JP2000503631A

JP2000503631A - 非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物および赤血球組成物

Info

Publication number: JP2000503631A
Application number: JP9521462A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．スライター，シェリル
Original assignee: パゲットサウンドブラッドセンター
Priority date: 1995-12-04
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 2000-03-28
Also published as: CA2239574A1; WO1997020570A1; AU1282597A; EP0874635B1; DE69626853T2; ATE234622T1; AU725669B2; DE69626853D1; EP0874635A1

Abstract

(57)【要約】非免疫原性および／または寛容原性の血小板組成物および赤血球組成物が提供される。このような組成物は実質的に白血球を含まない。濾過、遠心分離、およびUV照射の種々の組み合わせを使用するこのような組成物の調製方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物および赤血球組成物技術分野本発明は、一般に、血液製剤（blood product）に関し、そしてより詳細には非免疫原性かつ寛容原性（toleragenic）の血小板組成物および赤血球組成物、およびこれを生成する方法に関する。本発明の背景種々の障害の患者は、断続的または長期的な輸血支持を受けるか、または欠陥器官に代わる組織移植を必要とする。輸血支持を必要とする個体は、代替治療を必要とする１つ以上の血液成分の遺伝的欠陥または後天性欠陥のいずれかを有し得る。血液から調製された多くの異なる製剤は、輸血（細胞成分および血漿成分の両方を含む）に利用できる。しかし、血液製剤に繰り返し曝露されると、しばしば、レシピエントが外来輸血抗原を認識するようになる。例えば、同種免疫血小板不応性は、反復血小板輸血を必要とする患者の30％〜60％までで生じる。外来抗原のこのような免疫認識のために、輸血の利益を達成できず、そしてある環境では、レシピエントに有害な結果を伴う輸血反応の原因にさえなり得る。いくつかのアプローチが、同種免疫を防ぐかまたは遅らせるかのいずれかのために用いられてきた。主要な技術には、輸血レシピエントが、輸血外来抗原を認識するのを防ぐための免疫抑制治療を与えることが含まれる。このような免疫抑制治療は、しばしば、処置にもかかわらず同種免疫をもたらす認識過程を抑制するには不十分である。さらに、免疫抑制治療は、器官毒性および所望の応答（例えば、病原性細菌の認識および破壊）の免疫抑制を含む、所望されない副作用をもたらし得る。一旦、外来抗原に対する免疫応答が生じると、いかなる免疫抑制治療も有益であるという証拠はほとんど存在しない。継続的な適切な輸血支持は、ドナーとレシピエントとの間で抗原の適合が達成された場合のみ可能である。しばしば、適合するドナーが入手できないか、またはいくつかの血液製剤については、免疫応答に関与する抗原系がほとんど知られていないので、研究室の方法では、適合するドナーを適切に選択することが不可能である。レシピエントを免疫抑制する以外の同種免疫を防ぐための別のアプローチは、輸血される製剤の免疫原性を減少させることである。全ての輸血される血液製剤は免疫原性であり、そしてほとんどの輸血されたレシピエントに免疫応答を最終的に誘導するので、免疫化を防ぎ得るかまたは少なくとも遅らせ得る任意の手順が有益である。最初の輸血を始める抗原適合性ドナーのみを選択することはある環境では可能であるが、大多数の患者については、この過程を続けるためのドナーが十分に入手できないか、または適合させる手順が存在しない。器官移植については、外来組織抗原に持続的に曝露されるので、最終的には、移植した組織の拒絶が生じる。移植拒絶を防ぐためのいくつかのアプローチが用いられている：レシピエント免疫抑制、ドナーとレシピエントとの組織抗原を適合させること、移植した組織の免疫原性を減少させること、またはレシピエントにおいて移植片の外来抗原に対する寛容の状態を誘導すること。さらに、移植される組織に依存して、首尾よく移植を達成するには異なるアプローチが必要であり得、そして組合せ治療は、その有益な効果において付加的であり得る。例えば、骨髄移植では、莫大な線量の化学放射線治療がレシピエントに施されて、レシピエントの自己骨髄が破壊されそしてドナー骨髄の移植を許容する免疫抑制が誘導される。骨髄ドナーとレシピエントとが、主要組織適合抗原系（HLA）について関連し、かつよく適合する場合、なおよりよい結果が得られる。骨髄移植後、通常は免疫抑制が与えられるにもかかわらず、それは制限された時間のみである。対照的に、腎移植については受容不可能な骨髄および消化管毒性を避けるのに必要な免疫抑制治療の程度はより低い。さらに、継続的な移植後の免疫抑制が必要とされる。しばしば、関連した腎ドナーは入手できず、そしてドナーとレシピエントとの間のHLA適合の程度がより低いことは、しばしば骨髄移植よりもよく受容される。これらの２つの型の組織移植の他の主要な違いは、移植の前の輸血の効果である。腎移植レシピエントについては、事前の輸血は、（特に意図された腎ドナー由来の）続く腎移植のためにある程度寛容を誘導することによって明らかに有益である。しかし、骨髄移植の前の事前の血液輸血により、特に血液が意図された骨髄ドナー由来である場合、移植拒絶の危険が目に見えて増加する。従って、器官移植を増強するための手順（免疫抑制およびドナー-レシピエントHLA適合）が類似しているにもかかわらず、以下のような明らかな違いがある：（１）要求される免疫抑制の量、型、および期間；（２）器官ドナーとレシピエントとの間の非HLA同一性の受容；および（３）続く器官移植を増強するかまたは損なうことに対する、事前の輸血の効果。さらに、最もよく組み合わされた治療は、器官移植を確実に成功させることにおいて常に成功するとは限らず、そして、用いられた治療に付随して実質的に毒性であり得る。適合しているHLAおよびレシピエント免疫抑制を用いることに加えて、移植された組織の免疫原性を直接減少する努力、またはレシピエントに寛容を誘導する努力（腎レシピエントでの事前の血液輸血よるもの以外）は、限定されてきた。骨髄移植において、幹細胞のための骨髄移植片を精製または豊化し、そして移植片対宿主病（移植後の合併症）を担い得るＴリンパ球を排除するための努力により、しばしば、移植し損ねた移植骨髄が生じた。何人かの研究者は、移植を容易にするために移植（皮膚移植）の前にインビトロで移植片を保存または培養した。器官移植を増強するためのこれらの後者の方法のほとんどは、限定的に成功した。輸血または移植の後の、レシピエントによる不適合なドナー抗原の免疫認識、および続く同種組織の破壊を避けることは、有益である。本発明は、この要求を完全に満たし、そして他の関連する利点をさらに提供する。発明の要旨本発明は、非免疫原性かつ／または寛容原性の血小板組成物および／または赤血球組成物を提供する。このような組成物は、実質的に白血球を含まない。本発明の関連する局面において、このような非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を調製する方法が提供され、この方法は、血小板豊富血液製剤を一回以上遠心分離し、そしてその上清を回収する工程；および上清を濾過し、そして濾液を回収して血小板組成物を生成する工程を包含する。この遠心分離の工程は、血小板調製過程の任意の時点で、ハードスピンを伴うかまたは伴わない１回または２回のソフトスピンを含み得る。濾過工程は、遠心分離工程の後、またはソフトスピンの一回目と２回目との間に行われ得る。あるいは、濾過の工程は、遠心分離工程の前に行われ得る。別の関連する局面内において、非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を調製する方法は：（a）血小板豊富血液製剤をまずソフトスピンし、そして血小板組成物の上清を回収する工程；（b）血小板組成物を２回目にソフトスピンし、そして血小板組成物の上清を回収する工程；（c）血小板組成物をハードスピンし、そして血小板組成物の上清を回収する工程；および（d）血小板組成物を濾過し、そして血小板組成物の濾液を回収する工程；を包含し、ここで、工程（a）は、工程（b）、（c）、および（d）の前に行われ、そして工程（b）、（c）、および（d）は任意の順序で行われ得る。なお別の関連する局面において、非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を調製する方法は：（a）血小板豊富血液製剤をハードスピンし、そして血小板組成物の上清を回収する工程；（b）血小板組成物をソフトスピンし、そして血小板組成物の上清を回収する工程；および（c）血小板組成物を濾過し、そして血小板組成物の濾液を回収する工程；を包含し、ここで、工程（a）は、工程（b）および（c）の前に行われ、そして工程（b）および（c）はどちらの順序でも行われ得る。本発明の別の関連する局面において、非免疫原性の血小板組成物が提供される。本組成物は、（a）血小板豊富血液製剤を遠心分離し、上清を回収し、そしてこの組成物をUV照射に曝露する工程；または（b）血小板豊富血液製剤を濾過し、濾液を回収し、そして濾液をUV照射に曝露する工程のいずれかによって生成され得る。UV-Bが好ましいが、UV-A、UV-B、またはUV-Cの任意の照射が光付加剤（例えば、ソラリン（psoralin））とともにまたはなしで用いられ得る。遠心分離工程または濾過工程、およびUV照射工程は、どの順序でも行われ得ることが明らかである。上記の任意の方法において、適切な血小板豊富血液製剤は、全血、血小板豊富血漿、濃縮血小板、アフェレーシス血小板、および軟膜血小板調製物を含む。別の局面において、本発明は、非免疫原性かつ／または寛容原性の赤血球組成物を調製する方法を提供し、その方法は:（a）赤血球豊富血液製剤を遠心分離し、そして赤血球の下層を回収する工程；および（b）次に下層を濾過し、そして濾液を回収して非免疫原性かつ寛容原性の赤血球組成物を生成する工程を包含する。あるいは、濾過は初めに行われ、その後に遠心分離工程が行われ得る。本発明のさらなる局面において、患者に輸血または移植される組織に対する免疫学的寛容を誘導するための方法が提供される。このような局面の１つにおいて、本方法は、患者に、次に輸血または移植される組織に対する免疫学的寛容を誘導するのに十分な量で、非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を投与する工程を含む。ここで、この組成物は実質的に白血球を含まない。別のこのような局面において、本方法は、患者に、次に輸血または移植される組織に対する免疫学的寛容の誘導に十分な量で、非免疫原性かつ寛容原性の赤血球組成物を投与する工程を含む。ここで、この組成物は実質的に白血球を含まない。種々の実施態様において、輸血および移植される組織は、骨髄、血液、皮膚、膵臓、骨、肝臓、心臓、肺、腎臓、または角膜に由来し得る。好ましい実施態様では、輸血または移植される組織は血液である。これらおよび他の局面は、以下の詳細な説明を参照することによって明らかになる。本明細書に開示された全ての参考文献は、あたかもその各々が個々に援用されるかのように、その全体が本明細書中で参考として援用される。発明の詳細な説明本発明を説明する前に、本明細書中以下で用いられる特定の用語の定義を説明することは、本発明の理解の助けとなり得る。本明細書中で用いられる「非免疫原性」は、ヒトに投与された場合に、体液性（抗体）免疫応答の発達も細胞性免疫応答の発達も伴わない組成物の特徴をいう。本明細書中で用いられる「寛容原性」は、他の状況において、細胞媒介免疫または体液性免疫を誘導し得る、所定の抗原に対する免疫系の特異的な非反応性からなる免疫性応答を生成する組成物の能力をいう。本明細書中で用いられる「実質的に含まない」は、所定の型の細胞（例えば、白血球）数におけるベースラインからの少なくとも２〜３logの減少を含む組成物をいい、好ましくは１回の輸血あたり10⁵の残渣レベル（プロピジウムイオジド染色を用いるNeubauerチャンバーを用いたマニュアル的計数によって決定される）をいう。上記のように、本発明は、非免疫原性かつ/または寛容原性の血小板組成物を提供し、この組成物は実質的に白血球を含まない。このような組成物を達成するために重要なのは、濾過工程および遠心分離工程の組合せ（これは、いずれの順序でも行われ得る）の使用である。好ましい実施態様において、１つ以上の遠心分離工程が、濾過工程の前に行われる。さらに、上記のように、本発明は非免疫原性の血小板組成物を提供する。このような組成物は、遠心分離およびUV照射の組合わせ、または濾過およびUV照射の組合せ（これらの工程は、いずれの順序でも行われ得る）のいずれかを介して生成される。本発明はまた、非免疫原性かつ /または寛容原性の赤血球組成物を提供し、これらは遠心分離工程および濾過工程の組合せ（これらは、いずれの順序でも行われ得る）を介して生成され得る。本発明の状況において、血小板組成物は、任意の血小板豊富生成物（例えば、全血、血小板豊富血漿、濃縮血小板、アフェレーシス血小板、または軟膜調製濃縮血小板）から生成され得る。同様に、赤血球組成物は、赤血球豊富生成物（例えば、白血球、パックされた赤血球、またはアフェレーシス赤血球）から精製され得る。用いられる出発材料に依存して、遠心分離および/または濾過の前に１つ以上の工程を行うことが有利であり得ることは当業者に明らかである。例えば、全血は、赤血球からの血小板の分離を増強するために、遠心分離および濾過の前にRinger's Citrate Dextrose(RCD)で希釈（例えば、１：１）され得る。RCD は、滅菌された非免疫原性の注射可能な水中の、0.2ミクロンのフィルターで濾過された1Mクエン酸ナトリウムの20mlを、500mlバッグのRinger's Injection溶液中の５％Dextroseに添加することによって調製され得る。本発明の状況において、軟膜調製濃縮血小板を用いて開始する場合を除き、遠心分離および濾過の両方が、非免疫原性かつ寛容原性の製剤を生成するために必要とされることが見出されている。軟膜血小板については、本明細書中に記載されるような濾過が、非免疫原性かつ寛容原性の製剤を生成するのに十分であることが見出されている。任意の特定の理論に拘束されることを望むことなしに、白血球汚染は、血液由来製剤における免疫原性の顕著な供給源であると考えられている。本発明において、血液が白血球の２つの異なる集団を含むこと、および遠心分離工程および濾過工程の組合せが、製剤を実質的に白血球を含まないものにするために必要であることが見出されている。非免疫原性かつ寛容原性の製剤を生成するために、少なくとも１つの遠心分離工程が、濾過の前に好ましくは行われる。本明細書中に記載される遠心分離の第一の工程は、血小板から赤血球を分離しそしていくらかの白血球を除去するために行われる。このような分離は、一般に１つ以上のソフトスピンおよび/またはハードスピンを用いて達成され得る。本明細書中で用いられる用語「ソフトスピン」は、処理される血液の容量に依存して180〜2000×ｇで行われる遠心分離をいう。好ましくは、遠心分離は、30〜60mlの血液容量について約250×ｇである。処理される血液容量および用いられるｇ力に依存して、４〜30分の遠心分離時間が十分である。30〜60mlの血液容量について、250×ｇで10分が好ましい。用語「ハードスピン」は、処理される容量に依存して500〜6000×ｇで４〜40分間の遠心分離をいい、好ましくは30〜60mlの容量について約900×ｇで約10分間の遠心分離をいう。任意の種々の市販の遠心分離機（例えば、スウィングバケットローター遠心分離機(IEC，Needham Heights，MA)）が、遠心分離工程（単数または複数）のために用いられ得る。遠心分離の最初の工程は、ソフトスピンまたはハードスピンであり得る。１つの好ましい実施態様において、最初のソフトスピンの後に、第二のソフトスピン、ハードスピン、および濾過の工程があり、これらは任意の順序で行われ得る。別の好ましい実施態様において、最初のハードスピンの後に、ソフトスピンおよび濾過の工程があり、これらはいずれの順序でも行われ得る。これらの好ましい実施態様における工程の順序は、以下の表１に提供される。表１非免疫原性かつ/または寛容原性の血小板組成物を調製するための好ましい方法における工程の順序これらの工程が一般に非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を生成するのに十分である一方、他の遠心分離工程および/または濾過工程もまた、上記に提供される一連の工程の任意の時点で行われ得ることは明らかである。例えば、非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を調製するために、最初のソフトスピンが、血小板から赤血球を分離し、そしていくらかの白血球を除去するために上記のように行われ得る。全血において行われるソフトスピンは、赤血球を含む下層、主に血小板および血漿を含む上層、ならびに白血球および赤血球を含む界面を生じる。非免疫原性かつ寛容原性の赤血球組成物の調製のために、上層が除去され、そしてそれは以下に記載のように直接濾過され得る。次いで、ハードスピンは、血小板を濃縮するために行われ得る。好ましくは、ハードスピンは、第一のソフトスピンおよび濾過の後に行われ、濃縮血小板の下層を生成し、そして血漿の除去を可能にする。次いで、濃縮血小板は、再懸濁され、そして白血球のより完全な除去のための濾過の後に第二のソフトスピンに供され得る。しかし、さらなる白血球を除去するための第二のソフトスピンがまた、濾過の前に、ハードスピンの前の濾過の後に、または上記のように濾過およびハードスピンの両方が行われた後に、血小板豊富血漿について行われ得る。あるいは、血小板調製物（軟膜濃縮血小板）は、全血についてハードスピンを第一に行うことによって調製され得る。ハードスピンは、全血を主に血漿を含む上層、赤血球を含む下層、ならびに白血球、赤血球、および血小板を含む界面に分離する。血漿は除去され、そして白血球、血漿、および赤血球を含む界面が取り出され、そしてソフト遠心分離に供される。個々のユニットがソフトスピンに供されるか、またはソフトスピンが他の献血から調製された個々の軟膜をプールした後に行われるかのいずれかである。このソフト遠心分離は、白血球および赤血球を除去する。次いで、これらの軟膜血小板が濾過に供される。非免疫原性かつ寛容原性の赤血球を調製するために、少なくとも１つの遠心分離工程（ハードスピンまたはソフトスピンのいずれか）および濾過工程が行われ得る。好ましい実施態様において、全血のソフトまたはハード遠心分離いずれかの後に得られる赤血球の下層が取り出され、そして濾過される。あるいは、赤血球豊富生成物（例えば、全血）が濾過され、次いでハードまたはソフト遠心分離に供され、赤血球の下層が取り出され得る。濾過は、当業者に公知の任意の種々の装置および手順を用いて行われ得る。例えば、適切なフィルターとして、Pall フィルターBPF-4およびRC-10（Pall Biomedical Products，East Hills，NY）が挙げられる。本明細書中に記載される濾過工程（単数または複数）は、白血球数をさらに減少させるために行われる。濾過は、当業者に公知の任意の種々の装置および手順を用いて行われ得る。例えば、適切なフィルターとして、PLF-1、 PLF-10、PL-5 0、およびPL-100のようなPallフィルター(Pall Biomedical Products，East Hil ls.NY)、血小板フィルターTP^*IG500(Terumo，Somerset，NJ)、ならびに血小板フィルター4C2477（Fenwal/Baxter，Chicago，IL）が挙げられ得、PLF-10が好ましい。血小板組成物を調製するために、１つ以上の遠心分離工程が濾過の前に行われる場合は、回収された上清は、濾過装置を通される。種々の実施態様において、濾過工程は、白血球減少の程度がわずかに増大することを期待して２回行われ得る。しかし、本明細書中に記載の利点を達成するためには、１回より多く生成物を濾過する必要はない。上記のように、濾過は遠心分離の前に行われ得る。次いで、このような実施態様において、濾液は上記のような遠心分離に供される。上記の遠心分離工程および濾過工程は、非免疫原性かつ寛容原性の製剤を生成するために十分である。しかし、遠心分離されたおよび/または濾過された血小板組成物は、UV照射に曝すことによってさらに処理され得る。任意のUV-A、UV-B 、またはUV-C照射が用いられ得るが、UV-Bが好ましい。UV-Aは、320〜400nmの波長を表し、UV-Bは、290〜320nmの波長を表し、そしてUV-Cは、200〜290nmの波長を表す。UV-B照射の総用量は、一般に約600と1632mJ/cm²との間の曝露を生じ、約612mJ/cm²が好ましい。UV-C照射の総用量は、好ましくは約12と36mJ/cm²との間である。照射の強度（そしてそれによる総曝露の測定）は、放射線検出器（In ternational Light，Inc．Newburyport，MA）の使用を介して得られ得る。 UV-A、UV-B、またはUV-C照射（光付加剤（例えば、ソラレン(psoralin)）を用いるかまたは用いない）は、血小板および/または赤血球組成物の調製における任意の時点で行われ得ることは明らかである。広範な種々の装置が、本明細書中に記載のUV曝露を提供するために用いられ得る。このような装置として、殺菌灯（General Electric）およひHaemonetics（Braintree，MA）UV-B照射デバイスが含まれる。UV照射血小板または赤血球組成物の調製の際、混合リンパ球培養物（ MLC）実験を行い、そして残渣のリンパ球が、MLCにおいてもはや剌激または応答し得ないことを測定することによって、インビトロで非免疫原性かつ寛容原性の特徴を確認し得る。上記のように、本明細書中に記載の非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物および赤血球組成物は、寛容誘導のために用いられ得る。この目的のための組成物の投与の方法は、当業者に明らかである。寛容は、血小板または赤血球組成物のの輸血（一般に反復輸血）をレシピエントに投与することによって誘導される。輸血は通常１週間おきに与えられるが、他のスケジュールが適切である。一般に、１から８回までの輸血が提供され、少なくとも３回の輸血が好ましい。同種免疫の血小板不応性が起こったかどうかを決定するためには、血小板応答および抗体測定の両方が有用である。血小板応答は、輸血前および輸血後の血小板数を測定することによって、そして血小板増分、％血小板回復、または補正された数増分を計算することによって測定される。抗体測定は、血小板および/またはリンパ球毒性抗体試験を含む種々の試験を用いて行われる。このような試験は、当業者に周知である。あるいは、同種免疫のみが起こったかどうかを決定するために、抗体測定が用いられる。抗体測定は、血小板および/またはリンパ球毒性抗体試験を含む種々の試験を用いて行われる。以下の実施例は、例示のために提供されるが限定のためではない。実施例実施例１血小板組成物の調製この実施例は、非免疫原性および／または寛容原性の血小板組成物の調製を例証する。イヌの血液27mlを、18G 11/2"針（Becton-Dickinson Immunocytometry System s，San Jose，CA）を用いる頚静脈穿刺を介して、酸性クエン酸デキストロース処方A（Acid Citrate Dextrose formula A）（ACD-A抗凝固溶液）３mlを含む30m lシリンジ（Becton-Dickinson）に抜き取る。次いで、血液を、シリンジを３回反転させることによりACD-A（Fenwal/Baxter，Chlcago,IL）と混合する。抗凝固化された血液を、リンゲルクエン酸デキストロース（RCD）30mlを加えておいた1 50ml輸送用パック（transfer pack）(Baxter)に絞り出す。RCDを、無菌、非発熱性の注射用水（Baxter）中の0.2ミクロン濾過した（Gelman Sciences，Ann Arbo r，MI）1Mクエン酸ナトリウム（Mallinckrodt，Inc.，Paris，KY）20mlを、リンゲル注射溶液中の５％デキストロース（Baxter）の500mlバッグに加えることにより、調製する。150mlパックを３回反転し、ACD血液とRCDとを混合し、そして2 50×ｇで10分間、スイングバケットローター遠心分離機（IEC）に置く。血小板豊富血漿(PRP)を、血漿プレス（plasma press）(Fenwal)を介して赤血球層まで軟膜と共に、第２のl50ml輸送用パックヘ絞り出す。PRPを、重力の流れを介して第３の150ml輸送用パックに接続したPLF-1フィルター（Pall）を通して濾過する。白血球の少ない（leucopoor）PRP細胞を含む第３の輸送用パックをスイングバケットローター遠心分離機で900×ｇ、10分間遠心分離する。血漿／RCD を、血漿プレスを介して第４の150ml輸送用パックに絞り出し、そして保存する。残存する細胞ペレットを、第３の輸送用パック内で穏やかにマッサージして、血漿プレスにより残った残存溶液中にそれを再懸濁する。無菌の液体の⁵¹クロム酸ナトリウム（Amersham）300μCiを加え、そしてバッグを、穏やかに５回反転して溶液を混合する。バッグを放置して、室温で60分間インキュベートする。非結合51CRを、150ml輸送用パック中の取っておいた（set aside）血漿／RCDを、5 1CR標識血小板を含む150ml輸送用パックに移すことにより洗い流す。成分を、３回反転させることにより混合し、そして放射性の血小板を、スイングバケットローター遠心分離機で900×ｇ、10分間スピンすることによりペレット化する。放射性の血漿をデカントし、そしてRCD６mlを150mlパックに加える。ペレット化された血小板を穏やかにマッサージすることにより再懸濁し、13ml無菌スナップキャップチューブ（Falcon #1054）にデカントし、そしてスイングバケットで180 ×ｇ、５分間遠心分離する。上清を、RBC/WBCペレットの５mm以内まで、端に接続した10cm長の輸送用パックチュービングを使用して10mlシリンジに吸引する。５mlを、注射のために使用する。調製のこの方法を使用して、コントロールペレット（すなわち、濾過またはUV 照射なしであるが、遠心分離により白血球減少させた）（行１、表III）、遠心分離およひUV照射により調製した白血球減少組成物（上記の濾過工程を実施しなかったが、実施例２に記載するようにUV照射を実施した）（行４、表III）、ならびに濾過および遠心分離の両方により白血球減少させた組成物（行５、表III ）を調製した。実施例２血小板組成物の調製この実施例は、さらなる非免疫原性および／または寛容原性の血小板組成物の調製を例証する。イヌの血液27mlを、18G 11/2"針（Becton-Dickinson）を用いる頚静脈穿刺を介して、酸性クエン酸デキストロース処方A（ACD-A抗凝固溶液）３mlを含む30ml シリンジ（Becton-Dickinson）に抜き取る。次いで、血液を、シリンジを３回反転させることによりACD-A（Fenwal/Baxter）と混合する。抗凝固化された血液を、リンゲルクエン酸デキストロース（RCD）30mlを加えておいた150ml輸送用パック（Baxter）に絞り出す。RCDを、無菌、非発熱性の注射用水（Baxter）中の0.2 ミクロン濾過した（Gelman）1Mクエン酸ナトリウム（Mallinckrodt）20mlを、リンゲル注射溶液中の５％デキストロース（Baxter）の500mlバッグに加えることにより、調製する。150mlパックを３回反転し、ACD血液とRCDとを混合し、そして250×ｇで10分間、スイングバケットローター遠心分離機（IEC）に置く。血小板豊富血漿（PRP）を、血漿プレス（Fenwal）を介して赤血球層まで軟膜と共に、第２の150ml輸送用パックへ絞り出す。PRPを、重力の流れを介して別の150ml 輸送用パックに接続したPLF-1フィルター（Pall）を通して濾過する。製剤をUV 照射する場合、白血球の少ないPRPを300ml uv透過性バッグ（Terumo，Somerset ，NJによるStericell）に移し、そして撹拌しながらHaemonetics血小板処理システム（Platelet Treatment System）（Braintree，MA）上で612mJ/cm² uvBのモニターされる線量で照射する（International Light Inc.，Newburyport，MA）。UV照射された白血球の少ないPRPを、150mlパックに移し、この中で細胞を900 ×ｇ、10分間、スイングバケットローター遠心分離機でペレット化する。血漿／ RCDを、血漿プレスを介して150ml輸送用パックに絞り出し、そして後のために保存する。残存する細胞ペレットを、輸送用パック内で穏やかにマッサージして、血漿プレスにより残った残存溶液中にそれを再懸濁する。血小板懸濁液を、13ml 無菌スナップキャップ遠心分離チューブ（Falcon #2054）にデカントし、そして３mlシリンジ（Becton-Dickinson）中のRCDでの２回の連続した３mlのパックのすすぎ液をスナップキャップチューブに加える。このチューブを、スイングバケット（IEC）で180×ｇ、５分間スピンさせる。 PRPを、輸送用ピペット（Globe Scientific，Inc.，Paramus，NJ）を用いて、 RBC/WBCペレットの５mm以内までを別のスナップキャップチューブに取り出し、一方RBC/WBCペレットを含むチューブを保存する。無菌の液体の51クロム酸ナトリウム（Amersham）300μCiを加え、そして１秒間穏やかにボルテックスする。チューブを放置し、60分間室温でインキュベートする。非結合51CRを、ICR/PRP を血漿／RCDを含む150mlパックに移し戻すことにより洗い流す。成分を、３回反転することにより混合し、そして放射性の血小板を、スイングバケットローター遠心分離機で900×ｇ、10分間スピンすることによりペレット化する。放射性の血漿をデカントし、そしてRCD６mlを150mlパックに加える。ペレット化された血小板を穏やかにマッサージすることにより再懸濁し、13ml無菌スナップキャップチューブにデカントし、そしてスイングバケットで180×ｇ、５分間遠心分離する。輸送用ピペットを使用して、血小板を、ペレット化されたRBC/WBCを含む保存した13mlスナップキャップチューブに移す。血小板とRBC/WBCとを、輸送用ピペットのバルブを５〜10回押したり離したりすることにより穏やかに混合し、そして端に接続した10cm長の輸送用パックのチュービングを用いて10mlシリンジに吸引する。５mlを、注射のために使用する。調製のこの方法を使用して、濾過により調製した白血球減少組成物（行２、表 III）ならびに濾過およびUV照射により調製した組成物（行３、表III）を調製した。実施例３血小板の同種免疫の防止この実施例は、血小板の同種免疫を防止する、代表的な非免疫原性および／または寛容原性の血小板組成物の能力を例証する。イヌの対を、ドナーおよびレシピエントとして選別した。輸血された標識されたドナー血小板に対する各レシピエントの応答を、特殊化された輸血プログラムに従って決定した。一次ドナーに対する免疫を検出するために、８週間までの処理した血小板の輸血を、一次ドナー(１^○)から与えた。イヌが８週間の処理した血小板の輸血に不応性にならなかった場合、一次ドナーに対する寛容の誘導を評価するために、追加の８週間までの一次ドナーからのコントロール血小板の輸血を与えた。他のドナーに対する寛容の誘導を評価するために、８週間までのコントロール血小板の輸血を、二次ドナー（２^○）および三次ドナー（３^○）から与えた。これらの各輸血スケジュールについて、51クロム放射標識したドナー血小板を８週間までまたはレシピエントが不応性になるまで毎週与えた。この不応性は、２つの連続した場合に、輸血されたレシピエントにおける注射24時間後のドナー血小板の５％未満の回復として定義される。不応性の時点で、次のドナーからの輸血を開始した。放射標識化した血小板の生存の測定による血小板の不応性の決定に加えて、輸血されたレシピエントのいくつかには、FACScan（BectonD ickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA）を用いたフローサイトメトリー技術による、ドナーの血小板、リンパ球、および赤血球に対するレシピエント抗体についての測定もまた実施した。表IIは、実施例１および実施例２に概説した技術により調製した、注射前の血小板製剤（用量あたり）に対して実施した細胞計数の結果を示す。表II 輸血製剤の全細胞数の範囲 *自動細胞計数機（Coulter）により決定 **手動計数により決定（プロピジウム-ヨウ素染色を伴うNeubauerチャンバー） ***WBC計数に使用される方法の感度の限界表IIIは、輸血実験の結果を示す。一次ドナー由来の修飾した血小板輸血を使用した場合、遠心分離により白血球が減少されたコントロールの血小板製剤も濾過した製剤も（一度または二度のいずれの濾過を実施した場合も）、一種類より多くの修飾を受けた製剤（すなわち、遠心分離により白血球を減少させ、次いで UVを照射したかもしくは濾過した、または濾過および次いでUV照射により白血球を減少させた血小板）と比較して、血小板の同種免疫を防止し得なかった。二重に修飾した製剤の群の中において、一次の同種免疫を防止する能力において相互に有為に異なるこれらの製剤はなく、そしてそれらは、その一次ドナー由来のコントロール血小板製剤に対する寛容を維持することにおいて等しく有効であった。しかし、遠心分離により白血球を減少させ、さらにまた濾過により白血球を減少させた血小板製剤のみが、それらが以前に曝されていないドナー２^○およびドナー３^○由来のコントロール血小板輸血に対する寛容を誘導し得た（p<0.001、与えられた全ての他の血小板製剤と比較して）。他の実験において、遠心分離および濾過により白血球を減少させた血漿のない赤血球または遠心分離および濾過により白血球を減少させた血漿を、遠心分離および濾過により白血球を減少させた一次ドナーのイヌの血小板に加えた場合、これらの血小板製剤は依然として非免疫原性であった。これらの実験のためのRBCを、パックされた赤血球（血小板豊富血漿を除去した）を２つのBPF-4フィルターを通して濾過し、濾過したRBCを 1300×ｇで15分間遠心分離し、そしてRBCの底部の１〜２ccを取り出すことにより調製した。次いで、RBCを生理食塩水で２回洗浄した。血漿を調製するために、全血を、1300×ｇで10分間スピンした。上清の血漿を取り出し、そしてPLF-1 フィルターを通して濾過した。表III 輸血結果 *歴史的コントロール。現在のRx 腕（arm）との比較のためにはp値は与えられない。 **１回濾過された血小板を受けた８頭のイヌの中で、３頭のみが非不応性であり（38％）、そして２回濾過された血小板を受けた５頭のイヌの中で、１頭（20％）のみが非不応性であった。従って、１回濾過と２回濾過についてデータ間の差異はなかったので、データを併せた。 ***ドナー１^○、ドナー２^○、およびドナー３^○由来の全ての非Rx血小板はコントロール血小板のように調製される；すなわち、それらはCENTによるLRである。 ND 実施せず。実施例４免疫学的寛容の誘導この実施例は、免疫学的寛容を誘導するための、実施例１および実施例２に記載した血小板組成物の使用を例証する。その一次ドナー由来の処理した血小板に対して不応性にならなかった表III（行２〜５）の29頭の動物のサブグループの中で、３頭（10％）のみが、後に、遠心分離により白血球を減少させた一次ドナーの血小板に対して不応性となった。この不応性の率は、この製剤を最初の血小板処置プログラムとして与えた場合に見られる86％の血小板不応性率よりも非常に低い（表III、行１）。このことは、濾過、濾過-UVI、遠心分離-UVI、および濾過-遠心分離した製剤での前処置による寛容の誘導を示唆する。引き続く実験において、２重に修飾した製剤を受けた動物は、それらの一次ドナーからの非修飾血小板輸血に対して寛容であることが決定された。このような２重修飾血小板および赤血球製剤（特に、遠心分離しかつ濾過した白血球減少血小板および赤血球製剤）はまた、他の輸血される組織および移植される組織に対する寛容を誘導するために使用され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．非免疫原性かつ／または寛容原性の血小板組成物であって、該組成物は実質的に白血球を含まない、組成物。２．非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物の調製方法であって、該方法は以下の工程： (a) 血小板豊富血液製剤を１回以上遠心分離し、そして上清を回収する工程；ならびに (b) 該上清を濾過し、そして濾液を回収して、非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を生成する工程、を包含する、方法。３．前記遠心分離する工程が第１のソフトスピンおよび第２のソフトスピンを含む、請求項２に記載の方法。４．前記遠心分離する工程が濃縮血小板を生成するためのハードスピンをさらに含み、そしてここで該ハードスピンが前記第２のソフトスピンの前に実施される、請求項３に記載の方法。５．前記遠心分離する工程が少なくとも１回のソフトスピンおよびハードスピンを含み、そしてここで該ソフトスピンおよびハードスピンが濾過する工程の前に実施される、請求項２に記載の方法。６．前記濾過する工程が前記第１のソフトスピンの後かつ前記第２のソフトスピンの前に実施される、請求項３に記載の方法。７．非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物の調製方法であって、該方法は以下の工程： (a) 血小板豊富血液製剤に対して第１のソフトスピンを実施し、そして上清血小板組成物を回収し、そしてその後、任意の順序で、以下の工程を実施する工程： (1) 該血小板組成物に対して第２のソフトスピンを実施し、そして上清血小板組成物を回収する工程； (2) 該血小板組成物に対してハードスピンを実施し、そして上清血小板組成物を回収する工程；および (3) 該血小板組成物を濾過し、そして濾液血小板組成物を回収する工程；を包含し、それにより非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を生成する、方法。８．非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物の調製方法であって、該方法は以下の工程： (a) 血小板豊富血液製剤に対してハードスピンを実施し、そして上清血小板組成物を回収し、そしてその後、任意の順序で、以下の工程を実施する工程： (1) 該血小板組成物に対してソフトスピンを実施し、そして上清血小板組成物を回収する工程；および (2) 該血小板組成物を濾過し、そして濾液血小板組成物を回収する工程；を包含し、それにより非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を生成する、方法。９．非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物の調製方法であって、該方法は以下の工程： (a) 血小板豊富血液製剤を濾過し、そして濾液を回収しする工程；ならびに (b) 次に該濾液を遠心分離し、そして上清を回収して、非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を生成する工程、を包含する、方法。１０．前記血小板豊富血液製剤が、全血、血小板豊富血漿、濃縮血小板、アフェレーシス血小板、および軟膜血小板調製物からなる群より選択される、請求項２、７、８、または９のいずれかに記載の方法。１１．患者において、輸血または移植される組織に対する免疫学的寛容を誘導する方法であって、該方法は以下の工程：該患者に、次に輸血または移植される組織に対する免疫学的寛容を誘導するのに十分量の、非免疫原性かつ寛容原性の血小板組成物を投与する工程であって、該組成物は実質的に白血球を含まない、工程、を包含する、方法。１２．前記輸血または移植される組織が、骨髄、皮膚、膵臓、骨、肝臓、心臓、肺、腎臓、および角膜からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。１３．前記輸血または移植される組織が血液である、請求項１１に記載の方法。１４．非免疫原性の血小板組成物であって、該組成物は実質的に白血球を含まない、組成物。１５．非免疫原性の血小板組成物の調製方法であって、該方法は以下の工程： (a) 血小板豊富血液製剤を遠心分離し、そして上清を回収する工程；および (b) 該上清をUV照射に曝露する工程、を包含する、方法。１６．非免疫原性の血小板組成物の調製方法であって、該方法は以下の工程： (a) 血小板豊富血液製剤を濾過し、そして濾液を回収する工程；および (b) 該濾液をUV照射に曝露する工程、を包含する、方法。１７．前記UV照射がUV-B照射である、請求項１５または１６に記載の方法。１８．前記UV-B照射が約600mJ/cm²と1632mJ/cm²との間の曝露をもたらす、請求項１７に記載の方法。１９．前記血小板豊富血液製剤が、全血、血小板豊富血漿、濃縮血小板、アフェレーシス血小板、および軟膜血小板調製物からなる群より選択される、請求項１５または１６に記載の方法。２０．非免疫原性かつ／または寛容原性の赤血球組成物であって、該組成物は実質的に白血球を含まない、組成物。２１．非免疫原性かつ寛容原性の赤血球組成物の調製方法であって、該方法は以下の工程： (a) 赤血球豊富血液製剤を遠心分離し、そして下層を回収する工程；ならびに (b) 次に該下層を濾過し、そして濾液を回収して、非免疫原性かつ寛容原性の赤血球組成物を生成する工程、を包含する、方法。２２．前記遠心分離する工程がハードスピンを含む、請求項２１に記載の方法。２３．非免疫原性かつ寛容原性の赤血球組成物の調製方法であって、該方法は以下の工程： (a) 赤血球豊富血液製剤を濾過し、そして濾液を回収する工程；ならびに (b) 次に該濾液を遠心分離し、そして下層を回収して、非免疫原性かつ寛容原性の赤血球組成物を生成する工程、を包含する、方法。２４．前記遠心分離する工程がハードスピンを含む、請求項２３に記載の方法。２５．患者において、輸血または移植される組織に対する免疫学的寛容を誘導する方法であって、該方法は以下の工程：該患者に、次に輸血または移植される組織に対する免疫学的寛容を誘導するのに十分量の、非免疫原性かつ寛容原性の赤血球組成物を投与する工程であって、該組成物は実質的に白血球を含まない、工程、を包含する、方法。２６．前記輸血または移植される組織が、骨髄、皮膚、膵臓、骨、肝臓、心臓、肺、腎臓、および角膜からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。２７．前記輸血または移植される組織が血液である、請求項２５に記載の方法。