HRP20030098A2 - Pharmaceutical preparation for the treatment and diagnosis of tumors and method for the preparation of the lipid free fraction of blood plasma - Google Patents

Description

Izum se odnosi na farmaceutski pripravak, prvenstveno za liječenje i dijagnostiku tumora, te na postupak odvajanja bezlipidne frakcije krvne plazme.

Objavljena međunarodna patentna prijava WO 00/40256 odnosi se na tumor-inhibirajuće učinke krvne plazme dobivene iz pacijenata oboljelih od akutne leukemije. U prijavi su opisani brojni pokusi u kojima je korišteni pripravak uzrokovao 20%-tno poboljšanje u odnosu na kontrolnu skupinu kod određenih tipova tumora. Ovo poboljšanje je blizu donje granice onih za koje se smatra da su značajni.

Primjenjivost farmaceutskih pripravaka načinjenih iz krvi osoba s akutnom leukemijom je ograničena, prvenstveno zbog malog broja osoba koji mogu biti davatelji, te zbog postojanja strogih etičkih i zakonskih razloga vezanih za uporabu ljudske krvi. Iznimni značaj liječenja tumora, te raspon istraživanja učinjenih diljem svijeta na ovom području opravdavaju pomna ispitivanja svakog novog načina koji se pojavljuje kao mogućnost bilo u liječenju ili dijagnostici.

Gore spomenuta patentna prijava učinila je vjerojatnim da krv osoba koje boluju od akutne leukemije sadrži točno nedefiniran sastojak koji ima općenit protutumorski učinak.

Cilj izuma je osigurati novi farmaceutski pripravak koji se može uporabiti u liječenju i dijagnozi tumora uključujući cilj učinkovitog izdvajanja sastojaka krvne plazme koji imaju ulogu u savladavanju tumora, a idući cilj je pronalaženje odgovarajućih skupina davatelja takve plazme.

Za postizanje cilja u prvom koraku izumljen je učinkovitiji postupak pročišćavanja u kojem je pretpostavljeno da su učinkoviti sastojci u bezlipidnoj frakciji krvne plazme. Uvidjelo se da se odvajanje bezlipidnih sastojaka krvne plazme može provesti na pogodan način ako se frakcija plazme obrađuje prvo s organskim otapalom, zatim se dodaje surfaktant sačinjen od finih zrnaca, nakon čega slijedi intenzivno miješanje bezlipidne frakcije koja se veže na zrnca i odvaja od tekućeg dijela centrifugiranjem, a zatim se ova odvojena frakcija ponovno otapa.

Pročišćavanje će biti učinkovitije ako se koraci otapanja i odvajanja ponavljaju uporabom drugog organskog otapala nakon čega slijedi ponovno centrifugiranje.

Količina surfaktantnog sredstva je oko 0.5% u odnosu na masu plazme, te je veličina zrnaca između 200 do 400 nm. Preporučljivi materijali su na pr. bolus alba, aktivni ugljen ili metocel.

Centrifugiranje se preporučljivo izvodi s ubrzanjem od 15 000 g. Otapanje je olakšano ako se nakon primjene organskog otapala otopina čuva na duže vrijeme na povišenoj temperaturi uz povremeno miješanje.

Odvajanje zrnaca surfaktanta od bezlipidnog sastojka plazme nije nužan cilj, nakon drugog odvajanja zrnca zajedno s na njima vezanim bezlipidnim sastojkom plazme mogu se staviti na pr. u fiziološku otopinu.

Prema slijedećem načinu pročišćavanja bezlipidni sastojak plazme stavlja se u otopinu s blagim detergentom, te se nakon slijedećeg centrifugiranja čvrsti sastojak može odvojiti.

S obzirom da je za bezlipidni proizvod, na ovaj način odvojen i dobiven od davatelja koji imaju akutnu leukemiju, pokazana značajnija učinkovitost nego za proizvod opisan u gore spomenutoj patentnoj prijavi, razmatran je glavni vid ovog cilja, tj. nalazi li se takav protutumorski sastojak samo u krvi s akutnom leukemijom ili je prisutan i u krvi osoba koje su izliječene od tumora.

Pokazano je da je takav sastojak prisutan u krvi osoba izliječenih od tumora, te da se ovaj sastojak nalazi u bezlipidnom dijelu krvne plazme. Primjenom gore opisanog postupka pročišćavanja pokusom je potvrđeno da će u slučaju S 180 sarkoma miševa vrijeme preživljenja biti pouzdano duže u slučaju uporabe pripravka dobivenog od davatelja izliječenih od tumora, te da učinak ne ovisi o tipu tumora, a bezlipidna frakcija dobivena iz smjese krvnih plazmi dobivenih od davatelja izliječenih od različitih tumora imala je slično učinkovit inhibirajući učinak na tumor.

Iako je broj davatelja izliječenih od tumora znatno veći od broja osoba s akutnom leukemijom, te je manje ograničena količina krvi koja se od njih može dobiti, ne može se očekivati širok raspon medicinske uporabe zbog gore spomenutih moralnih i zakonskih ograničenja.

Daljnji pristup u rješavanju temeljnog cilja doveo je do slijedećeg inventivnog otkrića. Put do ovog otkrića vodio je preko ispitivanja spontanih izlječenja tumora u životinja. U slučaju papkara s parnim brojem prstiju tumorska je bolest uzrokovana retrovirusom vrlo specifična. U određenim vrstama bolest se očituje tumorom, te zaražena životinja umire, dok se kod drugih vrsta, prvenstveno kod goveda (stoke) bolest ne očituje tumorom ili bilo kojim drugim smanjenjem općeg statusa zdravlja životinja. Zaraza se može utvrditi prisutnošću protutijela GP 51 u krvi.

Opći je stav veterinarske medicine da se grla stoke odvoje od onih koji boluju od leukoze. Ovaj stav podržan je mišljenjem objavljenim u 4. izdanju Journal of Hungarian Veterinarians 1992, pod naslovom: "Zarazni status leukoze kod stoke u zemlji, te mogućnosti odvajanja grla", a to mišljenje doneseno je od Veterinarskog odbora Mađarske akademije znanosti. Nađeno je da je opseg leukozne infekcije blizu 50%. Iduća publikacija izdanja br. 9, 1997 istog časopisa sadrži članak dr. Telkes, Lajos "Odvajanje stoke od leukoze u Mađarskoj" koji naglašava značaj odvajanja grla s leukozom. Nađen je veći opseg zaraze na većim farmama, a u vrijeme drugog članka pojavnost zaraze je bila oko 17%.

Svrha otkrića leži u spoznavanju da bi krv životinja koje su uspješno i bez simptoma preboljele leukozu, a osobito bezlipidna frakcija plazme njihove krvi, trebala sadržavati one sastojke za koje je dokazano da su učinkoviti u pokusima izvedenim s krvlju gdje su davatelji bili ljudi. Nakon ovog otkrića slijedio je čitav niz pokusa koji su potvrdili ovu hipotezu s nekoliko strana, te osigurali podršku za postojanje tumorskog inhibicijskog učinka koji je učinkovit u tolikoj mjeri u kojoj je bio nepojmljiv u doba početka borbe protiv tumora.

Postojanje učinka također je potvrđeno spoznajom da slični sastojci krvi dobiveni od životinja koje ne boluju od leukoze nisu imali takve učinke.

Elektroforetska ispitivanja bezlipidne krvne plazme dobivene od ljudskih i životinjskih davatelja potvrdila su postojanje sličnih frakcija u dva raspona molekulske težine, a te dvije frakcije su izostajale u plazmi zdravih davatelja. Prva frakcija molekulske težine oko 40000 nadalje označena kao "bovin 40", te druga frakcija molekulske težine koja pada u rasponu između 300000 i 350000, označena nadalje kao "bovin 300" trebale bi biti odgovorne za tumorski inhibicijski učinak.

Spoznavanjem rješenja prema izumu čini se kako bi bilo uputno temeljito razmotriti potrebu da se grla oboljela od leukoze izdvoje iz stada.

Frakcije bovin 40 i bovin 300 kako je utvrđeno izumom posjeduju izvrstan tumorski inhibirajući učinak, te istovremeno otkrivanje njihove prisutnosti pomaže u postavljanju dijagnoze tumora.

Izum će sada biti opisan u vezi s primjerima uz reference s popratnim slikama i pokusima. Na slikama:

Sl. 1 je dijagram preživljenja tretmana s 0.15 mL Bbo-f tvari;

Sl. 2 je dijagram preživljenja 10 tretmana s Bbo-f tvari;

Sl. 3 je dijagram preživljenja 6 tretmana s Bbo-b tvari;

Sl. 4 je dijagram preživljenja 8 tretmana s Bbo-b tvari;

Sl. 5 je dijagram preživljenja 10 tretmana s Bbo-b tvari;

Sl. 6 je dijagram preživljenja tretmana s 0.1 mL Bbo-b tvari;

Sl. 7 je dijagram preživljenja tretmana s 0.15 mL Bbo-f tvari;

Sl. 8 prikazuje tjelesnu težinu životinja do 19. dana;

Sl. 9 je serija dijagrama kolona koji sumiraju rezultate enzimskih ispitivanja;

Sl. 10 prikazuje podatke o preživljenju tretmana nakon implantacije tumora debelog crijeva C26;

Sl. 11 prikazuje relativne mase tumora kod tretmana sa Sl. 10;

Sl. 12 prikazuje vrijednosti 5' nukleotidaze u slučaju tretmana sa Sl. 10;

Sl. 13 prikazuje dijagram preživljenja dobiven u slučaju tretmana MXT karcinoma dojke;

Sl. 14 ilustrira relativne mase tumora u slučaju tretmana sa Sl. 13;

Sl. 15 je verzija Sl. 14 u slučaju daljnjih tipova tretmana;

Sl. 16 prikazuje dijagram preživljenja dobiven u slučaju tretmana L1210 limfoidne leukemije;

Sl. 17 prikazuje apsolutne mase tumora dobivene kod tretmana sa Sl. 16; i

Sl. 18 prikazuje vrijednosti 5' nukleotidaze u slučaju tretmana sa Sl. 16.

Različiti detalji rješenja mogu se doznati prema izumu s obzirom na različita stajališta učinjenih pokusa. Bez obzira na red značajnosti, prvo je potreban opis postupka priprave tvari korištene u pokusima.

Odvajanje i dobivanje bezlipidnog sastojka plazme

Sastojci bezlipidne plazme dobivaju se iz krvi kao početnog materijala tijekom postupka odvajanja u više koraka. Preporučljivi koraci odvajanja su kako slijedi:

Kratko nakon uzimanja početna krv obrađuje se s antikoagulansom, preporučljivo heparinom.

Odvajanje krvnih zrnaca izvodi se centrifugiranjem, preporučljivo na temperaturi 4ºC uz ubrzanje od 5000 g (g: označava ubrzanje normalne sile teže). U slučaju da se krv odmah ne centrifugira nakon vađenja, krv obrađena antikoagulansom može se pohraniti na niskoj temperaturi, preporučljivo na temperaturi centrifugiranja najviše 48 sati. Trajanje centrifugiranja je najmanje 10 minuta. Za daljnji postupak uzima se gornji sloj tekućine. Tako dobivena plazma može se zamrznuti na temperaturu -20ºC, te se može pomiješati s plazmama slično dobivenim od različitih davatelja. Daljnji se postupak provodi s većom količinom plazme kad je potrebno. Za vrijeme primjera opisanih u ovoj specifikaciji plazma dobivena od bilo kojeg davatelja nije miješana s plazmom ostalih davatelja, te je svaka njihova razlika posebno navedena.

Kao prvi korak u uklanjanju lipidnih sastojaka plazma se razrjeđuje s istom masom prvog organskog otapala, na pr. s 96%-tnim alkoholom, tako dobivena otopina se miješa.

U drugom koraku dodaje se u otopinu surfaktantna tvar (sredstvo) u količini od 0.5 mas%. Zadatak ove surfaktantne tvari je da veže bezlipidne sastojke plazme na svoju površinu. Surfaktantna tvar može biti bolus alba, aktivni ugljen ili metocel, a prosječna veličina zrnaca od njih napravljena je preporučljivo između 200 i 400 nm. U slučaju opisanih primjera surfaktantna tvar je bolus alba.

Ova smjesa plazme je stalno održavana u suspendiranom stanju uz fizičku intervenciju (miješanjem) na sobnoj temperaturi tokom 6 sati, zatim je inkubirana na temperaturi od 5ºC 10 do 12 sati. U razdoblju inkubacije tekućina je miješana u kraćim razdobljima jedanput svakih pola sata.

Nakon inkubacije smjesa je resuspendirana miješanjem, a suspenzija centrifugirana na istoj temperaturi 4-5ºC uz ubrzanje 15000 g tijekom 10 minuta.

Iz centrifugata odvojeni su čvršći sastojci vezani na surfaktantne čestice za daljnju obradu, a tekuća faza je uklonjena. Dodano je drugo organsko otapalo u odvojenu fazu u količini jednakoj masi prvog organskog otapala, što je u primjernom slučaju 50 mas% - 50 mas% smjesa alkohola i toluena. Obrađivanje tako dobivene smjese jednako je onom nakon obrade s prvim otapalom. Za vrijeme ovog postupka smjesa plazme je stalno održavana fizičkom intervencijom (miješanjem) u suspendiranom stanju tijekom 6 sati na sobnoj temperaturi, zatim je inkubirana na 5ºC 5 do 12 sati. U razdoblju inkubacije tekućina je miješana u kraćim razdobljima jedanput svakih pola sata.

Nakon inkubacije smjesa je resuspendirana miješanjem, te je na istoj temperaturi od 5ºC suspenzija centrifugirana 10 minuta s ubrzanjem 15000 g.

Iz centrifugata čvrsti su sastojci vezani na surfaktantne čestice odvojeni za daljnju obradu, a tekuća faza je uklonjena.

Čvrsti sastojak je raširen kako bi tvorio tanki sloj, a zatim je uklonjen ostatak organskog otapala u sušioniku smještenom pod vakuum tijekom dva sata.

Nakon toga je u odvojeni talog dodana fiziološka otopina soli s masom jednakom masi početne plazme, te je tvar resuspendirana miješanjem. Tako dobiveni pripravci plazme bit će označeni u idućem dijelu specifikacije sa slovom ″b″ koje se odnosi na inicijal surfaktantne tvari, bolus albe.

U dobivanju drugog, relativno pročišćenijeg pripravka plazme surfaktantna tvar je uklonjena na način da je u smjesu "b" dodan detergent pogodan za tkiva koji je u stanju otopiti pripravak plazme. U primjernom slučaju detergent je 0.01 mas% natrij lauril sulfata. Za dobrobit dobivanja prikladne suspenzije, tvar i u nju dodan detergent inkubirani su na sobnoj temperaturi 6 sati uz stalno miješanje, a zatim pohranjeni u frižider 8 do 12 sati. Tvar koja je stvorila talog za vrijeme inkubacije je resuspendirana, te je u ohlađenom stanju centrifugirana uz ubrzanje od 15000 g. Talog je uklonjen, a gornji tekući sloj sadržavao je korisnu tvar, koja će u slijedećem dijelu specifikacije biti označena slovom "f" za razlikovanje od tvari "b", te će označavati da je ova tvar pročišćenija.

Za olakšanje izvođenja pokusa na miševima oba tipa proizvoda razdijeljena su u doze od 1 mL, zatim su obilježeni i pohranjeni zaleđivanjem.

Proizvodi i okolnosti njihova pripravljanja bili su sterilni, stoga je tvar bila aseptična i pogodna za parenteralne primjene.

I. Pokusi s implantacijom S 180 sarkoma

Svi ovi pokusi izvođeni su s istim tipom BDFI miševa ženskog spola prosječne težine 25 g. I u ispitivanim i pozitivnim kontrolnim životinjama S 180 sarkom transplantiran je potkožno. Okolnosti pokusa koje se tiču tipa životinja, tipa implantiranih sarkoma i načina implantacije jednaki su onima opisanim u ranije spomenutoj međunarodnoj patentnoj prijavi. Svaka se pokusna skupina sastojala od najmanje pet miševa, a izneseni podaci odnose se na prosječnu vrijednost miševa združene skupine. Miševi su razlikovani prema prikladnim skupinama brojeva, te su imali pojedinačne brojeve.

Pokus 1

Iz krvi bolesnika koji boluju od akutne leukemije pripravljen je pripravak plazme tipa ″b″ koju je u pokusnoj skupini svaki miš dobio potkožno 0.1 mL svaki drugi dan, ukupno osam puta.

U skupini pozitivnih kontrola prosječna duljina života bila je 19.6 dana, a u pokusnoj skupini 23.5 dana. Ovo povećanje od 20% može se smatrati značajnim poboljšanjem. U gore spomenutoj međunarodnoj prijavi u vezi s istim tipom tumora najbolji pripravak rezultirao je s 5%-tnim povećanjem preživljenja, što je još uvijek ispod praga značajnosti. Stoga je prikladno odvajanje bezlipidnog sastojka plazme vrlo bitno.

Pokus 2

Ovaj pokus obuhvaća rezultate šest neovisnih pokusa, a temelji se na pretpostavci da je tvar učinkovita protiv tumora, za koju se smatra da je sadržana u bezlipidnom sastojku plazme, također prisutna u krvi osoba izliječenih od tumora. Takve su osobe odabrane kao davatelji, oni koji su preživjeli najmanje 10, te najviše 27 godina od vremena kad im je tumor otkriven, te se iz tog razloga mogu smatrati izliječenima. Dijagnosticirani tipovi tumora davatelja bili su redom tumori larinksa, debelog crijeva, dojke, limfoidna leukemija, tumori testisa i prostate kao i tumori pluća.

Pripravak plazme tipa "b" načinjen je u slučaju svih šest davatelja, te su njime tretirane određene skupine miševa. Srednje vrijeme preživljenja kontrolne skupine bilo je opet 19.6 dana, međutim, srednja vrijednost tretirane skupine varirala je između 25.5 i 27.3 dana, stoga je postojala samo blaga razlika između tretiranih skupina. Takvo preživljenje predstavljalo je poboljšanje između 30% i 40% u odnosu na kontrolnu skupinu, što je vrlo značajno.

U daljnjem pokusu proizvod plazme tipa "b" načinjen je iz jednakih smjesa plazmi dobivenih od sviju šest davatelja nakon uklanjanja krvnih zrnaca. Ovaj je proizvod povećao preživljenje za 38% u odnosu na kontrolnu skupinu.

Ovi su pokusi tako potvrdili hipotezu prema kojoj sastojak bezlipidne plazme osoba izliječenih od tumora uključuje učinkovitu tumorsku inhibirajuću tvar. Štoviše dokazano je da postojanje takve tvari ne ovisi (barem u slučaju ispitivanih tumora) o stvarnom tipu tumora, te je stoga smjesa jednako učinkovita.

Pokus 3

Za davatelje je izabrana takva stoka (goveda) kod kojih je ispitivanjem krvi potvrđena stočja leukoza. Iz krvi takvih davatelja načinjeni su tipovi ″b″ i ″f″ proizvoda plazme. Slično, oba tipa proizvoda plazme pripravljena su iz krvi stoke čija krv nije pokazala prisutnost leukoze.

Ispitivanja su provedena na nekoliko načina, tako da je kao prvi promijenjivi parametar bio broj tretmana primijenjivan svaki drugi dan, drugi parametar bila je količina doze koja se mijenjala između 0.1 i 0.15 mL, te treći parametar čistoća proizvoda tj. primjenjivan je tip ″b″ ili ″f″. Preporučljiv raspon ispitivanja ovih parametara određen je pilotnim pokusima prije pravih pokusa, te su nađeni optimumi koji se tiču doze i broja tretmana.

Proizvod dobiven iz krvi stoke koja ima leukozu zadovoljava kriterij široke uporabe kako nema ograničenja s obzirom na dostupnost davatelja, te na etička i moralna razmatranja. Podaci o preživljenju bitno premašuju ionako povoljne podatke pripravaka dobivenih od ljudi kao davatelja. Stoga je to razlog detaljnog opisa rezultata ovih pokusa.

Tijekom pokusa su praćene prosječna težina životinja, prosječno vrijeme preživljenja, nadalje u fazi prije pokusa uzeti su uzorci 1 mL krvi od određenih miševa svake skupine, te je u uzorcima ispitivana prisutnost na više tumorskih biljega. Miševi od kojih su uzeti uzorci krvi uklonjeni su iz daljnjih ispitivanja s obzirom da ne mogu preživjeti davši toliku količinu krvi.

Podaci koji se odnose na vrijeme preživljenja

Rezultati koji se odnose na vrijeme preživljenja mogu se podijeliti u dvije glavne skupine, nazvane ovisno o tome je li tretman proveden s "b" ili "f" tipom proizvoda. Porijeklo od stoke koja je imala leukozu označena je kraticom "Bbo", stoga je tretman prve glavne skupine bio izveden s tvari Bbo-b, te druge glavne skupine s tvari Bbo-f.

Dani su brojani od implantacije tumora. Svaka krivulja prikazana na Sl. 1 do 7 odnosi se na srednje vrijednosti skupine koja uključuje najmanje 5 miševa.

Sl 1 i 2 prikazuju dijagrame preživljenja skupina tretiranih s tvari Bbo-f. Miševi u pozitivnoj kontrolnoj skupini nisu dobili nikakav tretman nakon implantacije osim uobičajenog hranjenja, miševi u tretiranoj skupini tretirani su svaki drugi dan s tvari Bbo-f određene mase. U svakom tretmanu u skupinama prikazanim na Sl. 1 doza je bila 0.15 mm. Dvije tretirane skupine razlikovale su se jedna od druge u broju tretmana. U prvoj skupini primijenjeno je 8 tretmana, dok je u drugoj broj tretmana bio 10, nakon čega miševi nisu dobili nikakav daljnji tretman. U slučaju skupine koja je dobila 10 tretmana može se vidjeti da je nakon završetka tretmana tj. nakon 20. dana stopa smrtnosti naglo porasla. Ovaj nagli porast se također može vidjeti u skupini s 8 tretmana, ali je zanimljivo primijetiti da porast dolazi kasnije i nije tako nagao. Prosječno vrijeme preživljenja u odnosu na kontrolnu skupinu s 19.6 dana, za skupinu s 8 tretmana 24.8 dana, dok je za skupinu s 10 tretmana 23.2 dana.

U svakoj skupini prikazanoj na Sl. 2 tretman je proveden 10 puta svakog drugog dana. Razlika leži u dozi. Miševi u prvoj skupini dobili su 0.15 mL doze pri svakom tretmanu, dok je druga skupina tretirana s dozom od 0.1 mL. Razlika je vrlo očita kada se doza smanji. Vrijeme preživljenja povećalo se do 30 dana što predstavlja 153%-tno poboljšanje u odnosu na pozitivnu kontrolnu skupinu.

Rezultati tretmana s tvari Bbo-b prikazani su na Slikama u 2 skupine. U slučaju Sl. 3 do 5 promijenjivi parametar je doza. U slučaju prikazanom na Sl. 3 tretman je proveden 6 puta, te se može vidjeti da vrijeme preživljenja ne ovisi o uporabljenoj dozi, manja doza je nešto bolja. Vrijeme preživljenja je bilo, međutim, znatno bolje u usporedbi s tvari Bbo-f, s obzirom da je srednje vrijeme preživljenja bilo 37 dana što je gotov 189%-tno poboljšanje u odnosu na pozitivnu kontrolu. Ovisnost vremena preživljenja o dozi bit će očitija kada se razmatra Sl. 4. Ovdje je broj tretmana bio 8 puta. Pod učinkom doze od 0.15 mL vrijeme preživljenja je smanjeno u usporedbi s vrijednošću dobivenom s 6 tretmana, a ovo može biti samo posljedica prevelike doze. Nasuprot tomu doza od 0.1 mL čini se da je optimalna s 8 tretmana, s obzirom da je srednje vrijeme preživljenja znatno poraslo, a dijagram 59. dana još nije dosegao 50%-tnu vrijednost. Prema tome je preživljenje naraslo preko 300% što je iznimno povoljan rast.

Sl. 5 prikazuje srednje vrijeme preživljenja u slučaju miševa koji su dobili 10 tretmana. Iznenađuje što je ovdje doza 0.15 mL jer u ovoj skupini preživljenje naglo pada, ali srednja vrijednost je bolja nego u prijašnjoj skupini sa sličnim tretmanom. Zbog malog broja miševa razlike bi mogle prozaći iz više ili manje povoljnog ponašanja jednog ili dva miša. Nagla smrtnost raste u slučaju doze od 0.1 mL nakon 33. dana, što bi također mogla biti posljedica prekomjerne doze.

Na Sl. 6 i 7 promijenjivi parametar je broj tretmana. Usporedba dviju slika ovdje također predočava primjenu 8 tretmana s dozom 0.1 mL kao optimalnom. Iz Sl. 7 može se zaključiti da u slučaju veće doze poboljšanje je povećano s manjim brojem tretmana što također upućuje da je doza bila previsoka.

Izlječenje tumora i prosječna težina životinja

Poboljšanje uočeno u statusu životinja tretiranih skupina može se prepoznati ne samo temeljem prosječnog vremena preživljenja. U životinja početne težine 25 g nastali su izrazito veliki tumori težine 6 do 8 g tj. blizu trećine ukupne težine životinje. U životinja tretiranih s 0.1 mL doze tvari Bbo-b osam puta pri kraju ciklusa tretiranja dobro raspoznatljiv tumor je promijenjen, sarkom je otvoren, a kašasta tvar je uklonjena. Ova tvar je sadržavala mrtve tumorske stanice. "Izraslina" na životinjama je nestala, a one su dobivale na težini.

Sl. 8 prikazuje vrijednosti prosječne tjelesne težine životinja u prvih 19 dana s obzirom na skupine Bbo-b i Bbo-f, obje s 8 tretmana, te pozitivna kontrolna skupina. Dijagram dobro odgovara gore opisanom izvještaju statusa, osobito u slučaju tretmana s tvari Bbo-b. Nedostatak dijagrama je što ne prikazuje odvojeno masu tumora. Nismo mogli dobiti točne vrijednosti težine tumora, stoga ukupna tjelesna težina također uključuje težinu tumora. U tretiranoj skupini uobičajen je početni pad nakon čega slijedi regenerativni porast, u slučaju pozitivne kontrolne skupine težina promjenjivo raste uzrokovana uglavnom porastom tumora.

Od gornjih pokusa oni koji su se pokazali najboljima ponovljeni su s takvom tvari koja je dobivena od zdrave stoke bez leukoze. Rezultati se nisu značajno razlikovali od onih dobivenih kod pozitivne kontrolne skupine, te je ovim potvrđeno da je učinkovita samo tvar dobivena iz krvi stoke koja ima leukozu.

Rezultati ispitivanja enzimskih tumorskih biljega

U ispitivanju metaboličkih promjena koje su udružene sa zloćudnim procesima nekoliko je enzimskih tumorskih biljega koji se određuju u kliničkoj praksi, te je od tih postupaka odabran određen broj tipova koji se mogu uporabiti u rutinskim ispitivanjima. U odabiru postupaka uzeto je u obzir da su zloćudni procesi udruženi i često podržavaju složene biokemijske poremećaje. Stoga se zbog ovih razmatranja činilo neophodnim razviti testove za metabolizam nukleinskih kiselina (serumska aktivnost alkalne (bazične) i kisele dezoksiribonukleaze, 5' - nukleotidaze); metabolizam poliamina (aktivnost arginaze); funkciju mitohondrija u jetri (aktivnost ornitin karbamoil transferaze); glukoneogenezu (aktivnost fosfoheksoza izomeraze); i utvrđivanje procesa u kostima (koštano specifična aktivnost alkalne fosfataze). Promjene u aktivnosti navedenih enzima prate metaboličke promjene koje su udružene i podržavaju zloćudne procese, te rezultate primijenjenih terapija.

Za vrijeme ispitivanja uzeti su uzorci krvi iz miševa 8., 15. i 19. dana nakon implantacije tumora. Podaci su sumirani u Tablici 1. Podaci se odnose na prosječne vrijednosti određenih pet miševa, svih ispitivanih odvojeno.

Značenje pojedinih stupaca u Tablici:

β-Glyc: nespecifična fosfataza, β-glicerofosfata; ovu vrijednost valja oduzeti od vrijednosti drugih fosfataza kako bi se mogli tumačiti kao tumorski biljezi;

5'-AMP: enzimska obitelj 5'-nukleotidaza, točnije: 5'-adenozin-5-monofosfat

Alk. F: alkalna fosfataza

5'-TMP: 5'-timidin-5-monofosfat

PDE: fosfodiesteraza

SDNaz: kisela dezoksiribonukleaza (kisela DNAza)

Σ.5'-ND: ukupna vrijednost svih 5'-nukleotidaza

Tablica 1: Učinci plazmatskog seruma Bbo-b i Bbo-f na miševe sa S-180 sarkomom

[image]

U tablici se uočavaju tri različite skupine. Zadnja skupina odnosi se na kontrolu s miševima kojima tumor nije implantiran, miševi 51-55 ispitivani su 8. dana, miševi 56-60 ispitivani su 15. dana, a miševi 106-110 ispitivani su 19. dana.

Srednja skupina odnosi se na pozitivne kontrole s miševima 151-155 koji su ispitivani 8. dana, miševima 101-105 15. dana, te miševima 41-50 19. dana.

Prva se skupina može podijeliti u dvije podskupine, one koji počinju sa znamenkom 2 tretirane su s tvari Bbo-b, te one koje počinju sa znamenkom 3 tretirane s tvari Bbo-f. U podskupini Bbo-b ispitivanje miševa 281-290 izvršeno je 8. dana, miševa 276-280 15. dana, miševa 271-275 19. dana, te konačno ispitivanje miševa 246-250 izvršeno je s obzirom na znatno preživljenje mnogo kasnije, 45. dana.

U drugoj podskupini miševa tretiranih s tvari Bbo-f raspodjela prema danu ispitivanja je: 396-400; 8. dana; 391-395: 15. dana; 385-390: 19. dana.

Rezultati su sumirani u obliku dijagrama kolona na Sl. 9 na kojima su skupine miševa prikazane na vodoravnoj osi, te udružene s podacima na okomitoj osi jedna iznad druge, gdje visina stušaca izražava zbroj podataka. Na vodoravnoj osi skupine miševa prikazane su odvojeno, te unutar svake skupine s lijeva na desno slijedi rastući redoslijed datuma uzorkovanja.

Tri lijeva stupca odnose se na kontrolnu skupinu, srednja tri stupca odnose se na pozitivnu kontrolnu skupinu, prva tri stupca od sedam desnih stupaca pripadaju podskupini Bbo-f, a posljednja četiri stupca pripadaju podskupini Bbo-b.

U kontrolnoj skupini podaci se, naravno, ne mijenjaju s vremenom, njihove fluktuacije su unutar prirodnog raspona. U slučaju pozitivne kontrolne skupine sve su komponente iznimno visoke, te su u vremenu uginuća (posljednji stupac) još porasle.

Nasuprot tomu, u obje tretirane skupine početne vrijednosti su već manje od podataka pozitivne kontrolne skupine, te dalje padaju s vremenom. Tvar Bbo-b osigurala je u skladu s povoljnim podacima preživljenja znatno bolje rezultate nego tretman s tvari Bbo-f. Pad se nastavlja nakon 19. dana, te su na kraju pokusa podaci za kontrolnu skupinu blizu normalnih vrijednosti.

Pokus 4

Na temelju povoljnih rezultata dobivenih u prethodnim pokusima ispitivano je koji su sastojci bezlipidne plazme odgovorni za učinak. Kako smo imali zdravu ljudsku krv, krv osoba s akutnom leukemijom, ljudsku krv osoba izliječenih od tumora, nadalje krv uzetu od stoke sa i bez leukoze, pripravak tipa "b" načinjen je od svake od spomenutih krvi, te su učinjena ispitivanja elektroforezom. Za ispitivanja početna tvar stavljena je na površinu uporabljivanog poliakrilamidnog gela, te su se nakon učinka elektroforetske obrade sastojci tvari razdvojili prema veličini njihovih molekulskih težina.

Frakcije uzete iz krvi za koje je dokazano da su neučinkovite sa stajališta tretmana tumora, tj. normalna ljudska krv i krv uzeta od stoke bez leukoze uspoređivana je s frakcijama dobivenim iz tipova krvi koje su učinkovite sa stajališta tretmana tumora. Najočiglednija razlika uočena je u frakcijama krvi uzete od stoke s leukozom, te se nalazila u prisutnosti frakcije molekulske težine oko 40000, te druga frakcija molekulske težine između 300000 i 350000. Ove dvije frakcije zajedno predstavljaju 8 do 12 % mase uzorka. Frakcije krvnih pripravaka uzete od davatelja s izliječenim tumorom sadržavale su oba ova sastojka, međutim, bila je očitija prisutnost frakcije molekulske težine oko 40000, a količina frakcija bila je znatno manja, oko 2-3%. Među frakcijama pripravaka uzetih iz krvi s akutnom leukemijom sastojak molekulske težine 40000 bio je prisutan samo u tragovima, a druga frakcija nije bila utvrđena.

Kako bi olakšali utvrđivanje dviju spomenutih frakcija, ona molekulske težine oko 40000 označit će se kao "bovin 40", a druga frakcija između 300000 i 350000 bit će označena kao "bovin 300". Ovdje opisan postupak dovoljan je za nepogrešivo utvrđivanje ovih dviju frakcija. Utvrđivanje strukture ovih dviju frakcija još je u postupku. Znajući prikazane rezultate može se ustvrditi uz dobre temelje da je prisutnost tvari bovin 40 i bovin 300 odgovorno za pokazane učinke.

II. Pokus s implantacijom C26 tumora debelog crijeva

Pokusi su izvedeni s prvom generacijom domaće uzgojenih Balb/c miševa muškog spola.

Mjesto porijekla miševa je TNO Institut, Rijkswiijk, Nizozemska, a mjesto njihovog uzgoja Nacionalni institut za onkologiju (Mađarska), Odjel eksperimentalne farmakologije.

Uvjeti uzdržavanja životinja su bili: kavez od makrolonskog materijala, temperatura 20 - 22ºC, relativna vlažnost 45 -55%, tama i svijetlost izmjenjivani su svakih 12 sati. Hranjenje je provođeno s mišjom hranom standardne kakvoće koja se može sterilizirati u autoklavu (tip: Altromin, Njemačka), stelja je načinjena od drvene piljevine. Higijenska razina uzgoja bila je u skladu s propisanim SPF (Specified Pathogen Free) uvjetima. Briga i uzdržavanje životinja bili su u skladu s Helsinškom deklaracijom "Guiding Principles for the Care and Use of Animals".

Colon-26 adenokarcinom debelog crijeva nabavljen je od SRI, Birmingham, Alabama, SAD. Način transplantacije: iz održavanog tumora uzet je komadić od 20 mg i implantiran potkožno u međulopatično područje.

Za vrijeme pokusa životinje su podijeljene u dvije skupine od po deset miševa, životinje u pozitivnoj kontrolnoj skupini nisu bile tretirane nakon implantacije. U tretiranim skupinama tretman je provođen s prethodno opisanom Bbo-b tvari. Ova je tvar za vrijeme dokumentiranja pokusa također označivana i kao ABB-7. Iskorištena su iskustva dobivena u I. seriji pokusa, te je tretman primijenjivan jedanput dnevno u isto vrijeme, između 1 i 9 dana, sve zajedno osam puta. Razlike između odgovarajućih skupina bile su u načinu tretmana, te u količini primijenjene pokusne tvari.

Podaci preživljenja sumirani su na Sl. 10. U slučaju pozitivne kontrolne skupine 100% vrijeme preživljenja bilo je 19 dana. U prvoj skupini tretman je proveden intraperitonelano (Ipl) uz dozu od 0.1 mL, u drugoj skupini način primijene je bio isti, ali je doza bila 0.15 mL, te je također isprobana primijena tvari na usta (per os). Ovdje je korišten prikladni aplikator doze kako bi se tvar dovela izravno u želudac životinja. U prvoj per os (po 1) skupini doza je bila 0.2 mL tvari, a u drugoj per os (po 2) skupini doza je bila 0.3 mL. Slijedeća skupina sc također je tretirana, a primijenjivano je 0.1 mL tvari potkožno. Podaci o preživljenju prikazuju prosječne vrijednosti skupina od deset miševa. Iz slike se može vidjeti da je u slučaju svake tretirane skupine došlo do znatnog poboljšanja, najučinkovitija dva tretmana bila su ip primjena s 0.1 mL i po tretman s 0.2 mL tvari.

Pokusi su ponovljeni u slijedećim skupinama od deset miševa, te su zbog mjerenja tumorske mase tumori uklonjeni iz životinja u agonalnom stanju (tj. neposredno prije smrti), a mase tumora mjerene.

Sl. 11 prikazuje rezultate ovih pokusa. Iznad stupaca su dane vrijednosti odgovarajućih razina pouzdanosti, koje su u svim slučajevima bile manje od 0.05 tj. podaci su vrlo pouzdani.

U slijedećim skupinama slično tretiranih deset miševa, određivane su aktivnosti 5'-nukleotidaze u uzorcima uzetim 8., 16. dana od implantacije tumora, te u stanju uginuća kao i u slučaju I. serije pokusa. Ovi su podaci prikazani na Sl. 12. Aktivnost je porasla od početne niske vrijednosti do vrlo visoke vrijednosti 16. dana, a kada je nastupilo agonalno stanje i uginućeuginuća aktivnost je znatno snižena od vrijednosti dobivenih kod pozitivne kontrolne skupine.

III. Pokusi s implantacijom MXT tumora dojke

U uvjetima uzdržavanja opisanim u pokusu II, BDF1 miševi ženskog spola opisanog porijekla korišteni su u ispitivanju učinaka tretmana s tvari Bbo-b u slučaju MXT tumora dojke. Mjesto porijekla tumorskih stanica koje su transplantirane je MASON Res. Inst. SAD. Iz uščuvanih tumora komadić volumena 1 mm3 implantiran je potkožno u međulopatično područje.

Kao i u slučaju pokusa II, stvorene su skupine životinja od po deset miševa, a unutar svake skupine miševi su jednako tretirani. Tretman s tvari Bbo-b izveden je isto kao i u pokusu II, tj. jedanput u isto vrijeme svakog dana tijekom 8 dana. U slučaju pozitivne kontrole prosječno vrijeme preživljenja bilo je 24 dana. Sl. 13 prikazuje vrijeme preživljenja u slučaju različito tretiranih skupina. Može se vidjeti da je određen broj različitih skupina tretiran na isti način, na pr. dozom od 0.15 mL skupine ip1 i ip2 jednako su tretirane intraperitonealno ili skupine po2 i po3 tretirane su dozom od 0.3 mL per os. U ovom tipu tumora porast vremena preživljenja bio je oko 40%, te je bio najveći u slučaju tretmana per os.

Ispitivanja mase tumora izvedena su na životinjama u agonalnom stanju, pred uginuće, kao što je opisano u pokusu II, a rezultati su sumirani na Sl. 14 i 15. Brojevi označeni na vodoravnoj osi odnose se na serijske brojeve miševa u određenoj skupini, te nemaju posebno značenje. Okomiti odsječci označeni u dijagramima kolona odnose se na devijacije unutar pojedine skupine. Pad tumorske mase bio je također najznačajniji kod per os primijenjenih tretmana.

Ispitivanja 5'-nukleotidaze izvedena na pokusnim životinjama pokazala su znatno sniženje u tretiranim skupinama; međutim analiza svih pokusnih podataka takvih ispitivanja još nije dovršena, te stoga ne mogu biti sumirani u obliku tablice.

IV. Pokusi s implantiranom akutnom L1210 limfoidnom leukemijom

Učinci tvari Bbo-b ispitivani su u slučaju akutne L1210 limfoidne leukemije. Skupine od deset miševa stvorene su od BDF1 miševa muškog spola uzdržavanih kako je opisano u vezi s pokusima II i III. Tekućina ascitesa DBA/2 miševa u kojoj je uščuvana akutna L1210 limfoidna leukemija, a tekućina načinjena iz fiziološke otopine, njen 0.1 mL sačinjavao je 106 stanica. Iz te tekućine ubrizgano je 0.1 mL intraperitonealno u svakog pokusnog miša, te su u tretiranim skupinama provedeni tretmani jedanput dnevno tijekom 8 dana kao u slučaju pokusa II i III.

Sl. 16 prikazuje podatke o preživljenju. Prosječno vrijeme preživljenja u pozitivnoj kontrolnoj skupini bilo je 9.9 dana. Na Sl. 16 može se vidjeti da postoji znatna razlika u vremenu preživljenja ovisno o tome kako je tvar primijenjena. U odgovoru na intraperitonealnu i potkožnu primjenu, vrijeme preživljenja je 170%, a nasuprot tomu per os primjena 0.2 mL doze rezultirala je 320% vremenom preživljenja, ali su u ovoj tretiranoj skupini velike razlike između pojedinačnih životinja, a neke od njih su potpuno izliječene. U ovom tipu tumora nije bilo načina odrediti relativnu masu tumora, a tekućina ascitesa nakupljena u peritonealnoj šupljini zajedno s tumorima prisutnim u mezenteriju činili su ukupnu masu tumora. Sl. 17 prikazuje izmjerenu težinu tako utvrđenih apsolutnih masi tumora u skupinama u stanju uginuća. Životinje koje su bile žive 30. dana također su pripadale ovim skupinama. Na Sl. 17 može se vidjeti da u tri tretirane skupine nije pronađena mjerljiva masa tumora.

Sl. 18 prikazuje promjenu aktivnosti 5'-nukleotidaze 5. i 8. dana kao i u stanju uginuća. Iz dijagrama se može vidjeti znatno poboljšanje u svim tretiranim skupinama, a u nekim tretiranim skupinama postignute su normalne vrijednosti.

U daljnjim skupinama miševa koji su sudjelovali u pokusima I i IV provedena su histološka ispitivanja u nekoliko različitih vremena. Ispitivanja su uključivala histološku analizu 17 različitih organa. Temeljem takvih histoloških ispitivanja utvrđeno je kako metastaze nisu nastale niti u jednom od ispitivanih tipova tumora. U slučaju pozitivnih kontrola, međutim, pronađena je dobro uočljiva metastatska aktivnost. Ovo je bilo utvrđeno u slučaju pojedinih tipova tumora kako slijedi: u slučaju S180 sarkoma u limfnim čvorovima i u jetri; u slučaju C26 u jetri i u mezenterijskim limfnim čvorovima; u slučaju MXT tumora u jetri; i u slučaju L1210 u koštanoj srži.

Gornji rezultati pokusa navode na mogućnost da će uočena značajna poboljšanja također biti postignuta u tipovima tumora koji ovdje nisu ispitivani. Ispitivanja koja pokrivaju sve tipove tumora bit će neophodna s obzirom na njihov izniman značaj. Ipak, gornji pokusi dovoljno su opsežni kako bi podržali postojanje glavnog učinka.

Rješenje prema ovom izumu može se učinkovito koristiti ne samo za liječenje tumora, već i za praćenje i sprječavanje stvaranja metastaza.

Zahvaljujući činjenici da su dvije odvojene frakcije koje su odgovorne za učinak, ili barem frakcija bovin 40, prisutne u krvi osoba koje imaju tumor, ispitivanje ovih frakcija može se uporabiti u dijagnostici tumora.

Rezultati dobiveni s pripravkom prema izumu sa svojom dijagnostičkim potencijalom obećavajući su u smislu učinkovitog liječenja i dijagnostike tumora. Broj grla stoke oboljele od leukoze značajan je širom svijeta, što dopušta proizvodnju velikog reda veličine. Dodatno, postoji mogućnost izuma sintetičkog načina proizvodnje tvari bovin 40 i bovin 300, stoga bi pomno ispitivanje ovih tvari moglo očekivano dovesti do takve proizvodnje.

Claims (16)

1. Farmaceutski pripravak, naznačen time, što sadrži sastojke bezlipidne frakcije krvne plazme papkara s parnim brojem prstiju koji nisu smrtonosno ugrožena leukozom.

2. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 1, naznačen time, što je papkar s parnim brojem prstiju stoka.

3. Farmaceutski pripravak za liječenje tumora, naznačen time, što sadrži tvar koja pokazuje razliku ustanovljivu elektroforezom između bezlipine frakcije krvne plazme dobivene od stoke koja ima leukozu i bezlipidne frakcije krvne plazme dobivene od zdrave stoke.

4. Postupak za pripravu bezlipidne frakcije krvne plazme prema zahtjevu 1 koji sadrži korake neobaveznog obrađivanja početne krvi sa sredstvom protiv zgrušavanja krvi i izdvajanja čestica iz nje, naznačen time, što sadrži korake obrade frakcije plazme prvim organskim otapalom, dodavanje surfaktantske tvari građene od sitnih zrnaca, miješanja tekućine, potom izdvajanja bezlipidne frakcije vezane na spomenuta zrnca od tekuće komponente centrifugiranjem, te prevođenja spomenute izdvojene frakcije opetovano u otopinu.

5. Postupak prema zahtjevu 4, naznačen time, što se koristi drugo organsko otapalo za provođenje spomenutog koraka prevođenja spomenute bezlipidne frakcije vezane za spomenuta zrnca centrifugiranjem, te prevođenja spomenute izdvojene frakcije drugi puta u otopinu.

6. Postupak prema zahtjevu 5, naznačen time, što se koristi fiziološka otopina u spomenutom koraku prevođenja spomenute izdvojene frakcije drugi puta u otopinu.

7. Postupak prema zahtjevu 5, naznačen time, što se koristi tekućina koja predstavlja otapalo za spomenutu bezlipidnu frakciju u spomenutom koraku prevođenja spomenute izdvojene frakcije u tekuću frakciju opetovanim centrifugiranjem.

8. Postupak prema zahtjevu 4, naznačen time, što spomenuta zrnca surfaktantske tvari imaju veličinu između 200 i 400 nm.

9. Postupak prema zahtjevu 4, naznačen time, što je masa spomenute surfaktantske tvari 0.5% mase spomenute frakcije plazme.

10. Postupak prema zahtjevu 4, naznačen time, što je spomenuta surfaktantska tvar bolus alba.

11. Postupak prema zahtjevu 4, naznačen time, što je masa spomenutog prvog organskog otapala u osnovi jednaka masi spomenute frakcije plazme.

12. Postupak prema zahtjevu 5, naznačen time, što je masa spomenutog drugog organskog otapala u osnovi jednaka masi spomenutog prvog organskog otapala.

13. Postupak prema zahtjevu 5, naznačen time, što je spomenuto prvo organsko otapalo alkohol, a spomenuto drugo organsko otapalo je smjesa jednakih dijelova alkohola i toluena.

14. Uporaba farmaceutskog pripravka iz zahtjeva 1, naznačen time, što je u svrhu liječenja i praćenja tumora.

15. Uporaba farmaceutskog pripravka iz zahtjeva 1, naznačen time, što je u svrhu sprječavanja razvoja sekundarnih tumora nakon primarnog tumora.

16. Uporaba zahtjeva 14, naznačen time, što je u svrhu liječenja S180 sarkoma, C26 tumora debelog crijeva, MXT tumora dojke i akutne limfoidne leukemije.