figura 1 1 muestra los resultados de estos experimentos. Encima de las columnas se dan los valores de los niveles de confidencia asociados , los cuales fueron en todos los casos menores de 0.05 , es decir, los datos son muy confiables . En grupos adicionales de diez ratones tratados de manera similar, las actividades de 5'-nucleotidasa se determinaron sobre m uestras tomadas los días 8, 1 6 a partir de la i mplantación del tumor; así como también en estado moribundo como en el caso de la serie experimental 1 . Estos datos se muestran en la figu ra 12. La actividad ha incrementado desde el valor bajo inicial por el día 16 hasta u no muy elevado, después , cuando se ha alcanzado el estado mori bundo, la actividad ha disminuido substancialmente desde los valores obtenidos en el grupo de control positivo. I I I . Experimentos con la implantación de tumor de mama MXT Bajo la manutención de las condiciones descritas en el experimento I I , los ratones hem bra BDF-¡ del origen descrito se utilizaron para exam inar los efectos de un tratamiento con el material de Bbo-b en caso de tumor de mama MXT. El lugar de origen de las células de tumor por transplantarse es el MASON Res. Inst. USA. Del tumor mantenido, una pieza pequeña de 1 mm3 de volumen se implantó de manera subcutánea en la región interescapular. De los animales, se formaron grupos de diez ratones como en el caso del experimento I I y dentro de cada grupo los individuos se trataron por igual. El tratamiento con el material de Bbo-b se llevó a cabo justo como en el caso del experimento II, es decir, una vez al mismo tiempo cada día a través de 8 días. En el caso del control positivo, el tiempo de sobrevivencia promedio fue de 24 días. La figura 13 muestra el tiempo de sobrevivencia en el caso de los diferentes grupos tratados. Puede observarse que un número de grupos diferentes se trató de una manera idéntica, por ejemplo, con grupos de dosis ip1 e ip2 de 0.15 mi igualmente tratados de manera intraperitoneal, o los grupos po2 y po3 se trataron con una dosis de 0.3 mi per os. En este tipo de tumor, el incremento en el tiempo de sobrevivencia fue de aproximadamente 40%, el cual fue el más elevado en caso de tratamientos per os. Las examinaciones de masa de tumor se llevaron a cabo en animales en estado moribundo como se describe en el experimento II, y los resultados se resumen en las figuras 14 y 15. Los números indicados en el eje horizontal se relacionan con el número de serie de los ratones en el grupo particular, no tienen significado especial. Las secciones verticales se indicaron en los diagramas de la columna con relación a las desviaciones dentro del grupo asociado. La disminución de la masa de tumor fue aquí lo más significativo también en los tratamientos aplicados per os. La examinación de 5'-nucleotidasa llevada a cabo en los animales experimentales demostró una disminución substancial en los grupos tratados, el análisis de los datos experimentales completos de tales examinaciones no se ha completado aún para el tiempo de existencia, por consiguiente, no pueden resumirse en la forma de una tabla.
IV. Experimentos con leucemia linfoide L12io aguda, implantada Los efectos del material de Bob-b se examinaron en el caso de leucemia linfoide L 2io aguda. Los grupos de diez ratones se formaron a partir de ratones BDFi macho mantenidas como se describe en conexión con los Experimentos II y II I. A partir de los ascitos líquidos de los ratones DBA/2, en los cuales se ha mantenido la leucemia linfoide L1210 aguda y a partir de una solución salina fisiológica se realizó un líquido, de los cuales comprendió 0.1 mi de 106 células. A partir de ese líquido, se inyectaron 0.1 mi en una manera intraperitoneal en cada ratón experimental y en los grupos tratados los tratamientos se llevaron a cabo una vez al día a través de 8 días tal como en el caso de los Experimentos I I y II I. La figura 16 muestra los datos de sobrevivencia. El tiempo de sobrevivencia promedio en el grupo de control positivo fue de 9.9 días. En la figura 16 puede observarse que existe una diferencia muy substancial en el tiempo de sobrevivencia dependiendo de la manera en que se aplicó el material. En respuesta a las aplicaciones intraperitoneales y subcutáneas, el tiempo de sobrevivencia fue de 170% y en contraste al mismo la aplicación per os de 0.2 mi de dosis dio como resultado un tiempo de sobrevivencia de 320%, pero en este grupo tratado las diferencias entre los animales individuales fueron enormes y algunos de ellos sanaron por completo. En este tipo de tumor, no hubo manera de determinar la masa de tumor relativa y los ascitos líquidos recolectados en la cavidad peritoneal junto con los tumores presentes en el mesenterio constituyeron la masa de tumor absoluta. La figura 17 muestra el peso medido de la masa de tumor absoluta así determinada en los grupos moribundos. Los animales que han sobrevivido al día 30 pertenecieron también a estos grupos. En la figura 17 puede observarse que en tres de los grupos tratados no se encontró masa de tumor medible. La figura 18 muestra el cambio de la actividad de 5'-nucleotidasa los días 5 y 8 así como también en estado moribundo. A partir de los diagramas, puede observarse que una mejora substancial tomó lugar en todos los grupos tratados y en algunos grupos tratados se obtuvieron valores normales. En grupos adicionales de ratones que participaron en los experimentos I a IV en varias diferentes fechas, se llevaron a cabo examinaciones de histología. Las examinaciones incluyeron el análisis de histología de 17 órganos diferentes. En base a tales examinaciones de histología puede establecerse que no se ha formado metástasis en ningún tipo de tumor examinado. Sin embargo, en el caso de los grupos de control positivos, se encontró actividad de metástasis bastante notable. En el caso de tipos de tumor individuales, se detectaron como sigue: en caso de sarcoma S-|80 en las glándulas linfáticas y en el hígado; en caso de C26 en el hígado y en las glándulas linfáticas mesentéricas; en caso de tumores XT en el hígado y en caso de L 2i o en la médula ósea. Los resultados experimentales anteriores hicieron probable que las mejoras significativas experimentadas tomaran lugar también en los tipos de tumor no examinados aquí. Las examinaciones que cubren todos los tipos de tumores serán necesarios debido a su sobresaliente importancia. No obstante, los experimentos anteriores han sido suficientemente amplios para soportar la existencia del efecto principal.
REIVINDICACIONES 1 . La preparación farmacéutica caracterizada porque comprende componentes de fracción libre de lípidos, del plasma sanguíneo de mamíferos con patas de número par de pezuñas no letalmente en peligro debido a y que tienen leucosis. 2. La preparación farmacéutica según la reivindicación 1 , caracterizada porque los mamíferos con patas de número par de pezuñas son ganado vacuno. 3. La preparación farmacéutica para el tratamiento de tumores, caracterizada porque comprende un material que constituye la diferencia detectable por electroforesis entre la fracción libre de lípidos del plasma sanguíneo tomado de ganado vacuno que tiene leucosis y la fracción libre de lípidos del plasma sanguíneo tomado de un ganado vacuno saludable. 4. Un método para la preparación de la fracción libre de lípidos del plasma sanguíneo según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende las etapas de tratar opcionalmente la sangre inicial mediante un anti-coagulante y separar los corpúsculos de la misma, caracterizado por las etapas de tratar la fracción de plasma por un primer solvente orgánico, agregar un material surfactante al mismo, compuesto de granos finos, mezclar el líquido, separar después la fracción libre de lípidos unida a dichos granos de los componentes líquidos por centrifugación y conducir dicha fracción separada de manera repetida en una solución. 5. El método según la reivindicación 4, caracterizado por el