CN115232858A - 一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂以及包括其的试剂盒 - Google Patents

一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂以及包括其的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂以及包括其的试剂盒，以能敏感特异快速，并能自动化分析，操作简单且重复性和灵敏度高，为此，本发明提供的测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂，基于酶法测定原理进行所述测定，其特征在于，包括：第一试剂和第二试剂，其中：所述第一试剂具有：MOPS缓冲液、表面活性剂1、过氧化物酶、N‑乙基‑N‑(2‑羟基‑3‑磺丙基)‑3甲基苯胺钠盐；所述第二试剂具有：MOPS缓冲液、4‑氨基安替比林、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶以及表面活性剂2。

Description

一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂以及包括其的试剂盒
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂以及包括其的试剂盒。
背景技术
动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的发病率和病死率逐年上升，早在《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》中指出，中国成人血脂异常总体患病率高达40.40％，低密度脂蛋白胆固醇(Low densitylipoprotein cholesterol，LDL-C)是公认的ASCVD危险因子和治疗靶点，但将LDL-C降低至推荐浓度后，仍存在相当大的复发性心血管事件的残余风险，这种残余或者“隐藏”的风险，无法通过检测LDL-C水平识别，但与心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)导致的致残或致死事件实质相关，因此，美国血脂管理指南和日本血脂管理指南均列出残余风险的补充指标。
脂蛋白残粒(Remnant-Like Particle，RLP)又称富含甘油三酯(triglyceride，TG)脂蛋白残粒(TRL)，是乳糜微粒(chylomicron，CM)和极低密度脂蛋白(very lowdensity lipoprotein，VLDL)经脂蛋白酶(lipoprotein lipase，LPL)水解逐渐失去甘油三脂、磷脂、载脂蛋白A(apoproteinA，apoA)和载脂蛋白C(apoproteinC，apoC)，转变为富含胆固醇、胆固醇酯和载脂蛋白E(apoproteinE，apoE)的较小颗粒。RLP具有致动脉粥样硬化作用，脂蛋白残粒胆固醇(RLP-Cholesterol，RLP-C)水平升高是动脉粥样硬化性疾病和冠心病(coronary heart disease，CHD)以及动脉粥样硬化性有关的代谢性疾病的重要危险因素。血浆或血清中RLP-C浓度在动脉粥样硬化性疾病及动脉粥样硬化相关的疾病(如II型糖尿病、III型高脂血症和慢性肾功衰及胖患者)中显著增加。
现有技术中测定RLP的传统方法多用超速离心法和凝胶电泳法。脂蛋白残粒是一组在大小、密度、电泳迁移率、化学组成及受体识别等方面呈高度异质性的颗粒，现有的分离方法主要是根据其不同的物理和化学特征来测定脂蛋白残粒。超速离心是脂蛋白分离的参考方法，通过密度梯度超速离心测量VLDL(0.96-1.006kg/L)和IDL(1.006-1.019kg/L，Intermediate Density Lipoprotein，中间密度脂蛋白)的胆固醇含量之和，其检测要求空腹状态下两组分定义为残粒。而聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)法根据分子大小来分离脂蛋白，用LDL来反映脂蛋白残粒状态，包括大小在VLDL和LDL的任何脂蛋白颗粒。
但是，此两种方法因需特殊仪器，费时或操作繁琐，均难于在普通实验室开展。因此，需要一种简单、廉价、灵敏且快速的检测血清或血浆中脂蛋白残粒胆固醇水平的共识方法。
发明内容
本发明提供一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂以及包括其的试剂盒，以能敏感特异快速，并能自动化分析，操作简单且重复性和灵敏度高，为此，本发明提供了以下的技术方案。
本发明提供一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂，基于酶法测定原理进行所述测定，其特征在于，包括：第一试剂和第二试剂，其中：所述第一试剂具有：MOPS缓冲液、表面活性剂1、过氧化物酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3甲基苯胺钠盐；所述第二试剂具有：MOPS缓冲液、4-氨基安替比林、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶以及表面活性剂2。
本发明提供的试剂，还具有这样的特征：其中，所述第一试剂用于对与检测样本混匀得到的第一点样本检测得到吸光度A1；所述第二试剂用于对继续加入所述第一点样本得到的第二点样本检测得到吸光度A2；所述A2减去A1得到所述检测样本的吸光度变化值。
本发明提供的试剂，还具有这样的特征：所述表面活性剂1和所述表面活性剂2分别为PELEX SS-L、DW-1、DW-2以及NEWREX R中的一种或多种，优选地，所述表面活性剂1和所述表面活性剂2的质量浓度均为0.05-2％，更优选地，所述表面活性剂1为DW-1，所述表面活性剂2为DW-2。
本发明提供的试剂，还具有这样的特征：其中，所述缓冲液调整的pH为6-8，优选地，pH为6-7，更优选地，缓冲液的使用浓度在20-100mmoL/L。
本发明提供的试剂，还具有这样的特征：所述胆固醇酯酶使用水解胆固醇酯的酶，优选地，胆固醇酯酶的活性比率为28～700和/或使用浓度为2-15KU/L，其中，所述活性比例为脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性。
本发明提供的试剂，还具有这样的特征：其中，4-氨基安替比林的质量浓度为0.01-3g/L，优选为0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L以及3g/L中的任意一个。
本发明提供的试剂，还具有这样的特征：所述第一试剂和/或所述第二试剂还具有稳定剂，优选地，所述稳定剂为乳糖一水、EDTA、CaCl2以及蔗糖中的任意一种或多种，更优选地，所述稳定剂为乳糖一水，进一步地，所述乳糖一水加入的浓度为0.5g/L。
本发明提供的试剂，还具有这样的特征：所述第一试剂还具有显色底物，所述显色底物为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3甲基苯胺钠盐，优选地，所述显色底物的使用浓度为0.05-4g/L，更优选为0.5g/L。
本发明提供的试剂，还具有这样的特征：所述胆固醇氧化酶的使用浓度为1-10KU/L和/或过氧化物酶的使用浓度为10-20KU/L。
本发明还提供一种试剂盒，其特征在于，包括：前述的试剂。
发明作用与效果
本发明提供的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂以及包括其的试剂盒，基于过氧化物酶法，能自动化分析，操作简单，重复性和灵敏度高，且测试的线性范围1mg/dL～80mg/dL，在此范围内线性相关系数r≥0.990。
附图说明
图1为本发明涉及的测定脂蛋白残粒胆固醇的反应原理；
图2-4分别为实施例1涉及的3个批次测定脂蛋白残粒胆固醇的结果的线性相关性图
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明提供的试剂包括第一试剂(试剂R1)和第二试剂(试剂R2)，其中：
试剂R1主要组成及浓度包括：
3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS)，优选地，浓度为20-100mmoL/L；
表面活性剂1：为PELEX SS-L、DW-1、DW-2以及NEWREX R中的一种或多种，优选地，质量浓度为0.05-2％，更优选地，为DW-1；
过氧化物酶：浓度优选为10-20KU/L；
N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3甲基苯胺钠盐：浓度优选为0.05-4g/L；
优选地，R1还含有稳定剂：优选地，稳定剂为乳糖一水、EDTA、CaCl2以及蔗糖中的任意一种或多种，更优选地，所述稳定剂为乳糖一水。
试剂R2主要组成及浓度包括：
3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS)：优选地，浓度为20-100mmoL/L；
4-氨基安替比林：4-氨基安替比林的质量浓度优选为0.01-3g/L，优选为0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L以及3g/L中的任意一个；
胆固醇酯酶：优选地，所述胆固醇酯酶使用水解胆固醇酯的酶，优选地，胆固醇酯酶的活性比率为28～700和/或使用浓度为1-10KU/L，其中，所述活性比率为脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性；
胆固醇氧化酶：所述胆固醇氧化酶的使用浓度为1-10KU/L；
过氧化物酶：优选地，使用浓度为10-20KU/L；
表面活性剂2：为PELEX SS-L、DW-1、DW-2以及NEWREX R中的一种或多种，优选地，质量浓度为0.05-2％，更优选地，为DW-2；
优选地，第二试剂还具有：
稳定剂：优选地，稳定剂为乳糖一水、EDTA、CaCl2以及蔗糖中的任意一种或多种，更优选地，所述稳定剂为乳糖一水。
在步骤中，将样本加入R1试剂后得到第一点样本，37℃孵育5min，读测第一点样本的吸光度A1，然后继续在第一点样本中加入R2试剂得到第二点样本，37℃孵育5min，读测第二点样本的吸光度A2，则样本的吸光度A＝样本A2－样本A1，此过程还包括校准品采用生化分析仪测定的步骤，测定过程同样本一样，最终，
脂蛋白残粒胆固醇结果计算：
Figure BDA0003776973900000071
式中：△A(吸光度)＝A2－A1
上述测定的参数为：
样本量：5μL，R1试剂量：240μL，R2试剂量：80μL，
主波长：600nm，副波长：700nm，测定方法：终点法，反应时间10min。
本发明涉及的测定脂蛋白残粒胆固醇的反应原理见图1。
注，图1中，：EMSE：N-乙基-N(-3-甲苯基)-N-琥珀酰乙二胺；
4-AA：4-氨基安替比林
H3O+：水合氢离子
上述反应生成的醌亚胺类化合物的色素为红色，其与样本中脂蛋白残粒胆固醇浓度成正比，在本发明中以600nm波长处进行吸光度测定，从而计算出脂蛋白残粒胆固醇浓度。
另外本发明的特征在于本试剂其含有能够使胆固醇脂酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇等产生特异作用的两种组合的表面活性剂，让胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对试样中的极低密度脂蛋白残粒中的胆固醇发生作用，最终生成还原性辅酶。这种特异作用又在一定程度上保护样本中的RLP-C，所以本发明在测定样本中脂蛋白残粒的浓度时不需要对样本进行任何处理。
酶法测定原理：
酶法检测RLP-C分析，在表面活性剂、胆固醇酯酶等多种酶的共同作用下将RLP以外的其他脂蛋白排除，使非脂蛋白残粒被表面活性剂抑制不溶于反应体系中，从而可直接检测RLP-C。
表面活性剂作用下选择性地修饰脂蛋白结构生成溶解态的残粒脂蛋白，有效屏蔽非脂蛋白残粒。表面活性剂可选择性溶解和降解富含TG的残余脂蛋白、VLDL残余物和乳糜微粒残余物；酶则作用于脂蛋白酯键，催化水解极性区，使其溶于反应体系中，形成溶解态的残粒脂蛋白，其中的胆固醇酯在胆固醇酯酶的作用下生成游离胆固醇和脂肪酸，游离胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下，生产胆甾烯酮和双氧水，并经Trinder(特林德尔偶联终点比色法)反应产生色源显色，通过测定红色醌亚胺色源在主波长600nm/副波长700nm下的吸光度(A)值变化，计算出血清RLP-C浓度。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂做进一步详细的介绍。
实施例1
日立7100生化仪；
测定参数：
样本量：5μL，R1试剂量：240μL，R2试剂量：80μL；
主波长：600nm，副波长：700nm，测定方法：终点法，反应时间10min。
按照产品配方，配置3批次试剂R1和试剂R2，与对照组(日本协和的RLP-C试剂)进行性能比较。
试剂的配置：
试剂R1：
Figure BDA0003776973900000091
试剂R2：
Figure BDA0003776973900000092
Figure BDA0003776973900000101
图2-4分别为实施例1涉及的3个批次测定脂蛋白残粒胆固醇的结果的线性相关性图。
(1)配制3个批次，每个批次同时测定100例临床血清样本，血清浓度值覆盖试剂盒线性范围。配制的3批次试剂与对照试剂的线性相关性分别见图2、图3和图4，测试相关系数如表1：
Figure BDA0003776973900000102
实验比较结果显示，配制的3批次试剂与对照试剂具有良好的相关性。
(2)任选1个批次进行低浓度质控和高浓度质控批内精密度测试，测试结果见表2；任选1个批次进行低浓度质控和高浓度质控批间精密度测试，测试结果见表3和4。
Figure BDA0003776973900000111
试剂测试10次其批内精密度(CV)符合产品技术要求≤10％的要求，说明试剂的结果差异较小。
Figure BDA0003776973900000121
Figure BDA0003776973900000122
试剂测试3次其批间精密度，相对极差(R)≤15％符合产品技术要求，说明试剂的结果差异较小。
Figure BDA0003776973900000131
(3)任选1个批次进行线性测试，测试结果见表5。
Figure BDA0003776973900000141
线性试验结果R符合要求，说明浓度在2-77mg/dL范围内，吸光度值随样本浓度升高也同比例升高。
(4)灵敏度测试结果(如表6)
Figure BDA0003776973900000142
编号1和编号2是平行测试2次，每一次都对纯化水和产品校准品分别作为样本进行测试，测试结果符合技术要求分析灵敏度≥0.005的指标。
(5)干扰试验
模拟血清中干扰物质浓度达到一定值后，直接影响测试结果正确性，通常干扰试验偏差控制在±10％以内，超过其偏差说明该试剂测试样本会出现偏差，从而说明该试剂不具备抗血清中内源干扰物的能力。
Figure BDA0003776973900000143
Figure BDA0003776973900000151
实验结果可以看出在抗坏血酸≤50mg/L，英脱利比特≤600mg/L，胆红素≤40mg/L时，对RLP-C无明显干扰，测定结果可靠。
实施例2
另外本发明特征在于R1试剂和R2试剂中的缓冲液体系，评价MOPS、MES、PIPES等几种缓冲体系进行对比，最终在本体系下优选MOPS，因该缓冲体系能提供一个合适的环境，使试剂中的酶类保持稳定，活性不会降低，其中的表面活性剂在添加入缓冲体系后还可以保护样本中RLP-C，最终选择在该缓冲体系下的pH为6-7且浓度优选在20-100mmoL/L。
1)缓冲液选择
根据酶反应最适pH范围，以MOPS、MES及PIPES为选择对象，作为试剂的缓冲液。分别配置各种缓冲液浓度为100mmol/L，pH在6.5，其他条件保持不变。考察在各缓冲体系下，试剂在配置当天和开封1周后试剂空白吸光度及高值样本回收率的变化。
Figure BDA0003776973900000161
根据试剂空白吸光度及高值样本回收率选择MOPS缓冲液，在其缓冲体系下，试剂底物能够保持相对稳定。
2)考察最适pH
分别配置MOPS缓冲液pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0考察在各pH条件下，试剂在配置当天和开封10天后试剂空白吸光度、分析灵敏度及高值样本反应结果。
试剂配置当天不同pH对试剂性能影响
Figure BDA0003776973900000171
试剂开封10天后不同pH对试剂影响
Figure BDA0003776973900000172
在不同pH下，试剂开封10天后，空白吸光度基本保持不变，试剂分析灵敏度有明显上升趋势，在试剂开封10天后根据高值样本回收率及与配置当天测定高值结果的回收率比较，pH选择在5.0～6.0时，空白吸光度有明显的下降趋势。考虑到试剂的开封稳定性，pH选择6.0～7.0范围之间。
3)缓冲体系浓度的选择
选取浓度分别在20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、120mmol/L的MOPS缓冲液，在其他条件不变的情况下，分别测定混合血清中脂蛋白残粒胆固醇的浓度，重复测定5次，获得不同浓度下的吸光度变化差值。
20 40 60 80 100 120
1 0.0242 0.0334 0.0458 0.0713 0.0772 0.0771
2 0.0238 0.0329 0.0458 0.0711 0.0775 0.0772
3 0.0234 0.0331 0.0455 0.0716 0.0770 0.0774
4 0.0239 0.0332 0.0451 0.0712 0.0777 0.0775
5 0.0237 0.0335 0.0450 0.0712 0.0769 0.0770
平均值 0.02380 0.03322 0.04544 0.07128 0.07726 0.07724
当浓度在20～100mmol/L，反应随缓冲液浓度增加而增加，当浓度升至100mmol/L后反应不再增加，故选择100mmol/L为最优缓冲浓度。
实施例3
试剂中表面活性剂能够明显提高胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶对于残粒脂蛋白的选择性，并且该酶对残粒脂蛋白之外的脂蛋白的作用降低。此类表面活性剂优选PELEX SS-L(烷基二苯醚二磺酸钠)、DW-1(表面活性剂1)、DW-2(表面活性剂2)，最终从提高酶反应的选择性方面使用DW-1和DW-2，该表面活性剂的使用浓度没有特别的限定，优选0.05-1％(0.5-10g/L)。特别指出的是表面活性剂DW-1是非离子表面活性剂同PELEX属于同一类都可以起到提高酶反应的选择性，而表面活性剂DW-2属于阴离子表面活性剂，可以增强酶反应的选择性，另外本发明中还可以起到保护样本中RLP-C的作用。在试剂研发阶段对各类表面活性剂进行了系列的正交实验，根据准确度实验结果并参考试剂反应分析灵敏度，故选择DW-1和DW-2。
以PELEX、DW-1+DW-2、NEWREX R作为评估对象分别添加入试剂中，PELEX和NEWREXR添加量都为0.5g/L，DW-1添加量5g/L，DW-2添加量1g/L，其他组分保持不变，测定试剂分析灵敏度、准确度及空白吸光度，通过试验结果来选择最适合的浓度。
表面活性剂 准确度 空白吸光度 分析灵敏度
PELEX 106.1％ 0.0019 0.3695
DW-1+DW-2 103.3％ 0.0017 0.3804
NEWREX R 107.4％ 0.0020 0.3643
试剂中表面活性剂从准确度、空白吸光度和分析灵敏度3个指标检测试剂性能，当试剂测试不含目标物的样品时，试剂空白吸光度检测结果也会出现响应值，该值越接近0越好，说明体系不含目标物时，检测值越接近真值。分析灵敏度是反应试剂检测到最小浓度目标物的反应能力，分析灵敏度高能检测到物质的能力越强，检测限就越低，能检测的浓度越低。
通过实验，表面活性剂DW-1+DW-2的选择其准确度最靠近100，其性能优于其他表面活性剂；空白吸光度最低，低于其他2种表面活性剂；分析灵敏度最高，高于其他2种表面活性剂；故选择DW-1+DW-2为表面活性剂。
表面活性剂DW-1+DW-2最适浓度的选择
Figure BDA0003776973900000201
从上面结果可以分析出，表面活性剂DW-1+DW-2按不同比例添加入试剂后，空白吸光度和分析灵敏度无明显变化，准确度较好的组合分别是5+1、6+1、5+2、6+2，按原材料最少添加量的话5+1是最好的组合，该组合已经满足最优的性能。故试剂R1中添加DW-1的量为5g/L，R2中添加DW-2的量为1g/L。
实施例4
本发明中胆固醇酯酶，使用水解胆固醇酯的酶，特别优选了活性比率为28～700(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)的胆固醇酯酶(通过对比实验得出具有活性比率的胆固醇酯酶与无活性比率的胆固醇酯酶可以明显提高该酶对残粒脂蛋白的选择性)。通过实验，该酶可选择性与残粒脂蛋白作用，将该脂蛋白质中的胆固醇酯选择性分解，可使仅测定目标残粒脂蛋白中的胆固醇。
以不同活性比率的胆固醇酯酶作为评估对象分别添加入试剂中，添加量为2KU/L，其他组分保持不变，测定试剂分析灵敏度、准确度，通过结果来选择最适活性比率的胆固醇酯酶。
Figure BDA0003776973900000211
CE：胆固醇酯酶；LPL：胆蛋白脂肪酶
采用不同类型的不同活性比率的胆固醇酯酶，根据准确度及分析灵敏度试验结果可以看出，活性比率为34.3是最优选用的胆固醇酯酶。
活性比率为34.3胆固醇酯酶进行最适浓度的选择
Figure BDA0003776973900000212
从上述试验结果可以看出，胆固醇酯酶的添加量在2KU/L～15KU/L，空白吸光度、准确度、高值回收率没有明显变化，性能比1KU/L添加量好，考虑试剂成本最适浓度定为2KU/L。
实施例5
本发明中，4-氨基安替比林及过氧化物酶存在的情况下与显色底物发生显色反应，4-氨基安替比林的质量浓度0.01-3g/L，配制列浓度梯度用量为0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L，观察试剂空白吸光度、灵敏度和高值回收率，结果如下。
Figure BDA0003776973900000221
实验通过空白吸光度、分析灵敏度和高值回收率3个试剂性能指标得知，试剂测试空白吸光度越低，说明干扰越小；回收率越接近100％说明准确度好。实验结果可看出，选择0.5g/L浓度时其空白吸光度、分析灵敏度和高值回收率3项指标都优于其他浓度。从性能最优角度选择，最适合的浓度是0.5g/L。
实施例6
本发明中的显色底物优选N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3甲基苯胺钠盐(TOOS)，在优化过程中选择在0.05-4g/L，最终优选为0.5g/L。该显色底物能够使反应更加灵敏，准确度更高。
以TOOS、TOPS、HDAOS作为评估对象分别添加入试剂中，添加量都为0.5g/L，其他组分保持不变，测定试剂分析灵敏度、准确度及空白吸光度，通过结果来选择最适合的底物。
底物 准确度 空白吸光度 分析灵敏度
TOOS 104.3％ 0.0017 0.3845
topS 106.9％ 0.0020 0.3814
HDAOS 107.5％ 0.0017 0.3779
实验结果准确度选择越接近100％、空白吸光度最低、分析灵敏度最高的实验结果为优选TOOS，然后对其浓度进行梯度分析。
TOOS浓度 准确度 分析灵敏度 精密度
0.5g/L 104.3％ 0.3835 2.6％
1g/L 104.9％ 0.3824 3.1％
2g/L 105.1％ 0.3829 3.8％
3g/L 104.8％ 0.3841 4.5％
4g/L 105.2％ 0.3845 4.3％
试验结果中随着TOOS浓度上升，准确度和分析灵敏度没有明显变化，精密度结果中0.5g/L浓度下结果最好，故选择浓度为0.5g/L。
实施例7
本发明中还添加稳定剂。稳定剂在研发评估中有使用乙二胺四乙酸、乳糖一水、氯化钙等。根据加速稳定性试验结果从中选择最适合的底物。其中各种稳定剂添加量都以0.5g/L量进行添加，其他成分不变。
Figure BDA0003776973900000231
Figure BDA0003776973900000241
根据分析灵敏度结果可以看出，乳糖一水在加速4周后，相比其他稳定剂灵敏度值下降最低；另外从空白吸光度结果分析加速至4周后，空白吸光度值升高最少。故选择使用乳糖一水作为最适稳定剂，并且从结果可以看出0.5g/L的添加量性能结果已满足要求。

Claims (10)

1.一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂，基于酶法测定原理进行所述测定，其特征在于，包括：
第一试剂和第二试剂，其中：
所述第一试剂具有：MOPS缓冲液、表面活性剂1、过氧化物酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3甲基苯胺钠盐；
所述第二试剂具有：MOPS缓冲液、4-氨基安替比林、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶以及表面活性剂2。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：
其中，所述第一试剂用于对与检测样本混匀得到的第一点样本检测得到吸光度A1；
所述第二试剂用于对继续加入所述第一点样本得到的第二点样本检测得到吸光度A2；
所述A2减去A1得到所述检测样本的吸光度变化值。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：
所述表面活性剂1和所述表面活性剂2分别为PELEX SS-L、DW-1、DW-2以及NEWREX R中的一种或多种，
优选地，所述表面活性剂1和所述表面活性剂2的质量浓度均为0.05-2％，
更优选地，所述表面活性剂1为DW-1，所述表面活性剂2为DW-2。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的试剂，其特征在于：
其中，所述缓冲液调整的pH为6-8，优选地，pH为6-7，更优选地，缓冲液的使用浓度在20-100mmoL/L。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的试剂，其特征在于：
所述胆固醇酯酶使用水解胆固醇酯的酶，
优选地，胆固醇酯酶的活性比率为28～700和/或使用浓度为2-15KU/L，其中，所述活性比例为脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的试剂，其特征在于：
其中，4-氨基安替比林的质量浓度为0.01-3g/L，优选为0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L以及3g/L中的任意一个。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的试剂，其特征在于：
所述第一试剂和/或所述第二试剂还具有稳定剂，
优选地，所述稳定剂为乳糖一水、EDTA、CaCl2以及蔗糖中的任意一种或多种，
更优选地，所述稳定剂为乳糖一水，进一步地，所述乳糖一水加入的浓度为0.5g/L。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的试剂，其特征在于：
所述第一试剂还具有显色底物，所述显色底物为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3甲基苯胺钠盐，优选地，所述显色底物的使用浓度为0.05-4g/L，更优选为0.5g/L。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的试剂，其特征在于：
所述胆固醇氧化酶的使用浓度为1-10KU/L和/或过氧化物酶的使用浓度为10-20KU/L。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-9任意一项所述的试剂。
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