BG107547A

BG107547A - Фармацевтичен препарат за лечение и диагноза на тумори и метод за получаване на липидночиста фракция от кръвна плазма

Info

Publication number: BG107547A
Application number: BG107547A
Authority: BG
Inventors: Andras Bertha
Original assignee: Andras Bertha
Priority date: 2000-07-10
Filing date: 2003-02-10
Publication date: 2004-01-30
Also published as: SK1282003A3; WO2002007739A9; IL153867A0; WO2002007739A2; HUP0002597A2; HRP20030098A2; EP1333844A2; US20040253317A1; HU0002597D0; ZA200300675B; EA200300133A1; MXPA03000342A; JP2004504353A; CN1477965A; EA005415B1; AU2001277630A1; CA2415862A1; YU9903A; WO2002007739A3; PL361049A1

Description

МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА АИПИДНО-ЧИСТА фракция от

КРЪВНА ПЛАЗМА

Изобретението се отнася до фармацевтичен препарат, главно за лечение на тумори, и до метод за отделяне на липидночиста фракция от кръвна плазма.

Публикуваната международна патентна заявка WO 00/40256 се отнася до въздействия за инхибиране на тумори на кръвна плазма получена от пациенти страдащи от акутна левкемия. В заявката е описано разнообразие от експерименти, при които използваният препарат причинява 20 % подобрение спрямо контролната група във връзка със специални видове тумори. Това подобрение е близко до по-ниския порядък на този споменат като значителен.

Приложимостта на фармацевтични препарати произведени от акутно левкемична кръв е ограничена първо от малкия брой пациенти, които могат да бъдат използвани като донори и от съществуващите стриктни етични и легални съображения във връзка с използването на човешка кръв. Откритата значимост на лечението на тумори и размера на направеното световно изследване в тази област оправдават напълно анализа на всеки нов начин, който се появява като перспективен както в терапията, така и в диагностиката.

Горе-споменатата патентна заявка е направена вероятно поради това, че кръвта на пациентите страдащи от акутна

Ί левкемия включва точно неопределен компонент, който обикновенно има противо-туморен ефект.

Целта на изобретението е да се осигури нов фармацевтичен препарат, който може да бъде използван за терапия на тумори, включвайки целта за резултатно отделяне на компонента на кръвната плазма, които има роля в борбата срещу туморите, и по-нататъиша цел е да се намерят подходящи групи от донори на такава кръв.

За постигане на целите, в първия етап са намерени поефективни почистващи процеси, при което се предполага, че ефективните компоненти са в липидно-чистата фракция на кръвната плазма. Признава се, че отделянето на липидно-чистите компоненти на кръвната плазма могат да бъдат извлечени по предпочитаем начин, ако плазмената фракция се обработи пърВо с органичен разтворител, след това се добави повърхностно-активно вещество, което е съставено от много финни зърна, и следва интензивно размесване на липидно-чистата фракция, която се свързва (прикрепва) към гранулите за да се отдели от течния компонент чрез центрофугиране, след това отделената фракция се довежда отново в разтвор.

Почистването ще бъде по-ефективно, ако етапите на разтваряне и отделяне се повторят като се използва втори органичен разтворител, последвани от повторно центрофугиране.

КоличестВото на поВърхностно-актиВното ВещестВо е около 0.5 % спрямо масата на плазмата и размера на негоВите

.) зърна е между около 2(Х) go 4(Х) nm. Предпочитани материали са например болус алба, активиран въглен или метилцелулоза.

Центрофугирането, за предпочитане, може да се осъществи при 15 (XX) g. Разтварянето се улеснява, ако следващото приложение на разтвора на органичния разтворител се съхрани за по-дълъг период при повишена температура с периодично разбъркване.

Отделянето на зърната от повърхностно-активно вещество от липидно-чистия компонент не е обективно необходимо, и следващото второ отделяне на зърната заедно със свързания липидно-чист плазмен компонент, освен това, може да доведе, например, до физиологичен разтвор.

Съгласно по-нататъшен начин на пречистване, липидночистия плазмен компонент се довежда до разтвор със слаб детергент, и чрез използване на по-нататъшно центрофугиране твърдият компонент може да бъде отделен.

Тъй като липидно-чистия продукт отделен по този начин и получен от донори които имат акутна левкемия се оказва значително по ефективен от продукта описан в гореспоменатата патентна заявка, се счита че главният аспект на целта на изобретението е, дали такъв противо-туморен компонент може да бъде открит само в акутно левкемична кръв, или той присъства също в кръвта на пациенти оздравели от рак.

Въпреки, че броят на донорите оздравели от рак е съществено по-висок от броя на пациентите които имат акутна левкемия, и количеството кръв което може да бъде получено от тях е по-малко ограничено, използване с широк медицински обсег не би могло да се очаква поради морални и легални ограничения споменати по-горе.

По-нататъшният подход за основното обективно решаване се ръководи от по-нататъшно изобретателско откритие. Начинът на това откритие е дошъл чрез изучаването на спонтанно заздравяващи тумори при животни. В случая на копитни животни, туморно заболяване причинено от ретро вирус е твърде специфично. При известни видове самото заболяване се проявява като тумор, и инфектираните животни умират, докато при други видове, главно при говеда (едър рогат добитък) самото заболяване не се проявява като тумор или като някакво намаляване на общото жизнено състояние на животните. Инфекцията може да бъде открита чрез присъствието на анти телата GP 51 в кръвта.

Има съвременно общо мнение на ветеринарната медицина, че групата едър рогат добитък би трябвало да бъде свободна от индивиди страдащи от левкоза. Този възглед се поддържа от мнението публикувано в Journal of Hungarian Veterinarians in 1922, 4^th issue, “The infection status of leucosis of cattle in the country and the possibilities of freeing the stock” , и това мнение е донесено от Ветеринарният Комитет на Унгарската Академия на Науките. Открито е, че размерът на левкозната инфекция приключва до 50 %. В по-нататъшна публикация на издание No 9, 1997 г. на същия журнал е включена студията на Dr. Telkes, Lajos “Freenig cattle from leucosis in Hungary” която набляга на значимостта на независимостта на породата от левкоза. Открито е, че размерът иа инфекцията е по-голям при по-големи ферми, и по времето на втората статия размерът на инфекцията е бил около 17 %.

Същността на откритието се простира на разпознаването, че кръвта на животните която има и признакасвободно да се бори с левкозата, по-специално липидно-чистата фракция от плазмата на тяхната кръв включваща тези компоненти, които се оказват ефективни при експериментите осъществени с кръвта на човешки донори. Това откритие беше последвано от голям брой експерименти, които потвърдиха тази хипотеза от няколко страни и осигуриха подкрепа за съществуването на инхибиторно въздействие срещу туморите като резултатно, както и като забележително, тъй като започва борбата срещу туморите.

Съществуването на ефекта беше потвърдено също чрез констатацията от подобни кръвни компоненти, получени от животни не страдащи от левкоза, които нямат такива ефекти.

Електрофорезно изследване на липидно-чиста кръвна плазма получена от човешки и животински донори потвърди съществуването на подобни фракции в два обхвата на молекулно тегло, и тези фракции са липсващи от плазмата получена от здрави донори. Първата фракция с молекулно тегло около 40000 спомената в следващото изложение като “волска 40” и втора фракция с молекулно тегло спадащо в обхвата между 300000 и 350000, спомената в следващото изложение като “волска 300” са отговорни за инхибиторния ефект срещу тумори.

I)

В познанието на решението съгласно изобретението, общата ревизия на необходимостта от освобождаване на групата едър рогат добитък от индивиди имащи левкоза изглежда благоразумна.

Фракциите волска 40 и волска 300 идентифицирани съгласно изобретението притежават отличен инхибиращ ефект срещу тумори, и в същото време откриването на тяхното присъствие подпомага установяването на диагнозата на туморите.

Сега изобретението ще бъде описано във връзка с примери, където споменаване ще бъде направено на придружаващите диаграми и експерименти. В диаграмите:

фиг. 1 е диаграма на оцеляване при третиране с 0.15 ml Bbo-f материал;

фиг. 2 е диаграма на оцеляване при 10 третирания с Bbo-f материал;

фиг. 3 е диаграма на оцеляване при 6 третирания с Bbo-b материал;

фиг. 4 е диаграма на оцеляване при 8 третирания с Bbo-b материал;

фиг. 5 е диаграма на оцеляване при 10 третирания с Bbo-b материал;

фиг. 6 е диаграма на оцеляване при третиране с 0.1 ml Bbo-b материал;

фиг. 7 е диаграма на оцеляване при третиране с 0.15 ml Bbo-b материал;

фиг. 8 показва телесното тегло на животните до

19-ия ден;

фиг. 9 е серии от колонни диаграми сумиращи резултатите от ферментни изпитания;

фиг. 10 показва данни за оцеляването при лечение последвано от имплантиране на колоректален тумор С₂₆;

фиг. 11 показва относителните туморни маси при лечението от фиг. 10;

фиг. 12 показва стойностите на 5’ нуклеотидаза в случая при лечението от фиг. 10;

фиг. 13 показва опитната диаграма на оцеляване в случая при лечение на МХТ карцином на гърдата;

фиг. 14 илюстрира относителните туморни маси в случая на лечението от фиг. 13;

фиг. 15 е версия на фиг. 14 в случая с по-нататъшни видове лечение;

фиг. 16 показва опитната диаграма на оцеляване в случая на лечение на L₁₂₁₀ лимфоидна левкемия;

фиг. 17 показва стойности на абсолютна туморна маса получена при лечението от фиг. 16; и фиг. 18 показва стойностите на 5 ’ нуклеотидаза в случая при лечението от фиг. 16.

Различни детайли от решението съгласно изобретението могат да бъдат научени вероятно от различните места на проведените експерименти. Без оглед на реда на значимост, първо се изисква описанието на метода за получаването на материала използван за експериментите.

Отделяне и получаване на липидно-чистия плазмен компонент у

От кръвта използвана като изходен материал, липидночистите плазмени компоненти се получават по многоетапен метод на разделяне. Предпочитаните етапи на разделяне са както следва:

Скоро след като бъде взета изходната кръв, тя се обработва с анти-коагулант, за предпочитане хепарин.

Отделянето на кръвните телца става чрез центрофугиране, за предпочитане при температура 4 °C и с ускорение 5000 g [g: означава ускорение при нормална гравитация]. В случай, че 'центрофугирането не става веднага следващото което става с кръвта е, че кръвта обработена с коагуланта може да бъде съхранена при ниска температура, за предпочитане при температурата на центрофугиране, най-много за 48 часа. Времетраенето на центрофугирането е най-малко около 10 минути. За по-нататъшното обработване се използва горната течност. Така получената плазма може да бъде охладена до температура -20 °C и може да бъде смесена с плазмите получени също така от различни донори. По-нататъшното обработване може да стане, когато е необходимо, с по-голямо количество плазма. По време на примерите описани в настоящото описание, плазмата получена от всеки специален донор не би трябвало да се смесва с тази получена от различни донори, и поради това всяка разлика се отразява отделно.

Като първи етап на отделянето на течните компоненти, плазмата се разрежда със същата маса на първия органичен разтворител, например, с алкохол с 96 % чистота, и така полученият разтвор се размесва.

Във вторият етап към разтвора се добавя повърхностно-активен материал (агент) в количество 0.5 % масови. Задачата на този повърхностно-активен материал е да свърже липидно-чистите компоненти на плазмата върху неговата повърхност. Повърхностно-активният материал може да бъде болус алба, активен въглен или метилцелулоза, и средния размер на зърното се простира за предпочитане между 200 и 400 пт. В случая на описаните примери повърхностно-активният материал е болус алба.

Плазмената смес се поддържа постоянно в суспендирано състояние чрез физична интервенция (размесване) при стайна температура в продължение на 6 часа, след това при температура 5 °C се инкубира в продължение на 10 до 12 часа. В периода на инкубиране течността се размесва, съответно през къси периоди, веднъж на всеки половин час.

След инкубирането сместа се ре-суспендира чрез размесване, и суспензията се центрофугира при същата температура 4-5 °C с ускорение 15000 g за период от 10 минути.

Повечето твърди вещества от центрофугата, свързани с частиците на повърхностно-активното вещество, се отделят за по-нататъшно обработване, и течната фаза се ликвидира. Добавя се втори органичен разтворител към отделената фаза в количество равно на масата на първия органичен разтворител, което в примерния случай е смес от алкохол и толуен, 50 % масови - 50 % масови. Обработването на така получената смес е идентично с това на обработването след първия разтворител. По време на този процес плазмената смес се поддържа постоянно в суспендирано

ΙΟ състояние чрез физична интервенция (чрез размесВане) В продължение на 6 часа при стайна температура, след тоВа се инкубира при 5 °C В продължение на 5 до 12 часа. В периода на инкубирането сместа се разбърква Веднъж на Всеки половин час за съответно къси периоди.

След инкубирането сместа се ресуспендира чрез разбъркване, и при същата температура от 5 °C суспензията се центрофугира в продължение на 10 минути с ускорение 15000 g.

От центрофугата се отделят твърдите компоненти свързани с частиците на повърхностно-активното вещество за понататъшно обработване, и течната фаза се ликвидира.

Твърдият компонент се разпределя по повърхността за да се образува тънък слой, след това какъвто и да е останал органичен разтворител се отделя в сушилня поставена под вакуум за два часа.

След това физиологичен разтвор с маса равна на плазмената маса се добавя към отделената утайка, и материалът се ресуспендира чрез размесВане. Така получените плазмени препарати ще бъдат отбелязани В следВащата част на описанието с буквата “Ь” което се отнася за инициала на повърхностно-активния материал който е болус алба.

При получаването се поддържа, относително порафиниран алтернативен плазмен препарат като повърхностноактивният материал се отделя по такъв начин, че тъканно благоприятният детергент се добавя към сместа “Ь” която е способна да разтвори плазмения препарат. В примерния случай този детергент е 0.01 % масови натриев лаурил сулфат. Заради получаването на подходяща суспензия, материалът се добавя заедно с детергента, освен това се инкубира при стайна температура 6 часа при непрекъснато разбъркване, след това се съхранява в хладилник в продължение на 8 до 12 часа. Материалът който образува утайка по време на инкубирането се ресуспендира, след това в охладено състояние се центрофугира с ускорение 15000 g. Утайката се ликвидира, и горната течност включваща полезния материал, ще бъде отбелязана в следващата част на описанието с буквата “f” за разлика от материала “Ь” и ще означава че този материал е рафиниран.

За улесняване, експериментите се извършват при подхранване на мишките с два вида продукти, съответно в дози от 1 ml, в същото време те се маркират и съхраняват в замразено състояние.

Продуктите и условията за тяхното получаване са стерилни, затова материалите са асептични и годни за парентерални приложения.

I. Експерименти с имплантиране на сарком S 180

Всички тези експерименти се извършват с еднакъв вид женски мишки BDF] със средно тегло 25 g. Както в изследваните, така и в позитивните контролни животни сарком S 180 се трансплантира по подкожен начин. Условията на експериментите от гледна точка на вида на животните, вида на имплантирания сарком и начина на имплантиране са еднакви с тези описани в по-рано публикуваната международна патентна заявка. Всяка експериментална група включва най-малко пет мишки, и публикуваните данни са средни за мишките свързани в група. Мишките са разпределени съответно в подходящи групи с номера и те имат индивидуални номера.

Експеримент 1

От кръвта на пациент страдащ от акутна левкемия се приготвя плазмен препарат вид “Ь”, и в експерименталната група всяка мишка ^получава подкожно 0.1 ml от този препарат всеки ден, всичко на всичко осем пъти.

В позитивната контролна група средната продължителност на живот е 19.6 дни, и в експерименталната група е 23.5 дни. Това е 20 % увеличение което може да бъде разглеждано като значително подобрение. В гореспоменатата международна заявка във връзка със същия вид тумор най-добрият препарат може да даде резултат 5 % увеличение на оцеляването, което е все още под значимия праг. Затова подходящото отделяне на липидно-чист плазмен компонент е много съществено.

Експеримент 2

Този експеримент включва резултатите от шест независими експерименти, и се базира на предположението, че материалът ефективен срещу туморите за който се предполага, че включва липидно-чист компонент на плазмата също присъства в кръвта на пациенти оздравели от рак. Такива хора са подбрани като донори, които са живи най-малко 10 и най-много 27 години omkakmo техния тумор е бил открит, затова те могат да бъдат разглеждани като оздравели. Диагностицираният туморен вид на донорите е от серията обхващаща лариикс, черва, гърди, лимфоидна левкемия, тестикули и простата какпю и белодробни тумори.

Плазменият препарат вид “Ь” е получен в случая от Всичките шест донора, и съответно групите от мишки са обработени с него. Средното време на оцеляване на контролната група отново е 19.6 дни, обаче, средното на обработените групи варира между 25.5 и 27.3 дни, това е само малка разлика между обработените групи. Така оцеляването съставлява подобрение между 30 % и 40 % спрямо контролната група, което е много значително.

Като по-нататъшен експеримент, плазменият продукт вид “Ь” се получава от смес на равни части плазми получени от всичките шест донори след отделяне на частиците. Този продукт осигурява увеличаване на оцеляването с 38 % отнесено спрямо контролната група.

Така тези експерименти потвърждават хипотезата съгласно която липидно-чист плазмен компонент от пациенти оздравели от рак включва ефективен инхибиращ тумори материал. Освен това също се доказва, че съществуването на такъв материал не зависи (най-малко в случая на изследвания туморен Вид) от фактически съществуващия внд на тумора, затова сместа е еднакво резултатна.

Експеримент 3

Едър рогат добитък (говеда) се избират като донори,

1-1 npu koumo изследването на кръвта потвърждава съществуването на левкоза в едрия рогат добитък. От кръвта на такива донори се получават плазмените продукти вид “b” и “f”. По същия начин, двата вида плазмени продукти се приготвят от кръвта на едър рогат добитък, чиято кръв не показва присъствие на левкоза.

Изпитанията се осъществяват в няколко версии, при което променливия първи параметър е броят на приложените обработки всеки ден, вторият параметър е количеството на доза което се променя между 0.1 и 0.15 ml, и третият параметър е чистотата на продукта т.е. един от двата вида “Ь” или “f”. Предпочитаният обхват на изследване на тези параметри се определя чрез пилотни експерименти предшестващи актуалните експерименти, докато се открият съответни оптимуми относно двата показателя, дозата и броя на обработките.

Продуктът получен от кръвта на едър рогат добитък, който има левкоза задоволява критерия за голяма скала на приложимост, тъй като не се ограничава от гледна точка на достъпността на донори и от гледна точка на етични и морални съображения. Данните за оцеляване съществено надхвърлят иначе благоприятните данни на препаратите получени от човешка кръв. Това е причината за подробно описание на резултатие от тези експерименти.

По време на експериментите са изследвани средното тегло на животните, средното време на оцеляване, освен това при предварително определени фази на експериментите, кръвните проби от 1 ml се вземат съответно от мишките на всяка група, и в пробите се изследва множество от туморни маркери. Мишките от koumo се Вземат кръвните проби, се отделят от следващите изследвания, тъй като те не могат да оцелеят давайки такова количество кръв.

Данни отнасящи до времето на оцеляване

Резултатите отнасящи се до Времето на оцеляване

могат да бъдат разделени на две групи, именно, дали обработването става с продукт вид “Ь” или “f”. Източникът от едър рогат добитък който има левкоза се означава със съкращението “ВЬо”, затова обработването на първата главна група стаВа с материалът Bbo-b и тоВа на Втората глаВна група стаВа с материала Bbo-f.

Дните се броят от имплантирането на тумора. Всяка криВа показана на фигури 1 до 7 се отнася до средното ниво на група Включваща най-малко пет мишки.

фигури 1 и 2 показват диаграмите на оцеляване на групи

обработени с материала Bbo-f. Мишките в положителната контролна група не получават каквато и да е обработка следВаща имплантирането, отделно от нормално хранене, мишките В обработената група се обработват Всеки Втори ден с материала Bbo-f който има определена маса. При Всяко обработване на групите показани на фиг. 1 дозата е 0.15 ml. Двете обработени групи се различават от всяка друга по броя на обработките. В първата група се прилагат 8 обработки, докато във втората броят на обработките е 10, след това мишките не получават каквато и да е по-нататъшна обработка. В случая на групата получила 10 обработки може да бъде Видяно че следВа прекратяване на обработката, т.е. след 20-я ден темпото на смъртност Внезапно се i6 увеличава. Това внезапно увеличаване може също да бъде видяно в групата която е получила 8 обработки, но интересно е да се види, че увеличението става по-късно и с незначителен наклон. Средното относително време на оцеляване на контролната група е 19.6 дни, при групата която е получила 8 обработки е 24.8 дни, докато при групата, която е получила 10 обработки е 23.2 дни.

Във всяка от групите показани на фиг.2 обработката става 10 пъти на всеки втори ден. Разликата се изразява в дозата. Мишките в първата група получават доза 0.15 ml при всяко

С* обработване,* докато тези от втората група се обработват с доза

0.1 ml. Разликата е много очевидна когато се намали дозата. Времето на оцеляване се увеличава на 30 дни, което съставлява 153 % подобрение отнесено спрямо положителната контролна група.

Резултатите от обработките с материала Bbo-b са показани в 2 групи на фигурите. В случая на фигури 3 до 5 променящият се параметър е дозата. В случая показан на фиг. 3 обработването става 6 пъти, и може да бъде видяно, че времето на оцеляване силно зависи от използваната доза, по-ниската доза е малко по-добра. Времето на оцеляване, обаче, е съществено по-добро при материала Bbo-f, докато средното време на оцеляване е 37 дни, което е почти 189 % подобрение отнесено спрямо положителната контрола. Зависимостта на времето на оцеляване от дозата ще бъде по-очевидна когато се разгледа фиг. 4. Тук броят на обработките е 8. Под въздействието на дозата 0.15 ml времето на оцеляване намалява в сравнение със стойността получена при 6 обработки, и това може да бъде само последица от прекомерна доза. Обратно, дозата 0.1 ml изглежда оптимална с 8 обработки, тъй като средното време на оцеляване се увеличава съществено, и на

59-я ден диаграмата Вече не достига стойност 50 %. При тоВа оцеляВането се уВеличаВа над 300 %, което е спорна благоприятна цифра.

фиг. 5 показВа средното Време на оцеляване в случая на мишки получили 10 обработки. Тук изненадва свойството на дозата 0.15 ml, понеже в тази група оцеляването намалява внезапно но общото равнище е по-добро отколкото при по-ранната група с подобна обработка. Благодарение на малкия брой мишки разликите могат да дойдат повече от по-малко благоприятното поведение на £ една или две «мишки. Внезапното увеличаване на смъртността В случая с доза 0.1 ml след 33-я ден също може да бъде последица от прекомерна доза.

Във фигури 6 и 7 Вариращият параметър е броя на обработките. Сравнението на двете фигури тук показва също приложение на 8 обработки с доза 0.1 ml като оптимално. От фигура 7 резултатът може да бъде неблагоприятен както В случая на по-висока доза подобрението се увеличава с намаляване броя на обработките, което при това означава че дозата е също висока.

Оздравяването на тумора и средното тегло на животните

Опитното подобрение в състоянието на животните от обработените групи може да бъде разпознато не само на базата на средното време за оцеляване. При животните с начално тегло 25 g се образува голям тумор който тежи 6 до 8 g т.е. близо една трета от пълното тегло на животното. При животните обработени осем пъти с доза 0.1 mi от материала Bbo-b в края на цикъла на обработването става добро разпознаване на състоянието is на тумора, саркомът се отваря и изпуска мек (кашкав) материал. Този материал включва мъртви туморни клетки. “Подутината” на животните изчезва и те започват да нарастват на тегло.

фигура 8 показва стойността на средното телесно тегло на животните през пърВите 19 дни относно групите Bbo-b и Bbo-f, двете получили 8 обработки и позитивната контролна група. Диаграмите са в добро съответствие с горе описаното състояние съобщено специално в случая на обработването с материала Bbo-b. Недостатъкът на диаграмата се състои в това, че тя не показва отделно масата на тумора. Не може да се получи точна стойност за теглото на тумора затова пълното телесно тегло също включва теглото на тумора. В обработената група е типично началното намаляване последвано от регенеративно увеличаване, в случая на увеличаване на теглото в позитивната контролна група, то се причинява по променлив начин главно от увеличението на тумора.

От горните експерименти единствено изглеждащите найдобри се повтарят с такъв материал, който е получен от здрав едър рогат добитък, който няма левкоза. Резултатите не се различават значително от тези получени при позитивната контролна група, и така има потвърждение, че само материалът получен от кръвта на едър рогат добитък който има левкоза е ефективен.

Резултати от изследванията на ензимен туморен маркер

За изследването на метаболитни промени съпътстващи злокачествени процеси има няколко ензимни туморни маркери, които са значително определени в клиничната практика, и от тези методи се избира броя на видовете които могат да бъдат използвани за рутинни изследвания. При подбора на методите би трябвало да се вземе предвид, че злокачествените процеси се съпътстват и често се поддържат от комплексни биохимични смущения. Затова се очаква поради тези съображения, че изглежда необходимо да се извършат анализи на метаболизма на нуклеиновата киселина (алкален (основен) серум и киселинна дезоксирибонуклеазна активност, 5’-нуклеотидазна активност); на полиаминен метаболизъм (аргиназна активност);

на функцията на чернодробна митохондрия (орнитил карбамоил трансферазна активност); на глюкорегенерация (фосфохексозна изомеразна активност); и за идентифициране на процеси свързани с костите (костно-специфична алкална фосфатазна активност). Промените в активността на ензимите от направения списък следват метаболитните промени съпътстващи и поддържащи злокачествените процеси и резултатите от приложените терапии.

По време на експериментите кръвните проби се вземат от мишките на 8-я, 15-я и 19-я ден след имплантирането на тумора. Данните са сумирани в таблица 1. Данните се отнасят до средната стойност съответно от пет мишки, всички изследвани отделно.

у'Чйа?

Значението на определените колони в таблицата е: β-Glyc: не специфична фосфатаза, β-глицерофосфат; тази стойност се изважда от стойността на другите фосфатазни стойности по такъв начин, че те да могат да бъдат интерпретирани като туморни маркери;

5-АМР: 5’-нуклеотидазна ензимна фамилия, по-специално: 5-аденозин-5монофосфат

2υ

Aik. F: алкална фосфатаза

5’-ТМР: 5’-тимидин-5-монофосфат

PDE: фосфодиестераза

SDNaz: кисела дезоксирибонуклеаза (кисела DNAse)

Σ.5’-Νϋ: обща стойност на цялата 5’-нуклеотидаза

Таблица 1: Въздействия на плазмен серум Bbo-b и Bbo-f Върху мишки, които имат сарком S-180

Групи животни β-Glyc	5-АМР	Alk.F.	5’-'ГМР	PDE	SDNaz	Σ.5’-Νϋ
246-251	‘ 2,12	5,45	14,7	4,67	31,2		45,7
271-275	5,76	7,12	23,5	7,89	44,6	100,7	53,4
276-280	6,78	8,92	19,9	10,78	54,6	98,3	55,67
281-290	2,67	10,23	23,9	13,6	55,9	123,1	67,3
385-390	4,56	16,8	32,8	11,7	67,2	98,9	72,4
391-395	3,56	19,9	34,7	17,3	66,8	134	77,9
396-400	2,45	21,8	33,5	20,76	67,9	145	78,5
41-50	3,33	21,3	32,78	19,43	86,8	359,1	97,8
101-105	2	24,7	21,72	21,45	78,9	189,1	69,9
151-155	1,56	29,4	31,32	13,42	65,7	201,6	76,1
106-110	1,15	3,67	10,39	5,67	43,2	35,2	35,2
56-60	2,91	3,4	13,6	5,8	36,8	40,8	40,3
51-55	-0,03	3,4	22,31	6,2	41,3	32,9	42,1

В таблицата могат да бъдат Видяни три различни групи.

Последната група се отнася до контролната с мишки които нямат имплантиран тумор, и групата Включваща мишки 51-55 които са изследвани на 8-я ден, мишките 56-60 се изследвани на 15-я ден и мишките 106-110 са изследвани на 19-я ден.

Средната група се отнася до позитивната контролна група с мишки 151-155 изследвани на 8-я ден, мишки 101-105 на 15-я ден и мишки 41-50 на 19-я ден.

Първата група може да бъде разделена на три подгрупи, едни започващи с числото 2 получават обработка с материала Bbo-b и други започващи с числото 3 се обработват с материала Bbo-f. В подгрупата Bbo-b изследването на мишките 281-290 става на 8-я ден, мишките 276-280 на 15-я ден, мишките 271-275 на 19-я ден и последното изследване на мишки 246-250 става много по-късно във връзка с оцеляването по същество, на 45-я ден.

Във втората подгрупа мишки обработени с материала Bbo-f разпределението съобразно деня на изследването е: 396-400 на 8-я ден; 391-395 на 15-я ден; 385-390 на 19-я ден.

Резултатите са сумирани под формата на колонни диаграми на фиг. 9, в която групите от мишки показани на хоризонталната ос са свързани взаимно с данните върху вертикалната ос по-горе, където височината на колоните изразява сумата от данните. На хоризонталната ос групите от мишки са показани отделно, и във всяка група последователно от ляво на дясно следва порядъка на увеличаване на данните от изследванията.

Трите леви колони са св|>рзани с контролната група, средните три колони са свързани с позитивната контролна група, u първите три колони на седемте десни колони спадат към подгрупата Bbo-f и последните четири колони спадат към под-групата Bbo-b.

В контролната група данните естествено нямат промени във времето, тяхното изменение е в естествен порядък. В случая на позитивната контролна група всички компоненти са с максимално високо съдържание, и в периода на умиране (последна колона) те имат по-нататъшно увеличение.

Обратно, в двете обработени под-групи началните стойности са вече по-малки от данните на позитивната контролна група и те по-нататък намаляват във времето. Материалът Bbo-b осигурява в съответствие с благоприятните данни на оцеляване съществено по-добри резултати от обработването с материала Bbo-f. Намаляването продължава след 19-я ден, и в края на експеримента данните са близки до нормалните стойности на контролната група.

Експеримент 4

Като се прави базиране на благоприятните резултати получени по време на предишните експерименти, се изследва кои компоненти от липидно-чистата плазма са отговорни за ефекта. Тъй като имаме кръв от здрави хора, кръв от пациенти с акутна левкемия, човешка кръв от пациенти оздравели от рак, по нататък кръв се взема от едър рогат добитък с и без левкоза, препаратът вид “Ь” се прави от всяка от изброената кръв и се гарантира от съответни електрофорезни изследвания. Изходният материал за изследванията се нанася върху повърхността на използвания полиакриламиден гел, и под Въздействието на електрофорезна обработка компонентите на материла се отделят в сътветствие с порядъка на техните молекулни тегла.

Фракциите се вземат от кръв която се оказва нерезултатна от гледна точка на лечението на тумора, т.е. нормална човешка кръв и кръв взета от едър рогат добитък без левкоза се сравнява с фракции получени от видове кръв ефективна от гледна точка на лечението на тумора. Най-очевидната разлика се научава от опита с фракциите от кръв взета от едър рогат добитък който има левкоза, и се намира в присъствието на фракция с молекулно тегло около 40000 и по-нататък фракция с молекулно тегло между 300000 и 35(ХХХ). Тези две фракции заедно представляват 8 до 12 % масови от пробата. Фракциите за кръвния препарат взети от донори които са оздравели от рак включват и двата от тези компоненти, обаче, присъствието на фракцията с молекулно тегло около 40000 е по-очевидна, и количеството на фракциите е по същество по-малко, около 2-3 %. Между фракциите на препарата взети от акутно - левкемична кръв компонентът с молекулно тегло 40000 присъства само като следи, в другите фракции е не откриваем.

Заради идентифицирането на казаните две фракции, едната с молекулно тегло около 40000 ще бъде споменавана като “волска 40” и другата фракция между З(ХХХХ) и 350000 ще бъде обозначена като “волска 300” . Методът описан тук е достатъчен за несъмнено идентифициране на тези две фракции. Структурното идентифициране на тези фракции е направено по обикновен начин.

?Α

В науката за тези показани резултати може да бъде заявено със значителни основания, че присъствието на материалите волска 40 и волска 300 е отговорно за показаните ефекти.

Експеримент с имплантирането на колоректален тумор С,₆

Експериментите се изършват с първо поколение вътрешно отгледани мъжки мишки Balb/c. Мястото на произход на мишките е TNO Institute, Rijkswijk, The Netherlands, тяхното място на размножение е National Institute of Oncology (Hungary), Department of Experimental Pharmacology.

Условията на отглеждане на животните са: кафези от макролонов материал, температура 20-22 °C, относителна влажност 45-55 %, отглеждането на тъмно и светло се променя на 12-часови периоди. Храненето става със стандартна качествена храна за мишки, която може да бъде стерилизирана в автоклав (вид: Altromin, Germany), постелята се прави от дървени стърготини. Хигиенното ниво на хранене е в съответствие с предписаните условия SPF (Specified Pathogen Free). Грижата и отглеждането на животните става в съответствие с Helsinki declaration on “Guiding Principles for the Care and Use of Animals”.

Чревният аденокарцином Colon-26 е взет от SRI, Birmingham, Alabama, U.S.A. Начинът на трансплантация е: парче от 20 mg от поддържан тумор се имплантира подкожно в междулопатъчната област.

По време на експериментите животните се разделят в групи по десет мишки, животните в позитивната контролна група не получават каквато и да било обработка следваща имплантацията. В обработваните групи обработката става с предварително описания материал. Този материал беше споменат по време на документирането на експериментите също като АВВ-7. Използвани са опитите получени по време на експериментните серии I, и обработването се прилага веднъж на ден по същото време, между ден 1 и 9, всичко на всичко осем пъти. Разликите между съответните групи са в начина на обработване и в количеството на прилагания експериментален материал.

Данните за оцеляване са сумирани във фигура 10. В

случая с позитивната контролна група 100 % време за оцеляване е дни. В първата група обработването се извършва интраперитониално (Ipl) с доза от 0.1 ml, във втората група начинът на прилагане е същия но дозата е 0.15 ml, и е опитано прилагането на материала през устата (per os). Тук човекът който храни животните използва подходяща доза за да доведе материала директно в стомаха на животните. В първата per os (ро 1) група дозата е 0.2 ml материал и във втората per os (ро 2) група дозата е 0.3 ml. По-нататък също се обработва група sc, където материалът се прилага по субкутанен (под кожата) начин в количество 0.1 ml. Данните за оцеляване показват средни стойности за групи от десет мишки. От фигурата се вижда, че в случая на всяка обработена група става съществено подобрение, найефективните две обработки са ip прилагането при 0.1 ml и ро обработването при 0.2 ml материал.

Експериментите се повтарят с по-нататъшни групи от десет мишки, и за измерване на туморната маса туморите се отделят когато животните достигнат тяхните умиращи състояния

?.(>

(т.е. директно предшестваща смърт) и туморните маси се измерват.

фиг. 11 показва резултатите от тези експерименти. Горе са дадени стойностите на колоните на свързаните поверителни нива, които във всички случаи са по-малки от 0.05 т.е. данните са много реални.

В по-нататъшни групи от десет мишки обработени по подобен начин, 5’-нуклеотидазните активности се определят върху проби взети на 8-я, 16-я дни от имплантирането на тумора, както в умиращо състояние така и в случай от експерименталните серии I. Тези данни са показани на фиг. 12. Активността се увеличава от началото с малка стойност до 16 ден до много висока стойност, когато се достигне умиращото състояние, активността по същество намалява спрямо стойностите получени при позитивната контролна група.

III. Експерименти с имплантиране на тумор на гърдата МХТ

При съблюдаване на условията описани в експеримент II женски мишки BDE, с описания произход се използват за изследване на ефектите от обработване с материала Bbo-b в случая с тумор на гърдата МХТ. Мястото на произхода на туморните клетки за трансплантиране е MASON Res. Inst. USA. Малко парче с обем 1 тт³ от потвърдения тумор се имплантира подкожно в междулопатъчната област.

Образуват се групи от животни от по десет мишки както при случая с експеримент II, и във всяка група индивидите се обработват еднакво. Обработването с материала Bbo-b се извършва точно както в случая с експеримент П, т.е. веднъж по същото време всеки ден в продължение на 8 дни. В случая при позитивен контрол средното време на оцеляване е 24 дни. фигура 13 показва времето за оцеляване в процеса на различно обработените групи. Може да се види че различните групи се обработват по идентичен начин, например, с доза 0.15 ml групите ip 1 и ip 2 се обработват еднакво интраперитонеално, или групите ро 2 и ро 3 се обработват с доза 0.3 ml per os. В тази туморна група увеличението на времето на оцеляване е около 40 %, което е най-високо в случая при обработванията per os.

Изследванията на туморна та маса се извършват върху животни в умиращо състояние както е описано в експеримент II, и резултатите са сумирани на фигури 14 и 15. Числата отбелязани върху хоризонталната ос се отнасят до сериините номера на мишките в специалната група, те нямат особенно значение. Вертикалните секции отбелязани в колоните на диаграмите се отнасят до отклоненията в сродната група. Намаляването на туморната маса тук е най-значително също при обработвания прилагани per os.

Изследването на 5’-нуклеотидаза се извършва върху експерименталните животни показали съществено намаляване в обработените групи, анализът на пълните експериментални данни на такива изследвания все още не са завършили по същество във времето, затова те не могат да бъдат сумирани под формата на таблица.

IV. Експерименти с имплантирана акутна L₁₂₁₀ лимфоидна левкемия

Въздействията на материала Bbo-b се изследват в случая наакутна L₁₂₁₀ лимфоидна левкемия. Групите от по десет мишки се образуват от мъжки мишки BDF_t отглеждани както е описано във връзка с експерименти II и III. От асцитната течност на мишките DBA/2, в която се поддържа акутна L₁₂₁₀ лимфоидна левкемия и от физиологичния разтвор се прави разтвор на течността, от който 0.1 ml включва 10⁶ клетки. От тази течност 0.1 ml се инжектира по интраперитониален начин във всяка експериментална мишка, и в обработваните групи третиранията се извършват веднъж на ден в продължение на 8 дни, точно както в случая при експерименти II и III.

фиг. 16 показва данните за оцеляване. Средното време за оцеляване в позитивната контролна група е 9.9 дни. Това може да се види на фиг. 16 в която има много съществена разлика във времето за оцеляване в зависимост от това как се прилага материала. В отговор на интраперитониалното и подкожно приложения времето на оцеляване е 170 %, и в противоположност на това приложението per os на доза 0.2 ml дава като резултат 320 % време за оцеляване, но в тази обработвана група разликите между индивидуалните животни са големи и някои от тях са напълно оздравели. При този туморен вид няма начин за определяне на относителната туморна маса, и асцитната течност събрана в перитонеалната кухина заедно с туморите присъства в мезентериалната съставена абсолютна туморна маса. фиг. 17 показва измереното тегло на така определената абсолютна туморна маса в умиращата група. Животните които са живи на 30-я ден принадлежат също към тези групи. Може да се види на фиг. 17, че в три от обработените групи не е открита измерваема туморна маса.

фиг. 18 показва промяната на активността на 5нуклеотидазата на 5-я и 8-я ден както и в умиращо състояние. От диаграмите може да се види, че съществено подобряване става във всички обработени групи, и в някои обработени групи се получават нормални стойности.

В по-нататъшни групи от мишки, които участват в експериментите I go IV с няколко различни данни, се извършват хистологични изследвания. Изследванията включват хистологичен анализ на 17 различни органи. Базирайки се на такива хистологични изследвания, може да се изложи, че метастази не се образуват във всеки от изследвания туморен вид. В случая на позитивните контролни групи, обаче, беше открита добре забележима метастазна активност. Има открити за всеки случай от индивидуалните туморни видове както следва: в случая на сарком S₁₈₀ в лимфатичните жлези и черния дроб; в случая на С₂6 В черния дроб и мезентериалните лимфатични жлези; в случая на тумора МХТ в черния дроб; и в случая на Ι-₁₂ιο В костния мозък.

Получените по-горе експериментални резултати , като опитни значителни подобрения, вероятно биха могли да станат също при туморни видоВе, които не се изследвани тук. Изследвания покриващи всички видове тумори ще бъдат необходими поради тяхната очебиеща значимост. Въпреки това, горните експерименти са достатъчно обширни за да се поддържа съществуването на главния ефект.

Решението съгласно изобретението може да се използва ефективно не само за лечение на тумори, но за продължаване на грижата и предотвратяване образуването на метастази.

Благодарение на факта, че двете отделни фракции, които са отговорни за ефекта с изключение поне на фракция волска 40, присъстват в кръвта на пациенти с тумор, изследванията на тези фракции могат да бъдат използвани за диагнозата на тумори.

Резултатите получени с препарата съгласно изобретението и неговия диагностичен потенциал осигуряват надежди относно ефективното лечение и диагноза на тумори. Наличността на едър рогат добитък с левкоза е реална по целия свят, което позволява едро-мащабно производство. Допълнително, има възможност за откриване на синтетичен начин за получаване на материалите волска 40 и волска 300, понеже при изследването на тези материали може да се очаква да се започне такова производство.

ФАРМАЦЕВТИЧЕН ПРЕПАРАТ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ТУМОРИ И

МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ. НЛ ЛИПИДНО-ЧИСТА ФРАКЦИЯ ОТ

КРЪВНА ПЛАЗМА

Горе-споменатата патентна заявка е направена вероятно поради това, че кръвта на пациентите страдащи от акутна левкемия включва точно неопределен компонент, който обикновенно има противо-туморен ефект.

Целта на изобретението е да се осигури нов фармацевтичен препарат, който може да бъде използван за терапия на тумори, включвайки целта за резултатно отделяне на компонента на кръвната плазма, който има роля в борбата срещу туморите, и по-нататъшна цел е да се намерят подходящи групи от донори на такава кръв.

Количеството на повърхностно-активното вещество е около 0.5 % спрямо масата на плазмата и размера на неговите зърна е между около 200 до 400 mn. Предпочитани материали са например болус алба, активиран въглен или метилцелулоза.

По-нататъшният подход за осноВното обективно решаване се ръководи от по-иатагаьшно изобретателско откритие. Начинът на това откритие е дошъл чрез изучаването на спонтанно заздравяващи тумори при животни. В случая на копитни животни, туморно заболяване причинено от ретро вирус е твърде специфично. При известни видове самото заболяване се проявява като тумор, и инфектираните животни умират, докато при други видове, главно при говеда (едър рогат добитък) самото заболяване не се проявява като тумор или като някакво намаляване на общото жизнено състояние на животните. Инфекцията може да бъде открита чрез присъствието на анти телата GP 51 в кръвта.

Има съвременно общо мнение на ветеринарната медицина, че групата едър рогат добитък би трябвало да бъде свободна от индивиди страдащи от левкоза. Този Възглед се поддържа от мнението публикувано в Journal of Hungarian Veterinarians in 1922, 4^th issue, “The infection status of leucosis of cattle in the country and the possibilities of freeing the stock” , и това мнение е донесено от Ветеринарният Комитет на Унгарската Академия на Науките. Открито е, че размерът на левкозната инфекция приключва до 50 %. В по-нататъшна публикация на издание No 9, 1997 г. на същия журнал е включена студията на Dr. Telkes, Lajos “Freenig cattle from leucosis in Hungary” която набляга на значимостта на независимостта па породата от левкоза. Открито е, че размерът на инфекцията е по-голям при по-големи ферми, и по Времето на Втората статия размерът на инфекцията е бил около 17 %.

19-ия ден;

фиг. 16 показва опитната диаграма на оцеляване в случая на лечение на L_12W лимфоидна левкемия;

фиг. 17 показва стойности на абсолютна туморна маса получена при лечението от фиг. 16; и фиг. 18 показва стойностите на 5’ нуклеотидаза в случая при лечението от фиг. 16.

Отделяне и получаване на липидно-чистия плазмен компонент

Отделянето на кръвните телца става чрез центрофугиране, за предпочитане при температура 4 °C и с ускорение 5000 g [g: означава ускорение при нормална гравитация]. В случай, че «центрофугирането не става веднага следващото което става с кръвта е, че кръвта обработена с коагуланта може да бъде съхранена при ниска температура, за предпочитане при температурата на центрофугиране, най-много за 48 часа. Времетраенето на центрофугирането е най-малко около 10 минути. За по-нататъшното обработване се използва горната течност. Така получената плазма може да бъде охладена до температура -20 °C и може да бъде смесена с плазмите получени също така от различни донори. По-нататъшното обработване може да стане, когато е необходимо, с по-голямо количество плазма. По време на примерите описани в настоящото описание, плазмата получена от всеки специален донор не би трябвало да се смесва с тази получена от различни донори, и поради това всяка разлика се отразява отделно.

ο

С Плазмената смес се поддържа постоянно в суспендирано състояние чрез физична интервенция (размесване) при стайна температура в продължение на 6 часа, след това при температура 5 °C се инкубира в продължение на 10 до 12 часа. В периода на инкубиране течността се размесва, съответно през къси периоди, веднъж на всеки половин час.

Чг Повечето твърди вещества от центрофугата, свързани с частиците на повърхностно-активното вещество, се отделят за по-нататъшно обработване, и течната фаза се ликвидира. Добавя се втори органичен разтворител към отделената фаза в количество равно на масата на първия органичен разтворител, което в примерния случай е смес от алкохол и толуен, 50 % масови - 50 % масови. Обработването на така получената смес е идентично с това на обработването след първия разтворител. По време на този процес плазмената смес се поддържа постоянно в суспендирано състояние чрез физична интервенция (чрез размесВане) В продължение на 6 часа при стайна температура, след тоВа се инкубира при 5 °C В продължение на 5 до 12 часа. В периода на инкубирането сместа се разбърква веднъж на Всеки половин час за съответно къси периоди.

При получаването се поддържа, относително порафиниран алтернативен плазмен препарат като повърхностноактивният материал се отделя по такъв начин, че тъканно благоприятният детергент се добавя към сместа “Ь” която е ΐ

способна да разтвори плазмения препарат. В примерния случай този детергент е 0.01 % масови натриев ,\аурил сулфат. Заради получаването на подходяща суспензия, материалът се добавя заедно с детергента, освен това се инкубира при стайна температура 6 часа при непрекъснато разбъркване, след това се съхранява в хладилник в продължение на 8 до 12 часа. Материалът който образува утайка по време на инкубирането се ресуспендира, след това в охладено състояние се центрофугира с ускорение 15000 g. Утайката се ликвидира, и горната течност включваща полезния материал, ще бъде отбелязана в следващата част на описанието с буквата “f” за разлика от материала “Ь” и ще означава че този материал е рафиниран.

I. Експерименти с имплантиране на сарком S 180

Експеримент 1

От кръвта на пациент страдащ от акутна левкемия се приготвя плазмен препарат вид “Ь”, и в експерименталната група всяка мишка «получава подкожно 0.1 ml от този препарат всеки ден, всичко на всичко осем пъти.

Експеримент 2

Този експеримент включва резултатите от шест независими експерименти, и се базира иа предположението, че материалът ефективен срещу туморите за който се предполага, че включва липидно-чист компонент на плазмата също присъства в кръвта на пациенти оздравели от рак. Такива хора са подбрани като донори, които са живи най-малко 10 и най-много 27 години i3 omkakmo техния тумор е бил открит, затова те могат да бъдат разглеждани като оздравели. Диагностицираният туморен вид на донорите е от серията обхващаща ларинкс, черва, гърди, лимфоидна левкемия, тестикули и простата както и белодробни тумори.

Така тези експерименти потвърждават хипотезата съгласно която липидно-чист плазмен компонент от пациенти оздравели от рак включва ефективен инхибиращ тумори материал. Освен това също се доказва, че съществуването на такъв материал не зависи (най-малко в случая на изследвания туморен вид) от фактически съществуващия вид на тумора, затова сместа е еднакво резултатна.

Експеримент 3

Едър рогат добитък (говеда) се избират като донори, npu koumo изследването на кръвта потвърждава съществуването на левкоза в едрия рогат добитък'. От кръвта на такива донори се получават плазмените продукти вид “в” и “f”. По същия начин, двата вида плазмени продукти се приготвят от кръвта на едър рогат добитък, чиято кръв не показва присъствие на левкоза.

Изпитанията се осъществяват в няколко версии, при което променливия първи параметър е броят на приложените обработки всеки ден, вторият параметър е количеството на доза което се променя между 0.1 и 0.15 ml, и третият параметър е чистотата на продукта т.е един от двата вида “Ь” или “f”. Предпочитаният обхват на изследване на тези параметри се определя чрез пилотни експерименти предшестващи актуалните експерименти, докато се открият съответни оптимуми относно двата показателя, дозата и броя на обработките.

Продуктът получен от кръвта на едър рогат добитък, който има левкоза задоволява критерия за голяма скала на приложимост, тъй като не се ограничава от гледна точка на достъпността на донори и от гледна точка на етични и морални съображения. Данните за оцеляване съществено надхвърлят иначе ^w благоприятните данни на препаратите получени от човешка кръв.

Това е причината за подробно описание на резултатие от тези експерименти.

По време на експериментите са изследвани средното тегло на животните, средното време на оцеляване, освен това при предварително определени фази на експериментите, кръвните проби от 1 ml се вземат съответно от мишките на всяка група, и в пробите се изследва множество от туморни маркери. Мишките от koumo се вземаш кръвните проби, се отделят от следващите изследвания, тъй като те не могат да оцелеят давайки такова количество кръв.

Данни отнасящи до времето на оцеляване

Резултатите отнасящи се до времето на оцеляване могат да бъдат разделени на две групи, именно, дали обработването става с продукт вид “Ь” или “f”. Източникът от едър рогат добитък който има левкоза се означава със съкращението “ВЬо”, затова обработването на първата главна група става с материалът Bbo-b и това на втората главна група става с материала Bbo-f.

фигури 1 и 2 показват диаграмите на оцеляване на групи обработени с материала Bbo-f. Мишките в положителната контролна група не получават каквато и да е обработка следваща имплантирането, отделно от нормално хранене, мишките в обработената група се обработват всеки втори ден с материала Bbo-f който има определена маса. При всяко обработване на групите показани на фиг. 1 дозата е 0.15 ml. Двете обработени групи се различават от всяка друга по броя на обработките. В първата група се прилагат 8 обработки, докато във втората броят на обработките е 10, след това мишките не получават каквато и да е по-нататъшна обработка. В случая на групата получила 10 обработки може да бъде видяно че следва прекратяване на обработката, т.е. след 20-я ден темпото на смъртност внезапно се увеличава. Това внезапно увеличаване може също да бъде видяно в групата която е получила 8 обработки, но интересно е да се види, че увеличението става по-късно и с незначителен наклон. Средното относително време на оцеляване на контролната група е 19.6 дни, при групата която е получила 8 обработки е 24.8 дни, докато при групата, която е получила 10 обработки е 23.2 дни.

Във всяка от групите показани на фиг.2 обработката става 10 пъти на всеки втори ден. Разликата се изразява в дозата. Мишките в първата група получават доза 0.15 ml при всяко обработване,. докато тези от втората група се обработват с доза 0.1 ml. Разликата е много очевидна когато се намали дозата. Времето на оцеляване се увеличава на 30 дни, което съставлява 153 % подобрение отнесено спрямо положителната контролна група.

фиг. 5 показва средното време на оцеляване в случая на мишки получили 10 обработки. Тук изненадва свойството на дозата 0.15 ml, понеже в тази група оцеляването намалява внезапно но общото равнище е по-добро отколкото при по-ранната група с подобна обработка. Благодарение на малкия брой мишки разликите могат да дойдат повече от по-малко благоприятното поведение на една или две «мишки. Внезапното увеличаване на смъртността в случая с доза 0.1 ml след 33-я ден също може да бъде последица от прекомерна доза.

Опитното подобрение в състоянието на животните от обработените групи може да бъде разпознато не само на базата на средното време за оцеляване. При животните с начално тегло 25 g се образува голям тумор който тежи 6 до 8 g т.е. близо една трета от пълното тегло на животното. При животните обработени осем пъти с доза 0.1 ml от материала Bbo-b в края на цикъла на обработването става добро разпознаване на състоянието i8 на тумора, саркомът се отваря и изпуска мек (кашкав) материал. Този материал включва мъртви туморни клетки. “Подутината” на животните изчезва и те започват да нарастват на тегло.

фигура 8 показва стойността на средното телесно тегло на животните през първите 19 дни относно групите Bbo-b и Bbo-f, двете получили 8 обработки и позитивната контролна група. Диаграмите са в добро съответствие с горе описаното състояние съобщено специално в случая на обработването с материала Bbo-b. Недостатъкът на диаграмата се състои в това, че тя не показва отделно масата на тумора. Не може да се получи точна стойност за теглото на тумора затова пълното телесно тегло също включва теглото на тумора. В обработената група е типично началното намаляване последвано от дегенеративно увеличаване, в случая на увеличаване на теглото в позитивната контролна група, то се причинява по променлив начин главно от увеличението на тумора.

Резултати от изследванията ма ензимен туморен маркер

За изследването на метаболитни промени съпътстващи злокачествени процеси има няколко ензимни туморни маркери, които са значително определени в клиничната практика, и от тези методи се избира броя на видовете които могат да бъдат използвани за рутинни изследвания. При подбора на методите би трябвало да се вземе предвид, че злокачествените процеси се съпътстват и често се поддържат от комплексни биохимични смущения. Затова се очаква поради тези съображения, че изглежда необходимо да се извършат анализи на метаболизма на нуклеиновата киселина (алкален (основен) серум и киселинна дезоксирибонуклеазна активност, 5’-нуклеотидазна активност); на полиаминен метаболизъм (аргиназна активност); на функцията на чернодробна митохондрия (орнитил карбамоил трансферазна активност); на глюкорегенерация (фосфохексозна изомеразна активност); и за идентифициране на процеси свързани с костите (костно-специфична алкална фосфатазна активност). Промените в активността на ензимите от направения списък следват метаболитните промени съпътстващи и поддържащи злокачествените процеси и резултатите от приложените терапии.

5-АМР: 5’-нуклеотидазна ензимна фамилия, по-специално: 5’-аденозин-5монофосфат

Aik. F: алкална фосфатаза

5’-TMP: 5 -тимидин-5-монофосфат

PDE: фосфодиестераза

SDNaz: кисела дезоксирибонуклеаза (кисела DNAse)

Σ-5-ND: обида стойност на цялата 5-нуклеотидаза

Групи животни β-Glyc	5-АМР	Alk.F.	5’-ТМР	PDE	SDNaz	L.5’-ND
246-251	‘ 2,12	5,45	14,7	4,67	31,2		45,7
271-275	5,76	7,12	23,5	7,89	44,6	100,7	53,4
276-280	6,78	8,92	19,9	10,78	54,6	98,3	55,67
281-290	2,67	10,23	23,9	13,6	55,9	123,1	67,3
385-390	4,56	16,8	32,8	11,7	67,2	98,9	72,4
391-395	3,56	19,9	34,7	17,3	66,8	134	77,9
396-400	2,45	21,8	33,5	20,76	67,9	145	78,5
41-50	3,33	21,3	32,78	19,43	86,8	359,1	97,8
101-105	2	24,7	21,72	21,45	78,9	189,1	69,9
151-155	1,56	29,4	31,32	13,42	65,7	201,6	76,1
106-110	1,15	3,67	10,39	5,67	43,2	35,2	35,2
56-60	2,91	3,4	13,6	5,8	36,8	40,8	40,3
51-55	-0,03	3,4	22,31	6,2	41,3	32,9	42,1

Последната група се отнася до контролната с мишки които нямат имплантиран тумор, и групата включваща мишки 51-55 които са изследвани на 8-я ден, мишките 56-6(1 се изследвани на 15-я ден и мишките 106-110 са изследвани на 19-я ден.

Първата група може да бъде разделена на три подгрупи, едни започващи с числото 2 получават обработка с материала Bbo-b и други започващи с числото 3 се обработват с материала Bbo-f. В подгрупата Bbo-b изследването на мишките 281-290 става на 8-я ден, мишките 276-280 на 15-я ден, мишките 271-275 на 19-я ден и последното изследване на мишки 246-250 става много по-късно във връзка с оцеляването по същество, иа 45-я ден.

Трите леви колони са свързани с контролната група, средните три колони са свързани с позитивната контролна група, и първите три колони на седемте десни колони спадат към подгрупата Bbo-f и последните четири колони спадат към под-групата Bbo-b.

Експеримент 4

Като се прави базиране на благоприятните резултати получени по време на предишните експерименти, се изследва кои компоненти от липид но-чистата плазма са отговорни за ефекта. Тъй като имаме кръв от здрави хора, кръв от пациенти с акутна левкемия, човешка кръв от пациенти оздравели от рак, по нататък кръв се взема от едър рогат добитък с и без левкоза, препаратът вид “Ь” се прави от всяка ош изброената кръв и се гарантира от съответни електрофорезни изследвания. Изходният материал за изследванията се нанася върху повърхността на използвания

2⁷ полиакриламиден гел, и под Въздействието на електрофорезна обработка компонентите на материла се отделят В сътветствие с порядъка на техните молекулни тегла.

Фракциите се Вземат от кръв която се оказва нерезултатна от гледна точка на лечението на тумора, т.е. нормална човешка кръв и кръв взета от едър рогат добитък без левкоза се сравнява с фракции получени от видове кръв ефективна от гледна точка на лечението на тумора. Най-очевидната разлика се научава от опита с фракциите от кръв взета от едър рогат добитък който има левкоза, и се намира в присъствието на фракция с молекулно тегло около 40(ХХ) и по-нататък фракция с молекулно тегло между ЗОСХХХ) и 35(ХХХ). Тези две фракции заедно представляват 8 до 12 % масови от пробата. Фракциите за кръвния препарат взети от донори които са оздравели от рак включват и двата от тези компоненти, обаче, присъствието на фракцията с молекулно тегло около 40000 е по-очевидна, и количеството на фракциите е по същество по-малко, около 2-3 %. Между фракциите на препарата взети от акутно - левкемична кръв компонентът с молекулно тегло 40(ХХ) присъства само като следи, в другите фракции е не откриваем.

^ЦДЗаради идентифицирането на казаните две фракции, едната с молекулно тегло около 4(ХХ)0 ще бъде споменавана като “волска 40” и другата фракция между ЗО(ХХХ) и 350000 ще бъде обозначена като “волска 300” . Методът описан тук е достатъчен за несъмнено идентифициране на тези две фракции. Структурното идентифициране на тези фракции е направено по обикновен начин.

Експеримент с имплантирането на колоректален тумор

С Данните за оцеляване са сумирани във фигура 10. В случая с позитивната контролна група 100 % време за оцеляване е 19 дни. В първата група обработването се извършва интраперитониално (Ipl) с доза от 0.1 ml, Във втората група начинът на прилагане е същия но дозата е 0.15 ml, и е опитано прилагането на материала през устата (per os). Тук човекът който храни животните използва подходяща доза за да доведе материала директно в стомаха на животните. В първата per os (ро 1) група дозата е 0.2 ml материал и във втората per os (ро 2) група дозата е 0.3 ml. По-нататък също се обработва група sc, където материалът се прилага по субкутанен (под кожата) начин в

N*' количество 0.1 ml. Данните за оцеляване показват средни стойности за групи от десет мишки. От фигурата се вижда, че в случая на всяка обработена група става съществено подобрение, найефективните две обработки са ip прилагането при 0.1 ml и ро обработването при 0.2 ml материал.

Експериментите се повтарят с по-нататъшни групи от десет мишки, и за измерване на туморната маса туморите се отделят когато животните достигнат тяхните умиращи състояния (т.е. директно предшестваща смърт) и туморните маси се измерват.

При съблюдаване на условията описани в експеримент II женски мишки BDFj с описания произход се използват за изследване на ефектите от обработване с материала Bbo-b в случая с тумор на гърдата МХТ. Мястото на произхода на туморните клетки за трансплантиране е MASON Res. Inst. USA. Малко парче с обем 1 тт³ от потвърдения тумор се имплантира подкожно в междулопатъчната област.

Образуват се групи от животни от по десет мишки както при случая с експеримент И, и във всяка група индивидите се

Tl обработват еднакво. Обработването с материала Bbo-b се извършва точно както в случая с експеримент II, т.е. веднъж по същото време всеки ден в продължение на 8 дни. В случая при позитивен контрол средното време на оцеляване е 24 дни. фигура 13 показва времето за оцеляване в процеса на различно обработените групи. Може да се види че различните групи се обработват по идентичен начин, например, с доза 0.15 ml групите ip 1 и ip 2 се обработват еднакво интраперитонеално, или групите ро 2 и ро 3 се обработват с доза 0.3 ml per os. В тази туморна група увеличението на времето на оцеляване е около 40 %, което е най-високо в случая при обработванията per os.

Изследванията на туморната маса се извършват върху животни в умиращо състояние както е описано в експеримент II, и резултатите са сумирани на фигури 14 и 15. Числата отбелязани върху хоризонталната ос се отнасят до сериините номера на мишките в специалната група, те нямат особенно значение. Вертикалните секции отбелязани в колоните на диаграмите се отнасят до отклоненията в сродната група. Намаляването на туморната маса тук е най-значително също при обработвания прилагани per os.

IV. Експерименти с имплантирана акутна L_i210 лимфоидна левкемия

Въздействията на материала Bbo-b се изследват в случая на акутна L₁₂₁₀ лимфоидна левкемия. Групите от по десет мишки се образуват от мъжки мишки BDFj отглеждани както е описано във връзка с експерименти II и III. От асцитната течност на мишките DBA/2, в която се поддържа акутна Ь₁₂ю лимфоидна левкемия и от физиологичния разтвор се прави разтвор на течността, от който 0.1 ml включва 10⁶ клетки. От тази течност 0.1 ml се инжектира по интраперитониален начин във всяка експериментална мишка, и в обработваните групи третиранията се извършват веднъж на ден в продължение на 8 дни, точно както в случая при експерименти II и III.

Фиг. 16 показва данните за оцеляване. Средното време за оцеляване в позитивната контролна група е 9.9 дни. Това може да се види на фиг. 16 в която има много съществена разлика във времето за оцеляване в зависимост от това как се прилага материала. В отговор на интраперитониалното и подкожно приложения времето на оцеляване е 170%, и в противоположност на това приложението per os на доза 0.2 ml дава като резултат 320 % време за оцеляване, но в тази обработвана група разликите между индивидуалните животни са големи и някои от тях са напълно оздравели. При този туморен вид няма начин за определяне на относителната туморна маса, и асцитната течност събрана в перитонеалната кухина заедно с туморите присъства в мезентериалната съставена абсолютна туморна маса. фиг. 17 показва измереното тегло на така определената абсолютна туморна маса в умиращата група. Животните които са живи на 30-я ден принадлежат също към тези групи. Може да се види на фиг. 17, че в три от обработените групи не е открита измерваема туморна маса.

фиг. 18 показва промяната на активността на 5’нуклеотидазата на 5-я и 8-я ден както и В умиращо състояние. От диаграмите може да се види, че съществено подобряване става във всички обработени групи, и в някои обработени групи се получават нормални стойности.

В по-нататъшни групи от мишки, които участват в експериментите I go IV с няколко различни данни, се извършват хистологични изследвания. Изследванията включват хистологичен анализ на 17 различни органи. Базирайки се на такива хистологични изследвания, може да се изложи, че метастази не се образуват във всеки от изследвания туморен вид. В случая на позитивните контролни групи, обаче, беше открита добре забележима метастазна активност. Има открити за всеки случай от индивидуалните туморни видове както следва: в случая на сарком S₁₈₀ в лимфатичните жлези и черния дроб; в случая на С₂₆ в черния дроб и мезентериалните лимфатични жлези; в случая на тумора МХТ в черния дроб; и в случая на L₁₂₁₀ в костния мозък.

Получените по-горе експериментални резултати, като опитни значителни подобрения, вероятно биха могли да станат също при туморни видове, които не се изследвани тук. Изследвания покриващи всички видове тумори ще бъдат необходими поради тяхната очебиеща значимост. Въпреки това, горните експерименти са достатъчно обширни за да се поддържа съществуването на главния ефект.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ (ПРОМЕНЕНИ)

1. фармацевтичен препарат, характеризиращ се с това, че включва компонентите на липидно-чиста фракция от кръвната плазма на копитни животни незастрашени летално от наличието на левкоза.
2. фармацевтичен препарат, както се претендира в претенция 1, характеризиращ се с това, че копитните животни са едър рогат добитък.

’ ί
3. фармацевтичен препарат за лечение на тумори, характеризиращ се с това, че включва материал, който образува откриваема чрез електрофореза разлика, между липидно-чистата фракция от кръвната плазма взета от едър рогат добитък, който има левкоза, и липидно-чистата фракция от кръвна плазма взета от здрав едър рогат добитък.
4. Метод за получаване на липидно-чистата фракция от кръвната плазма както се претендира в претенция 1, включваща етапите, по избор, обработване на началната кръв с анти-коагулант ^w и поради това отделяне на частиците, характеризиращ се с етапите на обработване на плазмената фракция с първи органичен разтворител, добавяне на повърхностно-активен материал образуван от финни зърна, размесване на течността, след това отделяне на липидно-чистата фракция свързана със споменатите зърна от течните компоненти чрез центрофугиране, и довеждане на споменатата нееднократно отделена фракция в разтвор.
5. Метод, както се претендира В претенция 4, характеризиращ се с тоВа, че при използване на Втори органичен разтворител за извършване на споменатия етап на довеждане на споменатата нееднократно фракция в разтвор, разтворът се размесва, и липидно-чистата фракция свързана към споменатите зърна се отделя от течните компоненти чрез центрофугиране, и и се доВежда споменатата отделена фракция за Втори път В разтвор.
6. Метод, както се претендира в претенция 5, / характеризиращ се с използване на физиологичен разтвор при споменатия етап на доВеждане на споменатата отделена фракция за втори път в разтвор.
7. Метод, както се претендира в претенция 5, характеризиращ се с използВане на течност, по същество разтворител за споменатата липидно-чиста фракция при споменатия етап на довеждане на споменатата отделена фракция за втори път в разтвор, след това отделяне на зърната на повърхностноактивното вещество от течната фракция чрез повторно центрофугиране.
8. Метод, както се претендира в претенция 4, характеризиращ се с това, че зърната на повърхностно-активния материал имат размер между 200 и 400 пт.
9. Метод, както се претендира В претенция 4, характеризиращ се с тоВа, че масата на споменатия поВърхностноактивен материал е 0.5 % от масата на споменатата плазмена фракция.
10. Метод, както се претендира В претенция 4, характеризиращ се с тоВа, че споменатия повърхностно-активен материал е болус алба.
11. Метод, както се претендира В претенция 4, характеризиращ се с тоВа, че масата на споменатия първи органичен разтворител е по същество раВна на масата на споменатата плазмена фракция.
12. Метод, както се претендира в претенция 5, характеризиращ се с това, че масата на споменатия втори органичен разтворител е равна на масата на споменатия първи органичен разтворител.
13. Метод, както се претендира В претенция 5, характеризиращ се с това, че споменатия първи органичен разтворител е алкохол и споменатия втори органичен разтворител е равнозначна смес от алкохол и толуен.
14. Използване на фармацевтичния препарат от претенция 1 за лечение на тумори и продължаване на грижата за тях.
15. Използване на фармацевтичния препарат от претенция 1 за предотвратяване образуването на вторични тумори след първичен тумор.
16. Използване съгласно претенция 14 за лекуване на всеки от сарком S180, чревен тумор С26, тумор на гърдата МХТ и акутна лимфоидна левкемия.

Фармацевтичен препарат за лечение и диагноза на тумори и метод за получаване на аипидно-чиста Фракция от кръвна плазма

Реферат фармацеВтичен препарат за лечение и продължаване на грижата за тумори, който Включва кръвна плазма или предварително определени компоненти на кръвната плазма от копитни животни, за предпочитане едър рогат добитък, който не е застрашен летално от левкоза. Предварително определената фракция е материалът волска 40 и/или волска 300 който образува откриваема чрез електрофореза разлика, между липидно-чистата фракция взета от едър рогат добитък, който има левкоза, и липидно-чистата фракция взета от здрав едър рогат добитък. При метода за отделяне на необходимата фракция, началната кръв по избор се обработва с анти-коагулант и затова частиците се отделят, плазмената фракция се обработва с първи органичен разтворител, след това се добавя повърхностно-активен материал образуван от финни зърна, течността се размесва и липидночистата фракция свързана към зърната се отделя от течните компоненти чрез центрофугиране и отделената фракция се довежда отново в разтвор.

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ (ПРОМЕНЕНИ)

1. фармацевтичен препарат, характеризиращ се с това, че включва компонентите на липидно-чиста фракция от кръвната плазма на копитни животни незастрашени летално от наличието на левкоза.

2. фармацевтичен препарат, както се претендира в претенция 1, характеризиращ се с това, че копитните животни са едър рогат добитък.

3. фармацевтичен препарат за лечение на тумори, характеризиращ се с това, че включва материал, който образува откриваема чрез електрофореза разлика, между липидно-чистата фракция от кръвната плазма взета от едър рогат добитък, който има левкоза, и липидно-чистата фракция от кръвна плазма взета от здрав едър рогат добитък.

4. Метод за получаване на липидно-чистата фракция от кръвната плазма както се претендира в претенция 1, включваща етапите, по избор, обработване на началната кръв с анти-коагулант и поради това отделяне на частиците, характеризиращ се с етапите на обработване на плазмената фракция с първи органичен разтворител, добавяне на повърхностно-актиВен материал образуван от финни зърна, размесване на течността, след това отделяне на липидно-чистата фракция свързана със споменатите зърна от течните компоненти чрез центрофугиране, и довеждане на споменатата нееднократно отделена фракция в разтвор.

5. Метод, както се претендира β претенция 4, характеризиращ се с това, че при използване на втори органичен разтворител за извършване на споменатия етап на довеждане на споменатата нееднократно фракция в разтвор, разтворът се размесва, и липидно-чистата фракция свързана към споменатите зърна се отделя от течните компоненти чрез центрофугиране, и и се довежда споменатата отделена фракция за втори път в разтвор.

6. Метод, както се претендира в претенция 5, характеризиращ се с използване на физиологичен разтвор при споменатия етап на довеждане на споменатата отделена фракция за втори път в разтвор.

7. Метод, както се претендира в претенция 5, характеризиращ се с използване на течност, по същество разтворител за споменатата липидно-чиста фракция при споменатия етап на довеждане на споменатата отделена фракция за втори път в разтвор, след това отделяне на зърната на повърхностноактивното вещество от течната фракция чрез повторно центрофугиране.

8. Метод, както се претендира в претенция 4, характеризиращ се с това, че зърната на повърхностно-активния материал имат размер между 200 и 400 пт.

9. Метод, както се претендира в претенция 4, характеризиращ се с това, че масата на споменатия повърхностноактивен материал е 0.5 % от масата на споменатата плазмена фракция.

10. Метод, както се претендира 6 претенция 4, характеризиращ се с това, че споменатия повърхностно-активен материал е болус алба.

И. Метод, както се претендира в претенция 4, характеризиращ се с това, че масата на споменатия първи органичен разтворител е по същество равна на масата на споменатата плазмена фракция.

12. Метод, както се претендира в претенция 5, характеризиращ се с това, че масата на споменатия втори органичен разтворител е равна на масата на споменатия първи органичен разтворител.

13. Метод, както се претендира в претенция 5, характеризиращ се с това, че споменатия първи органичен разтворител е алкохол и споменатия втори органичен разтворител е равнозначна смес от алкохол и толуен.

14. Използване на фармацевтичния препарат от претенция 1 за лечение на тумори и продължаване на грижата за тях.

15. Използване на фармацевтичния препарат от претенция 1 за предотвратяване образуването на вторични тумори след първичен тумор.

16. Използване съгласно претенция 14 за лекуване на всеки от сарком S180, чревен тумор С26, тумор на гърдата МХТ и акутна лимфоидна левкемия.