CN1199653C - 罗勒多糖在制备治疗抗肿瘤转移的药品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及的是罗勒多糖在制备治疗抗肿瘤转移的药品中的应用，属于中药治疗肿瘤转移的技术领域。本发明公开了罗勒多糖在制备治疗抗肿瘤转移的药品中的应用，罗勒多糖是从植物罗勒(Ocimum basilicum Lim)单味药中提取分离得到的，可以制成胶囊、针剂或丸剂。本发明的优点在于：发掘了罗勒多糖治疗抗肿瘤转移的新领域；本发明的药物安全无毒，疗效显著；原料来源丰富、价廉、并可制成各种剂型。
Description
(一)技术领域
本发明具体涉及一种制备治疗抗肿瘤转移的药品，属于中药治疗肿瘤转移的技术领域。
(二)背景技术
癌症是世界性严重危害人类健康和生命的常见病。肿瘤转移又是肿瘤恶性行为之一，是导致手术，放化疗失败的原因。为了能够根治恶性肿瘤，除有效治疗原发病灶外，控制肿瘤转移是关键问题。但目前用中药提取物治疗肿瘤转移的药物比较少见，如中国专利于2001年2月14日分开的公开号为1283464的“一种高分子抗肿瘤转移药物及其制备方法”的专利，中国专利于2002年8月28日分开的公开号为1365972的“吲哚类衍生物及其抗肿瘤用途”的专利，均是用化学合成的方法得到的，毒性比较大，效果不明显。因此，迫切需要一种有效的纯中药制剂的抗肿瘤转移药物，探索和开发此类药物已成为该项研究领域研究的热点。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种纯中药制剂在制备治疗抗肿瘤转移药物的应用。
本发明公开了罗勒多糖在制备治疗抗肿瘤转移的药品中的应用。
本发明的罗勒多糖是从植物罗勒(Ocimum basilicum Lim)单味药中提取分离得到的。
木发明的用罗勒多糖制备的治疗肿瘤转移的药品，可以制成胶囊、针剂或丸剂。
罗勒为一种草本生植物，为唇形料植物(Ocimum basilicum Lim)。
罗勒多糖是从植物罗勒提取分离出来的，属于总多糖，纯品为浅棕色微甜的颗粒，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶媒，分子量为30000-60000。
罗勒多糖其中的一种提取分离方法如下：①将罗勒药材用粉碎机粉碎。②将粉碎的罗勒粉，用85％的乙醇脱脂2次，为脱脂罗勒粉。③将脱脂罗勒粉加入适量的水，水煎2次，过滤、合并两次提取液，放入浓缩罐中进行浓缩，使其相对密度达到1.08-1.10，然后将浓缩液冷却至0-4℃，加入5倍量95％的乙醇静置沉淀48小时，收集沉淀物得到粗品罗勒多糖。④再将粗品罗勒多糖加水溶解，过滤，滤液进行浓缩，使其浓缩液相对密度为达到1.08-1.10，冷却至0-4℃后，浓缩液加入5倍量95％的乙醇静置沉淀48小时，收集沉淀物，脱水真空干燥后即得到精品罗勒多糖。
精品罗勒多糖进行无菌化处理后，加水溶解后，制成罗勒多糖的针剂。
精品罗勒多糖进行无菌化处理后，按常规的制药方法，可以制成胶囊、丸剂或片剂。
以下为本发明的药品在药效学研究和临床研究的结果。
(一)本发明的药物抗肿瘤转移作用药效学研究
1.抗自发转移
①本发明的药物对lewis肺癌自发肺转移模型的影响
从荷瘤小鼠上剥离并选取生长良好的瘤块，按瘤块(g)：生理盐水(ml)为1∶3的比例匀浆，在C57BL/6小鼠腋窝皮下接种肿瘤匀浆液0.2ml/只。接种24小时后，小鼠随机分5组，开始给药，一组生理盐水对照组(生理盐水0.4ml/只)，本药物分三个剂量组(2.5g生药/kg、1.25g生药/kg、0.625g生药/kg)，丝裂霉素组(4-6mg/人/只)灌胃给药容量为0.4ml/只，1次/日，共21天；丝裂霉素组(2mg注射前用生理盐水稀释至5ml，腹腔注射，剂量为0.05ml/只，用药5天)。第21天颈椎脱臼处死动物，称小鼠体重，瘤重和肺重Bouin氏液固定，解剖镜下计数肺部正反面及肺叶间的转移瘤灶，做病理组织切片观察，最后用Mann-Whitney U-Test的方法检验肺转移结节数的组间差异。以上实验共重复三批，每批动物同一性别，结果见表1。
表1 本发明的药物对Lewis肺癌自发转移模型的影响 (
X±S)
批号 组别 鼠数(只) 体重(g) 肺重(g) 肺结节数 转移率％
第 生理盐水组 10 21.25±1.10 0.171±0.202 16.1±3.84 100
大剂量组 10 18.67±2.65 0.116±0.027 2.6±2.7** 80
一 中剂量组 10 17.28±2.04 0.180±0.079 1.9±1.5** 80
小剂量组 10 19.97±1.37 0.176±0.018 9.9±5.3** 100
批 丝裂霉素组 10 21.02±1.94 0.152±0.023 16.2±8.4 100
第 生理盐水组 11 22.53±1.62 0.172±0.035 18.73±7.68 100
大剂量组 10 21.92±1.35 0.166±0.016 2.90±3.73** 60
二 中剂量组 10 22.06±1.25 0.187±0.024 2.56±3.21** 80
小剂量组 9 22.71±1.06 0.176±0.026 3.20±1.62** 100
批 丝裂霉素组 10 21.04±1.20 0.151±0.011 6.40±5.76 100
第 生理盐水组 10 24.91±0.97 0.165±0.098 5.2±.4.0 90
大剂量组 8 21.88±2.17 0.175±0.025 1.25±2.76* 25
三 中剂量组 8 22.61±1.76 0.158±0.092 0.5±1.07* 25
小剂量组 8 23.11±1.86 0.152±0.009 0.88±2.10* 37.5
批 丝裂霉素组 8 21.65±1.47 0.14±0.014 1.29±2.56* 42.8
注：*与生理盐水对照组比*p＜0.05，**p＜0.01。
由结果可知，三批实验中，本发明的药物均可使肺转移结节数明显少于生理盐水对照组(p＜0.01，p＜0.05)并且呈现出明显的量效关系，第一、第二批实验本发明的药物大、中剂量及第三批实验本发明的药物大、中、小剂量组肺转移率也均小于生理盐水对照组，因此证明中药本发明的药物对Lewis肺癌自发转移具有非常显著的对抗作用。
病理切片证实，肺转移瘤灶为Lewis肺癌。
②本发明的药物对小鼠子宫颈癌U14脾内移植后肝转移模型的影响
表2 对小鼠子宫颈癌U14脾内移植肝内自发转移的影响(％，
X±S)
| 鼠数 肝内转移 转批号 组别 (只) 结节数 移率 | 肝转移程度的组织分级 | 其他器官转移程度 | |||
| 0级 | 1级 | 2级 | 3级 | ||
| 第 生理盐水组 11 5.72±7.51 100大剂量组 12 1.0±2.48** 16.7一 中剂量组 12 1.0±2.40** 33.31小剂量组 11 1.45±3.2** 18.2批 丝裂霉素组 11 2.36±3.95* 45.5 | 31 | 6875 | 53344 | 62 | 肾肺转移肾转移 |
| 第 生理盐水组 11 4.91.±4.3 100大剂量组 12 2.0±2.73* 50二 中剂量组 12 2.00±3.28* 41.7小剂量组 11 12.00±1.48* 81.8批 丝裂霉素组 10 2.90±4.86 70 | 42 | 6792 | 62316 | 12 | 肾肺转移肾转移肾转移 |
| 第 生理盐水组 11 15.73±32.34 100大剂量组 10 2.00±3.09** 40三 中剂量组 10 2.20±2.62** 50小剂量组 9 2.88±2.03** 88.9批 丝裂霉素组 10 2.30±4.22** 70 | 31 | 6763 | 61236 | 51 | 肾肺转移肾转移肾转移 |
注：与生理盐水对照组比*p＜0.05，**p＜0.01.
抽取U14腹水瘤，台盼蓝排斥法计数活细胞数，用无血清的RPMI-1640培养液调整癌细胞浓度为108/ml备用，用0.25％戊巴比妥纳0.4---0.6ml/只腹腔注射麻醉小鼠。在小鼠的右侧腹部(脾区)消毒后，剪开约1cm的小口，剥露脾脏并固定，用4号针头在脾脏的一端包膜下缓慢地注入0.01ml癌细胞悬液，将脾脏退回腹腔内，缝合切口。24小时后随机分组，分组及给药同上。第14天处死小鼠，切取肝、脾、肺、肾等器官及腹腔内部分淋巴结(包括幽门、肾门处淋巴结)，Bouin氏液固定，HE染色，组织学观察来确定各器官及淋巴结是否有U14癌的转移灶，肝转移程度的组织学分级标准：0级：无转移；1级：肝内有1-2个200-500um的小转移灶；2级：肝内有3-5个小转移灶或1-2个500-1000um的较大转移灶；3级；肝内存在广泛转移灶。以上试验重复3批，每批动物同一性别。结果见表2。
由以上结果可知，三批实验中，本发明的药物均可使肝内转移结节数明显少于生理盐水对照组(p＜0.05，p＜0.01)，并且第一批实验大中小剂量组和第二三批实验大、中剂量组使转移率也均小于生理盐水对照组，肝转移程度组织分级上，本发明的药物组远较生理盐水对照组和丝裂霉素较轻。以上结果证明，本发明的药物对小鼠子宫颈癌U14脾内移植后肝转移的自发转移具有非常显著的对抗作用。
2.本发明的药物抗血道转移
①本发明的药物对黑色素瘤B16-F10人工肺转移小鼠模型的影响
取生长良好的小鼠B16-F10实体瘤制成细胞悬液，以PBS冲洗3遍，过200目筛网得到单细胞，用PBS调整单细胞悬液为106/ml浓度，用4号针头给C57BL/6小鼠尾静脉注射瘤液0.2ml/只。24小时后小鼠随机分5组。分组及给药剂量同上。第20天颈椎脱臼处死小鼠，称小鼠体重，肺重，解剖镜下计数肺转移瘤灶，用Mann-Whitney U-Test方法进行统计学检验，Bouin氏液固定后，病理组织学切片观察。试验重复三批，每批动物同一性别，结果见表3。
由以上结果可知，三批实验中，本发明的药物均可使肺内转移结节数明显少于生理盐水对照组(p＜0.05，p＜0.01＝。此结果证明本发明的药物对黑色素瘤B16-F10人工肺转移这种血道转移模型，具有明显的对抗作用。
从病理组织切片也证实，肺结节为B16-F10转移瘤。
表3 药物对黑色素瘤B16-F10人工肺转移小鼠模型的影响 (
X±S)
批号 组别 鼠数(只) 体重(g) 肺重(g) 肺结节数 转移率％
第 生理盐水组 10 18.10±2.91 0.223±0.154 10.21±6.17 70
大剂量组 9 17.16±2.88 0.168±0.095 4.11±8.27* 77.8
一 中剂量组 9 16.92±2.03 0.186±0.127 6.89±14.28* 44.4
小剂量组 9 18.44±1.50 0.146±0.07 4.78±8.91* 66.7
批 丝裂霉素组 9 18.47±1.11 0.266±0.202 16.02±2.91 77.8
第 生理盐水组 8 24.89±1.89 0.171±0.026 4.75±6.34 50
大剂量组 8 23.63±2.69 0.170±0.017 1.88±3.48** 25
二 中剂量组 8 23.05±2.09 0.165±0.016 6.50±6.61** 75
小剂量组 8 23.43±1.31 0.155±0.008 1.75±2.43** 50
批 丝裂霉素组 8 24.16±2.17 0.154±0.017 3.75±6.96 25
第 生理盐水组 8 22.06±1.87 0.196±0.018 12.15±7.21 80
大剂量组 8 21.78±1.49 0.166±0.015 2.14±3.78** 80
三 中剂量组 8 19.25±1.44 0.145±0.013 3.23±5.86** 80
小剂量组 8 18.65±1.58 0.155±0.016 4.55±6.21* 60
批 丝裂霉素组 8 19.02±1.66 0.179±0.012 7.85±9.14 70
注：与生理盐水对照组比*p＜0.05，**p＜0.01。
②本发明的药物对肝癌H22人工肺转移小鼠模型的影响
取生长良好的腹水型H22肝癌小鼠，抽取腹水，以PBS冲洗3遍，调整细胞浓度为106/ml ，用4号针头给昆明种小鼠尾静脉注射瘤液0.2ml/只，24小时后小鼠随机分5组，分组及给药剂量同上。第15天颈椎脱臼处死动物，称小鼠体重，肺重，Bouin氏液固定后解剖镜下计数肺转移瘤灶，用Mann-Whitney U-Test方法进行统计学检验，肺做病理组织学切片观察。实验重复三批，每批动物同一性别，结果见表4。
由以上结果可知，三批实验中，本发明的药物均可使肺转移瘤灶数明显少于生理盐水对照组(p＜0.05，p＜0.0 1)而且从各种肺切片上也可清晰的比较出差别，此结果证明，本发明的药物对肝癌H22人工肺转移这种血道转移模型具明显的对抗作用。从病理组织切片上证实肺结节为H22转移瘤。
表4 本发明的药物对肝癌H22人工肺转移小鼠模型的影响 (
X±S)
批号 组别 鼠数(只) 体重(g) 肺重(g) 肺结节数 转移率％
第 生理盐水组 10 21.02±5.00 0.172±0.026 19.50±7.75 90
大剂量组 10 20.27±3.39 0.169±0.027 3.8±5.01** 80
一 中剂量组 10 22.49±3.72 0.174±0.035 8.30±9.16* 40
小剂量组 10 21.93±3.80 0.159±0.029 10.50±11.75 60
批 丝裂霉素组 10 20.83±3.12 0.174±0.028 18.30±20.33 90
第 生理盐水组 10 22.29±2.97 0.160±0.019 21.30±28.28 100
大剂量组 10 22.16±4.15 0.152±0.023 11.20±14.69* 80
二 中剂量组 10 21.24±4.65 0.158±0.039 13.40±13.67* 90
小剂量组 10 23.68±6.56 0.172±0.047 16.00±30.90 80
批 丝裂霉素组 10 21.84±4.48 0.178±0.036 20.45±18.32 100
第 生理盐水组 10 22.83±1.93 0.140±0.012 26.90±18.71 100
大剂量组 10 22.53±2.07 0.140±0.014 6.67±4.36** 100
三 中剂量组 10 20.92±2.54 0.142±0.062 10.10±8.56* 100
小剂量组 10 21.26±1.79 0.168±0.068 22.30±17.21 90
批 丝裂霉素组 10 22.12±2.13 0.171±0.071 23.48±18.52 100
注：与生理盐水对照组比*p＜0.05 **p＜0.01
3.本发明的药物抗淋巴道转移
中药本发明的药物对肝癌H22淋巴道转移小鼠模型的影响
取生长良好的腹水型H22肝癌小鼠，抽取腹水，以PBS冲洗3遍，调整瘤细胞浓度为2×106/ml，用4号针头给昆明种小鼠右足趾爪垫接种瘤液0.05ml/只，24小时后小鼠随机分5组，分组及给药剂量同上，灌胃给药共20天，丝裂霉素与局部给药(后肢皮下)给药0.02ml/只，连续用药5天。第21天颈椎脱臼处死动物，称小鼠体重，肺重，Bouin氏液固定后解剖镜下计数肺转移瘤灶，用Mann-Whitney U-Test方法进行统计学检验，肺做病理组织学切片观察，并观察全身淋巴转移情况。实验重复三批，每批动物同一性别，结果见表5。
由三批实验结果可知，本发明的药物对肝癌H22爪垫移植的淋巴道转移这种血道转移模型具明显的对抗作用，使肺转移结节数明显少于生理盐水对照组(P＜0.01＝，使淋巴道转移控制在一级淋巴，所以本发明的药物对肝癌H22淋巴道转移也具明显对抗作用。
表5 本发明的药物对肝癌H22淋巴道转移小鼠模型的影响 (
X±S)
批号 组别 鼠数 体重(g) 肺重(g) 肺转移 转移率％ 淋巴转
(只) 灶瘤数 移级数
第 生理盐水组 12 24.56±3.45 0.243±0.088 26.08±6.36 100 III
大剂量组 10 24.96±2.50 0.192±0.013 5.38±4.27** 100 I
一 中剂量组 11 25.28±3.46 0.244±0.081 8.63±4.74** 100 I
小剂量组 10 25.89±4.04 0.210±0.059 8.37±5.28** 100 II
批 丝裂霉素组 10 21.86±3.10 0.251±0.078 19.1610.21 100 III
第 生理盐水组 12 24.56±3.45 0.241±0.086 18.91±10.4 100 III
大剂量组 10 25.04±2.16 0.181±0.014 6.14±5.12** 70 I
二 中剂量组 11 23.29±3.46 0.192±0.016 7.109±4.54** 90 I
小剂量组 10 24.12±3.12 0.213±0.06 9.18±6.12** 100 II
批 丝裂霉素组 11 22.58±2.71 0.235±0.07 16.14±9.18 100 II
第 生理盐水组 10 23.12±2.89 0.182±0.063 18.49±10.4 100 III
大剂量组 12 22.14±3.21 0.121±0.03 4.15±5.10** 100 I
三 中剂量组 12 22.86±5.42 0.135±0.02 5.86±3.20** 100 II
小剂量组 11 23.14±4.11 0.152±0.02 8.24±6.58** 100 II
批 丝裂霉素组 11 22.45±3.02 0.199±0.06 12.57±11.8 100 III
注：与生理盐水对照组比*p＜0.05，**p＜0.01。
二、本发明的药物抗肺癌、肝癌作用临床研究
本发明的药物治疗恶性肿瘤的临床观察(山东省肿瘤防治研究院内四科)
自1999年8月，开始使用本发明的丸剂药物抗肿瘤临床观察。采用随机分组的方法，共观察42例，其中治疗组22例，对照组20例，均为住院病人，肺癌患者均有病理学或细胞学诊断。现总结如下：
1.临床资料
治疗组22例，男性18例，女性4例，年龄31-70岁。肺癌21例，(小细胞未分化癌3例，腺癌8例，鳞状细胞癌7例)，肝癌1例。平均年龄56.9岁，KPS记分60分以上。对照组20例，男性15例，女性5例，年龄30-69岁，平均年龄55.2岁。肺癌18例(小细胞未分化癌3例，腺癌9例，鳞状细胞癌6例。)
2.治疗方法
对照组单独化疗。小细胞未分化肺部给予PDD20/日，静滴，第1-5天VP-16.01/日，静滴，第1-5天；3周重复。非小细胞肺癌VDS 4mg，静注，第1天 第8天 mmc6mg，静注，第1-5天；3周重复。肝癌行肝动脉介入治疗，用药ADM、5-Fu、PDD，4周重复。治疗且在上化疗方案基础上口服本发明的丸剂药物，每次1.5g，每日三次，连服3个月为一疗程。
3.结果
(1)治疗组一年生存率77.2％，较对照组40％高，经卡方检验，P＜0.05，两组有明显差异，说明治疗组优于对照组。
(2)治疗各项免疫功能CD3、CD4、CD8、CD4/CD8治疗后有所上升，NK细胞治疗后有升高趋势，但经t检验无统计学意义。对照组NK细胞治疗后下降，P＜0.05，有显著差异。治疗组CD3、CD8治疗后指标与对照组相比P＜0.01，有明显差异；治疗组CD4与对照组治疗后CD4相比，P＜0.05，有差异。证明本发明的药物对免疫功能有一定的增强作用。
(3)治疗组血色素、白细胞、血治疗前后无明显变化。红细胞治疗组前后相比，P＜0.05，有差异，说明本发明的药物对红细胞有一定的影响。对照组的白细胞治疗前后，P＜0.01，有明显下降。血色素血小板红细胞无明显变化，证实对照组单用化疗，对白细胞有抑制作用，而治疗组，对白细胞有一定的保护作用。
(4)治疗组未发现肝肾功能损害。两组转肽酶治疗后有明显差异，p＜0.01。可以表明本发明的药物对肝肾功能无任何毒性，对照组肝功有一定损害。
(5)观察凝血酶原时间两组均未发现明显变化。
(6)未发现消化道反应、过敏反应，对心脏及周围神经来见毒副反应，无发热现象。
根据以上结果，可以得出本发明的优点在于：发掘了罗勒多糖治疗抗肿瘤转移的新领域；本发明的药物安全无毒，疗效显著；原料来源丰富、价廉、并可制成各种剂型。
下面将描述本发明的几个实施例，但本发明的内容完全不局限于此。
(四)具体实施方式
实施例1
①取罗勒药材5KG，用粉碎机粉碎。②将粉碎的罗勒粉，加入8KG85％的乙醇脱脂，共2次，得到脱脂罗勒粉。③将脱脂罗勒粉加入10KG的无离子水，水煎2次，过滤、合并两次提取液，放入浓缩罐中进行浓缩，使其相对密度达到1.10，然后将浓缩液冷却至0-4℃，加入5倍量95％的乙醇静置沉淀48小时，收集沉淀物得到粗品罗勒多糖。④再将粗品罗勒多糖加入1KG无离子水溶解，过滤，滤液进行浓缩，使其浓缩液相对密度为达到1.08，冷却至0-4℃后，浓缩液加入5倍量95％的乙醇静置沉淀48小时，收集沉淀物，脱水干燥后即得到精品罗勒多糖。
实施例2
取实施例1制备的精品罗勒多糖200g，杀菌处理后，加入5kg无菌水溶解，装瓶配成2ml/支的针剂。
实施例3
取实施例1制备的精品罗勒多糖200g，杀菌处理后，按每个0.3g，装入胶囊，即制成成品。
Claims (3)
1.罗勒多糖在制备治疗抗肿瘤转移的药品中的应用。
2.根据权利要求1所述的罗勒多糖在制备治疗抗肿瘤转移的药品中的应用，其特征在于：罗勒多糖是从植物罗勒单味药中提取分离得到的。
3.根据权利要求1或2所述的罗勒多糖在制备治疗抗肿瘤转移的药品中的应用，其特征在于：药品为胶囊、针剂或丸剂。
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