CN1320039A - 氧化性应激因子的水平降低 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细菌菌株在生产用于使氧化应激因子水平降低的药物中的应用,所述菌株优选乳杆菌属或丙酸杆菌属中可在肠道中产生增加量的丙酸的菌种,所述因子如哺乳动物包括人体内的IL－6、反应性氧属(ROS)、以及粘附分子。所述药物可用于预防和/或治疗慢性炎性疾病如风湿性疾病和牛皮癣。

Description

氧化性应激因子的水平降低
本发明涉及一或多种细菌菌株在降低哺乳动物包括人体内氧化性应激因子(oxidative stress factors)水平中的应用。
发明背景
氧化性应激因子是主要导致机体内氧化强化状态(prooxidant)的多种分子的常用术语。所述分子，如IL-1、IL-6、ROS(反应性氧属)、IL-8、8-异前列腺素(isoprostaglandin)、VCAM(脉管细胞粘附分子)以及ICAM(细胞内粘附分子)在前炎性和炎性状态下水平升高。
所述氧化性应激因子也称为炎性标志物，但后者还包括所谓的二级分子，其由所述氧化性应激因子启动，如急性期蛋白。
与其它氧化性应激因子一样，ROS由单核细胞和淋巴细胞产生。其特有水平的正常产生可以维持体内内环境的自稳。
氧化性应激因子的水平升高是急性和慢性炎症的典型症状。在慢性炎症中，老化的不断加深带来动脉硬化症和癌症的危险。慢性炎性状态可以由例如吸烟过度或病毒和细菌的慢性感染引起。另一组慢性炎性疾病包括自身免疫病如风湿性疾病和牛皮癣。
慢性炎性病人目前接受抗生素、高剂量维生素或其它药物的治疗。抗生素的使用由于某些原因应予以避免，药物的使用常常带来不必要的负作用。风湿性疾病则使用例如有效而昂贵的布洛芬(ibuprofen)治疗，它有胃部负作用。对牛皮癣病人而言目前尚无对症药物。
现有技术
以Otsuka制药有限公司的名义申请的EP 0649603A1涉及一种抗氧化食物，其包括内含天然含镁物质(如茶叶)之食物经由微生物如植物乳杆菌发酵而产生的产物。选择上述细菌是由于其催化活性以及超氧化物歧化酶样活性，它们在机体内产生抗氧化活性，但仅在镁存在时有作用。
Nenonen,MT.等，英国风湿病学杂志，1998年3月，37(3)，第274-81页描述了未煮过的富含乳杆菌的绝对素食食物对类风湿病人的影响。有一半的病人出现诸如恶心和腹泻等副作用，并因此中止了实验，但另一半病人的症状得到不同程度的缓解。据推测每天食用乳杆菌可能还有利于针对性地测定类风湿性关节炎。
Seikenkai的US 4,314,995涉及一种对患有传染病所致感染或炎症的病人进行治疗的方法，其包括给与至少一种乳杆菌，其有不同于已知乳杆菌的营养需求，即它具有在一种特异性低营养培养基中生长的能力。该发明提到了5种不同的乳杆菌菌株。
国际食品微生物学杂志，42(1998)29-38，公开了每天摄入400ml含燕麦的刺玫果(rose-hip)饮料(由微生态制剂植物乳杆菌发酵产生)达3周后，短链脂肪酸(SCFA)乙酸和丙酸的粪便中总浓度有显著增长。这种据称与基础饮食无关的增长可解释为所摄入的微生态调节菌株导致的SCFA产生，或解释为该菌株对结肠中其他SCFA生产菌株的刺激或抑制。
发明详述
本发明涉及一种于肠道中产生增加量丙酸之细菌菌株的应用，其用于制备可降低哺乳动物包括人类中氧化性应激反应水平的药物。
本发明尤其涉及一种于肠道中产生增加量丙酸之细菌菌株的应用，其用于制备可降低哺乳动物包括人类中IL-6、ROS、以及单核细胞对内皮细胞之粘附因子的水平的药物。
氧化性应激因子，如白细胞介素1和白细胞介素6等细胞因子、ROS、以及单核细胞对内皮细胞之粘附分子的高水平是前炎性和炎性状态的特征。
于肠道中产生增加量丙酸之细菌菌株优选乳杆菌属或丙酸杆菌属的一种菌株。
根据本发明的一个优选实施方案，所述细菌菌株是植物乳杆菌。植物乳杆菌的优选菌株是植物乳杆菌299v，其已保藏在DSM，德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen von Zellkulturen GmbH,Braunschweig，德国，录入号DSM9843)。
本发明还涉及一种于肠道中产生增加量丙酸之细菌菌株的应用，其用于制备可预防和/或治疗慢性炎性疾病的药物。可根据本发明治疗的慢性炎性或前炎性疾病可由不同细菌如肺炎衣原体和幽门螺杆菌，或毒性物质如烟碱所诱导。例如已证实，连续1个月每天摄入400ml由植物乳杆菌DSM9843(5×107cfu/ml)发酵产生的含燕麦之刺玫果饮料Pro Viva后，抗幽门螺杆菌的抗体量减少。
根据本发明的一个优选应用是用于预防和/或治疗自身免疫病如类风湿性疾病和牛皮癣。
附图简述
图1显示用发酵的燕麦粥处理后，单核细胞对内皮细胞之粘附的减少。
图2显示用发酵的燕麦粥处理后，单核细胞对受刺激的内皮细胞的粘附的减少。
图3显示用发酵的燕麦粥处理之前和之后，单核细胞中ROS的产生。
实验
以下实验旨在测定给与能在肠道中产生增加量丙酸之微生态调节菌株对已有上述因子之水平升高的受试者血液中氧化性应激因子水平的影响。连续3周或6周每人每天给与25ml浓燕麦粥，其用植物乳杆菌DSM9843(含1×109cfu/ml)发酵产生。
方法
外周血单核细胞(PBMC)
PBMC经密度梯度离心从加了肝素的血液中分离。所述血液用PBS稀释。将25ml稀释的血液迅速加在15ml Ficoll-Paque液面上，离心(1900rpm,40分钟，22℃)。将混合的单核细胞层吸出并用PBS洗涤。计数分离出的PBMC，并分为两部分。其一用于测定细胞内ROS的产生，另一用于粘附试验。单核细胞制剂由约30％单核细胞和70％淋巴细胞组成。
内皮细胞的分离和培养
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用胶原酶消化脐带而得到，如Jaffe,E.A.等，来源于脐静脉的人内皮细胞的培养，临床研究杂志，1973；52:2745-2756所述。简言之，用PBS灌注脐带静脉以除去血细胞，充之以0.1％胶原酶(Ⅰa型)，于37℃C静置10分钟。在内皮细胞(EC)悬浮液中添加FBS，胎牛血清，并于1200rpm离心10分钟。于37℃,5％CO2的一定湿度空气环境中，在M-199培养基中培养EC。该培养基还包含100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2.5μg/ml两性霉素B,20mM HEPES,20％FBS和50μg/ml内皮细胞生长添加剂(ECGS)。HUVEC在包被了明胶的25cm2烧瓶中培养。每2天更换一次培养基，直至细胞融合(3-5天)。HUVEC纯度用coble-stone形态学(常用于静息态EC和Ⅷ因子的染色)评估。用0.01％胰酶/EDTA使融合的HUVEC脱壁，所述胰酶/EDTA用FBS拮抗。
试验1．对ROS产生的影响
在该试验中，向6名因吸烟过度而具有高水平反应性氧属ROS的健康志愿者给与由植物乳杆菌DSM9843发酵产生的浓燕麦粥，评估该给药的影响。平均年龄是32岁，体重指数为26.6kg/m2。每人每天给与25ml，共3周。
收集6个志愿者的血液。如上述经Gradisol L密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。
对细胞氧化的分析是基于反应性氧属(ROS)介导的转化反应，该转化反应将以2,7’-二氯荧光素二乙酸酯的形式装载于细胞中的非荧光性2,7’-二氯荧光素(DCFH)转化为荧光性DCF，其中该DCF的荧光发射能力增强，反映出氧化压力增加。将新鲜分离的、包含约30％单核细胞和70％淋巴细胞的PBMC重新悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)，然后与20μM2’,7-二氯荧光素在37℃避光保温30分钟。然后用PBS洗涤细胞。荧光基团2’,7-二氯荧光素(由其非荧光性前体通过过氧化物氧化反应生成)的相对荧光强度在细胞荧光测定试验(FACScan,Becton Dickinson)中检测。在流式细胞分析期间，单核细胞和淋巴细胞凭借前向散射(FCS)和侧向散射(SCC)分辨。结果以平均荧光强度表示，见下表1。
表1
受试者用植物乳杆菌299v处理之前和之后，其分离的
  单核细胞和淋巴细胞的反应性氧属(ROS)的产生。
                平均荧光强度(计数)
            单核细胞                   淋巴细胞
受试个体   处理前   处理后   处理前   处理后
    1     220     120     86     81
    2     254     369     150     134
    3     562     249     217     169
    4     425     201     172     135
    5     343     204     188     129
    6     338     224     133     106
上述数据显示，除了2号以外的其他受试者ROS的产生均下降，其中2号为无反应者。
试验2．布洛芬对ROS产生的影响，一项对比研究
为了研究布洛芬使ROS降低的机制，对参与试验1的6位受试者每天给与500mg的一种丙酸衍生物和一种已知抗炎药布洛芬，共3周。初步数据表明，单核细胞和淋巴细胞以完全相同于上述研究中对植物乳杆菌299v的方式应答。
试验3．对ROS产生的影响
在另一组10位健康志愿者(过度吸烟者)中重复试验1，他们在6周内给与浓燕麦粥。以平均荧光强度表示的给与浓缩燕麦粥之前和之后的结果示于图3，图中显示了给与乳杆菌299v株之前和之后正常静息态单核细胞中ROS的产生。
试验4．粘附试验
如下检验试验3中10位健康志愿者的PBMC的粘附。
将传至第3代的HUVEC培养于明胶包被的24孔板中。单核细胞融合后，在实验前18小时的时候用含抗生素、20％FBS和20mM HEPES而无ECGS的培养基199更换培养液。部分细胞用TNFα(500μ/ml)预处理18小时。新鲜分离的PBMC以3-9×105/ml重新悬浮于含有20mM HEPES的培养基199。用PBS洗涤HUVEC，然后加入PBMC(每孔0.5ml)，一起保温30分钟。移出PBMC悬浮液。用PBS洗涤HUVEC，将孔中填满福尔马林，根据Pappenheim用May-Grunwald和Giemsa溶液染色，在10个不同的区域计数粘附的单核细胞。数据表示为所加的单核细胞的百分率。所有试验均做双份。
结果示于图1和图2，图1显示给与乳杆菌299v株之前和之后单核细胞对未刺激的HUVEC的粘附，图2显示给与乳杆菌299v株之前和之后正常静息态单核细胞对TNFα刺激的HUVEC的粘附。
试验5．对白细胞介素6(IL-6)的影响
检验试验3之10位健康志愿者的PBMC中浓缩燕麦粥对IL-6水平的影响。
IL-6水平用Boehringer Mannheim的h-白细胞介素-6 ELISA试剂盒测定，其为一个光度测定型酶免疫试验，用于体外定量测定链亲和素包被的微滴板中的人白细胞介素-6(hlL-6)。结果见下表2。
表2
受试者编号 IL-6(pg/ml) IL-6(pg/ml)
    1     10     9
    2     11     5
    3     7     11
    4     13     10
    5     14     8
    6     5     5
    7     10     5
    8     7     8
    9     15     9
    10     9     6
试验6．丙酸诱导的氧化性应激反应的降低
如上述分离人单核巨噬细胞，在直径35mm的平皿中的2ml RPMI-1640(10％胎牛血清，50mg/ml青霉素/链霉素，2mM谷氨酰胺)中预培养6×106个细胞。然后加入10μM丙酸，将细胞于37℃培养4小时。然后将培养基更换为新鲜培养基，用1.0ng/ml LPS(脂多糖)刺激细胞，以激发氧化强化性应激反应。24小时后，移出培养液，经蒸发浓缩10倍。有丙酸和没有丙酸(对照细胞)的氧化应激反应用Cayman Chemical的8-Isoprostane EIA试剂盒评估。
3次8-isoprostane水平降低的实验中，表示为平均值的氧化应激反应的降低为47％。
试验7．牛皮癣病人中氧化应激因子的降低
6位牛皮癣复发病人志愿参与研究。病人至少6周不接受药物治疗，然后开始给与以植物乳杆菌DSM9843发酵产生的浓缩燕麦粥(含1×109cfu/ml)，每位病人每天25ml，共6周。
如上述，分离上述病人在给与乳杆菌之前，以及刚刚完成乳杆菌给药之后的外周血单核细胞(PBMC)。测定以下氧化应激因子：ROS，以PMA，佛波醇miristate乙酸酯，(100ng/ml)(其刺激细胞进行氧化应激反应)刺激之前和之后的值；粘附因子，单核细胞对内皮细胞的粘附；以及IL-6。以如上述相同的方法获得的结果见下表3。
表3
牛皮癣病人给与乳杆菌299v株之前和之后氧化性应激因子的降低
  病人编号       ROS(mfi*)    粘附(％) IL-6(pg/ml)
PMA刺激前 PMA刺激后
   1    前     774     4209     22     25
   后     781     1524     13     14
   2    前     1039     5442     23     18
   后     1033     3803     11     9
   3    前     660     1797     26     32
   后     1175     4087     11     19
   4    前     695     3772     -     29
   后     818     1516     -     17
   5    前     840     3708     30     25
   后     1348     5905     20     19
   6    前     564     4019     9,3     23
   后     1034     5520     13     21
*mfi=平均荧光强度
对接受6周治疗的6位病人中的5位进行临床评估显示，发痒显著减少。除了皮肤患处被分为更小的区域；患处内的降低也有10％-27％的水平差异。
结论
本文说明，由结肠微生物发酵而在大肠部位产生的丙酸酯可能具有抗炎作用。因此认为，可在肠道中产生更多量丙酸的细菌菌株将缓解与机体内不同慢性炎性疾病相关的前炎性状态。

Claims (10)

1．一种应用，其为能在肠道中产生增加量丙酸之细菌菌株在制备能降低哺乳动物包括人之氧化性应激因子水平的药物中的应用。
2．权利要求1的应用，其中所述细菌菌株是乳杆菌属或丙酸杆菌属的菌株。
3．权利要求1或2的应用，其中所述细菌菌株是植物乳杆菌。
4．植物乳杆菌299v，保藏号DSM9843，的权利要求1至3中任一项的应用。
5．权利要求1至4中任一项的应用，其用于降低血液中的IL-6水平。
6．权利要求1至4中任一项的应用，其用于降低血液中的反应性氧属的水平。
7．权利要求1至4中任一项的应用，其用于降低单核细胞对内皮细胞的粘附。
8．权利要求1至4中任一项的应用，其用于制备预防和/或治疗慢性炎性疾病的药物。
9．权利要求8的应用，其用于预防和/或治疗风湿性疾病。
10．权利要求8的应用，其用于预防和/或治疗牛皮癣。
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