CN1354799A - 检测溶血磷脂和磷脂的酶学方法及其与疾病的联系 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种酶学方法兼诊断成套工具,用于检测和定量受检个体体液标本中的一种或多种溶血磷脂。此方法将酶用于两阶段的定量分析法中,可用于检查与溶血磷脂水平改变有关的疾病状态,揭示疾病状态和溶血磷脂水平改变之间的关系。

Description

检测溶血磷脂和磷脂的酶学方法及其与疾病的联系
本发明所属技术领域
本发明主要涉及酶学方法，用于检测生物液体中的溶血磷脂，如溶血磷脂酸(LysoPA)和溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)，以及检测与溶血磷脂水平改变有关的疾病状态以及二者的相互关系。
与本发明相关的背景技术
磷脂酰胆碱(PC)，也称为卵磷脂，是多聚不饱和脂肪酸如花生四烯酸和亚麻酸的主要来源之一。前者是具有多种生物活性的廿烷类(eicosanoids)的前体。PC水解产生溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)以及参与信号转导的脂肪酸成分(Asaoka  等，PNAS.USA90：4917-4921(1993)；Yoshida等，PNAS.USA89：6443-6446(1992))。越来越多的证据显示，在氧化型低密度脂蛋白中高浓度的LysoPC可能在动脉粥样硬化形成和其它炎症性疾病中起重要作用(Steinberg等，《新英格兰医学杂志》(NEW.Eng.J.Med.)320：915-924(1989))。曾有报道表明，LysoPC可增加编码血小板来源生长因子的A和B链，以及培养的内皮细胞中的肝素结合上皮生长因子样蛋白(HB-EGF)的基因的转导(Kume和Gimbrone，《临床调查杂志》(J.Clin.Invest)93：907-911(1994))，并且可增加人单核细胞 mRNA 编码的HB-EGF (Nakano等，PNAS.USA91：1069-1073(1994))。这些基因的产物是平滑肌细胞和纤维母细胞的有丝分裂原(Higashiyama等，《科学》(Science)251：936-939(1991)；Ross，《自然(Lond.)》362：801-809(1993))。离体实验显示，LysoPC也激活蛋白激酶C(Sasaki等，《欧洲生物化学学会联合会信函》320：47-51(1993))，加强人T淋巴细胞的激活(Asaoka等，PNAS.USA89：6447-6451(1992))，并且加强由膜通透性的二酰甘油或佛波脂介导的HL-60细胞分化为巨噬细胞的过程(Asaoka等，PNAS.USA90：4917-4921(1993))。
通过溶血磷脂酶D的水解作用(Tokumara等，《生物化学生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)875：31-38(1986))，LysoPC也可能是具生物活性的溶血磷脂酸(LysoPA)的来源(Moolenear等，《药理·生化·生理综述》(Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.)119：47-65(1992))。LysoPA是天然磷脂，具有广泛的生长因子样生物活性。已证实，LysoPA可作为原核和真核细胞中磷脂生物合成的前体(VandenBosch，《生物化学综述年鉴》(Ann.Rev.Biochem.)43：243-277(1974)；Racenis等，《细菌学杂志》(J.Bacteriol)174：5702-5710(1992))。LysoPA的细胞间脂质介质作用的能力已被关注(Vogt，《药理病理档案》(Arch.Pathol.Pharmakol.)240：124-139(1960)；Xu等，《细胞生理学杂志》(J.Cell.Physiol)163：441-450(1995)；Xu等，《生物化学》(Biochemistry)309：933-940(1995)；Tigyiu等，《细胞生物学》(Cell Biol.)91：1908-1912(1994)；Panetti等，《临床医学实验杂志》129(2)：208-216(1997))。LysoPA由活化的血小板快速产生，可刺激血小板聚集和损伤修复。
卵巢癌活化因子(OCAF)已从卵巢癌腹水中分离得到(Mills等，《癌症研究》(Cancer Res.)48：1066(1988)；Mills等，《临床调查杂志》86：851(1990)和美国专利第5,326,690和5,277,917号)，并被确定含LysoPA的多种形式(Xu等，《临床癌症研究》(Clin.Cancer Res.)1：1223-1232(1995))。LysoPA被认为是卵巢癌病人腹水中强有力的癌症生长因子(Id.)。
与各种机体状态相关的其它溶血磷脂包括溶血磷脂酰丝氨酸(LysoPS)、溶血磷脂酰氨基乙醇(LysoPE)、溶血磷脂酰甘油(LysoPG)和溶血磷脂酰肌醇(LysoPI)。活化的血小板分泌两种磷脂酶：sPLA2和PS-PLA1。具报道，sPLA2在炎症反应中增加，抑制此酶可减弱炎症(Schrier等，《风湿性关节炎》(Arthritis Rheum.)39(8)：1292-1299(1996)；Tramposch等，《药理学和实验治疗》(Pharmacol.And Experimental Therapeutics)271(2)：852-859(1994))。PS-PLA1特异性水解磷脂酰丝氨酸，或溶血磷脂酰丝氨酸(LysoPS)，产生LysoPS或3-磷酸甘油。LysoPS极大地加强由刀豆球蛋白A引起的小鼠浆膜肥大细胞脱颗粒，增加组胺释放(Tamori-Natori等，《生物化学杂志(东京)》(J.Biochem(Tokyo)100(3)：581-590(1986))，并且可以刺激sPLA2引起的小鼠浆液肥大细胞的组胺释放(Hara等，《生物药理学公报》(Biol.Pharm.Bull.)19(3)：474-476(1996))。LysoPC是炎症性磷脂介质(Lloret等，《细胞生理学杂志》(J.Cell Physiol.)165(1)：89-95(1995))，以及sPLA2参与炎症过程(Lloret等，《毒理学》(Toxicon)32(11)：1327-1336(1994))。实验显示，LysoPI通过参与调控下游效应器分子的活性及其与RAS蛋白的相互作用的过程，刺激酵母腺苷酸环化酶的活性(Resnick和Thomaska，《生物学化学杂志》269(51)：32336-32341(1994))。
分离和半定量测定诸如LysoPA的磷脂的方法中，已知的有薄层色谱法(TLC)及其随后的气相色谱法(GC)和/或质谱分光术(MS)。例如，利用如Bligh和Dyer(加拿大《生化生理杂志》(Can.J.Biochem.Physiol.)37：911-917(1959))所描述的提取过程，脂质可以从体液被检标本中提取出。薄层色谱法可用来分离各种磷脂，例如，Thomas和Holub(《生物化学和生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)1081：92-98(1991))所描述的。磷脂和溶血磷脂能够在板上显现，如Gaudette等《生物学化学杂志》(J.Biol.Chem)268：13773-13776(1993)描述的利用紫外光方法。此外，与磷脂分离后或作为磷脂的一部分，溶血磷脂的浓度可以用NMR或HPLC确定(Creer和Gross，《脂质》20(12)：922-928(1985)；Bowes等，《生物学化学杂志》268(19)13885-13892(1993))。采用以LysoPA对培养的真核细胞的特异性作用为基础的测定方法，卵巢癌病人腹水中的LysoPA水平也已被测出(Mills等，《癌症研究》48：1066-1071(1988))。但是，这些先前的方法耗时昂贵而不稳定，尤其是只能半定量测定。
对于溶血磷脂类的快速敏感测定的发展，有助于将溶血磷脂作为细胞活性标志的利用，如血小板活化，以及将其作为与溶血磷脂水平改变有关的机体状态的标志。而且，这些测定将提供一种确定溶血磷脂水平的改变和与其变化相关的机体状态之间关系的方法。
发明简述
本发明包括测定血清或血浆等生物液体样本中诸如LysoPC的溶血磷脂浓度的酶学方法。此方法涉及至少一种溶血磷脂的两阶段的酶解反应，生成一种参与随后酶解反应的底物，后一反应产生可用于测定溶血磷脂浓度的可检测的终产物。
所述方法检测取自受检个体体液样本中的，诸如LysoPC的溶血磷脂的浓度。优选的是，通过脂质的提取，样本中的溶血磷脂首先被富集。例如，将极性脂质重新溶解于水溶液中，利用两阶段酶学反应来测定溶血磷脂浓度。溶血磷脂被酶消化，产生参与第二阶段酶反应的物质。在特异的反应体中，第二阶段反应为一酶循环反应，可以放大信号。此方法使得测定被检样本中少量的溶血磷脂成为可能。
在一个实施例中，采用诸如溶血磷脂酶或磷脂酶B的酶将G-3-P从LysoPA上离解下来。酶循环反应可以确定G-3-P水平，此反应利用G-3-P氧化酶和3-磷酸-甘油脱氢酶，以β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)为辅酶。用分光光度法测定β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化量，可以定量分析LysoPA。或者采用比色法，由循环反应生成的过氧化氢的测定得到LysoPA的量。
除LysoPA外，LysoPC、溶血磷脂酰丝氨酸(LysoPS)、溶血磷脂酰肌醇(LysoPI)、溶血磷脂酰氨基乙醇(LysoPE)和溶血磷脂酰甘油(LysoPG)等其它溶血磷脂，可用本发明的方法检测。对于这些溶血磷脂，可供使用的酶包括磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D、磷脂酶B和溶血磷脂酶、甘油磷酸胆碱磷酸二脂酶、及甘油激酶，但并不局限于这些酶。
所述的酶学方法可用于检测受检个体溶血磷脂相对于正常个体溶血磷脂水平的改变，从而检测与上述溶血磷脂水平改变有关的机体状态。用本发明的方法诊断某种机体状态，也可由测定取自受检个体样本在一段时间内某种溶血磷脂浓度的变化率实现。
本发明中的另一个实施例是，采用一种测定方法来确定溶血磷脂水平是否与某种机体状态有关。在此实施例中，已知处于一特定疾病状态如炎症情况的病人的溶血磷脂浓度被测定，并与未患此疾病病人的溶血磷脂浓度比较。与正常个体溶血磷脂浓度相比，受检个体样本溶血磷脂水平的改变，显示溶血磷脂的水平与疾病状态的存在有关联。
本发明的另一个实施例是一套诊断工具，包括本发明的酶学测定的酶和其它试剂，用于测定来自受检个体体液的样本溶血磷脂浓度。
附图简要描述
图1为由NADH氧化定量的LysoPA水平和血浆的稀释曲线，详见下文实施例1。
图2是由过氧化氢(H2O2)定量的LysoPA水平和血浆的稀释曲线，详见下文实施例1。
图3是由过氧化氢(H2O2)定量的LysoPC水平和血浆的稀释曲线，详见下文实施例2。
图4为直方图，显示了采用本发明之酶学测定方法得到的卵巢癌病人相对于正常人平均血浆LysoPA水平的升高，详见下文实施例3。
图5为直方图，显示了当LysoPA、LysoPC和PC在卵巢癌病人血浆中组合时，采用本发明之酶学测定方法得到的卵巢癌病人相对于正常人平均血浆LysoPA、LysoPC和PC浓度的升高，详见实施例3。
图6为直方图，显示了以凝血障碍为表现的出血性疾患病人相对于无癌症和出血性疾患个体血浆平均LysoPA水平的升高，详见实施例4。
发明详述
本发明提供了用于检测和定量个体体液样本的溶血磷脂浓度改变的酶学方法。其中，溶血磷脂包括但并不局限于：溶血磷脂酸(LysoPA)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)、溶血磷脂酰丝氨酸(LysoPS)、溶血磷脂酰肌醇(LysoPI)、溶血磷脂酰氨基乙醇(LysoPE)和溶血磷脂酰甘油(LysoPG)。
受检个体真核有机体，包括但不局限于哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖动物和爬行动物，脊椎动物最好。其中最佳选择是哺乳动物，尤为人类。体液包括但不局限于血浆、血清、尿液、唾液、腹水、脑脊液或胸水。
与这些溶血磷脂浓度改变有关的机体状态包括但并不局限于炎症疾患，如与血小板活化有关的状态。磷脂代谢的改变已被报道存在于大量疾病中(作为概览，可参阅Gregor Cevc(编辑)，《磷脂手册》(Phosoholipids Book)Ch28：Gupta，疾病状态中的磷脂，pp895-908(1993))并且可导致生物液体中溶血磷脂和磷脂水平的改变。这些疾病包括但不局限于镰状细胞性贫血、糖尿病、肌营养不良、局部缺血、肝脏疾病、肺病、心脏疾病、疟疾、老年性痴呆、帕金森氏病和各种癌症。在这些条件下，细胞功能的缺陷直接或间接导致了磷脂的稳定状水平的改变。其它疾病包括出血性疾患，包括由凝血障碍引起的与血小板功能异常有关的疾患。
这样，本发明所述的方法被用来检测已知机体状态或机体状态的鉴定，从而将机体状态与个体体液中溶血磷脂浓度的改变相关联，溶血磷脂浓度的改变是相对于缺乏与溶血磷脂浓度改变有关的机体状态个体而言的。
本发明的应用
本发明提供了一种用于检测个体体液中存在的少量溶血磷脂的快速准确且高灵敏度的方法。酶学测定可以用来检测与个体体液中溶血磷脂相对于正常样本的改变有关的机体状态。此外，所述测定方发可以确定各种疾病状态与溶血磷脂水平改变之间的关系。本发明之方法及试剂盒提供了检测与一定溶血磷脂水平改变有关的机体状态的切实可行的方法。酶学方法检测和定量溶血磷脂
本发明方法的操作如下：从受检个体获得生物样品，如全血。从样品血浆或血清中提取脂质，例如，可通过氯仿：甲醇溶液有机抽提、离心，得到一选定溶血磷脂如LysoPA的富集，或者得到总溶血磷脂。是否需要富集，部分决定于消化待测溶血磷脂的酶的特异性。水解溶血磷脂的酶与所提取的脂质一起温育，生成一种较小的代谢产物。然后进行另一种酶消化，产生一种可检测产物。在一个实施例中，进行包含两个酶反应的酶循环反应，它可以聚集可检测产物。此文中包括的检测LysoPA水平的实施例中，磷脂酶B(PBL)或溶血磷脂酶(LYPL，酶学委员会(EC)3.1.1.5，Asahi化学制剂有限公司，东京，日本)被用来产生3-磷酸-甘油(G-3-P)。然后利用3-磷酸-甘油脱氢酶、3-磷酸-甘油氧化酶和β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)进行酶循环反应，聚集H2O2和NAD(美国专利第5,122,454号，Ueda等)。
LysoPA水平的检测可由分光光度法于340nm处(如，OD340消失)监测β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化和由比色法采用过氧化酶聚集H2O2而实现。从已知C18：1_LysoPA的标准曲线可得到所需数值。典型的标准曲线包括从0到3μM的LysoPA的已知浓度值。可取的定量分析为含正负对照的可重复实验。酶循环反应前后OD340之差与具体化中LysoPA的量呈正比。不含磷脂酶B血浆的背景信号从所有样本中减去。绘制LysoPA标准曲线数值，符合线性或二次多项式曲线。每一样品中LysoPA水平由所测得的每一信号值与标准曲线值之比确定。
可供选择的另一种方法为采用额外量的和/或不同的酶化合物测定。例如，用磷脂酶C(酶学委员会3.1.4.3，Sigma化学制剂公司，圣路易斯，密苏里州)将LysoPA上的无机磷(Pi)解离。LysoPA水平可由测定释放的Pi的量而确定，Pi的定量采用现成的操作，如市售试剂盒(Procedure670，Sigma化学制剂公司，圣路易斯，密苏里州)。为提高灵敏度，采用从前已详述的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、黄嘌呤氧化酶(XOD)和尿酸氧化酶(UOD)来测定Pi的量(Kawasaki等，分析生物化学182：366-370(1989))。后一种方法中，每分子Pi产生3分子的H2O2。收集到的H2O2由过氧化酶比色计法测定。
在另一实施例中，诸如LysoPA的溶血磷脂与磷脂酶B或溶血磷脂酶一起温浴，生成3-磷酸-甘油(G-3-P)。在氧和水条件下，G-3-P被G-3-P氧化酶转变为磷酸二羟丙酮和过氧化氢。有β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)存在时，G-3-P脱氢酶将磷酸二羟丙酮还原为G-3-P，并将β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)氧化为NAD。NADH的消耗由分光光度法在OD340处监测。此外，过氧化氢的产物也可测定，例如用荧光或化学发光的比色法。大量发光底物中的任何一种均可用于比色计法定量分析，包括4-氨基安替比林(AAP)、联苯三酚、2-(2’-连氮基双(3-乙基苯环噻唑啉-磺酸)(ABTS)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)。
在另一实施例中，用磷脂酶B或溶血磷脂酶从LysoPC上解离用甘油磷酸胆碱(GPC)和脂肪酸，可以确定LysoPC量。用GPD磷酸二脂酶(GPD-PDE)将胆碱和G-3-P从GPD上解离下来，然后用比色酶测定法测定胆碱量，所用酶为胆碱氧化酶、4-氨基安替比林、3，5-二氯-2-磺酚酸钠盐(HDCBS)和过氧化物酶，从而可以确定LysoPC水平。将胆碱氧化为H2O2和甜菜碱，然后加入过氧化物酶生成醌亚胺染料。此外，将G-3-P脱氢酶和氧化酶用于本发明方法的循环反应中，也可测定G-3-P量。
除LysoPA和LysoPC外，其它溶血磷脂如溶血磷脂酰丝氨酸(LysoPS)、溶血磷脂酰肌醇(LysoPI)、溶血磷脂酰氨基乙醇(LysoPE)和溶血磷脂酰甘油(LysoPG)，均可用本发明的两阶段酶学测定方法确定。
所述方法第一阶段中用于消化溶血磷脂的酶包括溶血磷脂酶(lysophospholipase)、磷脂酶B(phospholipase B)、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C和磷脂酶D，但并不局限于这些酶。
第一阶段中，用于检测溶血磷脂的酶消化产物的酶包括G-3-P脱氢酶(glycerol-3-phosphate)、G-3-P氧化酶(glycerol-3-phosphateoxidase)、甘油磷酸胆碱磷酸二脂酶(GPC-PDE)、胆碱氧化酶、丝氨酸脱氢酶、丝氨酸脱氨酶、乙醛脱氢酶、氨基乙醇脱氨酶、甘油激酶和甘油脱氢酶，但并不局限于这些酶。
以LysoPS测定为例，LysoPS由磷脂酶D消化为丝氨酸和LysoPA。在丝氨酸脱氢酶作用下，测定NADH量(吸光率A340)，从而确定所产生的丝氨酸的量。此外，在脱氨酶作用下，丝氨酸脱氨基生成氨(NH3)和HOCH2-CO-COOH。另外，LysoPS被溶血磷脂酶消化可生成G-3-P丝氨酸，后者又被GPC-PDE消化生成G-3-P和丝氨酸。由此通过丝氨酸脱氢酶或LysoPS特异性溶血磷脂酶测定NH3产物和NADH产物，可以确定LysoPS水平。
利用本发明的酶学定量分析，在磷脂酶D作用下将LysoPE水解为LysoPA和氨基乙醇，可以测定LysoPE。氨基乙醇在脱氨酶作用下脱氨基并脱氢生成NADH、HOCH2-CHO和NH3。然后HOCH2-CHO被乙醛脱氢酶消化生成可由分光光度法测定的NADH(例如，在A340)。此外，一种LysoPE特异性溶血磷脂酶可水解LysoPE生成G-3-P氨基乙醇，后者在GPC-PDE作用下又可被水解为G-3-P。随后，G-3-P可用本发明的循环反应测定。
本发明的方法中，富集用的液体有机提取的替代方法包括固相提取，如采用含二氧化或氟化物的键-洗脱柱(Bond-Elutcolumn)(美国加利福尼亚州Harbor市Varian)，可用于溶血磷脂的富集以及去除蛋白和其它脂质。
为了最大限度回收所需的溶血磷脂，样品中可能会出现的内源性酶的抑制剂，可防止样品中溶血磷脂背景水平的增高以及溶血磷脂水平的降解。这些抑制剂包括特异性PLA2抑制剂，如马兜铃次酸(9-甲氧基-6-硝基菲-(3，4-d)-二氧戊烷-5-羧酸，Biomol研究实验室普利茅斯会议，巴拿马(Research Laboratories，PlymouthMeeting))；ONO-R-082(2-(p-戊基肉桂)-氨基-4-氯苯甲酸，Biomol)；OBAA(3-(4-十八烷基)-苯甲酰丙烯酸，Biomol)，4-溴化溴苯乙酮(Sigma化学实验室)；奎恩醌(Quincrine)(6-氯-9-9(4-双乙氨基)-1-甲丁基)氨基-2-甲氧基克厉叮(methoxycridine)，麦帕克林(Mepacrine)，Sigma)；曼诺力得(Biomol实验室)和HELSS((海咯内尔内酯自毁底物(Haloenol lactone suicide substrate)，Biomol)；磷酸二脂酶抑制剂，如IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，CalBiochem，LA Jolla，CA)；Ro-20-1724(CalBiochem)；Zaprinast(CalBiochem)和己酮可可碱(CalBiochem)；普通蛋白酶抑制剂，如E-64(反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酸酰胺-(4-胍基)丁烷，Sigma化学实验室)；亮肽酶素(Sigma化学实验室)；胃酶抑素(Sigma)；TPCK(N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲丙酮，Sigma)；PMSF(苯甲醇磺酰氟化物，Sigma)；苯甲咪(Sigma)和1，10-二氮杂菲(phenanthroline)(Sigma)；有机溶剂包括氯仿和甲醇；去污剂如SDS；降解磷脂酶的蛋白酶如胰蛋白酶(Sigma)和热稳定的蛋白酶(美国印第安纳州首府印第安纳波利斯Boehringger Mannheim生物化学制剂公司)；和金属离子螯合剂如EDTA(乙二胺四醋酸，Sigma)和EGTA(1，2亚乙基二醇双-(β二胺乙基醚)，Sigma)。
所述的定量分析可在微滴定格板上进行，从而使用少量样本和试剂，并可用诸如ELISA读数计的监测工具。这些小格有助于所述定量分析操作的自动化，并且缩短测定时间，从而减少结果之间的差异。溶血磷脂水平与疾病的关系
最初，总溶血磷脂和/或某一特定溶血磷脂生理(正常)浓度的测定是针对无疾患个体进行的。随后，经筛选患某疾病的个体的体液标本溶血磷脂浓度也被测定，并与正常个体的已确定的浓度相比。溶血磷脂浓度相对于正常对照有意义的升高和降低，如高于正常一个或多个标准差，可能提示与溶血磷脂浓度改变有关的机体状态的存在。
此外，一段时间内个体样本溶血磷脂浓度的测定，可作为机体对治疗的反应的监控。测定某种溶血磷脂的浓度，与同一个病人较早时间所测的溶血磷脂浓度相比。如果在某段时间内溶血磷脂浓度增加，可能提示受检个体疾病严重性的加重。反之，如果在某段时间内溶血磷脂浓度降低，可能提示受检个体疾病状态的好转。诊断盒
这里所描述的测定受检个体的体液样本中溶血磷脂浓度的方法也可以采用诸如成套包装的诊断盒进行。这种试剂盒含有消化一种或多种溶血磷脂的酶类，如磷脂酶B。试剂包括参与酶循环反应的物质，如G-3-P脱氢酶、G-3-P氧化酶、NADH和辅助试剂，如缓冲剂，以及抑制转运和储藏样本过程中溶血磷脂水解和其相应产物的试剂，如EDTA。试剂盒可能也会包括一个容器，用于本发明方法的操作和/或将样本转移到诊断实验室进一步处理，也可作为所述的发明方法的操作的适宜指导。
以下所描述的实施例用以阐明这里本发明的方法，对于披露的本发明有关的优选实施例，应该明了的是，本领域技术人员可以容易地对上述实施方案进行多种修改和改进，或应用于其它领域。本发明申请包括法律允许的各种实施方案与应用。尽管本发明申请按照某些优选实施方案的内容进行描述，本发明的范围不受此限制，而是按照下面权利要求的范围。实施例
                  实施例1
          人血浆溶血磷脂的检测和定量试剂
磷脂酶B(PLB)、G-3-P氧化酶、G-3-P脱氢酶、人血浆、人血清、4-氨基安替比林(AAP)和氯化钙购于密苏里州圣路易斯的Sigma化学制剂公司。溶血磷脂酶(LTPL)购于日本东京Asahi化学工业公司。过氧化物酶和NADH购于印第安纳波利斯BoerhingerMannheim公司。所有的脂质标准液、脂肪酸和甲基酯类购于美国亚拉巴马州Alabaster，Avanti Polar Lipids或Sigma化学制剂公司。3，5-二氯-2-磺酚酸钠盐(HDCBS)购于美国伊利诺斯州内珀维尔生物合成公司。样本收集和处理
收集血液于#6415或#7714BD vacutainer试管中，缓冲液采用3.2％枸橼酸，封闭保存于冰上待用。取样1小时内，血液以3000xg离心15分钟(如果可能，用冷离心机)。分离出血浆，转移至塑料试管，于-20℃至-80℃冷冻。也可以将血样吸入含EDTA的试管中，580xg离心5分钟；收集上清液于另一个二氧化硅试管内，8000xg再次离心5分钟。所述的上清液被收集于另一个二氧化硅试管，在-70℃保存。样本准备和薄层色谱法
约0.5ml血浆中加入3.75ml氯仿∶甲醇(1∶2)中，搅拌并以3000rpm离心10分钟。轻轻倒出上清液，置于一新试管中，加入1.25ml氯仿和1.75ml水后搅拌，再次离心产生两相溶液。将上层收集于另一试管中，下层保存。向上层中加入2.5ml氯仿和63μl浓盐酸，搅拌，离心。收集此酸化氯仿提取的下层，与刚才保存的下层混合。混合提取物的体积在氮气流作用下减至50μl，并被点到二氧化硅胶G TLC板的起点(Fisher Scientific，Santa Clara，CA)。色谱法在含有氯仿∶甲醇∶氢氧化铵(65∶35∶5.5)的溶剂中进行。
用若丹明6G(Sigma化学实验室)溶于水喷洒经上述处理的板，脂质和标准液即可显现，LysoPA形成的点从板上擦去。以七价癸酸作为内标准液穿刺每一样本液。加入1N的NAOH 1ml于甲醇中水解脂肪酸，并于100℃水浴箱温浴15分钟。冷却后，加入1ml三氟化硼(溶于甲醇，浓度14％，Alltech Associates，Deerfield，IL)，后样本于室温下温浴30分钟，从而生成甲基酯类。向其中加入2ml乙烷和1ml水，彻底搅拌混合物后3000rpm离心3-5分钟，有助于相的分离。收集有机层(表层)，氮气吹干，重新悬浮于25μl乙烷中，密封于自动取样瓶中。气体色谱法
在配备有自动取样瓶和发光离子化检测器的Hewlett Packard5890系列二气体色谱法，采用气体色谱法(GC)定量分析脂肪酸甲基酯类(FAMES)。乙烷中的2μl样本被注入一个Supelco SPB-5毛细管柱内(Supelco，Bellefonte，PA)。GC程序规定如下：170-235℃，温度以每分钟10℃的速度增加并保持在235℃13.5分钟，总时间为20分钟。甲基酯类的停留时间由已知标准液与未知样本的峰值之比确定。以七价癸酸内标准液为标度，峰值的定量可由其与七价癸酸标准曲线之比而实现。酶学测定的样本准备
3.75ml氯仿∶甲醇(1∶2)加入到约0.5ml血浆中，搅拌，3000rpm离心10分钟。轻轻倒出上清液，置于一新试管中，加入1.25ml氯仿和1.75ml水后搅拌，同前操作再次离心产生两相溶液。将上层收集于另一试管中，加入2.5ml氯仿和63μl浓盐酸，搅拌离心同前。收集下层并转移至一干净试管中。样本于氮气下彻底蒸发，无水的脂质提取物在250μl含2.5％Triton X-100，5mMCacl2和100mMTris(pH8.0)的样本缓冲液中重新水化。样本保存于-70℃待测。
此外，发展出了一种改良的提取程序，只用100μl样本液，这在很大程度上降低了诸如磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的脂质污染水平。在这种提取方法中，0.1ml血浆加入0.75ml氯仿∶甲醇(1∶2)，搅拌，14000rpm离心5分钟。倒出上清液，置于一新试管中，并加入0.25ml氯仿和0.35ml水。搅拌混合物，离心同前，产生二相溶液。弃去下层，向上层中加入0.5ml氯仿。再次搅拌样本，14,000rpm离心5分钟。再弃去下层。向上层中加入0.5ml氯仿和12.6μl浓盐酸，同前操作一样，搅拌混合物并离心。收集酸化的下层，转移到一干净试管。样本于氮气下彻底蒸发，在100μl含2.5％Triton X-100，5mMCacl2和100mMTris(pH8.0)的样本缓冲液中重新水化。样本保存于-70℃待测。酶学定量分析
在96孔的微滴定板的小孔中，5-100μl提取的脂质样本在100mMTris(pH8.0)中，37℃下，与0.25单位磷脂酶B或溶血磷脂一起温浴30-60分钟，产生G-3-P。以50mMTris(pH8.0)为缓冲液的100μl酶循环反应混合物含有1.7单位G-3-P脱氢酶、4单位G-3-P氧化酶、0.25mM NADH和5mM CaCl2。此混合物于37℃再温浴60分钟。G-3-P氧化酶将G-3-P转变为磷酸二羟丙酮和H2O2。磷酸二羟丙酮随后又在G-3-P脱氢酶作用下还原为G-3-P。这个反应将NADH氧化为NAD。因此，随着循环反应的继续，H2O2和NAD的量得到积累。
LysoPA的水平可由对NADH的氧化的监测而确定(如，循环反应之后340nm吸光率相对于循环反应之前A340的降低)。此外，利用色谱法，向每一孔中加入以100μlTris(pH8.0)为缓冲液，含0.5单位过氧化物酶、0.5％HDCBS和0.15％AAP的50μl溶液，然后记录505nm的吸光率，从而得到H2O2的积累量。
LysoPA浓度的数值可以从根据已知量LysoPA构建的标准曲线得到。经提取血浆的内标准液包括每一定量分析(如每一个板)中在不同稀释度下所测得的内标准液。在某些情况下，内标准液被用来校正不同试验之间的差异。缺乏磷脂酶B或溶血磷脂酶，内标准液也可进行测定。当用β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)测定值计算LysoPA水平时，这种“无酶”样本提供了需从每个未知样本中减去的背景信号值。采用色谱法时，在色彩呈现之前，505nm处的板是无色的。结果本发明的两阶段酶学定量分析的结果显示于表1和图1、2中。
          表1检测LvsoPA的酶学定量分析
           酶学定量分析            TLC/GC定量分析
灵敏度      0.2μM                   1μM
实验内差异  5％                      15％
实验间差异  ＜5％                    15％
产率        90％                     10％
样本体积    0.1mM                    0.5-1ml
操作时间
            3-4小时                  1-2日
(20样本)
这些结果显示了所述酶学定量分析法与TLC/GC定量分析相比的优越性。LysoPA浓度从0.2μM至1μM，定量分析呈线性。此外，本发明的酶学定量分析法产率高，灵敏快速。
                  实施例2
        人血浆和血清LysoPC水平的检测与定量试剂
溶血磷脂酶(LYPL)购于日本东京Asahi化学制剂公司。甘油磷酸胆碱磷酸而脂酶(GPC-PDE)、胆碱氧化酶和4-氨基安替比林(4-AAP)购于密苏里州圣路易丝Sigma化学制剂公司。过氧化物酶购于美国印第安纳州印第安纳波利斯Boerhinger Mannheim。3，5-二氯-2-磺酚酸钠盐(HDCBS)购于内珀维尔[美国伊利诺斯州东北部城市]生物合成公司。所有的脂质标准液和脂肪酸购于美国亚拉巴马州Alabaster，Avanti Polar Lipids公司或Sigma化学制剂公司。样本收集和处理
血样收集和血浆处理同实施例1。对于血清，血样收集于一涂有二氧化硅层的Vacutainer试管(红色在上(red top))，在通常条件下离心。血清和血浆转移至塑料试管中，-20℃至-80℃冷冻保存。酶学定量分新的样本准备
约35μl血浆或血清以1∶10比例，于样本缓冲液(1％Triton，10mM CaCl2，50mM Tris pH8.0)中稀释至350μl。酶学定量分析
在96孔的微定量板的小孔中，100μl稀释脂质均等分布。向每一个小孔中加入50μl LYPL(0.125单位)/GPC-PDE(0.0125单位)，37℃温浴10分钟。这步反应中，LYPL消化LysoPC，产生中间产物甘油磷酸胆碱。在GPD-PDE作用下，G-3-P和胆碱从甘油磷酸胆碱解离。接着，板在ELISA读数计显示的A505下变为无色。随后，加入50μl胆碱检测混合物(0.15单位胆碱氧化酶、0.5单位过氧化物酶、0.03％AAP、0.125％HDCBS、100mM Tris pH8.0)，于37℃温浴15分钟。然后，于A505读数。表2和图3列出了LysoPC定量分析的结果。LysoPC从5至200μM定量分析呈线性关系，5μM出最敏感。内定量分析和外定量分析差异均较小。
          表2酶学定量分析检测血浆LysoPC
             灵敏度             5Mm
             线性范围           5-200μM
             实验内差异         3.0％
             实验间差异         6.0％
这些结果显示采用本发明的酶学定量分析，血浆或血清中的LysoPC容易检测。从来自同一个病人血浆或血清获得的相似结果说明所述方法对血浆或血清均适用。血浆或血清LysoPC水平大多在50μM到500μM的范围内。因此，所述方法可以确定以1∶10稀释的样本LysoPC水平。
                      实施例3
           从癌症病人取样LysoPA的检测和定量
检测非癌症个体和卵巢癌病人血浆LysoPA水平。血样来自女性病人，其处理同上述实施例1。从样本中制备用于本发明的酶学定量分析的血浆，方法同上述实施例1。酶测定的操作同实施例1。
图4表示采用酶学定量分析得到的非癌症个体和癌症病人的平均LysoPA水平。其数据表明酶学定量分测定的卵巢癌病人血浆LysoPA的平均水平有显著性增加。
此外，采用如实施例2、实施例3所述的酶测定法，可以获得非癌症病人和卵巢癌病人的血浆LysoPC和PC水平。组合分析这些结果并相乘，可以得到多种脂质的诊断测量方法。独立测定的LysoPC和PC水平在卵巢癌病人比通常病人高10-100％。把卵巢癌病人每一样本的LysoPA、LysoPC和PC水平组合并相乘，可得到比通常病人高400％到500％的测定值，如图5所示。这些结果提示，组合分析方法由于减少了假阳性和假阴性结果，可提供更为精确的检测机体状态的定量分析方法，如与溶血磷脂和磷脂水平改变有关的癌症。
                      实施例4
           出血性疾患病人LysoPA的检测和定量
测定来自1-80岁年龄范围的男性和女性病人的93份血浆样本LysoPA水平，方法同实施例1。93份样本中，有17份样本来自曾经诊断为出血性疾患(如凝血障碍)的病人。如图6所示，出血性疾患病人平均LysoPA水平明显高于无癌症或出血性疾患的病人。
这里所列实施例的结果说明本发明的方法可用于检测病人溶血磷脂和磷脂如PA水平的改变，而这些病人患有与这些脂质的水平改变有关的各种疾病。而且，上述实施例的结果提供了一种诊断与溶血磷脂水平改变有关的疾病的新方法，即将血浆或血清不同磷脂水平相乘，LysoPA和LysoPC水平，从而检测疾病状态。
在此引用了大量的期刊文献作为参考。
特定实施例是为了对本发明进行说明，而不应该被解释成对权利要求范围的限制。对工艺熟悉的人对本发明的各种调整和变化亦非常熟悉，但这些并不背离本发明的范围和宗旨。即便本发明是与其适宜的特殊实施例一起阐述的，应该明了的是，权利要求的发明不应该被不适当地限制在这些特殊实施例里。确实，对那些对工艺熟悉的人来说，对所描述的实施本发明模式的各种调整已经非常熟悉。这些调整都在随后所附的权利要求范围内。
                     
                 按照条约第19条的修改
1.测定来自受检个体体液标本的一种或多种溶血磷脂浓度，以检测某种导致其浓度改变的机体状态，这种定量分析包括：
(a)用酶1处理受检个体体液样本，以消化溶血磷脂产生参与第二阶段酶反应的底物；
(b)将从(a)步骤消化过的待测样本得到的底物用于酶循环反应的第二阶段酶反应，产生一可检测产物；并且
(c)通过测定(b)步骤中产生的可检测产物的浓度，确定样本中存在的至少一种溶血磷脂的浓度；
(d)分析溶血磷脂浓度与机体状态的关系。
2.根据权利要求1所述的化验，其中所检测的溶血磷脂为立体特异计数-1和/或立体特异计数-2溶血磷脂。
3.根据权利要求2所述的化验，其中所述的溶血磷脂选自LysoPA、LysoPC、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG。
4.根据权利要求2所述的化验，其中所述的酶1消化溶血磷脂的立体特异计数-1和/或立体特异计数-2位。
5.根据权利要求4所述的化验，其中所述的用以消化溶血磷脂的酶1选自磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D、溶血磷脂酶、磷脂酶A1和磷脂酶A2，并且所述的酶2选自3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶、甘油磷酸胆碱-磷酸二脂酶、胆碱氧化酶、丝氨酸脱氢酶、丝氨酸脱氨酶、乙醛脱氢酶、氨基乙醇脱氨酶、甘油激酶和甘油脱氢酶。
6.根据权利要求1所述的化验，其中一种酶的组合物在步骤(a)中采用。
7.根据权利要求2所述的化验，其中所述的可检测产物为3-磷酸甘油。
8.根据权利要求7所述的化验，其中所述的测定酶循环反应产生的可检测产物的步骤包括NADH氧化量或H2O2累积量的测定。
9.根据权利要求8所述的化验，其中所述的酶循环反应混合物包括3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶和β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)。
10.根据权利要求1所述的化验，其中所述的酶1为磷脂酶B或溶血磷脂酶，所测溶血磷脂为LysoPA。
11.根据权利要求1所述的化验，其中所述的样本选自血浆、血清、尿液、唾液、腹水、脑脊液和胸水。
12.根据权利要求1所述的化验，其中所述的样本在步骤(a)之前进行提取，以富集所有溶血磷脂。
13.根据权利要求1所述的化验，其中样本在步骤(a)之前进行提取，以富集至少一种特定溶血磷脂。
14.根据权利要求1所述的化验，其中所述的溶血磷脂浓度与(d)步骤所述的机体状态的关联步骤包括正常个体溶血磷脂浓度与受检个体同种溶血磷脂浓度改变的比较，其中来自受检个体的样本溶血磷脂浓度相对于来自正常个体的样本溶血磷脂浓度的升高和降低，提示受检个体有某种疾病状态存在。
15.根据权利要求14所述的化验，其中所述的疾病状态是指癌症，与至少一种溶血磷脂浓度相对于正常个体的改变有关。
16.根据权利要求15所述的化验，其中所述的疾病状态为一种妇科癌症。
17.根据权利要求16所述的化验，其中所述的疾病状态为卵巢癌，所测溶血磷脂为LysoPA。
18.根据权利要求15所述的化验，其中所述的疾病状态为乳腺癌。
19.根据权利要求14所述的化验，其中所述的疾病状态为出血性疾患，与至少一种溶血磷脂浓度相对于正常个体的改变有关。
20.测定来自受检个体的一种或多种溶血磷脂浓度，与正常个体溶血磷脂浓度相比，以检测与其水平改变有关的疾病，所述的化验即定量分析方法包括如下步骤：
(a)用酶1处理受检个体体液样本，以消化溶血磷脂产生3-磷酸甘油；
(b)将经(a)步骤消化过的待测样本加入到酶循环反应混合物中，以测定(a)步骤生成的3-磷酸甘油；
(c)通过测定循环反应中氧化NADH量或H2O2累积量，确定样本中存在的至少一种溶血磷脂的浓度；并且(d)对比(c)步骤测定的一种或多种溶血磷脂浓度和正常个体相应溶血磷脂浓度，从而检测受检个体体内与溶血磷脂水平改变有关的疾病状态的存在，其中来自受检个体的样本溶血磷脂浓度相对于来自正常个体的样本溶血磷脂浓度的升高和降低，提示受检个体有某种疾病状态存在。
21.根据权利要求20所述的化验，其中所述的用以消化溶血磷脂的酶1选自磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D、溶血磷脂酶、磷脂酶A1和磷脂酶A2，并且所述的酶2选自3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶、甘油磷酸胆碱-磷酸二脂酶、胆碱氧化酶、丝氨酸脱氢酶、丝氨酸脱氨酶、乙醛脱氢酶、氨基乙醇脱氨酶、甘油激酶和甘油脱氢酶。
22.根据权利要求20所述的化验，其中所述的溶血磷脂为LysoPA。
23.根据权利要求20所述的化验，其中所述的疾病状态为癌症。
24.根据权利要求20所述的化验，其中所述的酶循环反应混合物包括3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶和β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)。
25.根据权利要求20所述的化验，其中所述的对于患某一疾病的受检个体，所述的溶血磷脂水平升高。
26.根据权利要求20所述的化验，其中所述的疾病状态为出血性疾患，与至少一种溶血磷脂浓度相对于正常个体的改变有关。
27.一种使受检个体的至少一种溶血磷脂相对于正常个体浓度的升高和降低和与其浓度改变有关的疾病状态相关联的方法，包括如下步：
(a)用酶1处理正常个体体液样本，以消化溶血磷脂产生参与第二阶段酶反应的底物；
(b)将经(a)步骤消化过的待测样本用于第二阶段酶反应，产生一可检测产物；
(c)通过测定所述的第二阶段酶反应中产生的可检测产物的浓度，确定样本中存在的至少一种溶血磷脂的浓度；并且
(d)对比(c)步骤测定的一种或多种溶血磷脂浓度和曾经诊断某种疾病的受检个体相应溶血磷脂浓度，曾经诊断某种疾病的受检个体相对于(d)步骤得到的溶血磷脂浓度的升高和降低，提示疾病状态的存在和溶血磷脂水平的改变有关联。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所检测的溶血磷脂为立体特异计数-1或立体特异计数-2溶血磷脂。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述的溶血磷脂选自LysoPA、LysoPC、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述的酶1消化溶血磷脂的立体特异计数-1和/或立体特异计数-2位。
31.根据权利要求27所述的方法，其中用以消化溶血磷脂的酶1选自磷脂酶B、溶血磷脂酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、卵磷脂酶和溶血卵磷脂酶。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述的可检测产物为3-磷酸甘油。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述的第二阶段酶反应为酶循环反应。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述的测定酶循环反应产生的可检测产物的步骤包括氧化NADH或H2O2累积量的测定。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述的酶循环反应混合物包括3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶和β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)。
36.根据权利要求27所述的方法，其中所述的酶1为磷脂酶B或溶血磷脂酶，并且所测溶血磷脂为LysoPA。
37.根据权利要求27所述的方法，其中所述的样本选自血浆、血清、尿液、唾液、腹水、脑脊液和胸水。
38.根据权利要求27所述的方法，其中所述的样本在步骤(a)之前进行提取，以富集各种溶血磷脂。
39.根据权利要求27所述的方法，其中所述的样本在步骤(a)之前进行提取，以富集特定待测溶血磷脂。
40.根据权利要求27所述的方法，其中所述的疾病状态为癌症。
41.根据权利要求27所述的方法，其中所述的疾病状态为出血性疾患。
42.测定来自受检个体的一种或多种溶血磷脂浓度，以检测与其水平改变有关的疾病，这种方法包括如下步骤：
(a)测定样本中至少一种溶血磷脂和磷脂酰胆碱(PC)的浓度；
(b)把溶血磷脂浓度和磷脂酰胆碱浓度相乘，得到受检样本的组合诊断标准；并且
(c)比较(b)步骤中得到的组合诊断标准与正常个体样本的组合诊断标准，以检测受检个体体内与溶血磷脂水平改变有关的疾病状态的存在，其中来自受检个体的样本溶血磷脂浓度相对于来自正常个体的样本溶血磷脂浓度的升高和降低，提示受检个体有某种疾病状态存在。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述的溶血磷脂选自LysoPA、LysoPC、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述的溶血磷脂为LysoPA。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述的多于一种的溶血磷脂的测试是结合的。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述的溶血磷脂为LysoPA和LysoPC。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述的样本选自血浆、血清、尿液、唾液、腹水、脑脊液和胸水。
48.根据权利要求42所述的方法，其中所述的溶血磷脂和PC的浓度依如下步骤确定：
(a)用酶1处理受检个体体液样本，以消化溶血磷脂产生参与第二阶段酶反应的底物；
(b)用酶1处理受检个体体液样本，以消化PC产生参与第二阶段酶反应的底物；
(c)用至少一种酶2处理(a)和(b)步骤中得到的体液样本，产生参与第二阶段酶反应的可检测底物；并且
(d)通过测定所述第二阶段酶反应产生的可检测产物，得到样本中存在的不同溶血磷脂和PC浓度。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述的与酶1消化溶血磷脂的产物反应的第二阶段酶反应为酶循环反应。
50.根据权利要求42所述的方法，其中所述的疾病状态为癌症。
51.根据权利要求42所述的方法，其中所述的疾病状态为出血性疾患。
52.用于检测来自受检个体的体液样本的溶血磷脂浓度的的诊断工具盒，所述的工具盒包括：
(a)至少一种酶1消化溶血磷脂的立体特异计数-1和/或立体特异计数-2位，以产生参与第一阶段酶反应的底物；并且
(b)至少一种酶2消化酶1作用于溶血磷脂产生的底物。
53.根据权利要求52所述的诊断工具盒，进一步包括一种酶循环反应混合物，用于所述的底物在酶2作用下的消化过程。
54.根据权利要求52所述的诊断工具盒，其中所述的用以消化溶血磷脂的酶1选自磷脂酶A1、磷脂酶A2、卵磷脂酶B和溶血卵磷脂酶。
55.根据权利要求52所述的诊断工具盒，其中所述的酶循环反应混合物包括3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油脱氢酶和β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)。
56.根据权利要求52所述的诊断工具盒，进一步包括一种用来抑制在转运和保存过程中样本中溶血磷脂水解或其水解产物的试剂。
57.根据权利要求52所述的诊断工具盒，进一步包括用于消化磷脂酰胆碱的试剂。

Claims (58)

1.检测受检个体体液样本中一种或多种溶血磷脂浓度的定量分析方法，包括：
(a)用酶1处理受检个体体液样本，以消化溶血磷脂，产生参与第二阶段酶反应的底物；
(b)将从(a)步骤消化过的待测样本得到的底物用于第二阶段酶反应，产生一可检测产物；并且
(c)通过测定(b)步骤中产生的可检测产物的浓度，确定样本中存在的至少一种溶血磷脂的浓度。
2.根据权利要求1所述的化验，其中所检测的溶血磷脂是立体特异计数-1或立体特异计数-2溶血磷脂。
3.根据权利要求2所述的化验，其中所述的溶血磷脂选自LysoPA、LysoPC、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG。
4.根据权利要求3所述的化验，其中所述的酶1消化一种溶血磷脂的立体特异计数-1和/或立体特异计数-2位。
5.根据权利要求4所述的化验，其中所述的用以消化溶血磷脂的酶1选自磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D、溶血磷脂酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2，酶2选自3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶、甘油磷酸胆碱-磷酸二脂酶、胆碱氧化酶、丝氨酸脱氢酶、丝氨酸脱氨酶、乙醛脱氢酶、氨基乙醇脱氨酶、甘油激酶和甘油脱氢酶。
6.根据权利要求1所述的化验，其中一种酶的组合物在步骤(a)中采用。
7.根据权利要求2所述的化验，其中所述的可检测产物为3-磷酸甘油。
8.根据权利要求1所述的化验，其中所述的第二阶段酶反应为酶循环反应。
9.根据权利要求7所述的化验，其中所述的测定酶循环反应产生的可检测产物的步骤包括氧化NADH或H2O2累积量的测定。
10.根据权利要求9所述的化验，其中所述的酶循环反应混合物包括3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶和β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)。
11.根据权利要求1所述的化验，其中所述的酶1为磷脂酶B或溶血磷脂酶，并且所测溶血磷脂为LysoPA。
12.根据权利要求1所述的化验，其中样本选自血浆、血清、尿液、唾液、腹水、脑脊液和胸水。
13.根据权利要求1所述的化验，其中所述的样本在步骤(a)之前进行提取，以富集各种溶血磷脂。
14.根据权利要求1所述的化验，其中所述的样本在步骤(a)之前进行提取，以富集特定溶血磷脂。
15.根据权利要求1所述的化验，进一步包括将步骤(c)所测定的受检个体溶血磷脂浓度与正常个体同种溶血磷脂浓度比较的步骤，从而检测与受检个体溶血磷脂浓度有关的疾病，其中来自受检个体的样本溶血磷脂浓度相对于来自正常个体的样本溶血磷脂浓度的升高和降低，提示受检个体有某种疾病状态存在。
16.根据权利要求15所述的化验，其中所述的疾病状态是指癌症，与至少一种溶血磷脂浓度相对于正常个体的改变有关。
17.根据权利要求16所述的化验，其中所述的疾病状态为一种妇科癌症。
18.根据权利要求1 7所述的化验，其中所述的疾病状态为卵巢癌，并且所测的溶血磷脂为LysoPA。
19.根据权利要求16所述的化验，其中所述的疾病状态为乳腺癌。
20.根据权利要求15所述的化验，其中所述的疾病状态为出血性疾患，与至少一种溶血磷脂浓度相对于正常个体的改变有关。
21.测定来自受检个体的一种或多种溶血磷脂浓度，与正常个体溶血磷脂浓度相比，以检测与其水平改变有关的疾病，所述的化验即定量分析方法包括：
(a)用酶1处理受检个体体液样本，以消化溶血磷脂产生3-磷酸甘油；
(b)将经(a)步骤消化过的待测样本加入到酶循环反应混合物中，以测定(a)步骤生成的3-磷酸甘油；
(c)通过测定循环反应中氧化β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)量或H2O2累积量，确定样本中存在的至少一种溶血磷脂的浓度；并且
(d)对比(c)步骤测定的一种或多种溶血磷脂浓度和正常个体相应溶血磷脂浓度，从而检测受检个体体内与溶血磷脂水平改变有关的疾病状态的存在，其中来自受检个体的样本溶血磷脂浓度相对于来自正常个体的样本溶血磷脂浓度的升高和降低，提示受检个体有某种疾病状态存在。
22.根据权利要求21所述的化验，其中所述的用以消化溶血磷脂的酶1选自磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D、溶血磷脂酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2，并且所述的酶2选自3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶、甘油磷酸胆碱-磷酸二脂酶、胆碱氧化酶、丝氨酸脱氢酶、丝氨酸脱氨酶、乙醛脱氢酶、氨基乙醇脱氨酶、甘油激酶和甘油脱氢酶。
23.根据权利要求21所述的化验，其中所述的溶血磷脂为LysoPA。
24.根据权利要求21所述的化验，其中所述的疾病状态为癌症。
25.根据权利要求21所述的化验，其中所述的酶循环反应混合物包括3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶和β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)。
26.根据权利要求21所述的化验，其中所述的对于患某一疾病的受检个体，其溶血磷脂水平升高。
27.根据权利要求21所述的化验，其中所述的疾病状态为出血性疾患，与至少一种溶血磷脂浓度相对于正常个体的改变有关。
28.一种使受检个体溶血磷脂相对于正常个体浓度的升高和降低和与其浓度改变有关的疾病状态相关联的方法，包括如下步骤：
(a)用酶1处理正常个体体液样本，以消化溶血磷脂，产生参与第二阶段酶反应的底物；
(b)将经(a)步骤消化过的待测样本用于第二阶段酶反应，产生一种可检测产物；
(c)通过测定所述的第二阶段酶反应中产生的可检测产物的浓度，确定样本中存在的至少一种溶血磷脂的浓度；并且
(d)对比(c)步骤测定的一种或多种溶血磷脂浓度和曾经诊断某种疾病的受检个体相应溶血磷脂浓度，曾经诊断某种疾病的受检个体相对于(d)步骤得到的溶血磷脂浓度的升高和降低提示疾病状态的存在和溶血磷脂水平的改变有关联。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所检测的溶血磷脂为立体特异计数-1或立体特异计数-2溶血磷脂。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述的溶血磷脂选自LysoPA、LysoPC、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG。
31.根据权利要求28所述的方法，其中酶1消化溶血磷脂的立体特异计数-1和/或立体特异计数-2位。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述的用以消化溶血磷脂的酶选自磷脂酶B、溶血磷脂酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、卵磷脂酶和溶血卵磷脂酶。
33.根据权利要求28所述的方法，其中所述的可检测产物为3-磷酸甘油。
34.根据权利要求28所述的方法，其中所述的第二阶段酶反应为酶循环反应。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述的测定酶循环反应产生的可检测产物的步骤，包括氧化β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)或H2O2累积量的测定。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述的酶循环反应混合物包括3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶和β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)。
37.根据权利要求28所述的方法，其中所述的酶1为磷脂酶B或溶血磷脂酶，以及所测溶血磷脂为LysoPA。
38.根据权利要求28所述的方法，其中所述的样本选自血浆、血清、尿液、唾液、腹水、脑脊液和胸水。
39.根据权利要求28所述的方法，其中所述的样本在步骤(a)之前进行提取，以富集各种溶血磷脂。
40.根据权利要求28所述的方法，其中所述的样本在步骤(a)之前进行提取，以富集特定待测溶血磷脂。
41.根据权利要求28所述的方法，其中所述的疾病状态为癌症。
42.根据权利要求28所述的方法，其中所述疾病状态为出血性疾患。
43.测定来自受检个体的一种或多种溶血磷脂浓度，以检测与其水平改变有关的疾病，这种方法包括如下步骤：
(a)测定样本中至少一种溶血磷脂和磷脂酰胆碱(PC)的浓度；
(b)把溶血磷脂浓度和磷脂酰胆碱浓度相乘，得到受检样本的组合诊断标准；并且
(c)比较(b)步骤中得到的组合诊断标准与正常个体样本的组合诊断标准，以检测受检个体体内与溶血磷脂水平改变有关的疾病状态的存在，其中来自受检个体的样本溶血磷脂浓度相对于来自正常个体的样本溶血磷脂浓度的升高和降低，提示受检个体有某种疾病状态存在。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述的溶血磷脂选自LysoPA、LysoPC、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述的溶血磷脂为LysoPA。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述的多于一种的溶血磷脂测定是结合的。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述的溶血磷脂为LysoPA和LysoPC。
48.根据权利要求43所述的方法，其中所述的样本选自血浆、血清、尿液、唾液、腹水、脑脊液和胸水。
49.根据权利要求43所述的方法，其中所述的溶血磷脂和PC的浓度依如下步骤确定：
(a)用酶1处理受检个体体液样本，以消化溶血磷脂产生参与第二阶段酶反应的底物；
(b)用酶1处理受检个体体液样本，以消化PC产生参与第二阶段酶反应的底物；
(c)用至少一种酶2处理(a)和(b)步骤中得到的体液样本，产生参与第二阶段酶反应的可检测底物；并且
(d)通过测定所述第二阶段酶反应产生的可检测产物，得到样本中存在的不同溶血磷脂和PC浓度。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述的用来与酶1消化溶血磷脂的产物反应的第二阶段酶反应为酶循环反应。
51.根据权利要求43所述的方法，其中所述的疾病状态为癌症。
52.根据权利要求43所述的方法，其中所述的疾病状态为出血性疾患。
53.用于检测来自受检个体的体液样本的溶血磷脂浓度的的诊断工具盒，所述的工具盒包括：
(a)一种酶1消化溶血磷脂的立体特异计数-1和/或立体特异计数-2位，以产生参与第一阶段酶反应的底物；并且
(b)至少一种酶2消化酶1作用于溶血磷脂产生的底物。
54.根据权利要求53所述的诊断工具盒，进一步包括一种酶循环反应混合物，用于所述的底物在酶2作用下的消化过程。
55.根据权利要求53所述的诊断工具盒，其中所述的用以消化溶血磷脂的酶1选自磷脂酶A1、磷脂酶A2、卵磷脂酶B和溶血卵磷脂酶。
56.根据权利要求53所述的诊断工具盒，其中所述的酶循环反应混合物包括3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油氧化酶和β-烟酰胺氨基嘌呤二核苷酸(NADH)。
57.根据权利要求53所述的诊断工具盒，进一步包括一种用来抑制在转运和保存过程中样本中溶血磷脂水解或其水解产物的试剂。
58.根据权利要求53所述的诊断工具盒，进一步包括一种用于消化磷脂酰胆碱的试剂。
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