RO111332B1 - Procedeu de obținere a unui produs hepatoprotector - Google Patents

Abstract

Invenția se referă la un procedeu de obținere a unui produs hepatoprotector, din splină de vită, prin tratarea succesivă a extractului cloroformic, obținut în urma autolizei, cu acetonă, delipoidare cu benzină, purificare prin trecere pe coloană cromatografică și tratare cu cărbune activ, care constă în aceea că extractul acetonic concentrat și delipoidat se tratează cu 5 °/00 (g/v) fenol, se purifică cu cărbune activ, se cromatografiază pe Sephadex SPC 25, se eluează cu apă cloroformată saturată și fracțiunea biaactivă urmărită se concentrează la 1/10 f A' Ar volum și se tratează cu 1 ... 3% (g/v) ciorură de sodiu apirogenă, 5 °/oa (g/v) fenol și 3 ... 10% cărbune activ depirogenat, se filtrează prin membrană sterilizantă și se liofilizează în mod cunoscut.

Description

Invenția se referă la un procedeu de obținere a unui produs hepatoprotector, care conduce la un produs cu efect protector asupra ficatului, utilizat în medicină.

Se cunoaște un procedeu de obținere a unui factor hepatoprotector, care constă în aceea că splina este supusă, într-o primă etapă, la extracții acetonice succesive, delipoidare și concentare, filtrare și control chimic pentru conținut în substanțe ninhidrin-pozitive și apoi controlul eficacității prin probe bromsulftaleină (BSP), după care extractul peptidic activ se purifică pe coloană de rășini dextronice cu lanțuri încrucișate, eluatul se liofilizează în vrac pentru concentrarea factorului hepatoprotector, apoi se reliofilizează în flacoane și se controlează pe animale intoxicate cu alcool olilic.

Procedeul de obținere a unui produs hepatoprotector, conform invenției, constă în aceea că extractul acetonic concentrat și delipoidat se tratează cu 5 %° (g/v) fenol, se purifică cu cărbune activ, se cromatografiază pe Sephadex SPC 25, se eluează cu apă cloroformată saturată și fracțiunea bioactivă urmărită se concentrează la 1/10 (g/v) din volum și se tratează cu 1=3% clorură de sodiu apirogenă, 5%° (g/v) fenol și 3 ... 10% cărbune activ depirogenat, se filtrează prin membrană sterilizantă și se liofilizează în mod cunoscut.

Procedeul de obținere a factorului hepatoprotector, cunoscut din materialul documentar din stadiul tehnicii și prezentat mai sus, utilizează splina proaspătă sau congelată, curățată de grăsimi și țesut conjuctiv aferent capsulei spolinei, care este tocată și autolizată în prezență de cloroform. După autoliză materialul este congelat și apoi extras de mai multe ori cu acetonă apoasă. Lichidul acetonic separat prin centrifugare este filtrat și apoi concentrat la 1/3 din volumul inițial.

Concentratul este degresat prin extracția repetată a lipidelor cu benzină, după care se filtrează prin filtru de profunzime și benzina este evaporată sub vacuum.

La lichidul apos dezbenzinat prin evaporare sub vid, se adaugă fenol în concentrație 5 %° și se păstrează la 0= +5°C până la faza următoare, dar nu mai mult de 3 luni.

Acesta constituie extractul peptidic de splină care este fracționat pe Sephadex SP C-25 (cationit cu forma sulfopropilică activat în ciclul Na⁺).

Intre două utilizări apropiate, schimbătorul de ioni se menține în apă distilată, iar după trei fracționări (2 - 4 zile) se suspendă acesta în apă cloroformată care se elimină complet cu apă distilată la o nouă fracționare. Fracționarea se face alimentând coloana cu apă distilată și separând fracțiunea I conform analizei cromatografice. înainte de a fi introdus în coloană pentru fracționare, extractul peptidic de splină este purificat cu cărbune absorbant și filtrat, după care se păstrează la O ... 3°C, max. 10 zile. După separarea fracțiunii conținând factorul hepatoprotector, schimbătorul de ioni se spală cu apă distilată până la reacție negativă la ninhidrină, fiind astfel pregătit pentru o nouă fracționare. In cazul când fracționarea decurge defectuos (eluat opalescent, separare necorespunzătoare) se procedează la reactivarea coloanei prin tratare cu soluții diluate de acid clorhidric și hidroxid de sodiu. Izolarea factorului hepatoprotector din eluat se face prin liofilizare.

O problemă de bază o constituie apirogenitatea produsului dependentă de asigurarea menținerii condițiilor aseptice pe tot parcursul procesului.

Extractul de splină constituie un mediu excepțional pentru dezvoltarea microorganismelor, astfel încât între măsurile de protecție ce trebuie luate asupra acestuia se înscrie prezența permanentă în acesta a unor antiseptice compatibile cu produsul și faza respectivă a procesului, pe lângă celelalte măsuri de protecție (dezinfecție de incinte și instalații, temperatura de conservare joasă).

Procedeul descris în stadiul tehnicii nu îndeplinește această cerință.

*

RO 111332 Bl

Astfel, după delipoidare și îndepărtarea benzinei prin evaporare sub vacuum și filtrare, se adaugă la material 5%« fenol, se trece la faza următoare de purificare cu cărbune adsorbant, după care are loc fracționarea pe Sephadex SPC - 25. Purificarea cu cărbune duce la pierderea unei importante cantități din fenolul existent, ceea ce face ca materialul să rămână neprotejat din acest punct de vedere.

Verificarea lipsei microorganismelor în extractul peptidic de splină purificat a condus la rezultate care confirmă prezența acestora în cantităti mari. Pe de altă parte, controlul pH-ului și menținerea la valoarea 6,2 ... 6,5 este obligatorie, determinând comportarea extractului de splină purificat pe schimbători de ioni, control neprevăzut de metoda actuală descrisă.

In faza următoare, la fracționarea pe coloană încărcată cu Sephadex SPC25, executarea operației în apa distilată la temperatura ambiantă lasă de asemenea materialul neprotejat de un antispetic și controlul microbiologic a arătat prezența în mare concentrație a unor microorganisme.

Fracțiunea conținând factorul hepatoprotector separată pe schimbătorul de ioni este o soluție apoasă diluată, care reprezintă un volum de circa 8 ... 10 ori mai mare față de volumul de extract peptidic de splină purificat introdus pe o coloană pentru fracționare. Liofilizarea acestei soluții diluate se execută cu un consum mare de energie și necesită o capacitate de liofilizare mare.

Toate aceste deficiențe pot fi eliminate prin aceea că, în conformitate cu prevederile invenției, extractul peptidic de splină, după purificare cu cărbune, este fenolat la concentrația de 5%° și adus la pH 6,0 ... 6,2 după care fracționarea pe coloane de Sephadex SPC 25 se execută în prezența de apă cloroformată, iar fracțiunea conținând factorul hepatoprotector este concentrată la cca. 1/10, adiționată cu NaCI apirogenă, tratată cu cărbune activ, filtrată steril, adiționată cu fenol 5% și liofilizată în vrac sau în fiole prin distribuirea soluției în fiole conform datelor analitice, pentru a avea concentrația de factor hepatoprotector prevăzută pe fiolă.

Aplicarea acestor modificări la linia generală de lucru, prezentată mai înainte asigură obținerea constantă cu randament ridicat a unui produs corespunzător apirogen.

Se dau în continuare 3 exemple de realizare a invenției.

Exemplul Π . Pentru obținerea produsului hepatoprotector, 60 kg splină de vită a fost curățațtă de grăsime și țesut conjunctiv, apoi tocată și amestecată cu cloroform 5% v/g și lăsată la autoliză la temperatura de 0° ? + 4°C timp de 48 h, după care s-a congelat menținându-se la temperatură joasă 72 h.

După acest timp materialul a fost decongelat și extras cu acetonă la prima extracție, apoi cu soluție hidroacetonică 50% volum egal față de glandă. S-au făcut în total trei extracții, de fiecare dată separându-se glanda extrasă la o centrifugă filtrantă.

Extractele acetonice reunite, cca. 130 I, au fost filtrate cu adjuvant de filtrare prevăzut cu pânză și hârtie de filtru. Extractul limpede s-a concentrai; ίε temperatura de maximum 38°C până la un volum de 1 /3 ... 1/4 față de volumul inițial.

Concentratul, 35 I, a fost delipoidat cu benzină de extracție foii >« volume egale cu cele de concentrat și separând de fiecare dată la pâlnia de separare.

S-au obținut 30 I extract concentrat degresat. Acesta a fost filtrat pentru clarifiere prin filtru de profunzime și s-a dezbenzinat în evaporator rapid sub vacuum la temperatura de 38 ... 45°C. Concentratul s-a refiltrat și î sa adăugat 5%° g/v fenol. Extractul brut 27 I fenolat, s-a păstrat la rece la 0°C 4+ 5°C, 5 zile, până la‘faza următoare de fracționare. Aceasta s-a executat după purificarea extractului cu cărbune activ.

* .

RO 111332 Bl

In acest scop, s-a dăugat 15% g/v cărbune adsorbant, s-a agitat 10 min., suspensia s-a filtrat. Cărbunele s-a spălat cu un volum egal de apă distilată apirogenă pe filtru. Filtratul, inclusiv apele de spălare reunite, s-a adiționat cu 5%° g/v fenol și i s-a corectat pH-ul cu soluție NaOH 0,1 N la valoarea de 6,2. Separarea fracțiunii active s-a făcut pe Sephadex SPC 25 activat în ciclul sodiu și menținut tot timpul în apă cloroformată.

Pe schimbătorul de ioni activat s-a introdus o cantitate de 1,8 1/100 I schimbător de ioni umed așezat în coloană, extractul peptidic de splină purificat cu pH 6,2 și fenolat 5%- g/v.

Pentru separarea fracțiunii bioactive s-a introdus în continuare în coloană apă cloroformată saturată si s-a colectat cu debit de 0,05 coloane/oră efluentul care a prezentat spotul caracteristic al produsului, fără alte spoturi ninhidrină pozitive la cromatografia rapidă pe hârtie. După colectarea fracțiunii bioactive, aceasta a fost concentrată la 1/10 din vlum, adiționată de 3% g/v clorură de sodiu farmaceutică apirogenă și fenol 5%° g/v, s-a agitat cu 2% cărbune activ depirogenat și s-a filtrat prin membrană sterilizantă. S-a liofilizat. Au rezultat 500 g produs liofilizat vrac. Produsul liofilizat s-a analizat și s-a dizolvat în apă distilată apirogenă la concentrația prescrisă de 40 pmoli/ml, acid glutamic s-a repartizat în fiole câte 1 ml și s-a liofilizat.

Exemplul 2 . Pentru obținerea produsului hepatoprotector, s-a procedat ca la exemplul 1 până la obținerea extractului. Acesta s-a purificat cu câte 15% g/v cărbune adsorbant apirogen. S-a filtrat de cărbune și s-a spălat acesta pe filtru cu un volum egal de apă distilată apirogenă. Filtratul cu apele de spălare s-au readus la concentrația de 5%° g/v cu fenol (de la 1,8 g %°). S-a sterilizat prin filtrare pe membrană și s-a fracționat pe Sephadex SPC 25. Fracționarea a avut loc pe schimbătorul de ioni activat în ciclul Na⁺ și menținut sub apă distilată apirogenă tratată cu cloroform. S-a introdus în coloană extractul peptidic de splină de purificat în cantitate de 1,8 % v/v din volumul schimbătorului de ioni umed aflat în coloană. Ca eluant s-a folosit apa distilată apirogenă saturată cu cloroform. S-a separat fracțiunea bioactivă, conform controlului cromatografic, și efluentul colectat s-a concentrat la 1/10 (25 I) din volumul inițial de 250 I. S-a adăugat clorură de sodiu farmaceutică apirogenă și 5%° g/v fenol. S-a purificat în final prin agitare cu 2% cărbune activ și s-a sterilizat. S-au obținut 23 I lichid impede incolor conținând 4% substanță uscată. S-a analizat pentru conținutul în clorură de sodiu, acid glutamic, și pH. S-a sterilizat prin filtrare pe membrană și s-a repartizat aseptic în flacoane câte 0,1 ml soluție, astfel ca să se obțină în fiecare flacon 40 pmol acid glutamic în amestec cu NaCI și peptide active sub forma unei pulberi albe cu 6% umiditate, pH-ul soluției 1% 6,5 ... 7, iar fenol 3 mg/flacon.

Exemplul 3 . Pentru obținerea produsului hepatoprotector, 10 I lichid reprezentând fracțiunea conținând FH separată pe Sephadex SPC 25 este concentrată la 1 I. Controlul substanțelor pirogene fiind pozitiv, s-au adăugat 30 g cărbune adsorbant apirogen și s-a agitat 20 minute. S-a filtrat de cărbune. S-a adăugat 1% g/v clorură de sodiu și 5%° fenol și s-a sterilizat prin filtrare pe membrană sterilizantă. S-au obținut 0,9 I concentrat care a fost liofilizat și găsit apirogen.

Claims (1)

1. Procedeu de obținere a unui produs hepatoprotector, din splină de vită, prin tratarea succesivă a extractului clorofonic, obținut în urma autolizei, cu acetonă, delipoidarecu benzină, purificare prin trecere pe coloană cromatografică și tratare cu cărbune activ, caracterizat prin aceea că extractul acetonic concentrat și delipoidat se tratează cu 5 %° (g/v) fenol, șe purifică cu cărbune activ, se cromatografiază pe Sephadex SPC 25, se eluează cu apă

   RO 111332 Bl cloroformată saturată și fracțiunea bioactivă urmărită se concentrează la 1/10 din volum și se tratează cu 1 ... 3% (g/v) clorură de sodiu apirogenă, 5%° (g/v) fenol și 3 ... 10% cărbune activ depirogenat, se filtrează prin membrană sterilizantă și se liofilizează în mod cunoscut.