CN1443077A - 结合cd40的apc激活分子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开抗CD40分子的激动剂，包括单克隆抗体，这些激动剂能结合并刺激专用的和非专用的人抗原呈递细胞(“APCs”)，增强CD40L对CD40阳性细胞的刺激效果和/或诱导单核细胞衍生的树突状细胞的表型成熟。本发明提供几种这样的单克隆抗体，产生这些单克隆抗体的细胞系已经保存在美国典型培养物保藏中心。

Description

结合CD40的APC激活分子
发明领域
本发明涉及一系列新型分子及单克隆抗体，它们通过表达在抗原呈递细胞上的CD40受体结合并刺激抗原呈递细胞。
发明背景免疫系统激活
免疫系统能够杀死受病毒感染或转化成癌细胞的自体细胞。这种具潜在危险的机制受到严格的调控。当没有遇到其特异性抗原时，免疫系统的杀伤性T细胞(CTL)以无活性的前体形式进行循环。杀伤性T细胞前体要激活，它必须识别其特异性的抗原肽，这些肽由专用的(professional)抗原呈递细胞(APC)上的MHC I类分子呈递。然而，这种抗原特异性的细胞相互作用并不足以完全激活CTL，尽管有来自APC的共刺激信号。
近来，据信完全激活CTL需要一种辅助性T细胞，它可以与CTL识别相同APC上的相同抗原。特异的辅助性T细胞一经激活，就产生激活CTL需要的细胞因子，如IL-2。然而，Guerder和Matzinger(J.Exp.Med.176：553(1992))提出了CTL激活的“许可(Licensing)”模型。在此模型中提示，当辅助性T细胞识别专用的APC表面的抗原时，它就会传递激活信号给APC，从而激活CTL，而不再需要辅助性T细胞的参与。最近，许可模型的分子机理已经清楚。Schoenberger等(Nature 393：480(1998))表明，CD40L-CD40通路在许可模型中起着关键作用。树突状细胞(DC)对辅助性T细胞的激活引起CD40L表达的上调，从而提供通过触发DC上的CD40分子使DC能激发CTL的信号。
DC循环并驻留在机体组织及抗原沉积或引入位点。当摄入抗原后，它们迁移到引流(draining)淋巴结，在此将抗原呈递给T细胞。众所周知，必须将DC激活以发挥最佳功能。静息DC仅表达低水平的MHC和共刺激分子，它只是T细胞较弱的刺激因子。DC可被炎性细胞因子和细菌产物所激活，引起MHC和共刺激分子的上调。因此，当在炎症条件下遇到抗原的DC到达引流淋巴结时很容易激活辅助性T细胞。因此，将抗原摄取位点的炎性细胞因子与辅助性T细胞相互作用期间的CD40L-CD40相互作用相结合，就有可能最佳地发挥DC激活CTL的能力。CD40分子和TNF受体家族
CD40分子属于I型跨膜蛋白的TNF受体家族。这个基因家族的成员(包括TNF的两个受体、低亲和力的神经生长因子受体和T细胞激活抗原CD27，CD30，及CD95等)的特征是在富含半胱氨酸的细胞外结构域具有序列同源性(Armitage et al.，Current Opinion inImmunology 6：407(1994))。TNF受体家族成员的已知配体也具有同源性。尽管TNF-α为可溶性细胞因子，它最初合成为膜相关分子。大多数TNF/CD40L受体和TNF/CD40家族成员属于II型跨膜蛋白，包括hTNF-α，hLT，hLT-β，hCD40L，hCD27L，hCD30L，cfECP1，myx VRh，mCD30，hCD27，hFas，m4-1BB，rOX-40，hTNFR-h，hTNFR-II，hTNFR-1及hLNGFR。CD40在B细胞激活方面的功能是最众所周知的。CD40分子在所有B细胞中组成性表达。CD40L-CD40相互作用能刺激纯化B细胞增殖，如果同时使用细胞因子，可调节免疫球蛋白产生。最近的研究表明，CD40分子的分布并不象最初估计的那样受到限制。新鲜分离的人单核细胞表达低水平的CD40，IFN-α存在时对其进行培养，使CD40的表达上调(Alderson et al.， J.Exp.Med.178：669(1993))。通过CD40刺激单核细胞能引起促炎细胞因子如IL-1和TNF-α及有毒的自由基中间体如一氧化氮的分泌并引起B7共刺激分子的上调。从人外周血分离的DC也能表达CD40分子(Caux et al.， J. Exp.Med.180：263(1994))。当体外培养的DC表面结合有CD40分子时，将大大增强其存活能力。正如单核细胞一样，用CD40刺激DC也会引起促炎细胞因子如IL-12和TNF-α的分泌及CD80/86共刺激分子的上调。此外，最近表明CD40的激活能够刺激杀伤T细胞的激活(Schoenberger et al.， Nature 393：480(1998))。因此将CD40分子和其配体结合，如和抗体结合而激活CD40，将诱导许多体液和细胞毒性效应，在抑制肿瘤方面具有重要作用。
发明概述
本发明包括这些分子，它们能结合并激活专用的和非专用的抗原呈递细胞上表达的CD40。这些激动剂分子，在和细胞表面的受体结合后，诱导细胞内信号传导，引起表达CD40的抗原呈递细胞的激活。本发明所涉及的分子包括单克隆抗体及其片段、肽、寡核苷酸及其他的化学物质。本发明也包括诱导表达抗CD40抗体表达的肽和基因。
这些分子能够以组合、双特异性或多价的形式进行使用，正如双特异性抗体一样，既可与相同细胞上的CD40交联，也可与不同细胞上的CD40交联。通过这样的交联产生协同或加和激动效应。
附图简述
图1表明用抗CD40单克隆抗体诱导单核细胞衍生的DC成熟。将单核细胞衍生的未成熟树突状细胞在有抗CD40单克隆抗体或同种型匹配的对照抗体存在的情况下培养两天，用FACS分析法研究CD80表达的上调及甘露糖受体表达的下调。图1a表明在几个实验中表达CD83的细胞百分比的综合结果，图1b表明，和经过刺激的细胞相比，在非刺激细胞中，甘露糖受体表达的平均荧光强度(MFI)的相对降低(MFI任意值取为100)。
图2表明用抗CD40单克隆抗体(克隆7、15、21、48、64和70)诱导单核细胞衍生的DC的成熟。将单核细胞衍生的未成熟树突状细胞在有抗CD40单克隆抗体或同种型匹配的对照抗体的情况下培养两天，用FACS分析法研究其CD80、CD83及CD86表达的上调以及甘露糖受体表达的下调。图中列出了一个典型实验的数据：CD80(图2a)、CD86(图2c)及甘露糖受体(图2d)的表达以平均荧光强度表示，而对成熟的树突状细胞而言，CD83的表达以表达这个标记的细胞的百分比表示(图2b)。
图3表明用CD40激动剂抗体和INF-γ刺激单核细胞衍生的DC后，诱导IL-12p70的分泌。单核细胞衍生的未成熟DC在抗CD40单克隆抗体或同种型对照抗体单独使用或与INF-γ结合使用的情况下培养两天。结果表明，IL-12p70的产生要求结合使用两种不同的刺激物。
图4表明，如果用CD-40 Fc片段预先温育，CD40激动剂抗体和INF-γ诱导的IL-12p70产生将受到阻碍。用过量的CD40-Fc片段和CD40激动剂抗体进行预先温育，将消除抗CD40单克隆抗体和IFN-g的结合诱导单核细胞衍生的DC中IL-12产生的能力。
图5表明CD40激动剂单克隆抗体促使DC增强诱导CD8+T细胞应答的能力。单核细胞衍生的DC要么是未刺激的，要么在有或无INF-γ时用CD40激动剂抗体预先激活，然后，在CD8+T细胞识别的具显性HLA-A2限制性表位的流感基质肽存在的情况下，和纯化的自体CD8+T细胞进行共培养。通过分析流感肽特异的CD8+T细胞的扩增(图5a)和产生INF-γ的CD8+T细胞的增加(图5b)研究CD40激活的DC对CD8+T细胞应答的诱导情况。
发明详述
本发明所描述和要求专利保护的分子包括单克隆抗体及其片段、肽和其他的化学物质。单克隆抗体的制备方法是：用常规的方法免疫哺乳动物，分离产生所需单克隆抗体的B细胞并和骨髓瘤细胞融合。优选的单克隆抗体包括嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、DeimmuizedTM抗体、单链抗体和抗体片段，包括Fab，F(ab’)2，Fv及其他一些保留了亲本抗体的抗原结合能力的片段。有关单链抗体(“ScFv”)及其构建方法见美国专利4,946,778号。
用本领域所熟知的重组方法制备嵌合抗体，其包括动物的可变区和人的恒定区。人源化抗体比嵌合抗体更接近于人的抗体序列，其中只有负责抗原结合和特异性的互补决定区(CDRs)是非人源的，因而具有相应于非人源抗体的氨基酸序列，而人源化抗体的其他部分(除了在某些情况下，可变区的少部分骨架区除外)基本上都是人源的，具有相应于人抗体的氨基酸序列。见L.Riechmann et al.，Nature：332：323-327 1988；美国专利5,225,539(Medical Research Council)；美国专利5,585,089；5,693,761；5,693,762(Protein Design Labs，Inc.)。
可用几种不同的方法制备人抗体，包括用人免疫球蛋白表达库(Stratagene Corp.，La Jolla，California；Cambridge AntibodyTechnology Ltd.，London，England)产生人抗体片段(VH，VL，Fv，Fd，Fab或(Fab)2)，用类似于制备嵌合抗体的技术，将这些片段的适当部分融合起来，由此构建出整个人抗体。人抗体也可用人免疫球蛋白基因组在转基因鼠中产生。转基因鼠可从如下公司买到，如Abgenix，Inc.，Fremont，California和Medarex，Inc.，Annandale，New Jersey。除了将重链和轻链Fv区连接构建单链抗体外，也可用类似的方法构建和表达Fab片段(M.J.Evans et al.，J.Immunol.Meth.，184：123-138 1995)。
DeImmunizedTM抗体是指除去了潜在的T细胞表位的抗体，如国际专利申请PCT/GB98/01473所描述。因此，当它们用于人体时，其免疫原性将完全消除或大大降低。
以上所述的所有完全或部分人抗体将同抗体片段和单链抗体一样，比完全鼠抗体或非人源抗体具有更低的免疫原性。因此，所有这些分子(或其衍生物)将很少可能引起人的免疫反应或变态反应。它们比完全非人抗体更适合对人体内给药，特别是重复和长期给药，如对治疗牛皮癣和其他炎症性皮肤病等可能都是必须的。
双特异性抗体可用于相同或不同细胞上CD40分子间的交联剂。这些双特异性抗体具有对CD40分子上两个不同表位的每一个的特异性。一个特异性是sCD40L与CD40结合的强激活剂，而另一特异性是sCD40L与CD40结合的部分或非抑制剂，从而对交联产生协同的激动效应。
这些抗体及制备抗体的方法公开于美国专利5,534,254(Creative Biomolecules，Inc.)。本专利所描述的双特异性抗体的不同实施方案包括将单链Fv和肽偶联剂连接，偶联剂包括Ser-Cys，(Gly)4-Cys，(His)6-(Gly)4-Cys，螯合剂，以及包括双马来酰亚氨基己烷和双马来酰亚氨基己酰的化学或二硫桥连接。
非抗体分子可用常规的方法从化合物库中分离和筛选得到。用来产生和筛选化合物库的自动系统请参考美国专利5,901,069和5,463,564。一个更精确的方法是结合位点的三维结构模拟，然后构建适合该模型的分子家族。然后从这个分子家族中筛选出具有最佳结合特性的分子。
另外一种方法是构建重组肽库，从肽库中筛选能和感兴趣的CD40表位结合的分子。见美国专利5,723,322。该表位和实施例中所描述的单克隆抗体结合的表位相同。实际上，一旦表位已知，根据现有的技术是相对容易制备和分离这些分子的。
另一种方法是诱导所需抗CD40抗体的内源性产生，主要是通过给予能诱导抗体产生的肽或抗体，或者通过基因治疗的方法，给予能编码合适的抗CD40抗体分子及其片段的基因。有关制备和引入这些分子的方法是本领域公知的。
这些分子的给药途径有很多。如果是肽或抗体，容易在胃肠道被降解，应优选注射的方式。本发明的其他化合物，也可用注射的方式给药。注射方式包括肌肉、血管及皮下注射。
本发明的非肽分子也可口服，包括混悬液，药片等。液体制剂可通过吸入冻干或气溶胶化的微胶囊的方式给药。也可用栓剂的方式给药。
可使用控制本发明的分子发挥作用持续时间的其他药物载体。具体的制备方法是，在胶体药物递送系统(如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒及纳米胶囊)或乳液中，用凝聚技术或界面聚合(羟甲基纤维素或明胶微胶囊)的方式，将分子包入微胶囊中。
赋形剂，例如盐、各种填充剂、其它缓冲剂、螯合剂、抗氧化剂、共溶剂等都可包括在最终的制剂之中。特殊的例子包括三-(羟甲基)氨基甲烷盐(“Tris缓冲液”)和依地酸钠。
制剂的剂量和给药方案可用本领域公知的标准程序测定。该程序包括从动物模型外推一个估计的剂量方案，然后在对人的临床剂量范围研究中确定最佳剂量。
本发明分子的实施例如下：
制备和使用激动性单克隆抗体A.材料和方法
下面所要列举的实施例中，用了以下一些实验方法，见实施例中。细胞系和培养条件
将EBV转化的B细胞系JY和骨髓源细胞系THP1培养在装有IMDM(Iscove’s改良Dulbecco’s培养基)培养基的T75培养瓶中，培养基中补加有50μg/ml庆大霉素和2％热灭活的胎牛血清(FCSi；BioWhittaker，Verviers，Belgium)。将细胞培养在37℃，含5％CO2的湿化孵育箱中，一周分瓶一到两次(1/20~1/100)。贮存细胞系时，使安瓿中每毫升HBSS(Hank’s平衡盐溶液)中含5-10×106个细胞，HBSS中补加有20％FCSi和10％DMSO，并贮于液氮中。外周血单核细胞的分离和贮存
外周血单核细胞(PBMC)是通过LymphoprepTM(1.077g/ml)密度离心及重悬在无Ca2+/Mg2+的PBS-0.1％BSA溶液中，从健康供血者血沉时的棕黄层中分离出来的。将自体外周血单核细胞保存在补加有2mM L-谷氨酰胺，10％FCSi，50μg/ml庆大霉素和10％DMSO的1640培养基中，贮于-196℃(CD8 T细胞的纯化见下文)。单核细胞富集和单核细胞衍生的未成熟DC的产生
通过免疫磁珠分离从PBMC中纯化单核细胞(富集单核细胞所用的混合物包括抗CD2、CD3、CD16、CD19、CD56、CD66b及血型糖蛋白A的单克隆抗体，StemSepTM来自StemCell Technologies，Vancouver，Canada)。将除去了嗜中性粒细胞、血小板、淋巴细胞和自然杀伤细胞的单核细胞(＞90％CD14+)制备物培养在无血清的培养基-StemSpan(StemCell Technologies)中，培养基中补加有10ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4(两种细胞因子来自PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)，在37℃/5％CO2培养6-7天。以1×106/2m/10cm2的密度将单核细胞接种于聚苯乙烯板上(覆盖有12mg/ml/10cm2聚丙烯酸羟乙基酯)，在第二天和第五天分别加入新鲜的GM-CSF/IL-4。6-7天以后，收集非粘连细胞(具树突状)，显示出以下的表型分布(用流式细胞仪检测)：CD1a+，CD14-，CD40+，CD80+，CD83-，CD86+，HLA-DR+及甘露糖受体++。CD8 T淋巴细胞分离
将自体外周血单核细胞解冻，用免疫磁珠除去其它细胞，将CD8 T淋巴细胞纯化(CD8富集混合物含有抗CD4、CD14、CD16、CD56及血型糖蛋白A的单克隆抗体；StemCell Technologies)。通过此纯化步骤后，得到了纯度＞90％的CD3+/CD8+淋巴细胞，其中不含单核细胞、噬中性粒细胞、血小板、B和CD4淋巴细胞及自然杀伤细胞。流式细胞仪分析
细胞(0.1×106 cells/100μl PBS-0.1％BSA/样品)和偶联的(与异硫氰酸荧光素藻红素或多甲藻黄素叶绿素蛋白偶联)单克隆抗体(Becton &Dickinson，Woerden，The Netherlands)一起温育，在21℃温育15分钟，然后在PBS-0.1％BSA中彻底洗涤，并在流式细胞仪上进行分析(FACSCaliburTM；Becton & Dickinson，Woerden，TheNetherlands).JY细胞上CD40配体和抗-CD40单克隆抗体的竞争
目前，已用表达高水平CD40的JY细胞证明了抗-CD40单克隆抗体(Mabs)对可溶性CD40配体(sCD40L)结合的阻断。这些细胞预先和抗-CD40单克隆抗体在21℃温育15分钟，然后彻底用PBS-0.1％BSA洗涤，再和可溶性融合蛋白在21℃温育15分钟，此可溶性融合蛋白由融合于鼠CD8α(CD40L-mCD8α来自Kordia，Leiden，TheNetherlands and Tanox Phama BV，Amsterdam，The Netherlands)细胞外结构域的人CD40L细胞外结构域组成。随后，用偶联到藻红素的大鼠抗小鼠CD8α的抗体检测CD40L-mCD8α，并用流式细胞仪进行分析。
将精确鉴定的单克隆抗体作为对照进行温育，M2和G28-5竞争CD40L结合位点，5C3结合于和CD40L结合位点不同的区域。EA-5部分抑制CD40L对其受体的结合(Pound et al.，Int Immunol 1999，11，p11-20)。CD40-Fc(IgG4)抑制抗CD40单克隆抗体与膜CD40L的结合
激活的CD4+T细胞被用作膜CD40L的来源。为此，通过在IMDM+5％人混合AB型血清中在PMA和离子霉素存在下培养塑性非粘连外周血单核细胞6小时以诱导T细胞，使其表达CD40L。直接将饱和剂量的CD40-Fc(IgG4由Tanox Inc Houston USA生产)加入激活的T细胞中，或者将CD40-Fc和过量的抗-CD40单克隆抗体预先温育后加到激活的T细胞中。当用PE偶联的山羊抗人IgG-Fc、FITC偶联的CD3和PERCP偶联的CD8后染色，用FACS分析法检测CD40-Fc与CD40L激活的CD4+(CD3+CD8-)T细胞的结合。CD40的ELISA分析
用0.5μg/ml山羊抗人IgG(Fc)包被ELISA板(Immunon 2)，50μl/孔，室温过夜。接着，用1％BLOTTO在室温处理60分钟。用PBS/Tween洗涤四次后，每孔加入50μl CD40-Fc和50μl融合孔上清，室温温育1小时。用PBS/Tween洗涤四次，加入50μl山羊抗小鼠IgG(Fc)-HRP偶联物，温育1小时。洗涤四次后，将底物TMB加入已温育30分钟的ELISA板中，每孔100μl。每孔加入50μl 0.2M H2SO4终止反应，用酶标仪监测在450/590nm处的读数。THP-1测定THP-1细胞的刺激
在有5×102U/ml IFN-g存在时，将3×106个THP-1细胞在10mlIMDM+2％人AB型血清中培养两天。然后将IFN-g处理过的THP-1细胞用IMDM+2％人AB型血清洗涤一次。向96孔板每孔的104个THP-1细胞中加入120μl用杂交瘤培养上清按1∶2稀释的培养基，培养两天。以最大量40μg/ml及2×稀释度的CD154-mCD8及最大量20ng/ml及2×稀释度的LPS作为对照。IL-8的测定
用5μg/ml小鼠抗人IL-8抗体(Serotec)包被ELISA板，每孔100μl，在ELISA板摇床上，室温振荡2小时。用1％BLOTTO温育ELISA板，室温振荡1小时。用PBS/Tween洗涤四次后，将从THP-1板收集到的80μl上清液加入ELISA板中。IL-8标准液的制备如下：用1％BLOTTO将IL-8稀释到1000pg/ml，300pg/ml，100pg/ml，30pg/ml，3pg/ml，1pg/ml。将ELISA板在室温振荡温育1小时。用PBS/Tween洗涤四次后，每孔加入100μl用1％BLOTTO按1∶1000稀释的小鼠抗IL-8的生物素偶联物(Serotec)，室温温育1小时。用PBS/Tween洗涤四次，每孔加入100μl用1％BLOTTO按1∶1000稀释的AMDXSA-HRP，室温振荡温育1小时。用PBS/Tween洗涤四次，每孔加入100μlTMB底物，在室温振荡温育30分钟。每孔加入50μl 0.2M H2SO4，以终止反应，用酶标仪检测在450/590nm处的读数。成熟DC的诱导
将未成熟的DC(见上文)在有抗CD40单克隆抗体的无血清培养基(StemSpanTM)中，37℃/5％CO2下培养48小时。另外，将CD40L-mCD8α，LPS以及IL-1β和TNF-α的结合作为DC成熟的对照。DC从未成熟到成熟的改变由以下因素确定：(1)表型(CD1a+，CD14-，CD40+++，CD80+++，CD83+，CD86+++，HLA-DR+++，甘露糖受体-)，(2)IL-12p70的产生(商用试剂盒)，和(3)诱导对流感基质肽(influenza-matrix peptide)特异的自体细胞毒性CD8+T淋巴细胞的能力(见下文)。IL-12p70的ELISA分析
在有抗CD40单克隆抗体(1μg/ml)，有或无IFN-g(1000U/ml)的情况下，将未成熟DC培养48小时，用商用试剂盒(来自DiacloneResearch，Becanson，France)测定培养物的上清，以检测所分泌的IL-12p70。将抗CD40单克隆抗体和10倍过量的CD40-Fc(IgG4来自Tanox Inc Houston USA)在室温预先温育15分钟，可抑制IL-12的产生。用成熟DC诱导细胞毒CD8+T淋巴细胞
向激动性抗CD40单抗诱导产生的成熟DC加入合成流感基质肽(Flu-peptide 58-66)；(1×106DC/流感基质肽5μg/ml StemSpanTM)并与0.5×106个纯化的自体CD8+T淋巴细胞在37℃/5％CO2中共培养7天。CD8+T淋巴细胞的细胞毒性由以下的方法测定：(1)计算产生IFN-γ的T细胞的数量，以此表示激活的CTL(用来自MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，Germany公司的IFN-γ消除试剂盒，用流式细胞术测定)，和(2)用一种常规的测定方法测定CTL对携带有流感基质肽的靶细胞的裂解。
实施例
实施例1： 小鼠抗人CD40单克隆抗体的产生
用两种免疫方案制备抗CD40的单克隆抗体。首先，向雌性BALB/c小鼠的腹膜腔内注入表达CD40的SF-9细胞(每鼠注入3×106个细胞)，将SF-9细胞注入小鼠腹腔前，用PBS洗涤细胞两次。在第17和31天，小鼠接受用SF-9细胞的加强注射。最后一次注射后14天，收集脾细胞。用聚乙二醇将108个脾细胞和108个SP2/0鼠骨髓瘤细胞进行融合。将融合后的细胞重悬于补加有HAT的D15培养基(经过改变的DMEM培养基)中，然后将细胞悬液铺于51个96孔板中。10-14天以后，用ELISA分析含有生长中的杂交瘤细胞的加样孔上清液，以检测抗-CD40抗体的产生。经分析表明：接种的4896个孔中，有69个孔中的杂交瘤细胞产生抗人CD40的特异性抗体。将这些孔中的培养物上清液取出用于其它的实验，如研究诱导THP-1细胞对IL-8的分泌(见下文)。接着，进行两次有限稀释，以便从许多杂交瘤细胞系中获得产生CD40激动剂抗体的克隆。为此，96孔板中杂交瘤的接种密度应低于1C/孔，并培养3-4周。用对CD40的ELISA测定筛选阳性孔，用THP-1分析法检测CD40结合抗体的出现。
第二种免疫方案是用2.5×106个单核细胞衍生的未成熟DC注入BALB/c小鼠的腹腔内。在第14，33和35天时，用来自不同供体的单核细胞衍生的DC对小鼠进行加强注射。在大约第100-120天，分离脾细胞，用上述的方法与鼠骨髓瘤细胞进行融合。用ELISA法筛选含有生长中的杂交瘤的加样孔上清液，以检测CD40结合抗体的存在。继续筛选含有CD40结合抗体的杂交瘤上清液以测定潜在的激动剂活性，这和用表达CD40的SF-9细胞免疫BALB/c小鼠，并从免疫小鼠分离B细胞制备杂交瘤一样。
实施例2从杂交瘤细胞系中筛选结合CD40抗体的样品对THP-1细胞的激动剂活 性，以及细胞系的克隆及单克隆抗体的检测
为了筛选出具有激动剂活性的抗体，检测含CD40结合抗体的上清液诱导表达CD40的单核细胞系THP-1产生IL-8的能力。THP-1细胞系已经用IFN-γ预温育。如表1所示，大部分上清液含有抗CD40抗体，在检测时具有激动剂活性。根据在THP-1测定中的效果，将上清液任意分成不同的四组(强激动剂的OD值＞2.000，中等强度激动剂的OD值为1.000-2.000，弱强度激动剂的OD值为0.375-0.999，非激动剂的OD值＜0.375)。
许多杂交瘤细胞系已经被克隆，从这些克隆产生的单克隆抗体已在THP-1分析中进行了检测。大多数(但不是所有的)克隆保留了相应母代细胞系的活性模式(数据未列出)。实施例3测定CD40反应性抗体克隆促使未成熟DC的成熟、IL-12p70产生及激 发CTL活化的能力
与GM-CSF和IL-4一起培养后的单核细胞衍生的DC代表未成熟的DC。已经测定了抗-CD40单克隆抗体对诱导表达CD40的未成熟DC成熟的能力。其他一些研究人员的试验也表明，用sCD40L刺激单核细胞衍生的DC能促使其分化为具有成熟表型的DC。而且，将sCD40L和IFN-γ结合使用，可刺激单核细胞衍生的DC分泌IL-12p70。和未成熟DC相比，成熟DC表达CD83。另外，和未成熟的DC相比，成熟的DC表现出基于每个细胞的共刺激分子CD80和CD86表达的增强，甘露糖受体表达降低，以及丧失了有效摄取分子的能力(正如葡聚糖-FITC所示)。首先，通过FACS-分析监测伴随未成熟DC分化为成熟DC的表型改变，以此显示抗-CD40单克隆抗体对DC成熟过程的诱导。首先将抗体独立地用于刺激单核细胞衍生的树突状细胞。如图1(表明CD83上调及甘露糖受体下调的几个实验的综合结果)和图2(一个表示诱导CD80，CD83，及CD86表达的典型实验)所示，通过检测结合CD40的抗体，发现其能诱导单核细胞衍生的DC的表型成熟，这正如表达CD83标记分子的细胞百分比的增加，基于每个细胞的CD80和CD86表达的增加(平均荧光强度，MFI)以及甘露糖受体表达的降低所显示的那样。显然，在THP-1细胞中，一些不能诱导产生IL-8的克隆能够诱导DC的成熟，这表明在表达CD40的不同细胞类型中，CD40单克隆抗体的激动特性是不同的(数据未列出)。
另外，通过用CD40单克隆抗体和IFN-γ刺激单核细胞衍生的DC后，检测其产生IL-12p70的情况，这是因为要求用至少两种不同的途径诱导树突状细胞，使其产生IL-12p70(Kalinski et al Blood 199790：1926)。我们的实验结果表明，除了诱导表型成熟外，CD40激动剂抗体和IFN-γ一起使用，还可诱导DC产生IL-12(图3)。我们发现CD40单克隆抗体和过量的CD40-Fc一起预先温育会抑制IL-12产生的诱导，表明抗体的激动作用是通过CD40发挥作用，而不是通过DC上其它的膜表达分子发挥作用的(图4)。
在小鼠中，T细胞辅助CTL是通过CD40激活的DC介导的。辅助性T细胞和DC间的抗原依赖性相互作用不仅引起辅助性T细胞的激活，而且通过CD40L-CD40相互作用引起DC的激活。只有在激活阶段，DC才能激发CTL应答。在没有辅助性细胞的情况下，没有DC的激活，因此也就没有激发CTL应答。然而，通过用一种抗小鼠CD40刺激性抗体进行体内给药，可以有效地绕过辅助性T细胞而直接将DC激活。
为了将CTL激活的同样机理应用于人类，进行了一项体外研究。在这个研究中，用一个由纯化的人CD8+T细胞、作为抗原呈递细胞的单核细胞衍生的DC、以及作为抗原且来源于流感病毒基质蛋白的最小肽组成的共培养体系来研究CTL激活。这个肽组成了一个显性HLA-A2限制的CTL表位。进行此实验的目的是确定抗-CD40单克隆抗体是否能使单核细胞衍生的DC具有比未处理的对照DC更强的刺激CTL应答的能力。在这个实验中，通过测量激活的CTL产生的IFN-Y及用PE偶联的HLA-A2/流感基质肽四聚体对CTL扩增进行计数，来分析CTL的激活。如图5a和图5b所示，用CD40单克隆抗体刺激单核细胞衍生的DC会导致这些细胞诱导流感肽指导的CD8+T细胞应答能力的增加。除了单克隆抗体外，对于大多数抗体，当IFN-γ用于树突状细胞的预激活时，都会使此效应增强。
实施例4抗-CD40抗体样品抑制sCD40L与CD40结合的分析
在CD40介导的DC激活诱导过程中，抗-CD40抗体和sCD40L协同作用，这最可能表明抗CD40抗体和sCD40L共结合于CD40，因此并不表示对sCD40L与CD40的结合的强阻断作用。为了筛选这种抗体，检测JY EBV转化的细胞中用单克隆抗体抑制sCD40L与CD40结合的抑制百分数。这个分析表明，单克隆抗体抑制sCD40L与CD40结合的程度具有极强的可变性。一些抗体样品几乎彻底抑制sCD40L结合，而其他的抗体样品仅仅部分阻断sCD40L结合或者对结合根本没有影响(表2)。对有限数量的克隆而言，可测定抗CD40单克隆抗体对CD40-Fc与CD40L(表达在PMA+离子霉素激活的CD4+T细胞膜上)结合的抑制，从而用相反的实验方法证实以上的实验结果。在这个实验中，克隆4阻断CD40-Fc与CD40L的结合达到88％，克隆7和克隆64分别阻断16％和25％。尽管在DC成熟和THP-1测定中，抗体效能和其阻断sCD40L与CD40结合的能力之间没有绝对的相关性，但不能阻断相互作用的所有克隆在两个测定体系中都是非应答者(数据未列出)。
实施例5在DC上，抗CD40抗体和mCD40L或sCD40L之间在激动剂活性方面的 协同效应
据预测，在很大程度上阻碍sCD40L与CD40结合的抗体，并不表现出在诱导DC成熟或在对CD40阳性细胞施加的其它激动活性方面同sCD40L有协同效应。相反，一些结合CD40的抗体和sCD40L有效共结合于其受体上，从而可假定表现出在促使DC成熟方面同sCD40L或膜结合CD40L(mCD40L)的协同性。(用作膜结合的CD40L抗原或丝裂源激活的CD4+T细胞的来源)这可以通过表达CD83的细胞百分比的增加，每个细胞中CD80和CD86表达的增加以及甘露糖受体表达的降低来加以说明。将某一种抗体与sCD40L和IFN-γ结合刺激DC，使其产生IL-12p70，其水平同单独用sCD40L或IFN-γ刺激时相比有所增强。除了sCD40L和抗CD40抗体之间的协同性以外，两个抗CD40抗体在诱导IL-12p70分泌时彼此之间也表现出协同效应。协同效应可能大多发生在阻断sCD40L与CD40结合的抗体和该相互作用的部分或非抑制剂之间，因为这些抗体可能结合CD40的不同表位。
同检测DC成熟的实验相似，关于抗CD40抗体样品单独或与sCD40L一起使用时激活CTL的效果，有待在将来的实验中作进一步的评价。由于来自DC更有效的刺激，预计对CTL激活的协同效应也会发生在与成熟测定所使用的相同的sCD40L和单克隆抗体的组合之间。同样，在CTL激活时，两个不同的抗CD40的抗体间也发生协同效应。
实施例6和CD40激动剂抗体相比，针对CD40和4-1BB配体的双特异性抗体或 针对CD40和CD28的双特异性抗体促使DC进行CTL激活的效力的增强
使用一侧有CD40特异性，而另一侧有T细胞决定簇的双功能抗体，具有使激活的DC更紧密接触周围T细胞的潜在优点。如果识别T细胞决定簇的抗体部分有激动剂特性，其额外的优点在于所吸引的T细胞既受激活DC所传递信号的刺激，又受双特异性抗体T细胞部份激动剂特性的刺激。这可以通过比较在以上描述的DC-CTL共培养体系中加入CD40单克隆抗体和双特异性抗体的激动效果，用对流感肽特异的CD8+T细胞应答作为读出结果进行评价。
以上描述和实施例只是举例说明，而不是限定范围。本发明应由其后所附的权利要求所明确说明，并包括此权利要求主题的所有等同的，已知的和未知的内容。

Claims (20)

1.能结合和刺激专用或非专用的人APCs的激动剂抗CD40分子。
2.权利要求1的激动剂抗CD40分子，其中专用的人APCs为人树突状细胞。
3.增强CD40L对CD40阳性细胞刺激作用的激动剂抗CD40分子。
4.诱导单核细胞衍生的树突状细胞表型和功能成熟的激动剂抗CD40分子。
5.权利要求1、2、3或4的激动剂抗CD40分子，其中所述分子能和CD40L同时结合到CD40，这由它们不能抑制CD40L结合CD40或不能抑制sCD40结合CD40L所确定。
6.权利要求1、2、3或4的激动剂抗CD40分子，它完全抑制CD40L结合CD40。
7.一种组合物，其中含有根据权利要求1～5中任何一项的激动剂抗CD40分子的组合。
8.权利要求7的组合物，其中包含至少一种激动剂抗CD40分子，它是sCD40L结合CD40的强激活剂，和至少一种激动剂抗CD40分子，它是sCD40L结合CD40及sCD40结合CD40L的部分抑制剂或非抑制剂。
9.权利要求1～6中任何一项的激动剂抗CD40分子，它们是单克隆抗体。
10.一种双特异性的激动剂抗CD40分子，其中每种特异性针对CD40上的不同表位。
11.权利要求10的双特异性单克隆抗体，其中一种特异性是sCD40L结合CD40的强激活剂，另一种特异性是sCD40L结合CD40的部分或非抑制剂。
12.权利要求9的单克隆抗体，它们是嵌合的、人源化的、DeimmunisedTM或人单克隆抗体。
13.权利要求12的单克隆抗体或其片断、类似物或同源物、或与这些抗体结合到相同表位的肽、寡核苷酸、肽模拟物或有机化合物。
14.权利要求13的片段，它们是Fab，F(ab’)2Fv或单链Fv。
15.产生权利要求9的单克隆抗体或其片段的细胞系。
16.产生权利要求12的单克隆抗体或其片段的细胞系。
17.编码权利要求12中任一分子的基因构建体。
18.编码权利要求13中任一分子的基因构建体。
19.用权利要求17的基因构建体转染或感染的细胞。
20.用权利要求18的基因构建体转染或感染的细胞。
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