CN1290305A - 浆果赤霉素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种浆果赤霉素和/或浆果赤霉素衍生物的制备方法,其中,10－脱乙酰浆果赤霉素或10－脱乙酰浆果赤霉素衍生物在有一种分离酶和乙酰基供体存在下发生反应,所用的酶是用SDS－PAGE测定分子量为70－72kD的乙酰转移酶,该乙酰转移酶可以从红豆杉的细胞培养物得到。

Description

浆果赤霉素的制备方法
本发明涉及通过选择性地将相应的10-脱乙酰化合物乙酰化而制备浆果赤霉素或浆果赤霉素衍生物的方法、催化该乙酰化反应的分离酶和制备该酶的方法。
紫杉醇是一种有前途的癌症治疗剂，它具有抗白血病活性和肿瘤抑制活性(参见，例如：M．Suffnes等，“生物碱，化学和药理学”，A．Brossi编辑，Academic Press出版，Orlando，FL，1985年，第ⅩⅩⅤ卷，第1章)。最初，紫杉醇是从某些紫杉树(Taxus taxaceae)的树皮中得到的。但是，从树皮中分离紫杉醇困难而昂贵，并且所需紫杉醇只能以非常低的产率(40-165mg／kg)从树皮中得到(参见，例如：R．W．Miller等，《有机化学杂志》46(1981)1469-1474；V．Senilh等，《J．Nat．Procl．》47(1984)131-137；N．Magri等，《有机化学杂志》51(1986)797-802)。另外，使用树皮会导致生长恢复非常缓慢的紫杉树死亡，因此起始原料的供给非常有限。
自从发现了紫杉醇的性能，表明它可用作癌症化疗剂之后，人们已作出了无数努力，试图通过合成或半合成方法来制备该化合物。因此，曾经尝试通过有机合成制备紫杉醇结构(参见，例如：W．F．Berkowitz等，《有机化学杂志》52(1987)1119-1124)。然而，由于紫杉醇分子非常复杂，至今还不可能通过全有机合成以事实上有用的量制得紫杉醇。
用于得到紫杉醇的另一种途径是从可容易地大量获得的前体开始进行部分合成。这些途径之一是从10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ开始合成，所述10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ可以容易地从欧紫杉L(Taxus baccata L)的树叶中大量提取获得(G．Chauviere等，Seances Acad．Sci．，Ser．2，1981年，293，501-503)。此时，有可能从每公斤树叶分离得到大约1g 10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ，并且这些树叶会迅速恢复生长。因此，有可能毫无任何问题地得到大量前体-10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ。
所需的活性化合物紫杉醇可以用这种从生物学原料获得的前体通过部分合成制备。但是，现已发现，尽管10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ和紫杉醇的结构可能类似，这种部分合成仍存在严重的问题，大部分合成只有通过使用特定的保护基才可能成功地进行，并且只能以较低的产率得到所需产物紫杉醇。
Denis等(《美国化学会杂志》110(1988)，5917-5919)描述了从10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ以两个步骤合成得到紫杉醇。在第一步中，将10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ的10位化学乙酰化。第二步，将浆果赤霉素转化为紫杉醇。然而，第一步不是区域特异的，10-脱乙酰浆果赤霉素的其他部位也发生乙酰化，特别是在7位。鉴于此，必需通过使用保护基封闭该位置上的羟基发生乙酰化。只有使用保护基才能仅在10位发生乙酰化。但是，使用保护基需要多出两步加工步骤(引入和去除保护基)，一方面，这么做是昂贵的，另一方面，这大大降低了所得产物的收率。使用保护基的另一个缺点在于随后必须进行复杂的纯化和分析操作以确保该产物中不再存有仍携带保护基的分子，特别是当该产物用作治疗活性化合物时更是如此。
Zocher等(《生物化学与生物物理学研究通讯》229(1996)，16-20)描述了紫杉醇的生物合成。此时，在一个中间步骤中，借助于欧紫杉树根的植物粗提物将10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ乙酰化得到浆果赤霉素Ⅲ。然而，不可能分离或描述影响该乙酰化作用的物质的特征。使用粗提物的缺点是，该粗提物中存在的物质也可能引发或影响其他大量反应，特别是在其他部位的乙酰化反应。另外，植物粗提物没有明确和可再现的组成，因此使用粗提物会导致无法控制且多变的反应和产率。
因此本发明的一个目的是提供一种制备浆果赤霉素和浆果赤霉素样浆果赤霉素衍生物的方法，是通过将相应的10-脱乙酰化合物的10位选择性乙酰化而实现的。本发明的另一个目的是提供一种特异性催化该反应的分离物质。
按照本发明，这些目的是利用制备浆果赤霉素或浆果赤霉素衍生物的方法实现的，该方法的特征在于：10-脱乙酰浆果赤霉素或10-脱乙酰浆果赤霉素衍生物在有分离酶和乙酰基供体的存在下发生反应，所用的酶是用SDS-PAGE测定分子量为70-72kD的乙酰转移酶，该乙酰转移酶可以从红豆杉(Taxus chinensis)的细胞培养物得到。我们已发现，可从悬浮的红豆杉细胞培养物获得的分离酶可催化10位上的区域选择性乙酰化反应。现已令人惊奇地发现，使用该分离和纯化的酶，有可能使10位上的乙酰化反应达到高区域特异性。该特异性优选大于80％，更优选大于90％，首选大于95％。现已发现，利用根据本发明所使用的酶有可能使特异性达到99％以上。在这里，特异性大于80％意味着在10位发生的乙酰化反应已达到80％以上，而在该起始物的其他位置上发生的乙酰化反应占20％以下。所以，该起始物中存在的其他羟基不必非用保护基封闭不可，因为当使用本发明的酶时，这些其他羟基仅发生非常有限的乙酰化反应(如果有的话)。
现已令人惊奇地发现，按照本发明所用的酶具有高底物特异性。因此，只有在C10位或其附近具有类似10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ构型的10-脱乙酰浆果赤霉素或10-脱乙酰浆果赤霉素衍生物发生转化。特别是，因庞大的取代基导致10位不能靠近的浆果赤霉素衍生物，诸如象10-脱乙酰紫杉醇和10-脱乙酰头孢马啉(10-deacetylcephalomannin)，不发生乙酰化。因此，浆果赤霉素衍生物被本发明的酶识别为底物的前提是，具有紫杉烷(taxane)环结构的这些衍生物在7、8、9、10、11、12和13位基本上与10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ一致，即，它们在这些位置上没有携带任何其他取代基，或者仅带有小体积的取代基。该方法优选适用于与10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ的7至13位带有相同取代基的浆果赤霉素衍生物，或者带有至少一些比10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ的取代基体积小的取代基、尤其是氢的浆果赤霉素衍生物。其他位置上的庞大取代基不会妨碍该反应。该方法特别优选用于将10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ乙酰化。另外，该方法特别优选用于将14-羟基-10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ的10位选择性乙酰化。
与此相比，7位上的羟基被庞大的保护基(诸如象7-TES-10-DAB Ⅲ或7-BOC-10-DAB Ⅲ)封闭的10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ衍生物不会被本发明的酶识别为底物。不过，这种封闭是不需要的，因为即使在其他位置上存在其他羟基，也会发生10位的区域选择性乙酰化。
利用本发明的方法可以将紫杉烷衍生物的10位选择性乙酰化，所述紫杉烷衍生物的7至13位具有与10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ相同、更少或更小的庞大取代基。其中有存在于10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ中的取代基(即，7位上的OH，8位上的CH3，9位上的=O，10位上的OH，12位上的CH3和13位上的OH)存在或者被更小或具有相同体积的基团代替的这类紫杉烷衍生物，也包括在本文所用的术语“10-脱乙酰浆果赤霉素衍生物”的范围内，并且如果它们的10位上有羟基的话，同样可被区域特异地乙酰化。这类衍生物的实例是10-脱乙酰云南红豆杉素(taxuyunnanin)C，10，14-脱乙酰云南红豆杉素C，2，10，14-脱乙酰云南红豆杉素C，5，10，14-脱乙酰云南红豆杉素C和2，5，10，14-脱乙酰云南红豆杉素C。
本发明的方法是在乙酰基供体的存在下进行的。合适的乙酰基供体原则上是能在10-脱乙酰起始物的催化转化中提供乙酰基的任何物质。该反应优选在乙酰基供体乙酰辅酶A的存在下进行。
从技术的观点出发，按照本发明使用分离酶有许多优点，特别是在转化率和再现性方面，如果使用分离酶就可容易地控制该反应。
所用的酶优选等电点为pH5．4-5．8，更好是5．5-5．7，最好是pH5．6。另外已发现，按照本发明所用的酶对乙酰辅酶A的米氏常数KM为55-65μm，优选为59-63μM，首选为61μM。
本发明还提供了一种分离酶，其特征在于：a)它在乙酰基供体特别是乙酰辅酶A的存在下，选择性乙酰化10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ的10位，b)用SDS-PAGE测定的分子量为70-72kD，和c)可以从红豆杉细胞培养物获得。
本发明的酶优选以大于50％的纯度存在，特别是大于80％，更优选大于90％，首选大于95％。本发明的酶的区别特征在于它在乙酰基供体特别是乙酰辅酶A的存在下，选择性乙酰化10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ的10位。这意味着事实上不会观察到10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ的1、7和13位上的其他羟基发生乙酰化。特别地，该乙酰化反应对10位的选择性大于50％，优选大于80％，更优选大于90％，首选大于95％。
该分离酶的另一个特征是用SDS-PAGE测定的分子量为70-72kD。为了测定分子量，0．3μg均质蛋白质用变性的10％强度SDS凝胶进行色谱分析，用已知分子量的标志蛋白质(Rainbow Marker)平行对照。用银染色法显示蛋白质，并通过比较校准蛋白质和本发明的酶的Rf值来确定分子量。利用SDS凝胶电泳确定的分子量再使用合适的凝胶过滤柱利用凝胶过滤加以证实。凝胶过滤使用biosilect-SEC 250-5柱(Biorad)在FPLC设备(Biologic Workstation，Biorad)中进行，该柱已用50mMTris，pH8．5，20mM 2-巯基乙醇平衡，流速为0．2ml／分钟。开始时该柱先用已知分子量的蛋白质进行校准。然后在相同的条件下，让50μg本发明的蛋白质通过该分析柱。收集洗脱液的250μl级分，并如下所述测定洗脱液的活性。将洗脱时间与已知标准物进行比较，从而确定分子量。
本发明的酶可以从红豆杉的细胞培养物中分离。其等电点为pH5．4-5．8，优选为5．5-5．7，特别是pH5．6。另外，所用酶对乙酰辅酶A的米-曼常数KM为55-65μM，优选为59-63μM，特别是61μM。
本发明的酶是一种乙酰转移酶，特别是乙酰辅酶A10-羟基紫杉烷-O-乙酰转移酶。
本发明还提供了上述酶的制备方法，其特征在于：使用已知纯化方法从含有酶的来源分离得到酶，每次纯化后，其中存在酶的级分通过加入10-脱乙酰浆果赤霉素或10-脱乙酰浆果赤霉素衍生物和乙酰基供体进行测定，并检测所形成的乙酰化产物。
例如，所用的含有酶的来源可以是植物提取物。所用的含有酶的来源优选细胞培养物，特别是悬浮细胞培养物。使用细胞培养物的优点在于能得到大量起始物。与使用粗提物作为含有酶的来源相比，当使用细胞培养物时，因为有大量的起始物，所以可以将该酶纯化到较高的纯度。特别优选使用来源于红豆杉的起始物，例如红豆杉细胞培养物。
为了从起始物纯化酶，可以采用用于分离酶或蛋白质的已知提纯方法。优选使用的方法包括从粗提物开始进行硫酸铵沉淀，还包括色谱提纯方法，诸如象使用交联葡聚糖Sephadex G-25柱，阴离子交换色谱，例如通过DEAE-Sephacel柱，凝胶过滤法，例如通过Ultrogel AcA 44，阴离子交换色谱，例如通过HighQ柱，通过羟基磷灰石柱的色谱法，染料亲和色谱，例如通过High Trap Blue，疏水作用色谱，例如通过苯基琼脂糖，和／或染料亲和色谱，例如通过Mimetic Green 1A6XL。纯化中优选包括有至少一个步骤使用通过HighQ的阴离子交换色谱。HighQ色谱柱是一种带有-N+(CH3)3基团作为配体的阴离子交换剂。现已发现，特别是在此纯化步骤中，可除去催化10位以外的其他位置发生乙酰化的物质。
在本发明的方法中，在每个提纯步骤后都要测定级分的酶活性，以确定含有酶的级分。为此，将该级分或该级分的等分试样与10-脱乙酰浆果赤霉素或上文所定义的10-脱乙酰浆果赤霉素衍生物以及乙酰基供体混合。在存在所需酶的级分中，可以检测到10位发生乙酰化的产物。该测试中优选使用10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ或10-脱乙酰云南红豆杉素C。所形成的乙酰化产物可以通过使用起始物中的适宜标志基团来检测。优选使用标记的乙酰基供体。这类标记的乙酰基供体包含之后可用于测定已在10位乙酰化的产物的标记乙酰基。优选使用放射性标记的乙酰基供体。此时，合适的放射性标记基团是13C和14C。所用的乙酰基供体特别优选乙酰辅酶A，尤其是[2-14C]-乙酰辅酶A。
也可以使用重同位素标记来进行检测。在这种情况下，反应产物可以用质谱测定。
采用本发明的酶、利用本发明的方法来制备浆果赤霉素或浆果赤霉素衍生物，可以制得已在10位特异性乙酰化的浆果赤霉素或紫杉烷化合物。这类化合物非常有价值，特别是可作为用于紫杉醇部分合成的起始物。因此，本发明还提供了一种制备紫杉醇和／或紫杉醇衍生物的方法，该方法的特征在于：将利用上述方法制备的浆果赤霉素或浆果赤霉素衍生物通过已知方法反应得到紫杉醇或紫杉醇衍生物。现有技术中已记载了将浆果赤霉素或浆果赤霉素衍生物部分转化得到紫杉醇或紫杉醇衍生物的方法，该方法实质上需要在浆果赤霉素衍生物13位上的羟基上引入适宜的取代基。所以，适用于此目的的浆果赤霉素衍生物至少在13位带有游离羟基。
从浆果赤霉素衍生物得到紫杉醇或紫杉醇衍生物的反应尤其是在用适宜的酸将该浆果赤霉素衍生物13位上的羟基酯化的情况下进行的。文献中详细描述了这类方法，例如在下列文献中：Colin等的美国专利第4，814，470号，Denis等的美国专利Re．34，277号，EP 0，400，971 A2，Denis等的美国专利4，924，011号，Bourzat等的美国专利第4，476，954号，以及Denis等，《美国化学会杂志》110(1988)，5917-5919。
本发明将利用下列实施例进行更详细的说明。
实施例1红豆杉细胞悬浮液的培养
所用的红豆杉悬浮培养物是来自于慕尼黑大学药物生物学学院的收集物，它们来源于红豆杉树的针状叶中。让这些培养物在24℃、100rpm和1500lux下生长14天。然后用50ml无菌移液管将150ml细胞悬浮液转移到250ml B5+1培养基中：
B5+1培养基(按照Gamborg，Miller，Ojima：《实验研究》50，1968年，151-158页所述的方法进行了改良)的组成是：
萘乙酸                            10μM
苄基氨基嘌呤                      0．2μM
                                  mg／l
NaH2PO4·H2O                   150
CaCl2·2H2O                     150
(NH4)2SO4                      134
MgSO4·7H2O                     250
KNO3                            2500
FeSO4·7H2O                     25．6
Na2EDTA·2H2O                   34．27
KJ                                 0．75
MnSO4·H2O                      10
H3BO3                           3
ZnSO4·7H2O                        3
Na2MoO4·2H2O                     0．25
CuSO4·5H2O                        0．25
CoCl2·6H2O                        0．25
烟酸                                 1
二氯硫胺(thiaminium dichloride)      10
盐酸吡哆醇                           1
内消旋肌醇                           1000
D-(+)-蔗糖                           20，000
pH5．6
NZ胺                                 1000
在高压蒸气灭菌和冷却后，在无菌条件下将NZ胺以无菌储备溶液(10g／l)形式加入培养基中。
在该培养后的第三天，加入30μM茉莉酮酸甲酯(购自Serva)，让该培养物再生长4天(Gundlach，H．，Muller，M．J．，Kutchan，T．M．，Zenk，M．H．，1992年，《美国国家科学院院报》89，2389-2393页)。然后通过真空过滤从该培养基中分离出细胞，这些细胞用液氮迅速冷冻后，用于酶浸解。不过，也可以将这些细胞在-20℃下储存长达1个月，之后，所需酶的活性会显著下降。
实施例2用于确定乙酰转移酶活性的酶试验
为了能够纯化、鉴定和检测酶，必需可获得精确而足够灵敏的试验方法。在这种情况下，检测的是所形成的产物，例如从10-脱乙酰云南红豆杉素形成的云南红豆杉素C，为此目的而开发了一种简单而可靠的方法。
用移液管将足量的要进行测试的酶溶液转移到微量离心管中的50μlTris缓冲液(0．8M，pH8．5)中。然后加入30μl纯化的乙酰辅酶A(5nmol未标记的乙酰辅酶A和0．02μCi-[2-14C]乙酰辅酶A)和15nmol用DMSO溶解的10-脱乙酰云南红豆杉素C的3mM储备溶液(对于对照组，仅加入相应量的DMSO代替该紫杉烷)。该混合物在35℃下温育30分钟，然后用20μl 12％H2SO4酸化，所形成的云南红豆杉素C用600μl叔丁基甲基醚萃取(10分钟，在塔顶摇动器中)后，将该混合物离心(在微量离心机中以14，000rpm的速度离心4分钟)。仍存在的未反应的[2-14C]乙酰辅酶A保留在水相中。将500μl有机相在空气流中蒸发至干，这同时除去了由于早期的酸化而作为酸存在的任何[2-14C]乙酸，它们在这时也都挥发了。使用闪烁计数仪(多功能闪烁计数仪LS 6500，购自Beckmann)或薄层放射扫描仪(自动TLC线性分析仪，购自Berthold)测定所形成产物的类型和量。前一种仪器用于测定转化情况，并利用计算出的cpm值确定酶活性。借助于薄层色谱(TLC)(流动相：氯仿∶乙腈7∶3)和随后的用放射扫描仪进行的评估，可以检查利用闪烁计数仪测得的放射性是否确实对应于预期产物的Rf值区域中的峰值。
实施例3乙酰转移酶的纯化3．1．经交联葡聚糖G25进行组织浸渍和脱盐
为了得到蛋白质粗提物，使用已培养了7天的悬浮培养物，其在培养后的第三天已用30μM茉莉酮酸甲酯进行了诱导。刚刚经过抽吸过滤的200g细胞利用液氮迅速冷冻。在冰冷的乳钵中，将这些细胞与20g PVPP混合，利用400ml标准缓冲液A(100mM硼酸／NaOH，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)搅拌融解。PVPP结合部分酚类，尤其是该提取物中存在的鞣剂，它们会干扰进一步的纯化过程。均质的细胞浆液通过四层薄布过滤，榨出的汁在15，000×g下离心(10分钟，SS34转子)。
将冰冷的上清液与已悬浮于标准缓冲液A(100mM硼酸／NaOH，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)中的50ml磷酸钙凝胶混合。体积量是在2500rpm下离心10分钟后得到的凝胶的量，相当于1．9g Ca3(PO4)2(干重)。让该混合物在冰浴中放置10分钟，偶尔进行搅拌。在这段时间里，异物，诸如象大量存在的鞣剂，应该被吸附到凝胶上。乙酰转移酶保留在溶液中，并通过随后的离心(6000×g，5分钟，GSA转子)而与凝胶物质分离。
随后将凝胶沉淀再次悬浮于75ml标准缓冲液A中，用玻璃棒搅拌5分钟，再在6000rpm(GSA转子)下离心5分钟，这么做是因为有一些乙酰转移酶吸附到了凝胶上，通过这种后处理，就可使它们释放到上清液中。如果不使用磷酸钙凝胶，主要的困难会在进一步的纯化过程中遇到，因为在这种情况下，仍存在的异物会迅速阻塞混合室的隔膜，将后来所用的柱子的颜色变为深棕色，它们的结合力迅速降低。
随着缓慢搅拌，将合并后的冰冷的上清液每次与少量硫酸铵混合，直到达到70％饱和，再继续缓慢搅拌30分钟。加入完成后，沉淀出的蛋白质随后可在15，000rpm下离心成团(10分钟，SS34转子)。将该沉淀仔细地再悬浮于30ml标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)中，该溶液用此缓冲液和交联葡聚糖G25柱(Pharmacia：2．7cmφ×7cm)脱盐，同时，除掉60％外源蛋白质。[G25洗脱液：82ml，78mg蛋白质]
3．2．通过DEAE Sephacel的阴离子交换色谱
DEAE Sephacel是一种改性纤维素，其上附着有带正电荷的二乙氨基乙基。如果溶解蛋白质的等电点比所用的缓冲液更呈酸性，它们将作为阴离子存在，并因此可结合到带正电荷的柱材料上。加入更强的阴离子，诸如象Cl-或SO4 2-，可降低所吸附的蛋白质和DEAE基团的静电相互作用。结果，蛋白质阴离子被无机阴离子交换，酶由此被洗脱出来。
在该纯化步骤中，除去了24．4％的外源蛋白质，特别是还除去了异物，尤其是含有酚的鞣剂。即使在首次使用过程中，柱材料的颜色也会变为深棕色，但可以使用1M NaOH将其实质净化。此步骤大大减少了在以后的纯化过程中所用的柱子的污垢。
DEAE柱(2．5cmφ×5cm)的起始流通液，包括用于洗涤柱子的30ml标准缓冲液B(50mM Tris／HCl， pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)，在混合室(Amicon，400ml，膜PM10)中通过加压过滤浓缩至5ml体积。[DEAE洗脱液：110ml，59mg蛋白质]3．3．通过Ultrogel AcA 44的凝胶过滤
凝胶过滤的原理是基于大分子，诸如象蛋白质，将根据它们的大小和形状而在具有确定孔径的基质(体积排除)和周围的液体之间分布。太大以致于不能渗透到凝胶孔中的分子通过这些颗粒，结果就比一开始被凝胶孔延迟但并未渗透到孔中的中等大小的蛋白质更快的洗脱出来。而更小的分子，尤其是盐离子，一开始就进入到凝胶孔中，它们只在某段停留时间后才离开凝胶孔，所以它们在柱中停留的时间最长。
这种技术是非常温和的，因为在材料和蛋白质之间确实没有相互作用，也不需要使用特殊缓冲液。
另外，洗脱液会被完全脱盐，因为较小的离子，在这种情况下是硫酸盐离子，在柱中的停留时间比活性蛋白质长得多。
所用的凝胶是聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶，它适于10-130kD的分级范围(Ultrogel AcA 44，购自Serva)。
浓缩蛋白质溶液用柱子(2．8cmφ×100cm)以流速20ml／小时分离过夜，该柱已用标准缓冲液B平衡。检测60个级分(各6．5ml)的蛋白质含量和乙酰转移酶活性。将显示主要活性的级分合并并进一步纯化。
使用该洗脱液可以测量乙酰转移酶的比活性。除了在低Rf值下的不同峰值以外，薄层色谱还显示了在云南红豆杉素C的Rf值高度下的峰值。[AcA洗脱液：53ml，25．7mg，总活性724pcat看作是100％]。利用该凝胶过滤，除掉了57％的外源蛋白质。
3．4．通过HighQ的阴离子交换色谱
与DEAE柱一样，带有-N+(CH3)3基团作为配体的HighQ柱也是一种阴离子交换剂，但与前者-一种强阴离子交换剂相比有所不同，即其电离状态在较宽的pH范围内都不会改变。弱交换剂的离解度和由此产生的交换容量在不同的pH值下有相当大的不同。由于HighQ柱材料由密集填塞的大小约10μm的树脂颗粒组成，因此它们具有高反压力，使得该柱必须使用FPLC设备(购自Biorad)进行操作。
将无盐的AcA洗脱液(53ml)泵入到HighQ 5ml现成柱上，该柱已用标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)平衡，流速为2ml／分钟，用相同的缓冲液洗涤该柱。无色的起始流通液已含有部分无活性的蛋白质，利用存在于标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)中的0．07M KCl除去其他外源蛋白质和黄色异物。在下一个步骤中，用存在于标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)中的0．14M KCl梯度洗脱活性蛋白质和其他黄色异物。使用存在于标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)中的1M KCl得到的洗脱液也是黄色的，并且含有加载蛋白质的1／3，但是没有乙酰转移酶活性。经过这最后一个步骤，柱同时再生。
该纯化步骤的最大优点在于，大体积的AcA洗脱液迅速而温和地浓缩至4ml(4个级分，每个1ml)。
梯度：时间(分钟)存在于标准缓冲液B中的1M KCl(％)0             035            035            745            745            1455            1455            10070            100[HighQ洗脱液：4ml，8．8mg蛋白质，796pcat]
与AcA洗脱液相比，该纯化步骤达到了富集因子为121％，并且除去了66％的外源蛋白质。3．5羟基磷灰石
所用的柱是CHT Ⅱ柱(购自Biorad)，该柱填充有球形的羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH]2颗粒。在低分子磷酸盐缓冲液的存在下，一开始，带负电荷的蛋白质可结合到Ca2+阳离子上，然后被洗脱缓冲液中的更高浓度的磷酸盐置换。
具有高pI的碱性蛋白质与具有相对低pI的蛋白质相比，其对柱材料的亲和力相对更高。在正电荷中心有Ca2+离子、在负电荷中心有PO4 3-的羟基磷灰石结构导致了混合离子交换分离。以0．5ml／分钟的流速将HighQ洗脱液泵入到CHT Ⅱ柱(5ml)上，该柱已用磷酸盐缓冲液(10mMNa2HPO4／NaH2PO4，pH6．8，，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)平衡，然后该柱用12ml此缓冲液洗涤。活性蛋白质在160mM磷酸盐缓冲液(20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)的浓度下洗脱出来。即使磷酸盐的浓度升高至400mM，也不可能再洗脱出更多的蛋白质。
梯度：时间(分钟)
                              160mM磷酸盐缓冲液(％)
    0                             0
    40                            0
    40                            100
    70                            100
检测已收集的0．5ml级分中的蛋白质和乙酰转移酶活性。
[CHT Ⅱ洗脱液：1．5ml，0．73mg蛋白质，578pcat]
与HighQ洗脱液相比，该纯化步骤达到了富集因子为8．7，同时除去了92％的外源蛋白质，导致活性损失27％。3．6．通过High Trap Blue的染料亲和色谱
HiTrapBlue 1ml(购自Pharmacia)含有偶联到琼脂糖基质上的合成多环染料Cibacron Blue F3 G-A。这些配体显示出与天然产分子诸如辅因子NAD+和NADP+有某种结构类似性，这使得它们能与蛋白质，尤其是需要含有腺苷酸的物质的酶强烈而特异地结合。因此该柱材料也称作“基团特异的”。不过，特异性受到下列事实的限制，即，迄今已编入目录中的酶有大约三分之一需要含有核苷酸成分的辅酶。另外，由于静电和／或疏水作用，蛋白质也可以非特异性地结合芳香族配体。
可以用合适的辅因子特异性洗脱，或用盐溶液非特异性洗脱。
可结合含有磷酸腺苷二磷酸的乙酰辅酶A的乙酰转移酶被吸附到蓝色柱材料上，利用线性梯度的KCl进行非特异性洗脱。出于此目的，将CHT Ⅱ洗脱液在FPLC设备(购自Biorad)中以0．5ml／分钟的流速上样到High Trap Blue柱上，该柱已用标准缓冲液B平衡，然后该柱用此缓冲液洗涤。结合到柱子上的蛋白质利用存在于标准缓冲液B(50mMTris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)中的0-1M KCl线性梯度盐以0．5ml／分钟的速率洗脱30分钟。梯度：时间(分钟)
                        存在于标准缓冲液B中的1M KCl(％)
    0                         0
    30                        0
    60                        100
级分体积为0．5ml。将含有活性的级分合并，用于进一步的纯化。
[High Trap Blue洗脱液：1．5ml，0．05mg蛋白质，168pcat]
与CHT Ⅱ柱相比，在该纯化步骤中富集因子达到4．2。除去了93％的外源蛋白质，并且总活性损失71％。3．7．在苯基琼脂糖上的疏水作用色谱
如果将某些中性盐，诸如象(NH4)2SO4或KCl，加入到溶解于含水介质的蛋白质中，该溶液的离子强度会升高。在这些条件下，蛋白质表面上的疏水区域发生缔合。它们也以相同方式被吸附到具有疏水配体的柱材料上，结果发生疏水作用(HIC=疏水作用色谱)。这些相互作用随后可通过使用具有低盐浓度的洗脱缓冲液再次降低。
为了进行这种纯化，需要将High Trap Blue洗脱液的浓度调节至0．5M硫酸铵。这可以通过非常缓慢地、少量多次地加入适宜量的冰冷的存在于标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)中的1M硫酸铵溶液达到。随后将蛋白质溶液上样到微型柱(1cmφ×1．3cm)上，该柱已用存在于标准缓冲液B中的0．5M(NH4)2SO4平衡。当蛋白质溶液已渗透到凝胶床(苯基琼脂糖，购自Pharmacia)中以后，该柱用7ml存在于标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)中的0．5M(NH4)2SO4洗涤。为了洗脱出结合蛋白质，使用存在于标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)中的0．1M(NH4)2SO4。以每级分0．5ml收集洗脱液，并测定相对蛋白质浓度和酶活性。将最具活性的级分合并，并检测活性和蛋白质含量。[苯基琼脂糖洗脱液：2．5ml，0．001mg，6．3pcat]
与HiTrapBlue洗脱液相比，富集因子计算为1．9，同时活性损失了96％，98％的外源蛋白质被除去。
3．8在Mimetic Green 1A-6 XL上的染料亲和色谱
正如已对High Trap Blue柱所讨论过的那样，在酶的辅因子结合位点与该材料的染料配体之间也有相互作用。用辅因子，照目前这个情况是乙酰辅酶A，可以仅洗脱下依赖于该辅因子的结合酶。非特异性吸附的蛋白质仍保留在柱上。
在苯基琼脂糖洗脱液可以转移到Mimetic Green柱(1cmφ×1．2cm，Affinity Chromatography Ltd．公司，Freeport，Ballasalla，Isle ofMan)上之前，它必须进行脱盐，这可使用PD10柱(购自Pharmacia)进行。为此，将2．5ml苯基琼脂糖洗脱液加入到PD10柱上，并使其渗透到柱中。利用标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)进行洗脱，将开始0．5ml洗脱液丢弃，收集接下来的2．5ml洗脱液，其中含有活性蛋白质。
将该酶溶液转移到Mimetic Green柱(1cmφ×1．2cm)上，该柱已用标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)洗涤。当溶液已渗透到凝胶床中以后，依次使用下列溶液不用泵进行洗脱：3ml标准缓冲液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巯基乙醇)，3ml存在于标准缓冲液B中的0．5mM乙酰辅酶A，2ml标准缓冲液B，3ml存在于标准缓冲液B中的1M KCl。收集各1ml的级分并检测蛋白质含量和乙酰辅酶A活性。
乙酰辅酶A洗脱液是唯一含有乙酰转移酶活性的级分。无论是开始的流通液还是KCl洗脱液都不含任何活性。
在测定乙酰辅酶A洗脱液的活性之前，必须除去该溶液中的辅因子。大量未标记的乙酰辅酶A可能会稀释少量14C标记的乙酰辅酶A，使得事实上没有放射性底物会被转换。
如上所述，使用PD10柱能将乙酰辅酶A几乎完全除去。对以这种方式获得的洗脱液进行通常的活性测试。不过，由于PD10洗脱液仍含有极少量来自洗脱缓冲液的乙酰辅酶A，即未达到完全去除，因此在活性测试中14C标记的辅酶A被稀释，使其活性和纯化因子值非常低。[Green洗脱液：2．5ml，0．0001mg蛋白质，0．7pcat]
在该纯化步骤中，剩余的外源蛋白质被除去，纯化因子为1.1,活性损失81％。3．9对纯化和均一性的总结。
利用上述过程，通过70％强度的硫酸铵沉淀和8个柱色谱步骤，从粗提物得到了所需的乙酰转移酶。用这种方法得到的乙酰转移酶制剂，其比活性是AcA洗脱液的280倍，总产率为0．1％。尽管仅在一天内对AcA洗脱液进行了处理，纯化过程中活性的大量损失可以解释为该酶的极不稳定性和其在pH8以下对pH值和对盐离子的敏感性，特别是对硫酸铵的敏感性所致。
为了检查该酶制剂的纯度，在SDS的存在下使用变性圆盘电泳。使用SDS-PAGE将模拟绿色柱的浓缩洗脱液分离，随后进行银染，显示出仅有1个条带。
纯化步骤   体积(ml)   总活性(pcat)   总蛋白质(mg)   比活性(pcat/mg)   产率(％)   纯化(x倍)
粗提物     278     -     372     -     -     -
Ca3(PO4)2     285     -     194     -     -     -
交联葡聚糖G25洗脱液     82     -     78     -     -     -
DEAE洗脱液     110     -     59     -     -     -
AcA44洗脱液     53     724     25.7     28     100     1
HighQ洗脱液     4     796     8.8     90.5     121     3.2
CHTⅡ洗脱液     1.5     578     0.73     792     80     43
High Trap Blue洗脱液     1.5     168     0.05     3360     23     120
苯基琼脂糖洗脱液     2.5     6.3     0.001     6300     0.87     225
Mimetic Green洗脱液     2.5     0.7     0.0001     7000     0.1     280
实施例4从红豆杉悬浮培养物得到的乙酰转移酶的鉴定4．1最佳pH
由于某些氨基酸官能基的电荷依赖于酶溶液的酸度而改变，因此pH对酶活性有很大的影响。这使得酶的活性中心的构象复杂化，结果对其活性也造成了影响。同样，某些底物的质子化模式依赖于pH值，并因此可影响酶活性。
为了确定最佳pH范围，在从pH5-pH11的不同pH值下测量乙酰辅酶A向10-脱乙酰云南红豆杉素C的转移。为此，在下列混合物中使用5．6pcat(1．7μg，50μl)的120倍富集的乙酰转移酶(High Trap Blue洗脱液)：混合物：50μl 0．8M Tris，pH8．5；
50μl乙酰转移酶(5．6pcat，1．7μg，120倍富集)；30μl乙酰辅酶A(5nmol，包括0．02μCi[2-14C]乙酰辅酶A)；5μl 3mM 10-脱乙酰云南红豆杉素C(15nmol)；50μl Millipore水。温育：在35℃下温育25分钟。该混合物在没有乙酰辅酶A的情况下预温育5分钟，然后加入辅因子使反应开始。在35℃下温育25分钟后，通过酸化使反应停止，并用叔丁基甲基醚萃取。利用闪烁计数仪评估醚萃取液中存在的放射性。
在相对窄的pH范围(pH8．5-9)内，乙酰转移酶活性较大，最佳pH值为pH9。半最大转化率是在pH6．8和pH10．8。
在pH8．5下进行纯化，因为在这种情况下，亲和柱的起始流通液中的活性蛋白质比pH9时的要少。4．2最佳温度
除了pH对酶活性有相当大的影响以外，酶活性也非常依赖于温育温度。开始时，酶活性随着温度的升高而升高，但之后从某个温度点开始迅速下降，这对于每种酶来说是特异的。在高温度下，酶发生变性和失活。为了确定乙酰转移酶的最佳温度，将1．7μg(5．6pcat)120倍纯化的酶在0℃至50℃的温度下温育，开始10分钟时没有乙酰辅酶A，之后加入辅因子，再温育25分钟。加入20μl 12％H2SO4使反应终止。所形成的云南红豆杉素C用600μl醚萃取。然后利用闪烁计数仪评估所形成的产物的量。
混合物：50μl 0．8M Tris，pH8．5；
50μl乙酰转移酶(5．6pcat，1．7μg，120倍富集)；
30μl乙酰辅酶A(5nmol，包括0．02μCi[2-14C]乙酰辅酶A)；
5μl 3mM 10-脱乙酰云南红豆杉素C(15nmol)；
50μl Millipore水。
温育：在各种温度下温育25分钟。
乙酰转移酶的最佳温度是35℃。4．3等电点
利用色谱聚焦确定等电点。将一种特异的阴离子交换剂，例如Mono PHR 5／20(购自Pharmacia)用于此目的，并在使其作为阴离子存在的pH值下向该阴离子交换剂上加载所需酶。在这些起始条件下，酶结合到柱材料上，随后可用含有两性电解质的缓冲液混合物(Polybuffer 94，购自Pharmacia)洗脱下来，所述缓冲液混合物通过柱时形成pH梯度。然后，就在pH值降低到使酶从阴离子态变为形式上不带电荷的状态的这一值，酶自己与阴离子交换剂脱离。这一pH就相当于等电点(IEP)。
对于乙酰转移酶来说，IEP使用带有Mono P HR 5／20柱(0．5cm φ×20cm，购自Pharmacia)的BioLogic FPLC工作站(购自Biorad)以流速为0．7ml／分钟来测定。该色谱柱用25mM咪唑／HCl pH7．4平衡，并加载HighQ洗脱液。为此，用Centriprep浓缩器(30kD)将1ml HighQ洗脱液浓缩至100μl，再用上述咪唑缓冲液稀释至6ml。在这里使用这种纯度的蛋白质是因为该HighQ洗脱液含有最高活性(pcat／ml)，而色谱聚焦预期会导致活性大量损失。该色谱柱用10ml起始缓冲液洗涤，用40mlPolybuffer 74(用Millipore水稀释1∶8倍，pH4)从柱上洗脱出蛋白质。收集1ml级分，为维持低pH值下的活性，从开始，每隔一个级分加入100μl 0．8M Tris pH8．5。测量中间级分的pH值。
为了确定活性级分，每隔一个级分取等分试样与下述混合物温育30分钟：
混合物：200μl酶溶液(缓冲至pH8．5)；
30μl乙酰辅酶A(5nmol，含有0．02μCi[2-14C]乙酰辅酶A)；
5μl 3mM 10-脱乙酰云南红豆杉素C(15nmol)。
温育：在35℃下温育30分钟。
用叔丁基甲基醚萃取后，利用闪烁计数仪进行评估。
主要活性在pH5．7-5．47范围内洗脱出来，所以乙酰转移酶的等电点确定为pH5．6。4．4分子量的确定
采用两种不同的方法确定乙酰转移酶的分子量，一种是使用校准过的凝胶过滤柱的凝胶过滤法，一种是SDS凝胶电泳法。
前者以0．2ml／分钟的流速使用FPLC设备(BioLogic工作站，Biorad)和Biosilect-SEC 250-5柱(购自Biorad)进行，该柱已用50mM Tris，pH8．5，10mM 2-巯基乙醇平衡。首先，该柱用已知分子量的蛋白质进行校正。然后，在相同的条件下，通过柱洗脱已用Centriprep浓缩器(2ml，膜10kD)浓缩至100μl的1．5ml High Trap Blue洗脱液(3360pcat，50μg蛋白质)。级分大小为250μl，通过用下述混合物(总体积为185μl)温育来确定洗脱液的活性：
混合物：50μl 0．8M Tris，pH8．5；
100μl洗脱液；
30μl乙酰辅酶A(5nmol，还含有0．02μCi[2-14C]乙酰辅酶A)；
5μl 3mM 10-脱乙酰云南红豆杉素C(15nmol)。
温育：在35℃下温育30分钟。
用叔丁基甲基醚萃取后，利用闪烁计数仪进行评估。
使用该方法计算出乙酰转移酶的分子量为72kD。
使用变性SDS凝胶电泳检验该值的正确性。为此，对0．3μg均质蛋白质用10％强度的SDS凝胶进行色谱分析，用具有已知分子量的标志蛋白质(Rainbow marker)作为平行对照。用银染色法使蛋白质显现，于是可以将校准蛋白质的Rf值和乙酰转移酶的Rf值进行对比，测得后者的分子量为70．8kD。4．5KM值测定测定10-脱乙酰云南红豆杉素C的KM值
为了获得有关乙酰转移酶对10-脱乙酰云南红豆杉素C的亲和力的信息，测定苯基琼脂糖洗脱液的KM值。
混合物：50μl 0．8M Tris，pH8．5；
100μl乙酰转移酶(0．25pcat，40ng蛋白质，225倍富集)；
30μl乙酰辅酶A(5nmol，还含有0．02μCi[2-14C]乙酰辅酶A)；
10μl 10-脱乙酰云南红豆杉素C(终浓度为：0．1／0．3／1／3／5710／30／50／100／200／300／500μM)。
温育：在35℃下温育30分钟，用叔丁基甲基醚萃取后，利用闪烁计数仪评估放射性。
测量结果按照Lineweaver和Burk的方法以双倒数方式作图，从图示测得10-脱乙酰云南红豆杉素C的KM值为23μM。4．6乙酰辅酶A的KM值的测定
乙酰转移酶对乙酰辅酶A的亲和力可以用KM值来描述，所述KM值可使用苯基琼脂糖洗脱液来测定。
混合物：50μl 0．8M Tris，pH8．5；
100μl乙酰转移酶(0．25pcat，40ng蛋白质，225倍富集)；
30μl乙酰辅酶A和水(终浓度为2．1／2．3／3／5／12／32／52／102／152／202／302／502μM，各含有2μM(40，000cpm)[2-14C]乙酰辅酶A)；
5μl 3mM 10-脱乙酰云南红豆杉素C(15nmol)。
温育：在35℃下温育30分钟，用叔丁基甲基醚萃取后，利用闪烁计数仪进行评估。测量结果按照Lineweaver和Burk的方法以双倒数方式作图，从而测得乙酰辅酶A的KM值为61μM。4．7转换数Kcat
转换数通过说明每秒钟内一分子酶转化多少分子的底物而描述酶反应的反应速率。
使用苯基琼脂糖洗脱液来测定转换数。通过利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将洗脱液分离，再用银染色法而测得其中所含的乙酰转移酶的浓度。将已知量的牛血清白蛋白作为对照浓度加入到凝胶的相邻槽中。使用相当于18ng乙酰转移酶的300μl酶溶液、10-脱乙酰云南红豆杉素C和乙酰辅酶A，在5至30分钟的范围内所记录的转换动力学是线性的。混合物：50μl 0．8M Tris，pH8．5；300μl乙酰转移酶(18ng乙酰转移酶，0．76pcat)；30μl乙酰辅酶A(5nmol，含有0．02μCi[2-14C]乙酰辅酶A)；5μl 3mM 10-脱乙酰云南红豆杉素C(15nmol)。温育：在35℃下温育30分钟。
温育混合物用叔丁基甲基醚萃取，并利用闪烁计数仪进行评估。从测量值计算转换数(pmol)。用酶的量(18ng)除以分子量(72kD)得到每批的酶浓度为0．25pmol。
通过测定每单位时间(秒)的转换来计算酶活性。酶活性(0．05pmol／sec)和浓度(0．25pmol)的商得到乙酰转移酶的转换值为0．2cat／mol均质酶(mol／sec／mol酶)。
转换=转换数Kcat：0．05pmol／sec：0．25μmol=0．2cat／mol。
这相当于在35℃、pH8．5和最佳量的底物(60mol 10-脱乙酰云南红豆杉素C，20mol乙酰辅酶A)条件下，每摩尔酶(72kg)每秒转换0．2mol底物。4．8最佳动力学
在生理学条件下，与酶的浓度相比底物的浓度非常小。只有少量的酶活性中心被占据，因此，未被底物占据的酶的量[E]大致相当于酶总量[E0]。
如果底物的浓度[S]大大低于KM(起始反应速率为半最大速率时的浓度)，则酶反应进行得比转换数Kcat说明的要慢得多。
使用商Kcat／KM来描述酶在这些条件下的特征。用该值乘以底物浓度[S]和酶的总量[E0]就可得到反应速率。
v=(Kcat／KM)[S][E0]
必须考虑到溶解在含水介质中的分子的扩散速率最多可达到108-109，因此，即使是非常快的酶，其反应速率也是有限的，因为底物不可能更迅速地接触到酶。
所计算出的对乙酰转移酶的最佳动力学如下：
KM(10-脱乙酰云南红豆杉素C)=23μM，Kcat=0．2cat／mol
Kcat／KM=0．2mol s-1 mol-1／23·10-3[M]=8．7 s-1M-1
实施例5底物特异性
为了检查纯化的乙酰转移酶的底物特异性，使用具有紫杉烷骨架的各种化合物作为底物。
-10-脱乙酰云南红豆杉素C
-14-脱乙酰云南红豆杉素C
-10，14-脱乙酰云南红豆杉素C
-2，10，14-脱乙酰云南红豆杉素C
-5，10，14-脱乙酰云南红豆杉素C
-2，5，10，14-脱乙酰云南红豆杉素C
-2，14-脱乙酰云南红豆杉素C
-5，14-脱乙酰云南红豆杉素C
-2，5-脱乙酰-10，14-脱乙酰云南红豆杉素C
-10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ(=10-DAB Ⅲ)
-10-脱乙酰紫杉醇
-10-脱乙酰头孢马啉
-10-epi-10-DAB Ⅲ
-19-羟基-10-DAB Ⅲ
-14-羟基-10-DAB Ⅲ
-7-TES-10-DAB Ⅲ
-7-BOC-10-DAB Ⅲ
我们发现，在所用的底物中，只有在C10位具有羟基的紫杉烷可被转化。具有乙酰化C10位并且在其他碳原子上具有游离羟基的紫杉烷衍生物也不被纯化的乙酰转移酶接受为底物。不过，如果C10位被庞大的取代基封闭而不能接近，如10-脱乙酰紫杉醇和10-脱乙酰头孢马啉的情况，则也不发生乙酰化。
当基于10-脱乙酰云南红豆杉素C的转化速率计算转化速率时，我们发现，具有游离羟基的所有云南红豆杉素C衍生物被转化到相同程度。与10-脱乙酰云南红豆杉素C转化到浆果赤霉素Ⅲ相比，10-DAB的转化速率为85％。
下表中显示了基于脱乙酰云南红豆杉素C转化的各种底物的转化情况。
基于10-脱乙酰云南红豆杉素C转化的各种底物的转化
10-脱乙酰云南红豆杉素C
酶：苯基琼脂糖洗脱液(225倍纯化)
底物 转化[％] pkat
10-脱乙酰云南红豆杉素C 100 1.12
10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ 80 0.9
10,14-脱乙酰云南红豆杉素C 102 1.14
2,10,14-脱乙酰云南红豆杉素C 81 0.91
5,10,14-脱乙酰云南红豆杉素C 88 0.99
2,5,10,14-脱乙酰云南红豆杉素C 53 0.59
10-epi-10-DAB Ⅲ 0 0
19-羟基-10-DAB Ⅲ 38 0.43
14-羟基-10-DAB Ⅲ 97 1.09
7-TES-10-DAB Ⅲ 0 0
7-BOC-10-DAB Ⅲ 2 2

Claims (15)

1、制备浆果赤霉素和／或浆果赤霉素衍生物的方法，其特征在于：使10-脱乙酰浆果赤霉素或10-脱乙酰浆果赤霉素衍生物在一种分离酶和乙酰基供体的存在下发生反应，所述酶是用SDS-PAGE测定分子量为70-72kD的乙酰转移酶，其等电点为pH5．4-5．8，对乙酰辅酶A的米-曼常数KM为55-65μM，该乙酰转移酶可从红豆杉细胞培养物中获得。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于从10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ制备浆果赤霉素Ⅲ。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于从14-羟基-10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ制备14-羟基浆果赤霉素Ⅲ。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于从10-脱乙酰云南红豆杉素C制备云南红豆杉素C。
5、如上述权利要求任一项所述的方法，其特征在于反应是在有作为乙酰基供体的乙酰辅酶A存在下进行的。
6、一种酶，其特征在于：
a)它在乙酰基供体特别是乙酰辅酶A的存在下，选择性乙酰化10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ的10位，
b)用SDS-PAGE测定的分子量为70-72kD，
c)等电点为pH5．4-5．8，
d)对乙酰辅酶A的米-曼常数KM为55-65μM，
e)是一种10-羟基紫杉烷基-O-乙酰转移酶，
f)可以从红豆杉细胞培养物获得。
7、如权利要求7所述的酶，其特征在于它以大于50％的纯度存在。
8、如权利要求7所述的酶，其特征在于它以大于90％的纯度存在。
9、制备权利要求6-8任一项所述的酶的方法，其特征在于使用已知纯化方法从含有酶的来源分离得到酶，每次纯化后，通过加入10-脱乙酰浆果赤霉素或10-脱乙酰浆果赤霉素衍生物和乙酰基供体测定各级分中酶的存在，并检测所形成的乙酰化产物。
10、如权利要求9所述的方法，其特征在于所述纯化方法包括使用HighQ柱。
11、如权利要求9或10所述的方法，其特征在于用10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ或10-脱乙酰云南红豆杉素C来检测含有酶的级分。
12、如权利要求9-11任一项所述的方法，其特征在于所用的乙酰基供体是乙酰辅酶A。
13、如权利要求9-12任一项所述的方法，其特征在于所形成的乙酰化产物利用放射性标记来检测。
14、如权利要求9-12任一项所述的方法，其特征在于所形成的乙酰化产物利用重同位素标记来检测。
15、制备紫杉醇和／或紫杉醇衍生物的方法，其特征在于首先制备权利要求1-7任一项所述的浆果赤霉素或浆果赤霉素衍生物，然后利用已知方法反应得到紫杉醇或紫杉醇衍生物。
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