CN1431319A - 一种细胞凋亡检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医用检测试剂技术领域，是一种用于检测细胞凋亡的试剂盒。现有的Annexin V检测试剂盒为进口产品，检测用蛋白为Annexin V，价格昂贵。本发明试剂盒检测用蛋白为Annexin B1，Annexin B1与Annexin V同属膜联蛋白家族，但Annexin B1在大肠杆菌中表达量高，且为可溶性表达，故生产工艺简单，生产成本低廉，且本发明试剂盒同样具有检测细胞量多、敏感性高和快捷等优点。

Description

一种细胞凋亡检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及医用检测试剂技术领域，是一种用于检测细胞凋亡的试剂盒。

背景技术：

细胞凋亡是细胞生命周期中的重要组成部分，是一种不同于细胞死亡的由基因调控的细胞自动消亡过程，它在胚胎发育，新旧细胞交替，某些组织的正常退化与萎缩、增生，或肿瘤细胞的自发抑制等过程中起着非常重要的作用。细胞凋亡的主要特征表现在细胞萎缩，胞膜结构的改变，核染色质致密，内源性核酸酶性DNA降解等。与之相对应的检测方法包括形态学方法；反映凋亡细胞膜改变的方法，如国外进口的Annexin V检测试剂盒；反映DNA有规律断裂的方法，如DNA末端标记法等。其中，Annexin V检测法是针对细胞凋亡最早期特征而设计。在细胞凋亡早期，细胞已丧失了其膜磷脂化合物的对称性，磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜表面。Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，在钙离子存在情况下与PS有高亲和力，结合荧光染料及流式细胞仪可作为一敏感探针检测暴露在凋亡细胞表面的PS，从而在细胞凋亡早期即尚未出现DNA链断裂情况下对其进行检测，具有处理细胞量多，敏感性高，快捷等优点。但目前市售的Annexin V检测试剂盒均为进口产品，试剂盒主要包括荧光标记的检测用蛋白Annexin V，DNA染料及相应的缓冲体系。该试剂盒价格昂贵，且Annexin V基因5’编码区GC含量高，在大肠杆菌等表达体系要获得高表达有一定困难。

发明内容：

本发明提供一种新的细胞凋亡检测试剂盒，与上述Annexin V检测试剂盒主要不同之处在于检测用蛋白的不同。本发明检测用蛋白为猪囊尾蚴cDNA文库中克隆的AnnexinB1基因表达的重组蛋白Annexin B1，其与Annexin V同属膜联蛋白家族，该蛋白含347个氨基酸，分子量32KDa。Annexin B1 cDNA序列已在GeneBank登录，登录号：AF147955。研究表明Annexin B1具有明显的抗凝血活性，现又发现Annexin B1在钙离子存在情况下与凋亡细胞表面的PS有高亲和力，故可以作为一种新型的分子探针用于凋亡细胞的检测。

Annexin B1 cDNA序列见核苷酸序列表1，序列长度为1044bp。相对应的AnnexinB1蛋白氨基酸序列见表2，由347个氨基酸组成。

Annexin B1蛋白制备大致流程为：根据Annexin B1 cDNA序列设计PCR引物，以目的基因质粒PUC-Annexin B1(孙树汉，王俊霞，陈蕊雯等，中国寄生虫与寄生虫病杂志，1997；15(1)：15～20)为模板进行PCR扩增，扩增产物测序正确后插入原核表达载体pJLA-503(购自美国菌种保藏中心)，然后转入宿主菌XLl-Blue(购自Clontech公司)。热诱导表达Annexin B1后，经离子交换及凝胶过滤层析法制备高纯度蛋白。本发明所用热诱导型原核表达载体pJLA-503全长4.9Kb(千碱基对)，含有质粒复制起点(ori)，氨苄抗性基因(AP^T)和P^RP^L启动子。本发明采用热诱导型表达载体，原因是考虑到大规模培养时热诱导方式成本低，且诱导后发现该蛋白表达量也比较高。

本发明试剂盒组成包括：1、用荧光染料异硫氰酸荧光黄(FITC)标记的检测用蛋白Annexin B1，即Annexin B1-FITC；2、碘化丙啶(PI)；3、结合缓冲液(bindingbuffer)。其中，Annexin B1-FITC用来识别凋亡细胞；PI是一种DNA染料，用PI做染色排斥实验，以从Annexin B1-FITC染色呈阳性的细胞群中区别出坏死细胞；因为Annexin B1与PS的结合需要一定浓度钙离子的存在，故试剂盒中加入供反应发生的含钙离子的结合缓冲液。

也可用别的荧光素标记Annexin B1蛋白，如生物素(biotin)、藻红蛋白(PE)等。用FITC标记蛋白时，相对应的DNA染料为PI；用PE标记蛋白时，相对应的DNA染料一般用7-氨基放线菌素D(7-ADD)。

附图说明：

图1为热诱导型原核表达质粒pJLA-Annexin B1的构建流程图

图2为Annexin B1蛋白诱导表达和纯化的电泳图谱

A：AnnexinB1蛋白诱导表达的电泳图谱

      泳道1：未诱导的菌体蛋白

      泳道2：诱导后3小时菌体蛋白

      泳道3：诱导后4小时菌体蛋白

      泳道4：诱导后5小时菌体蛋白

     泳道5：标准分子量蛋白

B：Annexin B1蛋白纯化的电泳图谱

     泳道1：标准分子量蛋白

     泳道2：菌体蛋白

     泳道3：菌体超声后上清液的蛋白

     泳道4：过DEAE Sepharose Fast Flow层析柱后蛋白

     泳道5：过SOURCE 15Q层析柱后蛋白

     泳道6：过Superdex 200层析柱后蛋白

图3为用本发明试剂盒结合流式细胞仪进行细胞凋亡检测结果分析。其中，“A”代

   表活细胞，“B”代表受损伤细胞，“C”代表凋亡细胞，“D”代表晚期凋亡细胞及

   继发性坏死细胞。

具体实施方式：下面结合附图，对本发明作详细叙述。

一、制备Annexin B1蛋白：

1、热诱导型原核表达质粒pJLA-Annexin B1的构建

据Annexin B1 cDNA序列设计两条PCR引物。正向引物为：5’C CATATGGCCTACTGTCGCTCCCTGGTTC3’，其中Nde I酶切位点“CATATG”包含起始密码子“ATG”。反向引物为：5’GC GGATCCTATTATGCAGGGCCGATGAGTTTCAAG3’，其中包含BamH I酶切位点“GGATCC”和终止密码子“TAA”。以目的基因质粒PUC-Annexin B1为模板，进行PCR扩增。扩增产物经Genecore公司测序证实完全正确后用常规方法纯化Annexin B1 DNA片断，并分别用Nde I和BamH I双酶切，然后定向克隆入同样用Nde I和BamH I双酶切的原核表达载体pJLA-503，得到重组质粒pJLA-Annexin B1。

2、制备工程菌XLl-Blue(pJLA-Annexin B1)

上述构建的重组质粒pJLA-Annexin B1转化大肠杆菌菌株XLl-Blue后即成工程菌。采用常用的氯化钙转化法进行质粒转化。先将宿主菌菌株XLl-Blue置于50mlLB培养基，该培养基含1％的胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠，pH7.0，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.4时，4℃以4000rpm离心10分钟，去上清。宿主菌用5ml预冷的100mmol/L的氯化钙溶液悬浮，10000rpm离心2分钟，用1～2ml预冷的100mmol/L的氯化钙溶液悬浮。冰浴2小时，即为感受态细菌。将构建的pJLA-Annexin B1质粒100ng与上述感受态细菌混匀后置于冰浴30分钟。然后42℃热休克90秒，冰浴10分钟。加入0.8ml LB培养基，37℃培养1小时，取0.2ml转化产物涂布于含有氨苄抗生素的LB琼脂平板上，37℃培养12～15小时，可获含有重组表达质粒pJLA-Annexin B1的单克隆菌，即为工程菌XLl-Blue(pJLA-Annexin B1)。

3、重组蛋白Annexin B1的诱导表达

分别挑取上述工程菌的单菌落至100ml含氨苄100mg/L的LB培养基中，28℃振摇培养过夜。次日，取100ml菌液接种至含氨苄100mg/L的1L LB培养基中，继续在28℃振荡培养，至细菌生长到对数期(分光光度计检测，波长为600nm处吸光值为A₆₀₀＝0.5)时，将培养液置于70℃热水浴中快速升温至42℃，再于42℃水浴摇床振荡培养4～5小时。A₆₀₀增至1.2左右，菌体内可表达大量的重组蛋白Annexin B1，约占菌体总蛋白的30％。(见图2A)

4、重组蛋白Annexin B1的纯化

培养后的菌液10000rpm离心10分钟，弃上清。用1×STE缓冲液重悬菌体(1×STE缓冲液配方为：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·HCl，PH8.0，1mmol/L EDTA，PH8.0)，冰浴超声破菌。超声时，根据菌液浓度和体积调整超声参数，当菌液由混浊变至半透明时即可终止，并注意不要有泡沫产生。10000rpm离心5分钟后，取上清液，聚乙二醇20000(Amresco公司)浓缩后过0.45μm滤膜除去杂质，移至透析袋中透析，透析液为20mM Tris·HCl，20mM NaCl，pH8.0，4℃磁力搅拌透析12～14小时，期间换液3～4次。

透析平衡后，样品过弱阴离子交换柱(层析介质为二乙胺基乙基琼脂糖，DEAESepharose Fast Flow，Pharmacia公司)进行离子交换层析。在20mM Tris·HCl，20mM NaCl，pH8.0条件下，0～1mol/L NaCl进行浓度梯度洗脱，依次收集各峰，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定重组蛋白所在峰值。收集目的蛋白峰洗脱液，20mMTris·HCl，20mM NaCl，pH8.0透析液透析平衡，然后过SOURCE 15Q柱(Pharmacia公司)进行精细纯化，平衡液及洗脱液成分同第一步纯化步骤。SDS-PAGE电泳确定目的蛋白主峰，经浓缩后，再过Superdex-200柱(Pharmacia公司)行凝胶层析进一步除盐除杂蛋白。收集蛋白样品经12％SDS-PAGE电泳，考马氏亮蓝染色显示为单一蛋白条带，灰度扫描纯度达98％以上(见图2B泳道6)。采用考马斯亮兰染色法(Bradford法)测定纯化蛋白浓度。将所得蛋白冷冻干燥后分装，置4℃保存。

利用本发明重组蛋白Annexin B1的纯化工艺，每克湿菌可获约30mg Annexin B1高纯度蛋白。

二、制备试剂盒中的试剂

1、制备荧光标记的Annexin B1蛋白(Annexin B1-FITC)

在碱性条件下，FITC的异硫氰基(-N＝C＝S)可与蛋白的自由氨基(主要是赖氨酸的ε-氨基)经碳酰胺化形成稳定的硫碳氨基键，成为荧光标记蛋白。荧光标记蛋白的方法采用半透膜渗透标记法(Clark法)。用0.025mol/L PH9.6的碳酸盐缓冲液将上述制备的Annexin B1蛋白稀释到一定浓度(5～10mg/ml)后装入透析袋，将FITC(Sigma公司)用相同缓冲液配成0.1～0.5mg/ml溶液(蛋白与荧光素用量比1∶50～1∶100)。然后将装有Annexin B1蛋白的透析袋浸没于FITC液，放4℃冰箱，在电磁搅拌下平衡结合18～24小时后取出，标记即告完成。标记后蛋白过G-25柱去除游离荧光素，洗脱用缓冲液为：50mM Tris·HCl，50mM NaCl，lmM EDTA，PH8.0。收集标记蛋白峰，将Annexin B1-FITC用洗脱液配制成20μg/ml浓度，分装小管，加入NaN₃至终浓度0.02％，4℃冰箱避光保存。若待标蛋白溶液体积较大，也可采用直接标记法(Marshall法或Chadwick法)。(以上蛋白标记方法可参照《现代免疫学实验技术》，湖北科学技术出版社，2002年)。

2、制备碘化丙啶(PI)

PI是一种DNA染料。由于坏死细胞失去膜的完整性，PS也会暴露，故用试剂盒检测必须能区分凋亡细胞与坏死细胞。Annexin B1-FITC用于分析凋亡细胞外层PS，而PI则用于区别坏死细胞。本发明试剂盒中PI(Sigma公司)浓度为50μg/ml，用1×PBS缓冲液配制，1×PBS配方为：8g NaCl；0.2g KCl；1.44g Na₂HPO₄·7H2O；0.24gKH₂PO₄·H₂O。0.1M NaOH调PH至7.4，加去离子水定容至1L。

3、制备结合缓冲液(binding buffer)

Annexin B1与PS的结合需要一定浓度钙离子的存在，其结合缓冲液的配方为10mM HEPES/NaOH PH7.4；140mM NaCl；2.5mM CaCl₂。也可据试剂盒包装大小配成10倍缓冲液，使用前用去离子水稀释。

三、组装试剂盒

将上述制备的三种试剂分别分装入管，各取一管置于试剂盒，即成本发明试剂盒。

试剂盒可根据使用量的需要做成不同大小的包装，例如可供做50次实验的小包装则各管分别为：含浓度为20μg/ml的Annexin B1-FITC 250μl一管，含浓度为50μg/ml的PI 500μl一管以及含50ml的结合缓冲液一管。按此用量配比依次类推，可组装成100次、500次等实验用中大型试剂盒。

试剂盒储存于2～8℃。因PI、NaN₃有毒性，故配制和使用时应注意防护。

四、试剂盒使用方法

1、标记细胞

1.1取待测细胞0.5～1×10⁶个/ml，用预冷(2～8℃)PBS洗涤2次，离心500～

   1000rpm，5～10分钟，弃上清。

1.2用结合缓冲液重悬细胞，调整细胞数1×10⁶个/ml。

1.3取100μl细胞悬液进行标记，加入5μl浓度为20μg/ml的Annexin B1-FITC及

   10μl浓度为50μg/ml的PI。

1.4室温避光轻轻混匀反应体系10～15分钟，即完成细胞荧光标记过程。

2、检测分析：检测分析方法有如下两种：

(1)荧光显微镜分析

取上述荧光标记的细胞悬液滴于载玻片上，盖上盖玻片，置荧光显微镜下观察。正常细胞无任何荧光标记；凋亡细胞膜上染有荧光标记呈黄绿光环；坏死细胞胞膜也呈黄绿光环，但胞核被PI染成红色。这样就把凋亡细胞与正常细胞及坏死细胞区分开来了。

(2)流式细胞仪分析

取上述荧光标记的细胞悬液每反应体系加400μl结合缓冲液，1小时内流式细胞仪分析。

进行分析时，在样品双色荧光标记二维点阵图上(见图3)，显示四个独特细胞群：①活细胞群(A)：显示低浓度FITC和低浓度PI信号。②受损伤细胞(B)：显示低浓度FITC和高浓度PI信号。③凋亡细胞(C)：显示高浓度FITC和低浓度PI信号。④继发性坏死细胞(D)：显示高浓度FITC和高浓度PI信号。

本发明的优点和积极效果：

本发明试剂盒能有效快速检测早期细胞凋亡，细胞分群清楚。检测用蛋白AnnexinB1在大肠杆菌表达体系中为可溶性蛋白，表达量高，为后续纯化工作带来了便利。该凋亡检测试剂盒生产工艺简单，与国外类似产品相比生产成本低廉，且同样具有处理细胞量多，敏感性高，快捷等优点。

实施例1：制备荧光标记蛋白Annexin B1-FITC

从-80℃冰箱取出冻存的工程菌XLl-Blue(pJLA-Annexin B1)于室温融化后，用接种环蘸取少量菌液划线接种于1.5％的含100μg/ml氨苄的LB琼脂平板。28℃培养过夜后，取单克隆接种于100ml含100μg/mL氨苄的LB培养液，该LB培养液含1％的胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠，pH7.0。28℃培养12小时，作为种子液。按1∶10的比例将种子液接种于1升含100μg/ml氨苄的LB培养液。于30℃培养2小时后将三角摇瓶置于70℃热水浴中快速升温至42℃，再置于42℃中振荡培养5小时进行热诱导。

热诱导培养后的菌液于10000rpm离心5分钟，收集菌体。将菌体悬浮于50ml 1×STE缓冲液，分装成5管，每管10ml，常规超声破菌。然后10000rpm离心5分钟，取上清，PEG浓缩后过0.45μm滤膜除去杂质，移至透析袋中透析，透析液为20mMTris·HCl，20mM NaCl，pH8.0，4℃磁力搅拌透析12小时，期间换液3次。透析平衡的蛋白样品经DEAE Sepharose FF进行离子交换层析。以20mM Tris·HCl，pH8.0+1mol/L NaCl pH8.0梯度洗脱，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定重组蛋白所在峰值。收集峰值段洗脱液，透析除盐后过SOURCE 15Q柱进行精细纯化，平衡液及洗脱液成分同第一步纯化步骤。SDS-PAGE电泳确定目的蛋白主峰，经浓缩后，再过Superdex-200柱行凝胶层析进一步除盐除杂蛋白。最终蛋白样品经12％SDS-PAGE电泳，考马氏亮蓝染色显示为单一蛋白条带。采用考马斯亮兰染色法(Bradford法)测定纯化蛋白浓度，计算回收率。将所得蛋白冷冻干燥后分装保存。然后采用半透膜渗透标记法(Clark法)进行荧光标记蛋白。0.025mol/L PH9.6的碳酸盐缓冲液将蛋白稀释到5mg/ml后装入透析袋，用同样的缓冲液将FITC配成0.1mg/ml溶液。将透析袋浸没于FITC液，放4℃冰箱，在电磁搅拌下平衡结合24小时后取出，蛋白标记即告完成。标记后的蛋白过G-25柱去除游离荧光素(缓冲体系为：50mM Tris·HCl，50mMNaGl，1mM EDTA，PH8.0)，收集蛋白峰，按20μg/ml浓度分装小管，加入NaN₃至终浓度0.02％，即完成Annexin B1-FITC的制备。

实施例2：检测细胞凋亡

选用幼龄小鼠胸腺细胞，诱导凋亡试剂为地塞米松。取2-3周Balb/c小鼠，眼球放血致死后无菌取胸腺，常规制备单细胞悬液，计数并调整细胞至1×10⁶个/ml。胸腺细胞液5ml置于培养皿中，除对照外，余加地塞米松至终浓度10^-5mol/L。对照及诱导组均置CO₂孵育箱中37℃培养，5小时后收集细胞，1×PBS洗涤细胞两次，1×bindingbuffer重悬细胞，调整细胞数l×10⁶个/ml。吸取100μl细胞悬液，加入5μl浓度为20μg/ml Annexin B1-FITC，10μl PI液，室温避光轻轻混匀反应体系15分钟后每管加400μl结合缓冲液，送流式细胞仪分析。结果如图3所示，未诱导组凋亡细胞占所测细胞总数的10.3％，活细胞为83.5％；地塞米松诱导组凋亡细胞占所测细胞总数的75.1％，活细胞为15.3％。正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞三群细胞分群清楚，反映该试剂盒是一种敏感性高、快捷的细胞凋亡检测试剂盒。

表1：Annexin B1 cDNA核苷酸序列1 atggcctact gtcgctccct ggttcatcta tatgccccca atggagagaa gtacaaaccg61 actattaccc caacacccgg gttctcaccg accgctgatg ctgagcactt gaagcgtgca121 atgcgaggac ttggcacgaa tgaacgtgcg atcattgaca ttcttggaaa ccgaacttca181 gccgaaagaa tggccattcg tgacgcctat ccgtcgattt ccagcaagac cctgcacgat241 gctctaacca gcgagctgag tggcaagttc cggaggttcg ccttgttgct aatccaatca301 ccgtggcagg tgatggcaga ggctctttac gacgccatga agggggctgg cactaaggaa361 cgcgtactca atgaaattat tgccgggtgt tcaaaggatg acatccctca gttgaaaaaa421 gcttttgaag aagtgagcgg aggagaaacc cttgatgatg cgatcaaggg ggacacgagt481 ggcgactacc gcgaggccct tctgctagcg ctcgccggtc aggctgatga accacaggcg541 atgcaactca aaaacctaac accctccact ctcagtcagg ttgtgaatcc cggccttgct601 gaaacggatg cgaaggagct gtacgcctgc ggtgaggggc gcccgggcac agcagagagt661 cgtttcatgc gtcctatcgt caatcgctca ttccttcaat taaacgcaac gaatgaggct721 tacaatcggg cctacggtca cccgttgatt gatgcaataa agaaggagac gtcgagagac781 cttgaggact ttctcataac tagagttcgc tacgccactg atcgcgccag tctgtttgcc841 gaactccttc actttgccat gagaggagct ggcaccaagg actccacttt gcaacgtgtt901 cttgccttga gggctgatac tgatctagga agcatcaagg agaagtatgc ggagctctat961 ggtgaaacct tggaagcggc aatcaagggt gatacttctg gtgactatga ggctctctgc1021 ttgaaactca tcggccctgc ataa表2 Annexin B1蛋白氨基酸序列MAYCRSLVHL  YAPNGEKYKP  TITPTPGFSP  TADAEHLKRA  MRGLGTNERA  IIDILGNRTSAERMAIRDAY  PSISSKTLHD  ALTSELSGKF  RRFALLLIQS  PWQVMAEALY  DAMKGAGTKERVLNEIIAGC  SKDDIPQLKK  AFEEVSGGET  LDDAIKGDTS  GDYREALLLA  LAGQADEPQAMQLKNLTPST  LSQVVNPGLA  ETDAKELYAC  GEGRPGTAES  RFMRPIVNRS  FLQLNATNEAYNRAYGHPLI  DAIKKETSRD  LEDFLITRVR  YATDRASLFA  ELLHFAMRGA  GTKDSTLQRVLALRADTDLG  SIKEKYAELY  GETLEAAIKG  DTSGDYEALC  LKLIGPAZ

Claims (5)

1、一种细胞凋亡检测试剂盒，试剂包括荧光标记的检测用蛋白、DNA染料及结合缓冲液，其特征在于检测用蛋白为Annexin B1。

2、权利要求1所述的细胞凋亡检测试剂盒，其特征在于荧光标记的检测用蛋白为Annexin B1-FITC，DNA染料为PI。

3、权利要求1所述细胞凋亡检测试剂盒的检测用蛋白Annexin B1的制备方法，包括构建表达质粒、制备工程菌、表达重组蛋白、重组蛋白的纯化，其特征在于构建的表达质粒为pJLA-Annexin B1。

4、权利要求3所述细胞凋亡检测试剂盒的检测用蛋白Annexin B1的制备方法，其特征在于制备的工程菌为XLl-Blue(pJLA-Annexin B1)。

5、权利要求1所述细胞凋亡检测试剂盒用于检测细胞凋亡用途。

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