CN110672499B - 一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液及其制备方法，应用于Annexin V或PI/7‑AAD单染，在正常收集的细胞中加入适量的阳性质控液，冰上孵育30分钟，即可使细胞死亡，再与等量的活细胞混合，可形成比例接近的活细胞和死细胞，Annexin V或PI/7‑AAD单染时，可检测到比例接近的阳性细胞群和阴性细胞群，可非常方便地用于仪器的补偿调节。操作简单、重复性好、方便补偿调节、保证结果的可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液及其制备方法。
背景技术
细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)，是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，是一种主动的、程序性的、细胞固有的生物学过程。细胞凋亡作为细胞生命周期中重要的组成部分，在凋亡的过程中伴随着细胞形态的改变以及一系列基因的激活、表达及调控等作用。其中，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内层翻转至外层，进而暴露于细胞表面，是细胞凋亡级联反应的初始事件。PS的外翻作为凋亡细胞被吞噬细胞识别的标志，进一步引起细胞皱缩、染色质浓缩、核内DNA的降解等。因此PS外翻可作为早期凋亡检测的靶点，具有较高的时效性。
Annexin V为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，是一种以钙依赖的方式与磷脂酰丝氨酸(PS)结合的蛋白质，具有抗凝血作用，分布广泛，在多种组织细胞(如心肌细胞、肝细胞、内皮细胞等)中表达。在细胞凋亡过程中，凋亡细胞膜发生变化，PS从细胞膜的脂双层内层迁移至外层是细胞凋亡级联反应的初始事件，Annexin V蛋白与细胞膜上的PS有很高的亲和力，因此利用Annexin V高亲和PS可早期检测凋亡的发生。这是目前公认的灵敏、高效和特异的凋亡细胞检测的方法。Annexin V标记FITC、PE、APC等用于体外细胞凋亡检测。
碘化丙啶(PI)和7-氨基放线菌素(7-AAD)是常用的核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期或死细胞，PI和7-AAD能够透过细胞膜给细胞核染色。因此将AnnexinV与PI或7-AAD结合使用，就可以将凋亡早晚期细胞及死细胞区分开。
对Annexin V法凋亡检测大部分都是利用流式细胞仪，流式细胞仪通过内置激光器发射激光激发荧光染料，发射出另一特定波长的发射光，通过检测器进行检测分析。但是用激光器激发两种或两种以上荧光染料而发出不同波长的荧光，由于每种荧光素分子都具有自身的光谱发射范围，这些发射光谱之间存在相互叠加现象，所以需要进行补偿调节。
补偿调节时，样本须同时包含阴性细胞群和阳性细胞群，且各自比例最好不低于20％。如果使用实验中凋亡诱导的阳性样本进行补偿调节，可能会因为凋亡阳性的细胞比例较低，导致难以调节补偿或不准确。另外，目前大部分凋亡实验都是通过凋亡药物添加诱导或者某些基因的过表达或敲除，但是这种诱导方式受诱导浓度、诱导时间等多种因素的影响，导致不同的实验需要进行反复多次的条件摸索，因此该方法的可重复性较差。当补偿调节受影响时，分析的结果就会产生假阳性或假阴性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于Annexin V凋亡检测的阳性质控液，用于Annexin V或PI/7-AAD单染时，可检测到比例接近的阳性细胞群和阴性细胞群，可非常方便地用于仪器的补偿调节。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液，包括以下成分和配方：
高氯酸钠，一水，终浓度：0.1M-0.2M；
柠檬酸三钠，二水，终浓度：0.05M-0.1M；
氯化镁，六水，终浓度：0.05M-0.1M；
氯化钙，二水，终浓度：0.05M-0.1M；
甘油，终浓度：5％-15％；
异丁醇，终浓度：0.5％-1％；
甲醛，终浓度：1％-4％；
其余为水；
阳性质控液的PH为：7.0-7.4。
作为一种优选方案，包括以下成分和配方：
高氯酸钠，一水，终浓度：0.15M；
柠檬酸三钠，二水，终浓度：0.05M；
氯化镁，六水，终浓度：0.05M；
氯化钙，二水，终浓度：0.05M；
甘油，终浓度：10％；
异丁醇，终浓度：0.92％；
甲醛，终浓度：4.04％；
其余为水；
阳性质控液的PH为：7。
进一步的，还提供一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：准确称量高氯酸钠，一水、柠檬酸三钠，二水、氯化镁，六水和氯化钙，二水至烧杯中，加入超纯水，搅拌混匀，充分溶解；
步骤二：准确量取甘油、异丁醇和甲醛，加入上述溶液中，搅拌混匀，放在通风橱中过夜；
步骤三：第二天用盐酸调节溶液pH值至7.0，定容至配制体积，搅拌混匀。
本发明的有益效果：上述阳性质控液应用于Annexin V或PI/7-AAD单染，在正常收集的细胞中加入适量的阳性质控液，冰上孵育30分钟，即可使细胞死亡，再与等量的活细胞混合，可形成比例接近的活细胞和死细胞，Annexin V或PI/7-AAD单染时，可检测到比例接近的阳性细胞群和阴性细胞群，可非常方便地用于仪器的补偿调节。操作简单、重复性好、方便补偿调节、保证结果的可靠性。
附图说明
图1为实施例1的Eca109细胞经阳性质控液处理后Annexin V-FITC/PI染色流式检测结果：
1-1：未染色空白对照组；
1-2：阳性质控液处理后的细胞染色Annexin V-FITC；
1-3：阳性质控液处理后的细胞染色PI；
1-4：阳性质控液处理后的细胞与等量活细胞混合后染色Annexin V-FITC，补偿调节；
1-5：阳性质控液处理后的细胞与等量活细胞混合后染色PI，补偿调节。
图2为实施例2的Jurkat细胞经阳性质控液处理后Annexin V-APC/7-AAD染色流式检测结果：
2-1：未染色空白对照组；
2-2：阳性质控液处理后的细胞染色Annexin V-APC；
2-3：阳性质控液处理后的细胞染色7-AAD；
2-4：阳性质控液处理后的细胞与等量活细胞混合后染色Annexin V-APC，补偿调节；
2-5：阳性质控液处理后的细胞与等量活细胞混合后染色7-AAD，补偿调节。
图3为实施例3的Eca019细胞经阳性质控液处理后Annexin V-PE/7-AAD染色流式检测结果：
3-1：未染色空白对照组；
3-2：阳性质控液处理后的细胞染色Annexin V-PE；
3-3：阳性质控液处理后的细胞染色7-AAD；
3-4：阳性质控液处理后的细胞与等量活细胞混合后染色Annexin V-PE，补偿调节；
3-5：阳性质控液处理后的细胞与等量活细胞混合后染色7-AAD，补偿调节。
具体实施方式
实施例1
一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液，包括以下成分和配方：
高氯酸钠，一水，终浓度：0.15M；
柠檬酸三钠，二水，终浓度：0.05M；
氯化镁，六水，终浓度：0.05M；
氯化钙，二水，终浓度：0.05M；
甘油，终浓度：10％；
异丁醇，终浓度：0.92％；
甲醛，终浓度：4.04％；
其制备方法为：准确称量高氯酸钠，一水、柠檬酸三钠，二水、氯化镁，六水和氯化钙，二水至烧杯中，加入超纯水，搅拌混匀，充分溶解；准确量取甘油、异丁醇和甲醛，加入上述溶液中，搅拌混匀，放在通风橱中过夜；第二天用盐酸调节溶液pH值至7，定容至配制体积，搅拌混匀。
其应用于方式为：
1.收集5×105-1×106个Eca109细胞，用预冷PBS离心洗涤两次，弃上清；
2.用500μl阳性质控液重悬细胞，置冰上孵育30分钟；
3.用预冷PBS离心洗涤，弃上清；
4.加入适量预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混匀。加入预冷1×Binding Buffer补充至1.5ml，等分三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管；
5.单染管分别加入5μl Annexin V-FITC或10μl PI，室温避光孵育10分钟。
其结果如图1所示。
实施例2
一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液，包括以下成分和配方：
高氯酸钠，一水，终浓度：0.1M；
柠檬酸三钠，二水，终浓度：0.075M；
氯化镁，六水，终浓度：0.075M；
氯化钙，二水，终浓度：0.075M；
甘油，终浓度：5％；
异丁醇，终浓度：0.5％；
甲醛，终浓度：1％；
其制备方法为：准确称量高氯酸钠，一水、柠檬酸三钠，二水、氯化镁，六水和氯化钙，二水至烧杯中，加入超纯水，搅拌混匀，充分溶解；准确量取甘油、异丁醇和甲醛，加入上述溶液中，搅拌混匀，放在通风橱中过夜；第二天用盐酸调节溶液pH值至7，定容至配制体积，搅拌混匀。
其应用于方式为：
1.收集5×105-1×106个Jurkat细胞，用预冷PBS离心洗涤两次，弃上清；
2.用500μl阳性质控液重悬细胞，置冰上孵育30分钟；
3.用预冷PBS离心洗涤，弃上清；
4.加入适量预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混匀。加入预冷1×Binding Buffer补充至1.5ml，等分三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管；
5.单染管分别加入5μl Annexin V-APC或10μl 7-AAD，室温避光孵育10分钟；
其结果如图2所示。
实施例3
一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液，包括以下成分和配方：
高氯酸钠，一水，终浓度：0.2M；
柠檬酸三钠，二水，终浓度：0.1M；
氯化镁，六水，终浓度：0.1M；
氯化钙，二水，终浓度：0.1M；
甘油，终浓度：15％；
异丁醇，终浓度：1％；
甲醛，终浓度：4％；
其制备方法为：准确称量高氯酸钠，一水、柠檬酸三钠，二水、氯化镁，六水和氯化钙，二水至烧杯中，加入超纯水，搅拌混匀，充分溶解；准确量取甘油、异丁醇和甲醛，加入上述溶液中，搅拌混匀，放在通风橱中过夜；第二天用盐酸调节溶液pH值至7，定容至配制体积，搅拌混匀。
其应用于方式为：
1.收集5×105-1×106个Eca109细胞，用预冷PBS离心洗涤两次，弃上清；
2.用500μl阳性质控液重悬细胞，置冰上孵育30分钟；
3.用预冷PBS离心洗涤，弃上清；
4.加入适量预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混匀。加入预冷1×Binding Buffer补充至1.5ml，等分三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管；
5.单染管分别加入5μl Annexin V-PE或10μl 7-AAD，室温避光孵育10分钟；
其结果如图3所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液，其特征在于，包括以下成分和配方：
高氯酸钠，一水，终浓度：0.1M-0.2M；
柠檬酸三钠，二水，终浓度：0.05M-0.1M；
氯化镁，六水，终浓度：0.05M-0.1M；
氯化钙，二水，终浓度：0.05M-0.1M；
甘油，终浓度：5％-15％；
异丁醇，终浓度：0.5％-1％；
甲醛，终浓度：1％-4％；
其余为水；
阳性质控液的PH为：7.0-7.4。
2.根据权利要求1所述一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：准确称量高氯酸钠，一水、柠檬酸三钠，二水、氯化镁，六水和氯化钙，二水至烧杯中，加入超纯水，搅拌混匀，充分溶解；
步骤二：准确量取甘油、异丁醇和甲醛，加入上述溶液中，搅拌混匀，放在通风橱中过夜；
步骤三：第二天用盐酸调节溶液pH值至(7.0)，定容至配制体积，搅拌混匀。
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