CN1296379C - 丙二酰基人参皂苷的制备工艺及其治疗糖尿病的药物用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种丙二酰基人参皂苷制备工艺及其治疗糖尿病的药物用途，同时还提供了一种丙二酸单酰基三七皂苷-R4新化合物和它的医用用途。鲜人参粉碎后用乙醇在室温下冷浸提取，将提取液减压回收溶剂，浓缩为水溶液，用正丁醇∶水反复萃取，水层溶液浓缩后上大孔树脂柱，乙醇洗脱，回收乙醇得丙二酰基人参皂苷；本发明制备工艺操作简单，提取率高，为丙二酰基人参皂苷的工业化生产提供了保证。
Description
技术领域
本发明涉及治疗糖尿病的药物，尤其是公开一种丙二酰基人参皂苷制备工艺及其治疗糖尿病的药物用途，同时还提供了一种丙二酸单酰基三七皂苷-R4新化合物和它的医用用途，属于中医药学技术领域。
背景技术
本发明涉及的丙二酰基人参皂苷(Malonyl-ginsenosides)又称为丙二酸单酰基人参皂苷，主要包括M-Rb1、M-Rb2、M-Rc、M-Rd和M-NR4系列化合物。
目前，丙二酰基人参皂苷的商业化生产中，用正丁醇萃取总皂苷时，这部分皂苷易混溶于水层，被当作糖分、无机盐等水溶性杂质而除掉；将总皂苷提取物直接上大孔树脂柱，也会造成一部分水溶性皂苷随水而流失。通过试验对比，人参各部位的丙二酰基人参皂苷的含量，以其鲜人参须根中丙二酸单酰基人参皂苷的总含量高达4％以上，而生晒参、红参及其它加工品种中该类皂苷的含量明显减少，甚至没有。在人参的各种制品中一方面丙二酰基人参皂苷在加工中损失一部分，另一方面是加工过程中脱掉丙二酰基转化生成其它皂苷。
发明内容
本发明公开一种丙二酰基人参皂苷的制备方法。
本发明丙二酰基人参皂苷在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
本发明还公开一种新化合物：丙二酸单酰基三七皂苷-R4(简称：M-NR4)及其医用用途。
本发明涉及的丙二酰基人参皂苷具有下述结构通式：
丙二酰基人参皂苷包括M-Rb1、M-Rb2、M-Rc、M-Rd和本发明的化合物M-NR4：
其中，丙二酰基人参皂苷的制备工艺包括以下步骤：
以1kg鲜人参(须根、支根、根茎、主根等)为原料，切碎，用10-20kg的20-98％的乙醇在室温下冷浸提取2-6次，每次8-16小时，提取过程要充分搅拌，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，用正丁醇：水反复萃取，水层溶液浓缩后上大孔树脂柱，用水、30％、60％乙醇洗脱，60％乙醇部分回收乙醇得到的水溶液冻干后保存备用，60％乙醇部分为丙二酰基总皂苷，再开发制剂。每步实验过程越短越好，得到的样品要低温保存。
丙二酸单酰基三七皂苷-R4(简称：M-NR4)
具有以下结构：
分子式：C62H102O30
分子量：1326
为3-0-[6-O-丙二酰基-β-D-葡萄吡喃糖(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖]-20-0-[β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖]-20(S)-原人参二醇。
M-NR4的制备工艺为：
取上述制备丙二酰基人参皂苷的60％乙醇相(丙二酸单酰基总皂苷)10-30g，干法上样，用硅胶干柱减压分离(硅胶G 2Kg青岛海洋化工厂生产)，用洗脱液(CHCl3-MeOH-H2O 65∶35∶10下层)洗至柱底，然后分割切断，用硅胶薄层检查，合并含有M-NR4组份。
将M-NR4组份再上硅胶干柱(600g、300～400目、4.5×60cm)，用氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)洗脱，分断切割后用硅胶薄层检查，将M-NR4上H+型阳离子交换树脂柱，继续用乙醇洗脱，洗脱液在40℃条件下减压浓缩，浓缩液经乙醇反复重结晶，得化合物即丙二酸单酰基三七皂苷-R4。
本发明还提供了据有很强的药理活性的一类丙二酰基人参皂苷制剂，其成分包含5种化合物：M-NR4、M-Rb1、M-Rb2、M-Rc和M-Rd。
本发明丙二酰基人参皂苷的药物含有治疗有效量的提取物及单体为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
本发明可以组合物的形式通过口服、直肠、静脉、肌肉注射或胃肠外给药方式施用于这种治疗的患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如：片剂、颗粒剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂、口服液体剂型和注射剂。也可使其活性成分与一种或多种载体或药物混合，制成所需剂型。
上文的载体是指药学领域常规的药物载体，包括如：防腐剂、色素、稀释剂、赋形剂，填充剂，粘合剂，矫味剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体。
本发明的的药物作用：
经过药理学试验筛选，对该类皂苷进行了实验性糖尿病鼠(四氧嘧啶型、链尿霉素型、肾上腺素性和外源性葡萄糖型)的降糖实验，发现该类化合物具有明显的降糖效果。
下述的药理试验证实了本发明化合物的降糖药理活性。
1试验材料、仪器和试剂：
1.1实验材料
动物系昆明种小白鼠，体重18-22g，雌雄均用。分别购自长春生物制品研究所动物室，许可证号：2002-0001；吉林大学基础医学院动物实验中心，许可证号：2003-0001。
1.2仪器
752型紫外光栅分光光度计，上海第二分析仪器厂制造；A-6半自动生化分析仪，北京松上技术有限公司。
1.3药物及试剂
丙二酰基人参皂苷、丙二酸、人参二醇组皂苷和丙二酸单酰基三七皂苷-R4均由本实验组提供。
阳性药胰岛素注射液，江苏万帮生化医药股份有限公司，批号：0307214。葡萄糖，北京化工厂，批号：20000901。总胆固醇试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号：050105。盐酸肾上腺素注射液，北京市永康药业有限公司，批号：03070241。四氧嘧啶，Sigma产品。链脲佐菌素，Sigma产品。血糖试剂盒，北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：041119。肝糖元测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20050307。柠檬酸，北京化工厂，批号：991105；柠檬酸钠，北京化工厂，批号：9911505。
2试验方法
2.1对正常动物血糖的影响
取健康小鼠60只，随机分为五组：空白对照组、阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量给药组，每天静脉注射给药一次，连续给药三天。末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟将小鼠断头处死，取血，分离血清，以血糖试剂盒测血糖含量。
2.2对高血糖动物模型的影响
2.2.1对链脲佐菌素致高血糖动物模型的影响
取健康小鼠72只，随机取12只作为空白对照组，其余小鼠均静脉注射链脲佐菌素200mg/kg(10ml/kg)，次日将这60只小鼠随机分为六组：模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量给药组。分组后按组别静脉注射给药，每天给药一次，连续给药四天。末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，将小鼠断头处死，取血，分离血清，以血糖试剂盒测血糖含量。
2.2.2对四氧嘧啶致高血糖动物模型的影响
取健康小鼠72只，随机取12只作为空白对照组，其余小鼠均静脉注射四氧嘧啶80mg/kg(10ml/kg)，次日将这60只小鼠随机分为六组：模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量给药组。分组后按组别静脉注射给药，每天给药一次，连续给药四天。末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，将小鼠断头处死，取血，分离血清，以血糖试剂盒测血糖含量。
2.2.3对肾上腺素致高血糖动物模型的影响
取健康小鼠72只，随机分为六组：空白对照组，模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量给药组。每天静脉注射给药一次，连续给药三天，末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，除空白对照组外，其余各组动物均腹腔注射肾上腺素注射液100μg/kg(10ml/kg)，30分钟后将小鼠断头处死，取血，分离血清，用血糖试剂盒测血糖含量。
2.2.4对外源性葡萄糖升高血糖动物模型的影响
取健康小鼠72只，随机分为六组：空白对照组，模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量给药组。每天静脉注射给药一次，连续给药三天。末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，除空白对照组外，其余各组动物均静脉注射葡萄糖2g/kg(10ml/kg)，15分钟后将小鼠断头处死，取血，分离血清，以血糖试剂盒测血糖含量。
2.2.5M-NR4对肾上腺素致高血糖动物模型的影响
取健康小鼠72只，随机分为六组：空白对照组，模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药M-NR430、20、10mg/kg三个剂量给药组。每天静脉注射给药一次，连续给药三天，末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，除空白对照组外，其余各组动物均腹腔注射肾上腺素注射液100μg/kg(10ml/kg)，30分钟后将小鼠断头处死，取血，分离血清，用血糖试剂盒测血糖含量。
2.3丙二酸单酰基人参皂苷不同分解产物对高血糖模型动物的影响：
取健康小鼠110只，随机分为十一组：空白对照组，模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60mg/kg二个剂量给药组，二醇组皂苷110.94、55.47mg/kg二个剂量给药组，丙二酸4.57、2.28mg/kg二个剂量给药组，二醇组皂苷+丙二酸110.94+4.56、55.47+2.28mg/kg二个剂量给药组，每天静脉注射给药一次，连续给药三天，末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，除空白对照组外，其余各组动物均腹腔注射肾上腺素注射液100μg/kg(10ml/kg)，30分钟后将小鼠断头处死，取血，分离血清，用血糖试剂盒测血糖含量。
2.4对高血糖模型动物肝糖元的影响
2.4.1对链脲佐菌素糖尿病小鼠肝糖元的影响
取健康小鼠72只，随机取12只作为空白对照组，其余小鼠均静脉注射链脲佐菌素200mg/kg(10ml/kg)，次日将这60只小鼠随机分为六组：模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量给药组。分别按组别静脉注射给药，每天给药一次，连续给药四天。末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，将小鼠断头处死，取肝脏，用肝糖元试剂盒测小鼠肝糖元含量。
2.4.2对四氧嘧啶糖尿病小鼠肝糖元的影响
取健康小鼠72只，随机取12只作为空白对照组，其余小鼠均静脉注射四氧嘧啶80mg/kg(10ml/kg)，次日将这60只小鼠随机分为六组：模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量给药组。分别按组别静脉注射给药，每天给药一次，连续给药四天。末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，将小鼠断头处死，取肝脏，用肝糖元试剂盒测小鼠肝糖元含量。
2.5对高血糖模型动物血清胆固醇含量的影响
2.5.1对链脲佐菌素致高血糖模型小鼠血清胆固醇的含量影响
取健康小鼠72只，随机取12只作为空白对照组，其余小鼠均静脉注射链脲佐菌素200mg/kg(10ml/kg)，次日将这60只小鼠随机分为六组：模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量给药组。分组后按组别静脉注射给药，每天给药一次，连续给药四天。末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，将小鼠断头处死，取血，分离血清，以总胆固醇试剂盒测血清胆固醇含量。
2.5.2四氧嘧啶致高血糖模型小鼠血清胆固醇含量的影响
取健康小鼠72只，随机取12只作为空白对照组，其余小鼠均静脉注射四氧嘧啶80mg/kg(10ml/kg)，次日将这60只小鼠随机分为六组：模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量给药组。分组后按组别静脉注射给药，每天给药一次，连续给药四天。末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，将小鼠断头处死，取血，分离血清，以总胆固醇试剂盒测血清胆固醇含量。
3试验结果
丙二酰人参皂苷以120、60、30mg/kg剂量给药，可明显降低小鼠正常血糖；对葡萄糖所致小鼠血糖升高有明显降低作用；可明显抑制肾上腺素引起的小鼠血糖升高；对四氧嘧啶糖尿病小鼠高血糖有明显降低作用，对链脲佐菌素所致雄性小鼠血糖升高亦有明显降低作用；有使实验性糖尿病小鼠肝糖元升高的趋势；对四氧嘧啶、链脲佐菌素致高血糖动物血清胆固醇有明显升高作用；剂量实验说明其对糖尿病可能既有预防又有治疗作用。
3.1对正常动物血糖的影响
由表3.1结果可知，阳性药胰岛素注射液、丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量均能明显降低正常小鼠血糖含量，具有明显的量效关系，说明胰岛素注射液、丙二酰人参皂苷对正常动物有降糖作用。
表3.1 丙二酰基人参皂苷对正常小鼠血糖的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 血糖含量(mmol/L) |
| 空白对照组胰岛素注射液 114.29u/kg丙二酰人参皂苷 120.00mg/kg60.00mg/kg30.00mg/kg | 1212121212 | 4.52±1.400.11±0.37△△△1.28±0.52△△△1.71±0.94△△△3.07±1.12△ |
与模型对照组比***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05
与空白对照组比△△△p＜0.001，△△p＜0.01，△p＜0.05(以下各表均同)
3.2对高血糖动物模型的影响
3.2.1对链脲佐菌素致高血糖动物模型的影响
由表3.2.1结果可知，同空白对照组比，链脲佐菌素模型组小鼠血糖明显升高，而阳性药胰岛素注射液及试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量均能明显降低小鼠血糖含量，说明胰岛素注射液、丙二酰人参皂苷对链脲佐菌素致高血糖模型动物有降糖作用。
表3.2.1 丙二酰基人参皂苷对链脲佐菌素致小鼠血糖升高的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 血糖含量(mmol/L) |
| 空白对照组模型组胰岛素注射液 114.29u/kg丙二酰人参皂苷 120.00mg/kg60.00mg/kg | 1212121212 | 3.12±0.9319.18±5.95△△△1.68±1.36***4.26±2.85***8.05±7.95*** |
| 30.00mg/kg | 12 | 8.85±6.89*** |
3.2.2对四氧嘧啶致高血糖动物模型的影响
由表3.2.2结果可知，同空白对照组比，注射四氧嘧啶小鼠血糖明显升高，而阳性药胰岛素注射液及试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量均能明显降低小鼠血糖含量，说明胰岛素注射液、丙二酰人参皂苷对四氧嘧啶致高血糖模型动物有降糖作用。
表3.2.2 丙二酰基人参皂苷对四氧嘧啶致小鼠血糖升高的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 血糖含量(mmol/L) |
| 空白对照组模型组胰岛素注射液 114.29u/kg丙二酰人参皂苷 120.00mg/kg60.00mg/kg30.00mg/kg | 121212121212 | 2.75±1.088.30±2.60△△△0.36±0.40***2.61±2.36***4.27±2.16***4.05±2.69*** |
3.2.3对肾上腺素致高血糖动物模型的影响
由表3.2.3结果可知，同空白对照组比，注射肾上腺素液组小鼠血糖明显升高，而阳性药胰岛素注射液及试药丙二酰人参皂苷120mg/kg剂量组均能明显降低小鼠血糖含量，具有量效关系，说明胰岛素注射液、丙二酰人参皂苷对肾上腺素致高血糖模型动物有降糖作用。
表3.2.3 丙二酰人参皂苷对肾上腺素致小鼠血糖升高的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 血糖含量(mmol/L) |
| 空白对照组模型组胰岛素注射液 114.29u/kg丙二酰人参皂苷 120.00mg/kg | 12121212 | 2.05±1.926.06±2.06△△△0.05±0.08***0.48±1.02*** |
| 60.00mg/kg30.00mg/kg | 1212 | 4.47±2.627.88±3.33 |
3.2.4对外源性葡萄糖升高血糖动物模型的影响
由表3.2.4结果可知，同空白对照组比，外源性注射葡萄糖可使小鼠血糖明显升高，而阳性药胰岛素注射液及试药丙二酰人参皂苷120、60mg/kg二个剂量给药组均能明显降低小鼠血糖含量，且试药组降糖作用随给药剂量增加，作用增强，说明胰岛素注射液、丙二酰人参皂苷对外源性葡萄糖致高血糖模型动物有降糖作用。
表3.2.4 丙二酰人参皂苷对外源性葡萄糖小鼠血糖升高的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 血糖含量(mmol/L) |
| 空白对照组模型组胰岛素注射液 114.29u/kg丙二酰人参皂苷 120.00mg/kg60.00mg/kg30.00mg/kg | 121212121212 | 3.97±1.0114.61±6.26△△△3.13±6.27***5.17±3.74***5.68±2.73***10.32±4.12 |
3.2.5M-NR4对肾上腺素致高血糖动物模型的影响
由表3.2.5结果可知，同空白对照组比，注射肾上腺素液组小鼠血糖明显升高，而阳性药胰岛素注射液及试药M-NR4120mg/kg剂量组均能明显降低小鼠血糖含量，具有量效关系，说明胰岛素注射液、M-NR4对肾上腺素致高血糖模型动物有降糖作用。
表3.2.3 丙二酰人参皂苷对肾上腺素致小鼠血糖升高的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 血糖含量(mmol/L) |
| 空白对照组模型组 | 1212 | 2.05±1.926.06±2.06△△△ |
| 胰岛素注射液 114.29u/kgM-NR4 30.00mg/kg20.00mg/kg10.00mg/kg | 12121212 | 0.05±0.08***1.68±2.21***5.56±2.778.14±2.82 |
3.3丙二酸单酰基人参皂苷不同分解产物对高血糖模型动物的影响
由表3.3结果可知，同空白对照组比，肾上腺素注射液模型组小鼠血糖明显升高，而阳性药胰岛素注射液及试药丙二酰人参皂苷120、60mg/kg二个剂量均能明显降低小鼠血糖含量，其余各药对肾上腺素引起的小鼠血糖升高无明显影响，给药组与模型组比血糖含量无明显差异，说明胰岛素注射液、丙二酰人参皂苷对肾上腺素致高血糖模型动物有降糖作用，二醇组皂苷、丙二酸、二醇组皂苷与丙二酸的混合物均无此作用。
表3.3 丙二酰人参皂苷不同分解产物对盐酸肾上腺素
致小鼠血糖升高的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 血糖含量(mmol/L) |
| 空白对照组模型组胰岛素注射液 114.29u/kg丙二酰人参皂苷 120.00mg/kg60.00mg/kg二醇组皂苷 110.94mg/kg55.47mg/kg丙二酸 4.57mg/kg2.28mg/kg二醇组皂苷+丙二酸 110.94+4.57mg/kg | 10101010101010101010 | 3.85±1.1510.00±2.12△△△2.15±1.44***3.60±1.48***4.91±2.07***10.67±2.568.14±2.818.23±2.3910.45±3.6614.08±3.05 |
| 55.47+2.28mg/kg | 10 | 14.77±2.43 |
3.4对高血糖模型动物肝糖元的影响
3.4.1对链脲佐菌素糖尿病小鼠肝糖元的影响
由表3.4.1结果可见，试药丙二酰人参皂苷对链脲佐菌素致高血糖模型动物肝糖元含量有增加的趋势。
表3.4.1 丙二酰人参皂苷对链脲佐菌素致高血糖小鼠肝糖元含量的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 糖元含量(mg/g组织) |
| 空白对照组模型组胰岛素注射液 114.29u/kg丙二酰人参皂苷 120.00mg/kg60.00mg/kg30.00mg/kg | 121212121212 | 2.48±1.643.24±4.581.95±1.747.12±7.804.05±4.193.91±3.99 |
3.4.2对四氧嘧啶糖尿病小鼠肝糖元的影响
由表3.4.2结果可见，注射四氧嘧啶后，小鼠肝糖元含量无明显变化各给药组与模型组间无明显差异。
表3.4.2 丙二酰人参皂苷对四氧嘧啶致高血糖小鼠肝糖元含量的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 糖元含量(mg/g组织) |
| 空白对照组模型组胰岛素注射液 114.29u/kg丙二酰人参皂苷 120.00mg/kg60.00mg/kg30.00mg/kg | 121212121212 | 2.48±1.642.03±3.571.95±1.443.23±1.843.80±2.402.09±1.24 |
3.5对高血糖模型动物血清胆固醇含量的影响
3.5.1对链脲佐菌素致高血糖模型小鼠血清胆固醇的含量影响
由表3.5.1结果可见，模型组小鼠注射链脲佐菌素后，与空白对照组比，血清胆固醇含量明显降低，给予胰岛素和试药丙二酰人参皂苷后，血清胆固醇含量增加，与模型组比有明显差异，与空白组动物胆固醇含量相似。
表3.5.1 丙二酰人参皂苷对链脲佐菌素致高血糖小鼠血清胆固醇含量的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 总胆固醇含量(mmol/L) |
| 空白对照组模型组胰岛素注射液 114.29u/kg丙二酰人参皂苷 120.00mg/kg60.00mg/kg30.00mg/kg | 121212121212 | 4.28±1.122.60±1.01△△△4.05±1.23**3.73±1.33*3.36±1.062.99±1.06 |
3.5.2四氧嘧啶致高血糖模型小鼠血清胆固醇含量的影响
由表3.5.2结果可见，模型组小鼠注射四氧嘧啶后，与空白对照组比，血清胆固醇含量有降低的趋势，给予胰岛素和试药丙二酰人参皂苷后，血清胆固醇含量明显增加。
表3.5.2 丙二酰人参皂苷对四氧嘧啶致高血糖小鼠血清胆固醇含量的影响(
x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 总胆固醇含量(mmol/L) |
| 空白对照组模型组胰岛素注射液 114.29u/kg丙二酰人参皂苷 120.00mg/kg60.00mg/kg30.00mg/kg | 121212121212 | 2.73±0.702.20±0.612.60±0.833.02±0.78*3.17±0.68**3.05±0.97* |
4对肾上腺素致高血糖动物模型的影响
取健康小鼠72只，随机分为六组：空白对照组，模型对照组，阳性药胰岛素注射液114.29u/kg给药组，试药丙二酰人参皂苷120、60、30mg/kg三个剂量给药组。每天静脉注射给药一次，连续给药三天，末次给药前将小鼠饥饿16小时，末次给药后15分钟，除空白对照组外，其余各组动物均腹腔注射肾上腺素注射液100μg/kg(10ml/kg)，30分钟后将小鼠断头处死，取血，分离血清，用血糖试剂盒测血糖含量。
4结论与讨论
目前随着生活水平的提高，饮食结构的改变，糖尿病的发病率有逐年增高的趋势。高血糖是糖尿病的最基本的病理特征，也是引起糖尿病一些慢性并发症的重要原因，如何逆转糖尿病的高血糖状态一直是国内外学者研究的重点。由于口服降糖药的副作用及长期注射胰岛引起的胰岛素依赖性和苏木杰效应，使得人们迫切需要在中药中寻找合适的降糖药物。因此中药对于糖尿病的治疗近年来引起了广大医务工作者的高度重视。
本实验通过对鲜人参中丙二酰人参皂苷的降糖作用观察结果显示，丙二酰人参皂苷能降低正常小鼠血糖，且具有明显的量效关系，表明丙二酰人参皂苷可能具有促进糖代谢的作用。
链脲佐菌素为一种广谱抗菌素，具有抗菌、抗肿瘤和致糖尿病的作用，对实验动物的胰岛β细胞具有高度选择性毒性作用，引起胰岛细胞损伤。四氧嘧啶是一种特异性β细胞毒剂，可选择性地破坏胰岛-β细胞，引起细胞坏死，而致糖尿病。丙二酰人参皂苷能明显降低链脲佐菌素、四氧嘧啶引起的小鼠高血糖，这表明丙二酰人参皂苷可能具有减弱链脲佐菌素、四氧嘧啶对胰岛β细胞的损伤或改善受损β细胞的功能。
肾上腺素能促进体内糖元分解及糖酵解，抑制胰岛素分泌；静脉注射葡萄糖则属于直接外源性增加体内糖含量，这些都是对胰腺β细胞无直接毒害作用，而是对抗胰岛素作用而引起糖尿病。实验结果显示，丙二酰人参皂苷不仅能对抗链脲佐菌素、四氧嘧啶破坏胰岛β细胞引起的高血糖，而且对不损伤胰岛β细胞，只是对抗胰岛素作用引起的高血糖也有降糖作用，说明其对血糖的影响是非特异性的。
在试验中根据不同的动物模型采用了预防和治疗两种不同的给药方式，结果表明，均有降糖作用，故提示其对糖尿病可能既有预防又有治疗作用。丙二酰人参皂苷对链脲佐菌素、四氧嘧啶高血糖动物有促进肝糖元合成的趋势，说明丙二酰人参皂苷其降糖作用机制可能与促进糖原的合成与贮存，抑制糖原的分解和异生有关。
从试验结果可见，丙二酰人参皂苷可明显增加链脲佐菌素与四氧嘧啶动物血中胆固醇含量，与胰岛素作用相似，这可能与其促进脂肪合成，抑制其分解有关。至于其与胰岛素具有促进葡萄糖进入细胞内合成甘油三酯而储存，或抑制脂肪酶活性、减少脂肪分解是否完全一致；还是与其结构中含有丙二酰基，这个脂肪分解过程中重要的酶——胞浆脂酰CoA合成酶的部分结构相似有何关系，都需进行深入研究。
通过丙二酰人参皂苷不同分解产物对肾上腺素致高血糖动物血糖含量的研究，可见，丙二酰人参皂苷具有明显的降糖作用，而相关剂量的二醇组皂苷、丙二酸、二醇组皂苷与丙二酸的混合物则没有此作用，说明二醇组皂苷及丙二酸不具有降糖作用，同时也说明丙二酰人参皂苷降糖作用的机制比较复杂，而不是其分解产物的简单组合。从M-NR4对肾上腺素致高血糖动物模型的影响可见M-NR4作为丙二酰人参皂苷中的一种化合物也具有明显的降糖作用。本实验为丙二酰人参皂苷临床用于治疗糖尿病提供了初步的药理学依据，关于其对糖耐量、糖代谢、脂代谢的影响及其降糖作用的机制、对胰岛素的敏感性等等还有待于深入研究。
附图说明
图1为本发明丙二酸单酰基人参皂苷制备流程图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
以1kg鲜人参(须根、支根、根茎、主根等)为原料，切碎，用15kg的80％的乙醇在室温下冷浸提取3次，每次8-16小时，提取过程要充分搅拌，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，用正丁醇∶水反复萃取，水层溶液浓缩后上大孔树脂柱，用水、30％、60％乙醇洗脱，得到60％乙醇部分为丙二酰基总皂苷，回收乙醇得到的水溶液冻干后保存备用，再开发制剂.每步实验过程越短越好，得到的样品要低温保存。
实施例2
以西洋参(须根、支根、根茎、主根等)为原料，切碎，用20％的乙醇在室温下冷浸提取6次，每次16小时，提取过程要充分搅拌，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，用正丁醇∶水反复萃取，水层溶液冻干后低温保存备用。取出冻干样品再上大孔树脂柱，用水、30％、60％乙醇洗脱，得到60％乙醇部分为丙二酰基总皂苷，回收乙醇得到的水溶液冻干，再开发制剂.每步实验过程越短越好，得到的样品要低温保存。
实施例3
取实施例1或2制备的60％乙醇相(丙二酸单酰基总皂苷)10g，干法上样，用硅胶干柱减压分离(硅胶G 2Kg青岛海洋化工厂生产)，用洗脱液(CHCl3-MeOH-H2O 65∶35∶10下层)洗至柱底，然后分割切断，用硅胶薄层检查，合并含有M-NR4组份。
将M-NR4组份再上硅胶干柱(600g、300～400目、4.5×60cm)，用氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)洗脱，分断切割后用硅胶薄层检查，将M-NR4上H+型阳离子交换树脂柱，继续用乙醇洗脱，洗脱液在40℃条件下减压浓缩，浓缩液经乙醇反复重结晶，得化合物即丙二酸单酰基三七皂苷-R4。
实施例4
取实施例3中60％乙醇相(丙二酸单酰基总皂苷)20g，干法上样，用硅胶干柱减压分离(硅胶G 2Kg青岛海洋化工厂生产)，用洗脱液(CHCl3-MeOH-H2O 65∶35∶10下层)洗至柱底，然后分割切断，用硅胶薄层检查，合并含有M-NR4组份。
将M-NR4组份再上硅胶干柱(600g、300～400目、4.5×60cm)，用氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)洗脱，分断切割后用硅胶薄层检查，将M-NR4上H+型阳离子交换树脂柱，继续用乙醇洗脱，洗脱液在40℃条件下减压浓缩，浓缩液经乙醇反复重结晶，得化合物即丙二酸单酰基三七皂苷-R4。
实施例5
取实施例3中60％乙醇相(丙二酸单酰基总皂苷)30g，干法上样，用硅胶干柱减压分离(硅胶G 2Kg青岛海洋化工厂生产)，用洗脱液(CHCl3-MeOH-H2O 65∶35∶10下层)洗至柱底，然后分割切断，用硅胶薄层检查，合并含有M-NR4组份。
将M-NR4组份再上硅胶干柱(600g、300～400目、4.5×60cm)，用氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)洗脱，分断切割后用硅胶薄层检查，将M-NR4上H+型阳离子交换树脂柱，继续用乙醇洗脱，洗脱液在40℃条件下减压浓缩，浓缩液经乙醇反复重结晶，得化合物即丙二酸单酰基三七皂苷-R4。
实施例6
取方案1或方案2制备的丙二酰基总皂苷1kg，加入赋形剂药用环糊精1kg，混合均匀，造粒，制得片剂，每片含丙二酰基总皂苷100mg.
实施例7
取方案1或方案2制备的丙二酰基总皂苷1kg，加入赋形剂药用环糊精1kg，混合均匀，造粒，装入胶囊，每粒含丙二酰基总皂苷100mg.
实施例8
取方案1或方案2制备的丙二酰基总皂苷1kg，加入药用丙二醇2L，注射用水8L，溶解，膜过滤；膜过滤(0.2μm)，分装，每瓶2mL，含丙二酰基总皂苷200mg.所有操作均应在无菌条件下进行。
实施例9
取方案3、方案4或方案5制备的丙二酸单酰基三七皂苷-R45g，加入赋形剂药用环糊精40g，混合均匀，造粒，制得片剂，每片含丙二酸单酰基三七皂苷-R4 10mg.
实施例10
取方案3、方案4或方案5制备的丙二酸单酰基三七皂苷-R45g，加入赋形剂药用环糊精40g，混合均匀，造粒，装入胶囊，每粒含丙二酸单酰基三七皂苷-R4 10mg.
实施例11
取方案3、方案4或方案5制备的丙二酸单酰基三七皂苷-R45g，加入药用丙二醇100mL，注射用水400mL，溶解，膜过滤；膜过滤(0.2μm)，分装，每瓶2mL，含丙二酰基总皂苷20mg.所有操作均应在无菌条件下进行。
Claims (5)
1、一种丙二酰基人参皂苷的制备方法，包括以下步骤：
将1kg鲜人参粉碎后用10-20kg的20-98％的乙醇在室温下冷浸提取2-6次，每次8-16小时，提取过程要充分搅拌，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，用正丁醇：水反复萃取，水层溶液浓缩后上大孔树脂柱，用水、30％、60％乙醇洗脱，60％乙醇部分回收乙醇得到的水溶液冻干后保存备用，60％乙醇部分为丙二酰基总皂苷，回收乙醇得丙二酰基人参皂苷；丙二酰基人参皂苷包括丙二酸单酰基人参皂苷-Rb1、丙二酸单酰基人参皂苷-Rb2、丙二酸单酰基人参皂苷-Rc、丙二酸单酰基人参皂苷-Rd和丙二酸单酰基三七皂苷-R4。
2、丙二酰基人参皂苷在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
3、丙二酸单酰基三七皂苷-R4，具有以下结构：
分子式：C82H102O30
分子量：1326
为3-O-[6-O-丙二酰基-β-D-葡萄吡喃糖(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖]-20-O-[β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖]-20(S)-原人参二醇。
4、丙二酸单酰基三七皂苷-R4的制备工艺为：包括以下步骤：
将1kg鲜人参粉碎后用10-20kg的20-98％的乙醇在室温下冷浸提取2-6次，每次8-16小时，提取过程要充分搅拌，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，用正丁醇：水反复萃取，水层溶液浓缩后上大孔树脂柱，用水、30％、60％乙醇洗脱，60％乙醇部分回收乙醇得到的水溶液冻干后保存备用，60％乙醇部分为丙二酰基总皂苷，回收乙醇得丙二酰基人参皂苷；丙二酰基人参皂苷包括丙二酸单酰基人参皂苷-Rb1、丙二酸单酰基人参皂苷-Rb2、丙二酸单酰基人参皂苷-Rc、丙二酸单酰基人参皂苷-Rd和丙二酸单酰基三七皂苷-R4；
取上述60％乙醇相10-30g，干法上样，用硅胶干柱减压分离，用洗脱液：CHCl3-MeOH-H2O 65∶35∶10下层，洗至柱底，然后分割切断，用硅胶薄层检查，合并含有丙二酸单酰基三七皂苷-R4组份；
将丙二酸单酰基三七皂苷-R4组份再上硅胶干柱，用氯仿-甲醇-水为6∶4∶1洗脱，分断切割后用硅胶薄层检查，将丙二酸单酰基三七皂苷-R4上H+型阳离子交换树脂柱，继续用乙醇洗脱，洗脱液在40℃条件下减压浓缩，浓缩液经乙醇反复重结晶，得化合物即丙二酸单酰基三七皂苷-R4。
5、丙二酸单酰基三七皂苷-R4在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
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