CN1313402A - D－泛解酸内酯的微生物酶法制备方法 - Google Patents
D－泛解酸内酯的微生物酶法制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物酶水解制造D－泛解酸内酯的方法,该方法利用发明人筛选并保藏的能高产D－泛解酸内酯水解酶的微生物菌株串珠镰孢霉菌Fusariummoniliforme SW－902(即CGMCCNo.0536),在优化条件下发酵产酶,发酵液酶活达到3～6U/l,酶制剂0.5～1.5U/g(干菌体);游离酶或其固定化细胞用于DL－泛解酸内酯水解,酶一次转化率25～45%;对底物总转化率70～90%;酶转化液中的D－泛解酸内酯化后得到的纯品D－泛解酸内酯对消耗DL－泛解酸内酯底物的得率为86.07%;主要质量指标[α]20 D=－50～－51。
Description
本发明涉及用化学合成DL-泛解酸内酯作底物，用微生物菌株串珠镰孢霉菌Fusarium moniliforme.SW-902(即CGMCCNo.0536)发酵生产的D-泛解酸内酯水解酶，进行酶水解拆分制造D-泛解酸内酯的方法。
D-泛解酸内酯(pantoyl laetone)是生产泛酸、泛醇以及泛酰巯基乙胺的重要中间体，它与β-丙氨酸反应即得到泛酸。泛酸，Pantothenic acid，又称本多生酸、维生素B5、或B3，是一种重要的药物、食品添加剂和饲料添加剂。其产品形式一般为其右旋体钙盐D-泛酸钙。泛酸是维生素B族物质，是辅酶A的组成部分，参与体内脂肪酸降解、脂肪酸合成、柠檬酸循环、胆碱乙酰化(一种神经冲动传导物质)、抗体的合成(促进对病原体的抵抗力)等代谢，由于辅酶A的生理功能，泛酸的存在有利于各种营养物质的吸收和利用。临床上泛酸用于治疗一些疾病，与其他B族维生素一起用于补充营养，用于维生素B缺乏症、周围神经炎、手术后肠梗阻、链霉素中毒及类风湿等。通常其钙盐与其他B族维生素一起用于补充营养。
泛酸钙还是一种重要的饲料添加剂，现大量用于饲料工业。泛酸钙作为维生素饲料添加剂，在畜禽养殖中具有重要的作用，供应不足时会使畜禽出现各种代谢、神经、肠胃等方面生理机能的紊乱。许多国家法定使用D-或DL-泛酸钙，我国只批准使用D-型。生产D-泛酸的中间体泛解酸内酯则要求是具有较高光学纯度的D-构型。
D-泛醇(维生素原B5)，是重要的化妆品和药用原料，市场紧缺。D-泛醇的生产不能采用钙盐诱导结晶法，生物拆分法制备D-泛解酸内酯更有实际意义。
D-泛解酸内酯的制备方法有以下几种：
1，化学方法拆分，如用奎宁化合物、二甲马钱子碱或手性胺等拆分剂拆分泛解酸内酯，化学拆分法的缺点是拆分剂太贵，成本高，分离困难，还有环境污染和毒性问题；
2，物理方法拆分，如用诱导结晶法直接拆分DL-泛酸钙生产D-泛酸钙，条件控制要求高，收率低，光学纯度差，成本高，只能用于D-泛酸钙的生产，而不适合D-泛醇等其它衍生物的生产；
3，生物法拆分主要有酶法，微生物法。已报道的研究有多种技术路线。如：
①用微生物彻底降解DL-泛解酸内酯中的L-泛解酸内酯，得到未分解的D-构型泛解酸内酯。(JPA 47-19745)。此方法的缺点是至少损失一半DL-泛解酸内酯原料；
②用微生物氧化DL-泛解酸内酯中的L-构型泛解酸内酯成酮基泛解酸内酯，再不对称还原转化为D-泛解酸内酯。(JPA 61-293386、JPA 47-19745、JPB 61-14797)。由于基质浓度低、反应速率低，几乎没有实际意义；
③用微生物选择性地不对称水解DL-泛解酸内酯中的L-泛解酸内酯，而得到未水解的D-泛解酸内酯。(JPA 57-152895)。也由于基质浓度低、反应速率低，几乎没有实际意义，并且只有L-构型的内酯水解的非常彻底才能得到高光学纯度的D-泛解酸内酯；
④用微生物选择性地不对称水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，得到D-泛解酸，用高光学纯度的D-泛解酸进行内酯化生成D-泛解酸内酯，(USPatent 5,275,949,1994；US Patent 5,372,940,1994)，此法为日本FuJi公司(发明人为日本京都大学的Sakamoto Keiji等)申请的美国专利，已在日本第一制药公司用于工业生产。但该法的缺点是菌体酶培养发酵时间长，需要7天，培养的菌体只进行一次酶转化反应，菌体利用率低，酶成本高。
还有一些其他酶法、微生物法拆分的报道，如：脂肪酶或酰氨酶水解泛酸酯或泛酸酰氨(JP-A 1-228487,JP-A 1-228488)、用微生物将DL-泛解酸中的D-泛解酸与β-丙氨酸选择性地合成生成D-泛酸(JP-A 5-23191)、用羟腈水解酶(氧腈酶)的醛醇的不对称氰醇化路线(Adam,G.,and Seebach,D.,Synthesis,373,1988)等。均由于收率低、产物光学纯度低而缺乏实用意义。
另外，1996年，日本武田药品工业株式会社在中国申请了“生产D-泛酸钙的方法”的专利(申请号：96194779，公告号：1187854)，最近又陆续有日本和美国专利(JP-A 6-261772,U S Patent 5,932,457,1999；US Patent 6,013,492,2000)，通过微生物发酵方法直接生产D-泛酸。他们筛选了能直接发酵葡萄糖生成D-泛解酸，在发酵液中添加β-丙氨酸，就可直接得到D-泛酸。但是由于发酵液组分复杂，特别是有大约10％的单糖和寡糖，很难用离交、结晶等方法去除，浓缩、结晶时由于粘，操作困难，溶剂消耗大，产品颜色深，提取收率低，规模性生产放大有困难。
本发明采用微生物不对称水解DL-泛解酸内酯方法得到D-泛解酸，再经过内酯化反应生成D-泛解酸内酯的方法。与不对称水解L-泛解酸内酯得到未水解D-泛解酸内酯法相比，很符合实用性要求。
若用L-立体专一性内酯水解酶水解，将L-泛解酸内酯水解为L-泛解酸，可直接得到未水解的D-泛解酸内酯。但由于要求酶水解必须彻底，方能保证产品的光学纯度。这样，对酶及其酶解条件要求很高，反应时间也长，还可能因长时间反应带来化学水解引起其他杂质。
本发明用D-立体专一性内酯水解酶水解D-泛解酸内酯，不要求水解彻底，反应时间短，未水解部分经过消旋化可反复使用。所筛选得到的微生物酶的立体专一性好(即不水解L-泛解酸内酯)，可得到很高光学纯度的D-泛解酸内酯。
产D-泛解酸内酯水解酶的微生物菌株主要有镰孢霉菌Fusarium，赤霉菌Gibberella，粘帚霉属Gliocladium，黑曲霉属Aspergillus，以及Cylindrocarpon.Volutella等。本发明筛选并诱变得到了能高产立体专一性D-泛解酸内酯水解酶、且不利用不降解泛解酸内酯或泛解酸的微生物菌株串珠镰孢霉菌Fusariummoniliforme.SW-902。
本发明采用的工艺路线与日本FuJi公司申请的美国专利(对照文献：USPatent 5,275,949,1994；US Patent 5,372,940,1994)相同，但所用的菌株为镰孢霉属中的串珠镰孢霉(稻恶苗霉)Fusarium.moniliforme(SW-902)，属于赤霉组[Lisola]，此菌能发酵产生植物生长激素赤霉素，不引致植物枯腐或蔫萎病(但易引起水稻等植物徒长)。而对照文献用的是镰孢霉属中的尖镰孢霉Fusariumoxysporum，属于绮丽镰孢霉组[Elegans]，该菌种一般都会引致植物叶枯、根腐或蔫萎病，是一种植物致病菌，它排放、扩散后会对农作物产生危害(对照文献未说明)。本发明所筛选的菌种，是发酵产生植物生长激素赤霉素的工业生产用菌种，它用于本项发明的产品生产则无此顾虑。本发明目前达到的水平为：产酶发酵时间2～3天；酶一次性转化率25～45％；对底物总转化率7～90％；酶转化时间短(5～30小时)，酶可反复利用多次(6次以上)；用卡拉胶进行固定化后，反复分批酶转化可达10次以上；对产物提取收率60％以上；D-泛解酸内酯主要质量指标比旋光[α]D 20为-48～51°，光学纯度为99(％e.e)。部分指标略优于对照文献所报道的水平(产酶发酵时间5～7天；酶一次性转化率25～30％；酶转化时间2～3天，酶利用1次；D-泛解酸内酯主要质量指标比旋光[α]D 20为-45.6°，光学纯度为91～98％e.e)。
本发明的目的提供一种高产D-泛解酸内酯水解的微生物新菌株，提供一种新的微生物酶法拆分制备D-泛解酸内酯的方法。所得到的酶水解产物中D-泛解酸经内酯化后提取的D-泛解酸内酯的光学纯度达到99％e.e.以上，满足D-泛酸钙及D-泛醇生产中间体的质量要求。
本发明通过下列方案来实现：
(1)本发明人实验室选育并保藏的能高产D-泛解酸内酯水解酶的微生物菌株串珠镰孢霉菌Fusarium moniliforme.SW-902-CGMCCNo.0536(此菌株已于2001年2月12日保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心)，作为产酶菌株；
(2)菌株经斜面活化，发酵产酶，用其湿菌体或其固定化细胞为酶制剂，作为酶源；
(3)以异丁醛为原料，采用甲醛法，氰化钠路线合成，生产DL-泛解酸内酯，精制后作为酶转化底物；
(4)将(2)的酶制剂加入(3)的底物中，酶转化生成的D-泛解酸，经内酯化，溶剂萃取、脱色、浓缩、结晶，制成D-泛解酸内酯。
菌种及其诱变：
从发酵工业生产中收集和本发明人实验室保藏的微生物菌株中，经初筛、复筛及分离纯化，获得一株产D-泛解酸内酯水解酶的镰孢霉菌Fusariumsp.SW-9，该菌株产酶稳定，立体选择性好，在产酶培养基上摇瓶发酵的菌丝体作酶源，水解D-泛解酸内酯得到的D-泛解酸，经内酯化后提取得到的D-泛解酸内酯光学纯度高，[α]D 20=-47°。本方法以该菌作为产酶菌株。
选择Fusarium sp.SW-9为菌株，按常规方法进行紫外线、Co-60诱变处理。紫外线照射为15W，距离27cm，时间2～3分钟：Co-60照射为剂量2～8万伦琴，时间为20～30分钟。经处理的菌丝体移种到含DL-泛解酸内酯和DL-泛解酸的基本培养基及完全培养基上，20～40℃培养3～7天，检出在含DL-泛解酸内酯和DL-泛解酸的基本培养基不长，在完全培养基上生长的菌落。与此同时，将上述诱变和筛选的菌丝体移种到含D-泛解酸内酯和指示剂的筛选培养基上，20～40℃培养3～7天，检出变色圈大的生长菌落。
含DL-泛解酸内酯和DL-泛解酸的基本培养基包含Na2SO4、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、维生素、微量元素溶液和琼脂诸组分。
经诱变获得的菌株称为Fusarium sp.SW-902，即CGMCC No.0536。该诱变株与亲株相比，外观形态一致，但在含DL-泛解酸内酯和DL-泛解酸的基本培养基上不生长，不分解DL-泛解酸内酯和DL-泛解酸，并且其产酶发酵时间从7天缩短到2～3天，产酶活力提高了25％，酶转化所需的时间也从24～48小时缩短到5～6小时。该菌株以保存号CGMCC No.0536保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心。
菌种初步鉴定结果：
观察了该菌的外貌、生长形态、观察了它的内部结构。在马铃薯或米饭培养基上，产生大量气菌丝呈棉絮状，菌丝在培养基中不产生色素，未见子囊，有性孢子不详。未见镰刀形大型孢子。在液体培养基中菌体为丝状体，有隔膜，有较多小型孢子，多数孢子单细胞，圆形，单生，未见串生。此菌能发酵产生植物生长激素赤霉素，不引致植物枯腐或蔫萎病。对照《真菌鉴定手册》(魏景超遗著，上海科学技术出版社，1979，上海p609～638)，按渥仑韦柏和莱因钦(Wollenweber & Reinking)的分类系统，我们初步认为应属于镰孢霉属中的稻恶苗霉Fusarium.moniliforme，属于赤霉组[Lisola]，拟命名为串珠镰孢霉菌Fusarium moniliforme.SW-902。
产酶菌株的培养和发酵：
斜面培养：配制含葡萄糖1～10％，马铃薯浸汁5～30％，琼脂1～2.5％,pH6～9的培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，下同。100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、制成斜面、接种，20～40℃培养3～7天。产酶培养：配制含丙三醇1～10％，蛋白胨0.5～5％，酵母膏0.5～5％，玉米浆0.5～5％,pH6～9的培养基，装液量20～200ml/500ml三角瓶，100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、接种，接种量5～10％,20～40℃，摇瓶转速100～220r/min。在上述条件下进行摇瓶发酵试验，培养3-7天，产酶可达4U/l(1.0U/g干菌体)以上。
D-泛解酸内酯水解酶酶活测定方法：取10ml发酵液，滤取菌丝体，向菌体中加入2％泛解酸内酯2.5ml,CaCl250mmol和pH7.5,0.2mol/LTris-HCl缓冲液，28℃,150r/min摇床反应30min，抽滤除去菌体，反应液用高压液相色谱分析(HPLC)测定D-泛解酸。酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟水解D-泛解酸内酯成D-泛解酸的μmol量的酶量，定义为1个酶活力单位(U)。
泛解酸内酯和泛解酸的HPLC测定：柱型为ZORBAX SB C18 5μM 250×4.6mm，流动相为乙腈∶KH2PO4(0.02mol/L)=1∶9，用HCl调pH为3，流速为1ml/min，紫外检测波长为215nm。
酶转化反应：
培养后的菌丝体作为酶源，以DL-泛解酸内酯为底物，底物浓度为1～70％，加酶量为0.1～5U/g底物，酶反应温度为20～40℃，酶解时间为3～30小时。在此条件下所得的DL-泛解酸内酯酶解液进行高压液相色谱分析及比旋光测定表明，已酶解的主要组分为D-泛解酸。
或者，发酵产得湿菌丝体，用生理盐水制成菌丝体悬液，与4～6％,1～5倍量卡拉胶溶液在35℃～60℃下混匀，冷却后加KCl溶液硬化制得固定化细胞。以此作为酶源进行酶水解。除了卡拉胶作为固定化载体包埋外，还可以用海藻酸钙、明胶、几丁质等载体包埋的方法。固定化细胞可反复回用，进行多次酶水解反应。
D-泛解酸内酯的提取及精制：
酶水解后所得的酶解液清液，主要成分为L-泛解酸内酯及D-泛解酸，还有未转化的D-泛解酸内酯，还含有一些无机盐杂质及较深的颜色，可以先用适当溶剂萃取去除L-泛解酸内酯及未转化的D-泛解酸内酯，分离出已转化的D-泛解酸，进行内酯化反应后，再用适当溶剂萃取提取，并进行脱盐和脱色处理，或重结晶方法来加以精制，从而得到高纯度、高质量的D-泛解酸内酯产品。
本发明的工艺流程示意图见附图1。
本发明克服了诱导结晶法直接拆分DL-泛酸钙收率低，光学纯度差，成本高，只能用于D-泛酸钙生产的局限，克服了化学拆分法拆分剂贵，成本高，分离困难，有污染和毒性问题等缺点。对其它酶法或发酵法的缺点，如基质浓度低、反应速率低、产物光学纯度低等有所改善。本发明的优点是选育了一株能高产立体专一性D-泛解酸内酯水解酶、不利用不降解泛解酸内酯或泛解酸的微生物菌株串珠镰孢霉菌Fusarium moniliforme.SW-902-CGMCC No 0536，而且，产酶发酵时间短(3天)，酶转化时间短(5～10小时)，酶可反复利用多次(6次以上)。提供了一种工艺简单的微生物酶法拆分制备D-泛解酸内酯的方法。所得到的酶水解产物D-泛解酸经内酯化后提取得到的D-泛解酸内酯的光学纯度达到99％e.e.以上，可满足D-泛酸钙或D-泛醇生产中间体的质量要求。
下面的实施例对本发明作详细说明。
实施例1
斜面培养：培养基为马铃薯浸汁(20％)100ml，葡萄糖2g，琼脂2g,pH6.5，加水至1000ml,121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种，菌种为串珠镰孢霉菌Fusarium moniliforme SW-902-CGMCC No.0536,25℃培养5天，作为斜面活化种子。
产酶培养：培养基为丙三醇3％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，玉米浆0.5％，pH6.0，装液量为500ml三角瓶装液100ml,121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，28℃培养3-7天，作为发酵酶液。
摇瓶产酶试验结果如下(表1)。由表1可见，培养时间3天，酶活达到最高值，以后几天酶活基本维持恒定。
表1摇瓶产酶试验结果
| 培养时间d | 菌体湿重g/L | 菌体干重g/L | 酶活U/g(干菌体) |
| 123456 | 10.38586.125174.41105.13577.2897.225 | 0.466.0059.79511.8513.9214.785 | 00.441.621.221.201.27 |
平均菌体湿重/菌体干重=9.69
实施例2
由化学合成制备的DL-泛解酸内酯，用含50mmolCaCl2的水溶液配制成30％浓度为底物；加按实例1方法制备的湿菌体(D-泛解酸内酯水解酶)，加酶量为0.3U/g泛解酸内酯，置摇床28℃,150r/min反应，每20min取样进行高压液相色谱分析及比旋光测定，并用浓氨水调节反应液的pH值为7.0。酶解时间为5～10小时。将反应结束后滤出的菌丝体，加入新的反应底物继续反应，如此反复，重复利用6次。得到酶水解结果见表2。表2结果表明，5～30小时酶水解后，得到的酶转化率为38％左右，经内酯化后萃取的产品D-泛解酸内酯的比旋光度为[α]D 20=-47°。菌体使用6次后，酶转化率仍然没有明显的下降。结果如表2所示：
表2反复分批酶转化结果
| 转化次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 转化率(％) | 30.5 | 31.1 | 29.3 | 28.6 | 29.3 | 29.6 |
实施例3
按实例1方法，发酵产酶。得湿菌丝体100g，加100ml生理盐水制成菌丝体悬液，30℃保温；另称取20g卡拉胶，加400ml生理盐水，加热溶解后，冷却到55℃保温。两者在50℃以下混匀，倒入平皿，冷却，加KCl溶液，放冰箱中硬化3hr，称重得约500g固定化细胞。将此固定化细胞，按实例2方法酶水解。反复分批酶水解10次结果见表3。
表3 固定化细胞反复分批酶转化结果
| 转化次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 转化率(％) | 28.5 | 30.1 | 32.2 | 30.5 | 29.3 | 29.6 | 30.5 | 31.2 | 28.6 | 31.5 |
实施例4
按实施例2的方法，配制浓度为30％的DL-泛解酸内酯底物，加按实例1方法制备的湿菌体(D-泛解酸内酯水解酶)，按实施例2的方法酶水解。所得的酶解液100ml过滤所得的清液，用体积比为1∶1～2的二氯甲烷萃取3次，分离出水相，其中主要含已转化的D-泛解酸。水相用HCl调pH为1进行内酯化反应后，再用二氯甲烷萃取提取，有机相进行蒸发回收溶剂，得到D-泛解酸内酯粗品12.5g，粗品得率41.67％(对DL-泛解酸内酯计)，测定比旋光为[α]D 20=-48°。粗品用丙酮/异丙醚重结晶，得D-泛解酸内酯纯品10.5g，重结晶收率84％，对DL-泛解酸内酯得率35％，产品比旋光为[α ]D 20=-51°，HPLC测定D-泛解酸内酯光学纯度为99％e.e.。
收集L-泛解酸内酯及未转化的D-泛解酸内酯，蒸发浓缩回收溶剂后，用NaOH溶液130℃加热2小时，进行消旋化反应。回收得到DL-泛解酸内酯17.8g，直接用于下次酶反应。按此计算，得到的纯品D-泛解酸内酯对消耗DL-泛解酸内酯底物(酶水解的D-泛解酸内酯)的得率为86.07％。
实施例5
按实例1方法，用15L发酵罐发酵产酶。按实施例2的方法，配制浓度为30％的DL-泛解酸内酯底物，加罐发酵制备的湿菌体(D-泛解酸内酯水解酶)，按实施例2的方法，用15L反应罐进行酶水解，自动加浓氨水调节pH值为6.9～7.0。按实例3方法进行产物提取和未转化底物回收。酶反复利用5次。结果为：发酵时间2天，酶活达到1.02 U/g(干菌体)，菌体湿重42g/L,6次酶转化平均酶转化率为30.2％，粗品D-泛解酸内酯的比旋光度为[α]D 20=-47°，粗品对酶水解的D-泛解酸内酯的提取得率90.5％。
Claims (4)
1．一种高产D-泛解酸内酯水解酶的微生物菌株，它是串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)SW-902 CGMCC No:0536。
2．制造D-泛解酸内酯的方法，包括：
(1)将权利要求1所述的菌株SW-902，进行常规培养，发酵，获得湿菌体或用卡拉胶等载体固定化后做为酶制剂；
(2)以异丁醛为原料，采用甲醛法，氰化钠路线生产DL-泛解酯内酯，精制后作为酶转化底物；
(3)将(1)的湿菌体或用卡拉胶等载体固定化后加入到(2)的底物反应，生成D-泛解酸，经内酯化，制成D-泛解酸内酯。
3．根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中底物浓度为1-70％，加酶量为0.1-5U/g底物，酶反应温度为20-50℃，酶解时间为5-30小时。
4．根据权利要求2所述的方法，其特征在于产酶发酵培养的培养基为：丙三醇1-10％，蛋白胨0.5-5％，酵母膏0.5-5％，玉米浆0.5-5％,pH6-9，温度20-40℃，培养2-7天。
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