CN117511773B - 一株粪肠球菌、复合菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株粪肠球菌、复合菌剂及其应用，涉及微生物领域。其中，所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)于2022年10月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.62869。所述粪肠球菌以及复合菌剂能够有效地治疗猫肠道紊乱以及猫炎症性肠病，并可应用于制备相关的药物。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一株粪肠球菌、复合菌剂及其应用。
背景技术
肠道疾病是猫常见的疾病之一，其通常是由于食物的质量不佳、环境突然发生变化而引起肠道稳态的改变，其主要表现是出现腹泻，有时候还会伴随严重的炎症性肠病。
目前针对细菌引起的猫肠道紊乱以及炎症性肠病的治疗方法主要是给猫服用抗生素类的药物，目的是通过抗生素杀死有害细菌，让肠道内能重新达到稳态。但是抗生素具有广谱的杀菌作用，除了会杀死肠道内对宿主有害的细菌，也会杀死有益的细菌，因此，服用抗生素的治疗疗程和完全康复期较长。另外，过度或长时间使用抗生素会细菌的耐药性，导致抗生素的治疗效果逐渐变差，但是目前尚未有疗效更好的替代药物。
可见，现有技术还有待改进和提高。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一株粪肠球菌和复合菌剂，旨在提高猫肠道紊乱或炎症性肠病的治疗效果。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一株粪肠球菌，所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)于2022年10月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.62869。
一种复合菌剂，包括长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和以上所述的粪肠球菌。
一种如上所述的粪肠球菌在制备抑制肠道细胞炎症因子表达药物中的应用。
一种如上所述的粪肠球菌在制备治疗猫肠道紊乱药物中的应用。
一种如上所述的粪肠球菌在制备治疗猫炎症性肠病药物中的应用。
一种如上所述的复合菌剂在制备治疗猫肠道紊乱药物中的应用。
一种如上所述的复合菌剂在制备治疗猫炎症性肠病药物中的应用。
有益效果：
本发明提供了一株粪肠球菌，该粪肠球菌能有效地治疗细菌引起猫肠道紊乱或炎症性肠病，并且相对于采用抗生素药物治疗，猫的治疗疗程更短。
本发明还提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括长双歧杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌，所述复合菌剂通过3种菌剂的协同作用，除了能有效治疗猫的肠道紊乱，还能进一步提高猫炎症性肠病的治疗效果。
附图说明
图1为粪肠球菌HHP003的细胞毒性测试结果。
图2为细胞实验中HT29细胞的炎症因子表达水平结果。
图3为粪便评分图。
图4为第30天经药物或复合菌剂处理后各组猫血液中的IgA含量。
图5为第30天经药物或复合菌剂处理后各组猫血液中的IgG含量。
图6为第30天经药物或复合菌剂处理后各组猫血液中的IgM含量。
图7为粪便评分标准。
具体实施方式
本发明提供了一株粪肠球菌、复合菌剂及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
此处需要说明的是，在以下实验中，粪肠球菌HHP003(Enterococcus faecalis)即保藏编号为GDMCC No：62869的粪肠球菌A-A-2，于2022年10月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
长双歧杆菌HHP004(Bifidobacterium longum)即保藏编号为GDMCC No：62866的长双歧杆菌A-1-12，于2023年5月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
屎肠球菌HHP005(Enterococcus faecium)即保藏编号为GDMCC No：62870的屎肠球菌M-3，于2022年10月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
实施例1
采用人结肠癌细胞HT29，实验共分为五个组别：分别为细胞的培养液孔(空白对照孔)、37℃处理的对照细胞孔(对照孔)、粪肠球菌HHP003处理孔、LPS处理的细胞孔(处理样品孔)、LPS+粪肠球菌HHP003处理孔；各组的具体处理方式参照实施例1；
处理完成后，加入LDH检测工作液，混匀，室温(约25℃)避光孵育30min，然后在490nm处测定吸光度。计算公式为：细胞毒性或LDH酶活性＝(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100。
从图1可以看出，HT29细胞经LPS处理后，HT29细胞的LDH产生量显著提高，说明LPS会对HT29细胞造成损伤；而经粪肠球菌HHP003处理后的HT29细胞的LDH产生量无显著变化，说明粪肠球菌HHP003对HT29细胞无毒性。
此外，LPS+粪肠球菌HHP003组的LDH含量也显著低于LPS组，反映粪肠球菌HHP003的加入可以显著降低LPS引起的细胞损伤。
实施例2
2.1细胞实验
2.1.1培养人结肠癌细胞HT29
人结肠癌细胞HT29用RPMI1640(HyClone,UT,USA)培养基在37℃加湿的5％CO2中孵育，培养基中含有10％ FBS(Gibco,Grand Island,NE,USA)以及1％抗生素(100mg/mL的链霉菌素和100U/mL的青霉素)。HT29细胞以5×105个细胞/孔的密度接种在12孔细胞培养板中。
2.1.2屎肠球菌HHP003(Enterococcus faecalis)与HT29细胞共培养
实验共设置4个组别，分别为对照组(Control组)、HHP003组、LPS组以及LPS+HHP003组；
对照组的具体操作如下：培养HT29细胞，不做其他处理；
HHP003组的具体操作如下：当HT29细胞达到80％汇合度时，将HT29细胞放入含有粪肠球菌HHP003的(细菌浓度为1×107CFU/mL)细胞培养基中共同孵育6小时；
LPS组的具体操作如下：当HT29细胞达到80％汇合度时，加入10μg/mL LPS处理12h；
LPS+HHP003组的具体操作如下：当HT29细胞达到80％汇合度时，先将HT29细胞放入含有粪肠球菌HHP003的(细菌浓度为1×107CFU/mL)细胞培养基中共同孵育6小时，然后再加入10μg/mL LPS处理12h；
各组处理结束后，分别用PBS洗涤3次，然后HT29细胞用RNAiso170Plus(Takara，大连，中国)裂解以提取RNA。
2.2测定细胞炎症因子基因的表达水平，相应的结果见图2，Control组与HHP003组的细胞炎症因子表达量相当，无显著差异，说明粪肠球菌HHP003的使用不会引起人结肠癌细胞的细胞炎症因子表达上调。
LPS组与Control组进行比较，可见IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17和TNF-α的基因表达均有显著上调。
而LPS+HHP003组与LPS组进行比较，其IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的基因表达均有下调，其中IL-1β和TNF-α的基因表达量与LPS组有显著差异，说明粪肠球菌HHP003与HT29细胞共培养能够有效抑制LPS引起的炎症因子表达上调，与其他药物联合使用时，有望可以达到更好的疗效。
实施例3
3.1动物实验
将猫随机分为4组，每组各有6只猫，各组分别为：
对照组(N组)：不作其他处理；
药物组(A组)：第1-8天进行连续的攻毒处理，攻毒为每天灌喂大肠杆菌菌粉灌装胶囊1次，饲喂量为每千克体重的猫饲喂1×109CFU的菌；第9-30天喂食抗生素阿莫西林克拉维酸钾，每天1次，每次50mg(1片)；
单株益生菌组(1S组)：第1-8天进行连续的攻毒处理，攻毒方式与药物组相同；第9-30天喂食粪肠球菌HHP003，饲喂量为每千克体重的猫饲喂1×109CFU的菌；
三株益生菌组(3S组)：第1-8天进行连续的攻毒处理，攻毒方式与药物组相同；第9-30天喂食粪肠球菌HHP003、长双歧杆菌HHP004和屎肠球菌HHP005，每种菌的饲喂量为每千克体重的猫饲喂1×109CFU的菌；
以上的猫分别在第0天，第8天和第30天进行采血，以测定血液中的相关指标；
对猫的粪便进行评分；
评分标准引用文献：Evaluation of canned therapeutic diets for themanagement of cats with naturally occurring chronic diarrhea，Journal ofFeline Medicine and Surgery，14(10)669–677，DOI:10.1177/1098612X12446906。
评分标准如图7所示。图7的评分标准中，分数越靠近2分，说明猫的健康状态越好。
3.2粪便的测试结果如下：
请参阅图3，图3为各组猫的粪便评分取平均值后所作的每日变化趋势图。对照组(N组)为没有进行攻毒处理，也没有饲喂益生菌或抗生素，图1中，N组的粪便评分稳定在2.5-3.5之间；
药物组(A组)在进行攻毒处理后，粪便评分在逐渐增加，在取消攻毒处理并饲喂抗生素后，其粪便评分在第10-15天有明显的下降趋势，但是在20-22天出现了反复，说明抗生素的使用有助于短期内修复肠道稳态，但是长时间使用可能会导致病菌具有耐药性；
单株益生菌组(1S组)在进行攻毒处理后，粪便评分也在逐渐增加，且评分的增加幅度明显大于药物组(A组)，反映该组的猫对攻毒处理更为敏感，在取消攻毒处理并饲喂粪肠球菌HHP003后,其粪便评分在10-25天内持续下降，并之后稳定在2.5-3分内，此外，在同一段时间内，单株益生菌组(1S组)的粪便评分下降速度明显大于药物组(A组)，说明粪肠球菌HHP003对猫肠道紊乱的治疗效果要优于药物组(A组)；
三株益生菌组(3S组)在进行攻毒处理后，粪便评分也在逐渐增加，在取消攻毒处理并饲喂粪肠球菌HHP003、长双歧杆菌HHP004和屎肠球菌HHP005后,其粪便评分变化趋势与单株益生菌组(1S组)相似，说明粪肠球菌HHP003、长双歧杆菌HHP004和屎肠球菌HHP005的联合使用也对猫肠道紊乱的治疗效果要优于药物组(A组)。
3.3第30天经饲喂药物或益生菌后猫的血液IgA含量
请参阅图4，图4为在第30天时，各组猫的血液中IgA的含量，从图4可以看出，对照组(N组)未经攻毒和饲喂药物或益生菌的处理，其IgA含量处于正常水平；
药物组(A组)的IgA含量很高，且与对照组(N组)有着非常显著的差异，说明药物组(A组)虽然改善了猫肠道紊乱的问题，但是攻毒引起的炎症并没有很好地消除；
单株益生菌组(1S组)的IgA含量较药物组(A组)低，且与对照组(N组)无显著差异，说明粪肠球菌HHP003可以起到较好地消除攻毒引起的炎症，治疗炎症性肠病；
三株益生菌组(3S组)的IgA含量较药物组(A组)低，且与对照组(N组)无显著差异，说明粪肠球菌HHP003、长双歧杆菌HHP004和屎肠球菌HHP005的组合也可以较好地消除攻毒引起的炎症，治疗炎症性肠病。
3.4第30天经饲喂药物或益生菌后猫的血液IgG含量
请参阅图5，图5为在第30天时，各组猫的血液中IgG的含量，从图5可以看出，对照组(N组)未经攻毒和饲喂药物或益生菌的处理，其IgG含量处于正常水平；
药物组(A组)的IgG含量很高，且与对照组(N组)有着极其显著的差异，说明药物组(A组)的猫的炎症问题依旧很明显，抗生素的使用不能有效消除攻毒引起的炎症问题；
单株益生菌组(1S组)的IgG含量较药物组(A组)低，且与药物组(A组)有显著差异，说明粪肠球菌HHP003可以一定程度上改善了攻毒引起的炎症，治疗炎症性肠病；
三株益生菌组(3S组)的IgG含量与药物组(A组)有显著差异，且较单株益生菌组(1S组)低，说明粪肠球菌HHP003、长双歧杆菌HHP004和屎肠球菌HHP005的组合较单株益生菌组的治疗效果好。
3.5第30天经饲喂药物或益生菌后猫的血液IgM含量
请参阅图6，图6为在第30天时，各组猫的血液中IgM的含量，从图6可以看出，对照组(N组)未经攻毒和饲喂药物或益生菌的处理，其IgM含量处于正常水平；
药物组(A组)的IgM含量很高，且与对照组(N组)有着极其显著以上的差异，说明药物组(A组)的猫的炎症问题依旧很明显，抗生素的使用难以有效治疗攻毒引起的炎症问题；
单株益生菌组(1S组)的IgM含量较药物组(A组)低，且与药物组(A组)有显著差异，说明粪肠球菌HHP003可以改善攻毒引起的炎症，治疗炎症性肠病；
三株益生菌组(3S组)的IgM含量较药物组(A组)低，且与药物组(A组)有显著差异，说明粪肠球菌HHP003、长双歧杆菌HHP004和屎肠球菌HHP005的组合可以改善攻毒引起的炎症，治疗炎症性肠病。
综上所述，抗生素治疗猫肠道紊乱具有一定的效果，但是其疗程时间长，效果不明显，并且抗生素不能有效治疗猫的炎症性肠病。本发明的1S组和3S组菌剂不仅能治疗猫肠道紊乱，而且从猫的粪便评分以及免疫球蛋白指标上反映出，与抗生素治疗法(A组)相比，1S组和3S组菌剂的治疗效果明显更好，具有良好的应用前景和实际价值。
另外，将1S组和3S组的粪便评分、IgA、IgG和IgM的含量进行综合比较后发现：3S组的治疗效果总体上优于1S组，虽然3S组和1S组的粪便评分的下降幅度和趋势都相近，但是综合比较IgA、IgG和IgM的含量，第30天时，3S组的3种主要Ig含量均是低于1S组，说明3S组治疗炎症性肠病的效果要优于1S组，在粪肠球菌的基础上进一步联合使用长双歧杆菌和屎肠球菌可以提高疗效。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一株粪肠球菌（Enterococcus faecalis）A-A-2，其特征在于，所述粪肠球菌A-A-2于2022年10月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:62869。
2.一种复合菌剂，其特征在于，由长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）A-1-12、屎肠球菌（Enterococcus faecium）M-3和权利要求1所述的粪肠球菌A-A-2组成；所述长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）A-1-12的保藏编号为GDMCC NO:62866，于2023年5月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；所述屎肠球菌（Enterococcus faecium）M-3的保藏编号为GDMCC NO:62870，于2022年10月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
3.一种如权利要求1所述的粪肠球菌在制备治疗大肠杆菌引起的猫肠道紊乱药物中的应用。
4.一种如权利要求2所述的复合菌剂在制备治疗大肠杆菌引起的猫肠道紊乱药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311330221.0A CN117511773B (zh) | 2023-10-13 | 一株粪肠球菌、复合菌剂及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN202311330221.0A CN117511773B (zh) | 2023-10-13 | 一株粪肠球菌、复合菌剂及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117511773A CN117511773A (zh) | 2024-02-06 |
| CN117511773B true CN117511773B (zh) | 2024-07-09 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101067120A (zh) * | 2006-11-29 | 2007-11-07 | 康哲医药研究(深圳)有限公司 | 粪肠球菌cms－h001及其应用 |
| CN109673861A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-04-26 | 山东艾贝迪宠物食品有限公司 | 一种猫用藻菌类营养化毛膏及其制备方法 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101067120A (zh) * | 2006-11-29 | 2007-11-07 | 康哲医药研究(深圳)有限公司 | 粪肠球菌cms－h001及其应用 |
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