ES2217777T3

ES2217777T3 - Procedimiento para la preparacion de bacatina.

Info

Publication number: ES2217777T3
Application number: ES99934214T
Authority: ES
Inventors: Ezio Bombardelli; Birgitta Menhard; Meinhart Hans Zenk
Original assignee: Indena SpA
Current assignee: Indena SpA
Priority date: 1998-02-06
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2019-01-29
Also published as: DK1053345T3; DE59908741D1; SK11242000A3; CZ20002723A3; CN1290305A; RU2219242C2; JP2002502613A; PL342711A1; PT1053345E; HUP0100724A3; CA2319136C; JP4278864B2; US6514732B1; DE19804815C1; PL197703B1; WO1999040216A1; NO20003787D0; KR20010040647A; EP1053345B1; AU3251999A

Abstract

Procedimiento para la preparación de bacatina y/o derivados de bacatina, caracterizado porque se hace reaccionar 10-desacetil-bacatina o un derivado de 10-desacetil-bacatina en presencia de una enzima aislada y de un agente donante de acetilo, utilizándose como enzima una acetil-transferasa que tiene un peso molecular de 70a 72 kD, determinado por medio de una SDS-PAGE con un punto isoeléctrico de pH 5, 4 a 5, 8 y una constante KM de Michaelis Menten para la acetil-coenzima A de 55 a 65 my-M, que es obtenible a partir de cultivos de células de Taxus chinensis.

Description

Procedimiento para la preparación de bacatina.

El invento se refiere a un procedimiento para la preparación de bacatina o derivados de bacatina, por acetilación selectiva de los correspondientes 10-desacetil compuestos, a una enzima aislada, que cataliza a esta reacción de acetilación, así como a un procedimiento para la preparación de la enzima.

El taxol (paclitaxel) es un agente muy prometedor para el tratamiento del cáncer, que presenta una actividad anti-leucémica e inhibidora de los tumores (véase p.ej.: la cita de M. Suffnes y colaboradores, en "The Alkaloids, Chemistry and Pharmacology" [Los alcaloides, química y farmacología], A. Brossi, coordinador de edición, Academic Press; Orlando, FL, 1985, volumen XXV, capítulo 1). Originalmente, el taxol se obtenía a partir de la corteza de determinadas especies de tejos (Taxus taxaceae). El aislamiento de taxol a partir de la corteza es sin embargo díficil y costoso, y se obtiene el deseado taxol a partir de la corteza solamente con unos rendimientos muy pequeños (de 40 a 165 mg/kg) (véase p.ej. la cita de R.W. Miller y colaboradores J. Org. Chem. 46 (1981) 1.469-1.474; V. Sénilh y colaboradores, J. Nat. Procl. 47 (1984) 131-137; N. Magri y colaboradores, J. Org. Chem. 51 (1986) 797-802). Además, la utilización de la corteza conduce a la muerte de los tejos, que crecen de nuevo con mucha lentitud, de manera tal que el material de partida está a disposición solamente en una extensión limitada.

Después de haberse descubierto las propiedades del taxol, que lo recomiendan para una utilización como agente quimioterapéutico contra el cáncer, se emprendieron numerosos esfuerzos de prepararlo mediante procedimientos sintéticos o semi-sintéticos. Así, se intentó preparar la estructura del taxol mediante una síntesis orgánica (véase p.ej. la cita de W.F. Berkowitz y colaboradores, J. Org. Chem. 52 (1987) 1.119-1.124). A causa de la complejidad de la molécula, no se consiguió hasta ahora, sin embargo, preparar el taxol en cantidades utilizables en la práctica mediante una síntesis totalmente orgánica.

Una vía adicional, que se siguió, a fin de obtener el taxol, es una síntesis parcial que parte de un compuesto precursor, obtenible con facilidad y en gran cantidad. Uno de estos enfoques parte de la 10-desacetil-bacatina III, que se puede obtener de manera fácil y con gran rendimiento a partir de las hojas de Taxus baccata L (G. Chauviere y colaboradores, Seances Acad. Sci., Ser. 2, 1981, 293, 501-503). Es posible en este caso aislar aproximadamente 1 g de 10-desacetil-bacatina III por cada kg de hojas, realizándose que las hojas crecen de nuevo con rapidez. Así, se pueden obtener sin dificultades grandes cantidades del compuesto precursor 10-desacetil-bacatina III.

A partir de este compuesto precursor, obtenido a partir de un material biológico, se puede preparar seguidamente, por medio de una síntesis parcial, la deseada sustancia activa taxol. No obstante, se ha demostrado que a pesar de lo similares que parecen ser las estructuras de la 10-desacetil-bacatina III y del taxol, esta síntesis parcial implica todavía grandes dificultades y en la mayor parte de los casos se puede llevar a cabo con éxito solamente mediando utilización de grupos protectores específicos, realizándose que el deseado producto taxol se obtiene solamente con rendimientos pequeños.

Denis y colaboradores, (J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 5.917-5.919) describen la conversión química de 10-desacetil-bacatina III en taxol en tres etapas. En la primera etapa, la 10-desacetil-bacatina III se acetila químicamente en la posición 10. En la segunda etapa, se efectúa la transformación de bacatina en taxol. La primera etapa no es sin embargo regioespecífica, por lo que en particular tiene lugar también una acetilación de la 10-desacetil-bacatina en la posición 7. Por lo tanto, es necesario hacer que el grupo hidroxi situado en esta posición sea inaccesible a la acetilación mediante un grupo protector. Solamente mediante la utilización de un grupo protector se podía conseguir una acetilación exclusiva en la posición 10. La utilización de un grupo protector implica, sin embargo, otras dos etapas de procedimiento (colocación y eliminación del grupo protector), lo cual, por una parte, es costoso y, por otra parte, disminuye manifiestamente el rendimiento del producto obtenido. Una desventaja adicional, en el caso de la utilización de grupos protectores, consiste en que, en particular cuando se utiliza el producto como sustancia activa farmacéutica, se deben hacer seguir posteriormente costosos procesos de purificación y análisis, con el fin de asegurar que ya no se encuentren en el producto moléculas algunas, que estén provistas de grupos protectores.

Zocher y colaboradores (Biochem. Biophys. Res. Commun., 229 (1996), 16-20) describen una biosíntesis de taxol. En una etapa intermedia, en este caso la acetilación de 10-desacetil-bacatina III para formar bacatina III, se llevaba a cabo con ayuda de extractos brutos vegetales a partir de las raíces de Taxus baccata. Sin embargo, no se consiguió aislar ni caracterizar sustancias, que originen la acetilación. Resulta desventajoso, en el caso de la utilización de un extracto bruto, el hecho de que otras numerosas reacciones, en particular la acetilación en otras posiciones adicionales, se pueden ocasionar o influir mediante sustancias presentes en el extracto bruto. Además, un extracto bruto de plantas no presenta ninguna composición definida y reproducible, de manera tal que la utilización de extractos brutos de plantas conduce a unas reacciones y unos rendimientos incontrolables y variables.

Una misión del presente invento fue, por lo tanto, poner a disposición un procedimiento con el que se puedan preparar bacatina y derivados de bacatina similares a la bacatina, por medio de una acetilación selectiva en la posición 10 de los correspondientes 10-desacetil compuestos. Una misión adicional consistió en poner a disposición una sustancia aislada, que catalice específicamente esta reacción.

Los problemas planteados por estas misiones se resuelven, conforme al invento, mediante un procedimiento para la preparación de bacatina o derivados de bacatina, que está caracterizado porque la 10-desacetil-bacatina, o un derivado de 10-desacetil-bacatina, se hace reaccionar en presencia de una enzima aislada y de un agente donante de acetilo, utilizándose como enzima una acetil - transferasa con un peso molecular de 70 a 72 kD, determinado mediante una SDS-PAGE (electroforesis en gel de dodecil-sulfato de sodio-poli(acrilamida)) que es obtenible a partir de cultivos de células de Taxus chinensis. Se comprobó que una acetilación regioselectiva en la posición 10 es catalizada por una enzima aislada, que se puede obtener a partir de cultivos en suspensión de células de Taxus chinensis. Con sorpresa, se comprobó que, mediando utilización de la enzima aislada y purificada, se puede obtener una regioespecificidad alta en lo que se refiere a la acetilación en la posición 10. Esta especificidad es, de modo preferido > 80%, de modo más preferido > 90%, y de modo sumamente preferido > 95%. Se comprobó que con la enzima utilizada conforme al invento se puede obtener una especificidad > 99%. Una especificidad de > 80% significa, en este contexto, que la acetilación ha tenido lugar en más de un 80% en la posición 10 y en menos de un 20% en otras posiciones del compuesto de partida. Esto tiene como consecuencia el hecho de que otros grupos hidroxi adicionales, que se presentan en la sustancia de partida, no deben de ser bloqueados con un grupo protector, puesto que no aparece, o solamente aparece en muy pequeño grado, una acetilación de estos grupos hidroxi adicionales, en el caso de la utilización de la enzima conforme al invento.

De modo sorprendente, se comprobó que la enzima utilizada conforme al invento presenta una alta especificidad para el substrato. Así, se convierten químicamente 10-desacetil-bacatina o derivados de 10-desacetil-bacatina, que junto a, y en el entorno de, la posición C10 presentan una configuración similar a la de la 10-desacetil-bacatina III. En particular, no son acetilados los derivados de bacatina, en los que el acceso a la posición 10 está bloqueado mediante sustituyentes que llenan el espacio, tales como por ejemplo 10-desacetil-taxol y 10-desacetil-cefalomanina. Una premisa para que los derivados de bacatina sean reconocidos como substratos por la enzima conforme al invento, es, por lo tanto, el hecho de estos derivados, que presentan la estructura anular del taxano, se corresponden en las posiciones 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 en lo esencial con la 10-desacetil-bacatina III, es decir que en estas posiciones no llevan ningún otro sustituyente, o solamente llevan sustituyentes, que presenta(n) un pequeño volumen. De modo preferido, el procedimiento es apropiado para los derivados de bacatina, que en las posiciones 7 a 13 llevan los mismos sustituyentes que la 10-desacetil-bacatina III o que, por lo menos en parte, llevan sustituyentes con un volumen menor que el de los sustituyentes de la 10-desacetil-bacatina III, en particular hidrógeno. No perturban a la reacción los sustituyentes voluminosos situados en las demás posiciones. De modo especialmente preferido, el procedimiento se utiliza para la acetilación de 10-desacetil-bacatina III. Además, el procedimiento se utiliza de modo especialmente preferido para la acetilación selectiva en la posición 10 de 14-hidroxi-10-desacetil-bacatina III.

Por el contrario, los derivados de 10-desacetil-bacartina III, cuyo grupo hidroxi en la posición 7 está bloqueado mediante un grupo protector voluminoso, tales como por ejemplo 7-TES-10-DAB-III o 7-BOC-10-DAB-III, no son reconocidos como substratos por la enzima conforme al invento. Sin embargo, un bloqueo de este tipo tampoco es necesario, puesto que una acetilación regioselectiva en la posición 10 tiene lugar también en el caso de la presencia de otros grupos hidroxi adicionales en otras posiciones distintas.

Con el procedimiento conforme al invento es posible acetilar selectivamente en la posición 10 derivados de taxano, que presentan en las posiciones 7 a 13 los mismos sutituyentes, menor número de sustituyentes, o sustituyentes menos voluminosos, que la 10-desacetil-bacatina. Tales derivados de taxano, en los que los sustituyentes presentes en la 10-desacetil-bacatina III (es decir, OH en la posición 7, CH_{3} en la posición 8, =O en la posición 9, OH en la posición 10, CH_{3} en la posición 12 y OH en la posición 13) están presentes o han sido reemplazados por un radical similarmente voluminoso o de menor tamaño, en particular hidrógeno, entran en este caso dentro del concepto de derivados de 10-desacetil-bacatina y pueden ser acetilados asimismo de una manera regioespecífica, siempre y cuando que ellos tengan un grupo OH en la posición 10. Ejemplos de tales derivados son 10-desacetil-taxuyunanina-C, 10,14-desacetil-taxuyunanina-C, 2,10,14-desacetil-taxuyunanina-C, 5,10,14-desacetil-taxuyunanina-C y 2,5,10,14-desacetil-taxuyunanina-C.

Preferiblemente, con el procedimiento conforme al invento se preparan la bacatina-III a partir de 10-desacetil-bacatina III, la 14-hidro-bacatina III a partir de 14-hidroxi-10-desacetil-bacatina III, o la taxuyunanina C a partir de 10-desacetil-taxuyunanina C.

El procedimiento conforme al invento se lleva a cabo en presencia de un agente donante de acetilo. Como agente donante de acetilo es fundamentalmente apropiada cualquier sustancia que ponga a disposición un grupo acetilo, en el caso de la reacción catalítica de la 10-desacetil - sustancia de partida. De modo preferido, la reacción se lleva a cabo en presencia de la acetil-coenzima-A como agente donante de acetilo.

La utilización, conforme al invento, de una enzima aislada ofrece muchas ventajas en cuanto a la técnica de procesos. La reacción es fácil de controlar, en particular en lo que se refiere a la velocidad de reacción y en lo que se refiere a la reproducibilidad, en el caso de la utilización de una enzima aislada.

De modo preferido, la enzima utilizada presenta un punto isoeléctrico con un valor del pH de 5,4 a 5,8, de modo preferido de 5,5 a 5,7, y en particular con un pH de 5,6. Además, se comprobó que la enzima utilizada conforme al invento presenta una constante K_{M} de Michaelis Menten para la acetil-coenzima A de 55 a 65 \muM, de modo preferido de 59 a 63 \muM y en particular de 61 \muM.

Un objeto adicional del invento es una enzima aislada, que está caracterizada porque ella a) acetila selectivamente en la posición 10 a la 10-desacetil-bacatina III en presencia de un agente donante de acetilo, en particular la acetil-coenzima A, b) tiene un peso molecular de 70 a 72 kD, determinado por medio de una SDS-PAGE y c) es obtenible a partir de cultivos de células de Taxus chinensis.

La enzima conforme al invento se presenta,. de manera preferida, en una pureza > 50%, en particular > 80%, de modo más preferido > 90% y de modo sumamente preferido > 95%. La enzima conforme al invento se distingue por el hecho de que acetila selectivamente en la posición 10 a la 10-desacetil-bacatina III en presencia de un agente donante de acetilo, en particular de la acetil-CoA. Esto significa, en particular, que no se observa prácticamente ninguna acetilación de los demás grupos hidroxi de la 10-desacetil-bacatina III en las posiciones 1, 7 y 13. La reacción de acetilación presenta en particular, con respecto a la posición 10, una selectividad de > 50%, de modo preferido de > 80%, de modo más preferido de > 90% y de modo sumamente preferido de > 95%.

La enzima aislada está caracterizada además por un peso molecular de 70 a 72 kD, determinado por medio de una SDS-PAGE. Para la determinación del peso molecular, se cromatografiaron 0,3 \mug de una proteína homogénea en un SDS-gel desnaturalizante al 10%, paralelamente con proteínas marcadoras que tienen un peso molecular conocido (marcadores de arco iris (del inglés rainbow)). Mediante coloración plateada, las proteínas fueron hechas visibles, siendo determinado el peso molecular por comparación de los valores de Rf de las proteínas de calibración y de la enzima conforme al invento. El peso molecular, determinado mediante una electroforesis en SDS-gel, se confirmó mediante filtración a través de gel en una apropiada columna para filtración en gel. La filtración en gel se llevo a cabo en una columna Biosilect-SEC 250-5, equilibrada con 50 mM de Tris, de pH 8.5, y 20 mM de 2-mercapto-etanol (Biorad) en una instalación para FPLC (de Fast Performance Liquid Chromatography = cromatografía en fase líquida con rendimiento rápido) (BioLogic Workstation, Biorad) y concretamente con un caudal de 0,2 ml/min. En este caso, la columna se calibró primeramente con proteínas que tenían un peso molecular conocido. En condiciones idénticas, se condujeron luego a través de la columna 50 \mug de la proteína conforme al invento. El material eluido se recogió en fracciones de 250 \mul y la actividad del material eluido se determinó, tal como se describe seguidamente. El peso molecular se determinó por medio de una comparación de los períodos de tiempo de elución con los patrones conocidos.

La enzima conforme al invento se puede aislar a partir de cultivos de células de Taxus chinensis. Ella presenta un punto isoeléctrico a un pH de 5,4 a 5,8, preferiblemente a un pH de 5,5 a 5,7 y en particular de a un pH de 5,6. Además, se encontró una constante de Michaelis Menten K_{M} para la enzima utilizada para la acetil-coenzima A de 55 a 65 \muM, de modo preferido de 59 a 63 \muM y en particular de 61 \muM.

En el caso de la enzima conforme al invento, se trata de una acetil-transferasa, en particular de una acetil-CoA-10-hidroxitaxano -O-acetil - transferasa.

Un objeto adicional del invento es un procedimiento para la preparación de la enzima antes descrita, que está caracterizado porque la enzima se aísla a partir de una fuente que contiene esta enzima, utilizándose procedimientos de purificación conocidos, y después de cada purificación se determinan las fracciones, en las que se presenta la enzima, añadiendo 10-desacetil-bacatina o un derivado de 10-desacetil-bacatina y un agente donante de acetilo, y se detecta el producto de acetilación que se ha formado.

Como fuente que contiene la enzima se puede utilizar por ejemplo un extracto de plantas. De modo preferido, como fuente que contiene la enzima se utiliza un cultivo de células, en particular un cultivo de células en suspensión. La utilización de un cultivo de células es ventajosa, por cuanto que se pueden obtener grandes cantidades del material de partida. En comparación con la utilización de un extracto bruto como fuente que contiene la enzima, en el caso de la utilización de un cultivo de células, a causa de la gran cantidad de material de partida, es posible una purificación de la enzima hasta llegar a una alta pureza. De modo especialmente preferido, se utiliza un material de partida que procede de Taxus chinensis, por ejemplo un cultivo de células de Taxus chinensis.

Para la purificación de la enzima a partir del material de partida, se pueden utilizar conocidos procedimientos de purificación para la obtención de enzimas o bien de proteínas. Los procedimientos utilizados de manera preferente abarcan la precipitación con sulfato de amonio a partir del extracto bruto así como procedimientos de purificación por cromatografía, tales como por ejemplo la utilización de una columna con Sephadex G-25, una cromatografía con intercambio de aniones, p.ej. en presencia de DEAE-Sephacel, una filtración a través de gel, p.ej. en presencia de Ultrogel AcA 44, una cromatografía con intercambio de aniones, p.ej. en presencia de HighQ, una cromatografía a través de una columna con hidroxi-apatito, una cromatografía de afinidad con colorante, p.ej. en presencia de High Trap Blue, una cromatografía con interacción hidrófoba, p.ej. en presencia de fenil-Sepharose y/o una cromatografía de afinidad con colorante, p.ej. en presencia de Mimetic-Grün (Verde mimético) 1A6XL. De modo preferido, la purificación abarca por lo menos una etapa mediando utilización de una cromatografía con intercambio de aniones en presencia de HighQ. La columna con HighQ es un intercambiador de aniones con grupos -N^{+}(CH_{3})_{3} como ligandos. Se comprobó que, en particular, en el caso de esta etapa de purificación se pueden eliminar las sustancias, que catalizan una acetilación en otras posiciones distintas de la posición 10.

En el caso del procedimiento conforme al invento, después de cada etapa de purificación, se determina la actividad enzimática de las fracciones, con el fin de comprobar en cuáles de las fracciones se presenta la enzima. Para ello, la fracción, o una parte de la fracción, se mezcla con 10-desacetil-bacatina o con un derivado de 10-desacetil-bacatina, como se ha definido antes, y con un agente donante de acetilo. En las fracciones en las que se presenta la deseada enzima, se puede detectar un producto acetilado en la posición 10. Para esta detección, se emplea de modo preferido 10-desacetil-bacatina III o 10-desacetil-taxuyunanina-C. La detección del producto de acetilación formado se puede conseguir mediante la utilización de apropiados grupos de marcación en las sustancias de partida. De modo preferido, se utiliza un agente donante de acetilo marcado. Un agente donante de acetilo marcado de este tipo comprende un grupo acetilo marcado, con cuya ayuda se puede determinar luego el producto acetilado en la posición 10. De modo preferido, se utiliza un agente donante de acetilo marcado radiactivamente. Apropiados grupos de marcación radiactivos son en este caso ^{13}C y ^{14}C. De modo especialmente referido, se utiliza como agente donante de acetilo una acetil-coenzima, en particular la [2-^{14}C]acetil-coenzima A.

También es posible llevar a cabo la detección por medio de una marcación con un isótopo pesado. En este caso, el producto de reacción se puede determinar mediante una espectrometria de masas.

Con el procedimiento conforme al invento para la preparación de bacatina o derivados de bacatina, mediando utilización de la enzima conforme al invento, es posible preparar compuestos de bacatina o bien de taxano, específicamente acetilados en la posición 10. Tales compuestos son de interés, en particular, como sustancias de partida para la síntesis parcial de taxol. Un objeto adicional del invento es, por lo tanto, un procedimiento para la preparación de taxol y/o derivados de taxol, que está caracterizado porque se hacen reaccionar, conforme a métodos conocidos, bacatina o derivados de bacatina, que se habían preparado de acuerdo con el procedimiento antes descrito, para formar taxol o bien derivados de taxol respectivamente. La reacción parcial de bacatina o bien derivados de bacatina para formar taxol o bien derivados de taxol, respectivamente. Se ha descrito en el estado de la técnica, y comprende de modo esencial la colocación de sustituyentes apropiados en el grupo hidroxi situado en la posición 13 de los derivados de bacatina. Los derivados de bacatina, utilizados de manera apropiada para ello, tienen por lo tanto un grupo OH libre por lo menos en la posición 13.

La reacción de derivados de bacatina para formar taxol o bien derivados de taxol respectivamente se efectúa en particular mediante una esterificación del grupo OH, situado en la posición 13 de los derivados de bacatina, con un ácido apropiado. Tales procedimientos han sido descritos detalladamente en la bibliografía, por ejemplo en la patente de los EE.UU. 4.814.470 (de Colin y colaboradores), en la patente de los EE.UU. Re. 34.277 (de Denis y colaboradores), en el documento de solicitud de patente europea EP-0.400.971 A2, en la patente de los EE.UU. 4.924.011 (de Denis y colaboradores), en la patente de los EE.UU. nº 5.476.954 (de Bourzat y colaboradores) así como en la cita de Denis y colaboradores en J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 5.917-5.919.

Para ofrecer ilustración, se indican a continuación las fórmulas estructurales de la bacatina III y del paclitaxel:

1

2

El invento se explica con mayor detalle por medio de los siguientes Ejemplos.

Ejemplo 1 Cultivación de suspensiones de células de Taxus chinensis

Se utilizaron cultivos en suspensión de Taxus chinensis procedentes de la Colección del Instituto de Biología Farmacéutica de la Universidad de Munich, que originalmente proceden de agujas (pinochas) de un árbol de T. chinensis. Se dejó que los cultivos creciesen durante 14 días a 24ºC, a 100 rpm (revoluciones por minuto) y 1.500 lux. Luego se transfirieron 150 ml de una suspensión de células con una pipeta estéril, que tenia una capacidad de 50 ml, a 250 ml de un medio B5 + 1.

Composición del medio B5 + 1 (modificado de acuerdo con Gamborg, Miller Ojima: Experimental Research, 1968, 50, páginas 151-158).

Ácido naftil-acético	10 \muM
Bencilamino-purina	0,2 \muM

	mg/l
NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O	150
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O	150
(NH_{4})_{2}SO_{4}	134
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O	250
KNO_{3}	2.500
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O	25,6
Na_{2}EDTA\cdot2H_{2}O	34,27
KI	0,75
MnSO_{4}\cdotH_{2}O	10
H_{3}BO_{3}	3
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O	3
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O	0,25
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O	0,25
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O	0,25

Ácido nicotínico	1
Dicloruro de tiaminio	10
Hidrocloruro de piridoxol	1
meso-Inosita	1.000
D(+)sacarosa	2.000

pH 5,6

NZ-aminas	1.000

Las NZ-aminas se añadieron al medio, después de un tratamiento en autoclave y de un enfriamiento en condiciones estériles, como una solución original estéril (10 g/l).

En el 3^{er} día después de esta sobreinoculación se añadieron a ello 30 \muM de jasmonato de metilo (MeJA) (de la entidad Serva) y se dejó que el cultivo creciese durante 4 días adicionales (Gundlach, H., Müller, M.J., Kutchan, T.M., Zenk, M.H., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, páginas 2.389-2.393). Luego, las células se separaron mediante filtración en vacío con respecto del medio y, después de una congelación brusca con nitrógeno líquido, se utilizaron para la disgregación de la enzima. A -20ºC, éstas se pudieron almacenar sin embargo hasta durante un mes, y después de ello disminuyó en gran manera la actividad de la enzima buscada.

Ejemplo 2 Ensayo enzimático para la determinación de la actividad de acetil-transferasa

Con el fin de poder purificar, caracterizar y detectar una enzima, una premisa indispensable es la disponibilidad de métodos de ensayo precisos y suficientemente sensibles. En el presente caso, esto lo cumplían la captación y la determinación del producto formado, p.ej. de la taxuyunanina C a partir de 10-desacetil-taxuyunanina, para lo cual se desarrolló un procedimiento sencillo de realizar y confiable.

Una cantidad suficiente de la solución de enzima que se había de ensayar, se añadió con pipeta a 50 \mul de un tampón Tris (0,8 M, de pH 8,5) dentro de una caperuza Eppendorf Cap. Luego se añadieron 30 \mul de la acetil-CoA purificada (5 nmol de una acetil-coenzima A no marcada y 0,02 \muCi de [2-^{14}C]acetil-coenzima A) y 15 nmol de una solución original 3 mM de 10-desacetil-taxuyunanina C disuelta en DMSO, en el testigo, en lugar de este taxano, solamente se añadió la cantidad correspondiente de DMSO. Después de una incubación durante 30 minutos a 35ºC, la tanda se acidificó con 20 \mul de H_{2}SO_{4} al 12%, la taxuyunanina C formada se extrajo por agitación con 600 \mul de terc.-butil-metil-éter (con un agitador por la parte superior durante 10 min) y la tanda se centrifugó luego (centrífuga de Eppendorf a 14.000 rpm durante 4 min). La [2-^{14}C]acetil-CoA no reaccionada, todavía presente, permaneció en la fase acuosa. 500 \mul de la fase orgánica se concentraron por evaporación hasta sequedad mediante evacuación por soplado con aire, realizándose al mismo tiempo que se podía eliminar el [2-^{14}C]ácido acético, eventualmente existente, que se presentaba en forma de ácido mediante la precedente acidificación y por consiguiente era volátil. Mediante un contador por escintilación (centelleo) (Multiple Purpose Szintillation Counter LS 6500, de la entidad Beckmann) o mediante un escaneador radiológico de capa fina (Automatic TLC Linear Analyzer, de la entidad Berthold) se determinaron el tipo y la cantidad del producto formado. El primero se empleó con el fin de determinar con los valores de cpm (cómputos por minuto) contados el grado de conversión, y por consiguiente la actividad de la enzima. Con ayuda de una cromatografía de capa fina (DC, de Dünn-schicht Chromatographie) (agente eluyente LM (de LösungsMittel): mezcla de cloroformo y acetonitrilo 7:3) y una subsiguiente evaluación en el escaneador radiológico (Radioscanner) se pudo comprobar si la radiactividad medida con el contador de escintilación también correspondía realmente a un pico situado al nivel del valor de R_{f} del producto esperado.

Ejemplo 3 Purificación de la acetil-transferasa 3.1 Disgregación tisular y desalinización a través de Sephadex G 25

Para la obtención del extracto proteínico en bruto, se utilizaron cultivos en suspensión con una antigüedad de 7 días, que en el 3^{er} día habían sido estimulados por sobreinoculación con 30 \muM de MeJA. Se congelaron bruscamente con nitrógeno líquido 200 g de células recientemente filtradas con succión. En un mortero (almirez) enfriado por hielo, éstas se mezclaron seguidamente con 20 g de PVPP (Poli-Vinil-Poli-Pirrolidona) y se descongelaron mediando agitación con 400 ml del tampón patrón A (100 mM de ácido bórico/NaOH, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol). La PVPP fija a una parte de los fenoles que perturban en la ulterior fase de purificación, entre otros a los materiales curtientes (taninos) contenidos en el extracto. La papilla celular homogénea se filtró luego a través de una gasa de 4 cuatro capas y el zumo prensado se centrifugó a 15.000 x g (durante 10 min, en un rotor SS34).

El material sobrenadante enfriado por hielo se mezcló con 50 ml de un gel de fosfato de calcio suspendido en el tampón patrón A (100 mM de ácido bórico / NaOH, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol). El dato de volumen indica la cantidad de gel que se obtiene después de una centrifugación durante 10 minutos a 2.500 rpm, y corresponde a 1,9 g de TG (de Trocken Gewicht = peso en seco) de Ca_{3}(PO_{4})_{2}. Durante 10 minutos se dejó reposar esta mezcla en un baño de hielo, con agitación ocasional. Durante este período de tiempo, debieron adsorberse junto al gel sustancias acompañantes, tales como por ejemplo las sustancias curtientes contenidas en grandes cantidades. La acetil-transferasa permaneció en solución y pudo ser separada con respecto del material del gel por subsiguiente centrifugación (6.000 x g, durante 5 min, en un rotor GSA).

A continuación, el gel presente como sedimento se recogió nuevamente en 75 ml del tampón patrón A, se agitó durante 5 minutos con una barra de vidrio y se centrifugó de nuevo durante 5 minutos a 6.000 rpm (con un rotor GSA), puesto que una parte de la acetil-transferasa se había adsorbido junto al gel y llegó al material sobrenadante mediante este tratamiento posterior. Sin utilización del gel de fosfato de calcio resultaron grandes dificultades en la fase de purificación ulterior, puesto que las sustancias acompañantes, todavía contenidas entonces, taponaban con mucha rapidez a la membrana de la celda de agitación, y las columnas utilizadas a continuación se coloreaban de pardo oscuro y disminuían con rapidez sus capacidades de fijación.

El material sobrenadante enfriado por hielo y reunido se mezcló mediando lenta agitación en porciones hasta llegar a una saturación de 70% con sulfato de amonio y, después de una adición completa, se agitó lentamente durante otros 30 min adicionales. A continuación, la proteína precipitada se pudo sedimentar a 15.000 rpm (durante 10 min, con el rotor SS34). El precipitado se volvió a suspender cuidadosamente en 30 ml del tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol) y la solución se desalinizó mediando utilización de este tampón con ayuda de una columna de Sephadex G25 (Pharmacia, 2,7 cm de \diameter (diámetro) x 7 cm), siendo separado al mismo tiempo un 60% de la proteína ajena.

[material eluido con G25: 82 ml, 78 mg de proteína].

3.2 Cromatografía con intercambio de aniones en presencia de DEAE-Sephacel

En el caso de la DEAE-Sephacel se trata de una celulosa modificada, a la que están fijados radicales de dietilaminoetilo cargados positivamente. Si el punto isoeléctrico de las proteinas disueltas es más ácido que el tampón utilizado, entonces ellas se presentan en forma de aniones y por consiguiente se pueden fijar al material de la columna, que está cargado positivamente. La adición de aniones más fuertes, tales como Cl^{-} o SO_{4}^{2-},debilita a la interacción electrostática de la proteína adsorbida y de los grupos DEAE. Como consecuencia de ello, los aniones de proteínas son intercambiados por los aniones inorgánicos, y por consiguiente la enzima es eluida.

En esta etapa de purificación se separó un 24,4% de la proteína ajena, así como en particular las sustancias acompañantes, entre otras las sustancias curtientes que contienen fenoles. El material de la columna se coloreó intensamente de pardo ya durante el primer uso, pero se pudo purificar ampliamente con NaOH 1 M. El ensuciamiento de las columnas empleadas posteriormente en la fase de purificación se pudo reducir considerablemente mediante esta etapa.

La fracción que había pasado por la columna con DEAE (2,5 cm de \diameter x cm) inclusive 30 ml del tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol), con el que se había lavado posteriormente la columna, se concentró por evaporación hasta 5 ml mediante filtración a presión en una celda con sistema de agitación (Amicon, 400 ml, membrana PM10).

[Material eluido con DEAE: 110 ml, 59 mg de proteína]

3.3 Filtración a través de gel en Ultrogel AcA 44

El principio de la filtración a través de gel se basa en el hecho de que las macromoléculas, tales como por ejemplo las proteínas, se reparten, dependiendo de su tamaño y su forma, entre una matriz que tiene un definido tamaño de poros (volumen de exclusión) y el espacio líquido que la rodea. Las moléculas, que son demasiado grandes como para poder penetrar en los poros del gel, se desplazan junto a las partículas y con ello son eluidas con mayor rapidez que las proteínas de tamaño intermedio, que primeramente son retardadas por los poros, pero sin penetrar en éstos. Las moléculas todavía más pequeñas, entre otros los iones de sales, llegan en primer lugar a los poros, que ellas abandonan tan sólo después de un determinado período de tiempo de permanencia, por lo cual permanecen durante el período de tiempo más largo en la columna.

Esta técnica es muy moderada, puesto que prácticamente no aparecen interacciones algunas entre el material y la proteína, y no se deben utilizar tampones especiales de ningún tipo.

Además, se efectúa una desalinización completa del material eluido, puesto que los iones de menor tamaño, en este caso los iones de sulfato, permanecen en la columna durante un período de tiempo más largo que la proteína activa.

Se utilizó un gel de poli(acrilamida) y agarosa, para el que se indica un intervalo de fraccionamiento de 10-130 kD (Ultrogel AcA 44, de la entidad Serva).

La solución de proteínas, concentrada por evaporación, se separó en una columna equilibrada con el tampón patrón B (2,8 cm de \diameter x 100 cm) con un caudal de 20 ml/h durante una noche. Las 60 fracciones (cada una de 6,5 ml) se ensayaron en cuanto a su contenido de proteínas y a su actividad de acetil-transferasa. Las fracciones con la actividad principal se reunieron y se purificaron ulteriormente.

Con este material eluido se pudo medir la actividad específica de la acetil-transferasa. El cromatograma de capa fina mostró, junto a picos nítidos a un bajo valor de Rf, también un pico al nivel del valor de Rf de la taxuyunanina C. [Material eluido con AcA: 53 ml, 25,7 mg, la actividad total de 724 pcat fue establecida como 100%]. Por medio de esta filtración en gel se separó un 57% de la proteína ajena.

3.4 Cromatografía con intercambio de aniones en presencia de HighQ

Igual a como la columna con DEAE, también la columna con HighQ, que posee grupos -N^{+}(CH_{3})_{3} como ligandos, es un intercambiador de aniones, pero, al contrario que la primera, es uno más fuerte, es decir que a lo largo de un amplio intervalo de valores del pH no se modifica su estado de ionización. En el caso de intercambiadores débiles, fluctúa considerablemente a diferentes valores del pH el grado de la disociación y por consiguiente la capacidad de intercambio. Puesto que el material de la columna con HighQ consta de las partículas de resina con un pequeño tamaño de aproximadamente 10 \mum, densamente empaquetadas, y por consiguiente se establece una alta contrapresión, se debe hacer funcionar en una instalación para FPLC (de la entidad BioRad).

El material eluido con AcA exento de sales (53 ml) se bombeó con una velocidad de flujo (caudal) de 2 ml/min sobre la columna acabada con HighQ-5 ml, equilibrada con el tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol) y ésta se lavó posteriormente también con este tampón. En la fracción incolora, que había pasado, se encontraba ya una parte de la proteína inactiva, con KCl 0,07 M en el tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol) se eliminó más cantidad de proteínas ajenas y de sustancias acompañantes de color amarillo. En la siguiente etapa del gradiente, con KCl 0,14 M en el tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol), se eluyó la proteína activa, y junto a ella también las sustancias acompañantes de color amarillo. También el material eluido obtenido con KCl 1 M en el tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol) estaba coloreado de amarillo y contenía 1/3 de la proteína aplicada, pero sin actividad de acetil-transferasa. Esta ultima etapa regeneró al mismo tiempo a la columna.

Una gran ventaja de esta etapa de purificación consistía en que el gran volumen del material eluído con AcA se podía concentrar con rapidez y de manera moderada hasta 4 ml (4 fracciones, cada una de 1 ml).

Gradiente	Tiempo (min)	KCl 1 M en el tampón patrón B (%)
	0	0
	35	0
	35	7
	45	7
	45	14
	55	14
	55	100
	70	100

[Material eluido con HighQ: 4 ml, 8,8 mg de proteína, 796 pcat]

Con esta etapa de purificación, se podía conseguir un factor de enriquecimiento de 121% en comparación con el material eluido con AcA, junto con una separación de proteínas ajenas de un 66%.

3.5 Hidroxi-apatito

Se utilizó una columna con CHT II (de la entidad Biorad), que estaba llena con partículas esféricas de hidroxi-apatito, [Ca_{5}(PO_{4})_{3}OH]_{2}. Las proteínas cargadas negativamente se pueden fijar, en presencia de un tampón de fosfato de baja molaridad, primeramente a los cationes de Ca^{2}, y luego pueden ser desplazados desde más altas concentraciones de fosfato en el tampón para elución.

Las proteínas de carácter básico, con un alto valor de pl (punto isoeléctrico), poseen una afinidad con respecto al material de la columna, mayor que las que tienen un pl más bajo. La estructura de hidroxi-apatito, con iones de Ca^{2+} en los centros cargados positivamente y PO_{4}^{3-} en los centros cargados negativamente, proporciona una separación mixta por intercambio de iones. El material eluido con HighQ se bombeó con una velocidad de 0,5 ml/min sobre la columna con CHT II (de 5 ml), equilibrada con un tampón de fosfato (10 mM de Na_{2}HPO_{4} / NaH_{2}PO_{4}, de pH 6,8, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol) y se lavó posteriormente con 12 ml de este tampón. La elución de la proteína activa se efectuó con 160 mM de un tampón de fosfato (20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol). Tampoco en el caso de un aumento adicional de la concentración de fosfato hasta 400 mM se pudo eluir ya ninguna proteína.

\newpage

Gradiente	Tiempo (min)	160 mM de tampón de fosfato (%)
	0	0
	40	0
	40	100
	70	100

Las fracciones recogidas, a razón de 0,5 ml, se comprobaron en cuanto a proteínas y actividad de acetil-transferasa.

[Material eluido con CHT II: 1,5 ml, 0,73 mg de proteína, 578 pcat]

Con esta etapa de purificación se pudo conseguir un factor de enriquecimiento de 8,7 con respecto al material eluido con HighQ, pudiéndose consignar una pérdida de actividad de 27% en el caso de una separación de 92% de proteínas ajenas.

3.6 Cromatografía de afinidad con colorantes en presencia de High Trap Blue

1 ml de HiTrapBlue (de la entidad Pharmacia) contiene el colorante policiclico sintético Cibacron Blue F3G-1, que se había acoplado a una matriz de agarosa. Estos ligandos muestran una cierta similaridad estructural con respecto a moléculas presentes en la naturaleza, tales como los cofactores NAD^{+} y NADP^{+}, lo cual los capacita para fijar a las proteínas de una manera fuerte y específica, entre otras a enzimas, que necesitan sustancias que contengan adenilato. El material de la columna es designado por lo tanto también como "específico para ciertos grupos". La especificidad es relativizada no obstante por el hecho de que, de las enzimas hasta ahora catalogadas, aproximadamente un tercio de ellas necesita una coenzima, que contenga un componente nucleótido. Además, las proteínas pueden fijar también de manera inespecífica a los ligandos aromáticos por interacciones electrostáticas y/o hidrófobas.

La elución se efectúa de una manera específica con el correspondiente cofactor o de manera inespecífica con soluciones salinas.

La acetil-transferasa, que fija a la acetil-CoA que contiene fosfo-adenosil-difosfato, se adsorbía al material de color azul de la columna y se eluia inespecíficamente con un gradiente lineal de KCl. Para ello, el material eluido con CHT II fue aplicado sobre la columna con High Trap Blue, equilibrada con el tampón patrón B, con una instalación para FPLC (de la entidad Biorad) a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min y se lavó posteriormente con este tampón. La elución de la proteína fijada a la columna se efectuó en el caso de 0,5 ml/min con un gradiente salino lineal de KCl 0-1 M en el tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol) durante 30 min.

Gradiente	Tiempo (min)	KCl 1 M en el tampón patrón B (%)
	0	0
	30	0
	60	100

El tamaño de las fracciones era de 0,5 ml. Las fracciones que contenían la actividad se reunieron luego para la purificación ulterior.

[Material eluido con High Trap Blue: 1,5 ml, 0,05 mg de proteína, 168 pcat]

En comparación con la columna con CHT II, se pudo conseguir en esta etapa de purificación un factor de enriquecimiento de 4,2. En el caso de una separación de 93% de proteínas ajenas, se había de consignar una pérdida de actividad total de 71%.

3.7 Cromatografía de interacción hidrófoba en presencia de fenil-Sepharose

Si a las proteínas disueltas en el medio acuoso se les añaden determinadas sales neutras, tales como por ejemplo (NH_{4})_{2}SO_{4} o KCl, se aumenta la fuerza iónica de la solución. En estas condiciones, las zonas hidrófobas, situadas sobre la superficie de las proteínas, se asocian unas con otras. Exactamente igual se adsorben éstas también a los materiales de las columnas con ligandos hidrófobos y se llega por consiguiente a interacciones hidrófobas (HIC = Hydrophobic Interaction Chromatography = cromatografía de interacción hidrófoba). Estas interacciones se pueden debilitar a continuación de nuevo, utilizando un tampón para elución con una baja concentración salina.

Este principio de purificación exigía por consiguiente ajustar el material eluido con High Trap Blue a una concentración de sulfato de amonio de 0,5 M. Esto se efectuaba mediante adición muy lenta, en porciones, de la cantidad correspondiente de una solución 1 M de sulfato de amonio, enfriada por hielo, en el tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol). A continuación, la solución de proteínas se aplica sobre la mini-columna (1 cm de \diameter x 1,3 cm) equilibrada con (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,5 M en el tampón patrón B. Después de la penetración de ésta en el lecho de gel (fenil-Sepharose, de la entidad Pharmacia), se lava posteriormente con 7 ml de (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,5 M en el tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol). Para la elución de la proteína fijada, se emplea (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,1 M en el tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol). El material eluido se recoge en fracciones, cada una de 0,5 ml, y se determinan la concentración relativa de proteínas y la actividad enzimática. Las fracciones más activas se reunieron y se ensayaron en cuanto a su actividad y a su contenido de proteínas

[Material eluido con fenil-Sepharose: 2,5 ml, 0,001 mg, 6,3 pcat].

Como factor de enriquecimiento con respecto al material eluido con HiTrapBlue, se calculó un valor de 1,9 con una pérdida simultánea de actividad de 96% y una separación de 98% de las proteínas ajenas.

3.8 Cromatografía de afinidad con colorantes en presencia de Mimetic-Grün 1A-6 XL

Tal como ya se ha señalado en el caso de la columna con High Trap Blue, también en el caso de este material aparecen interacciones entre el sitio de fijación al cofactor de una enzima con el ligando de colorante. Solamente las enzimas fijadas, dependientes del cofactor, se pueden eludir entonces con el cofactor, en el caso presente la acetil-coenzima A. Las proteínas adsorbidas inespecíficamente permanecen en tal caso todavía sobre la columna.

Antes de que el material eluido con fenil-Sepharose pudiera ser añadido con pipeta a la columna con Mimetic-Grün (1 cm de \diameter x 1,2 cm, de Affinity Chromatography Ltd, Freeport, Ballasalla, Isla de Man), éste tuvo que ser primeramente desalinizado, lo cual se realizó de nuevo con una columna con PD10 (de la entidad Pharmacia). Para ello, los 2,5 ml del material eluido con fenil-Spharose se aplicaron sobre la columna con PD10 y se les dejó penetrar en ella. La elución se efectuó con el tampón patrón B (50 mM de Tris/HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto.etanol), siendo desechados los primeros 0,5 ml del material eluido y siendo recogidos los 2,5 ml adicionales, que contenían la proteína activa.

Esta solución de enzima se añadió con pipeta a una columna con Mimetic-Grün, lavada con el tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol) (1 cm de \diameter x 1,2 cm). Después de que ésta hubo penetrado en el lecho del gel, se eluyó sin ninguna bomba sucesivamente con las siguientes soluciones: 3 ml del tampón patrón B (50 mM de Tris / HCl, de pH 8,5, 20% de glicerol, 20 mM de 2-mercapto-etanol), 3 ml de la acetil-coenzima A 0,5 mM enn el tampón patrón B, 2 ml de tampón patrón B, 3 ml de KCl 1 M en el tampón patrón B. En tal caso se recogieron fracciones de 1 ml y se comprobaron en cuanto a la existencia de proteínas y de actividad de la acetil-coenzima A.

El material eluido con acetil-coenzima A contenía, como única fracción, una actividad de acetil-transferasa. Ni en la fracción que había pasado ni en el material eluido con KCl se pudo medir ninguna actividad.

Antes de la determinación de la actividad en el material eluido con acetil-CoA se tuvo que eliminar primeramente el cofactor a partir de la solución. Mediante la gran fracción agrupada de la acetil-coenzima A no marcada, la pequeña proporción de la acetil-CoA marcada con ^{14}C estaría tan diluida que prácticamente no se hubiera convertido ningún substrato radiactivo.

Una eliminación casi total de la acetil-coenzima A se consiguió mediante una columna PD10, tal como antes se ha descrito. Con el material eluido, así obtenido, se pudo llevar a cabo el usual ensayo de actividad. Puesto que en el material eluido con PD10 estaban presentes todavía vestigios de la acetil-CoA, procedentes del tampón de elución, y por lo tanto no se podía conseguir una eliminación completa, en el ensayo de actividad se diluyó la fracción agrupada de la acetil-CoA marcada con ^{14}C, y por consiguiente se obtuvo un valor demasiado pequeño para la actividad y para el factor de purificación.

[Material eluido con Grün: 2,5 ml, 0,0001 mg de proteína, 0,7 pcat].

Mediante esta etapa de purificación, la proteína ajena restante fue separada y se alcanzó un factor de purificación de 1,1 con una pérdida de actividad de 81%.

3.9 Representación colectiva de la purificación y demostración documental de la homogeneidad

Con el procedimiento descrito se obtuvo la buscada acetil - transferasa a partir del extracto bruto mediante una precipitación con sulfato de amonio al 70% y 8 etapas de cromatografía en columna. Con ello se obtuvo una formulación de acetil-transferasa, cuya actividad específica alcanzó un valor 280 veces mayor del material eluido con AcA, siendo de 0,1% el rendimiento total. La gran pérdida de actividad durante la purificación, aunque el material eluido con AcA se había tratado en un día, se puede explicar por la gran inestabilidad de la enzima, así como su sensibilidad frente a valores del pH situados por debajo de pH 8 y frente a iones salinos, entre otros de sulfato de amonio.

Con el fin de comprobar la pureza de la formulación enzimática, se empleó la electroforesis en disco desnaturalizante en presencia de SDS.

Después de haber separado con SDS-PAGE el material eluido concentrado de la columna con Mimetic-Grün y de haberlo coloreado posteriormente de plateado, se mostró solamente 1 banda.

3

Ejemplo 4 Caracterización de la acetil-transferasa a partir de cultivos en suspensión de Taxus chinensis 4.1 Valor óptimo del pH

El valor del pH ejerce una gran influencia sobre la actividad enzimática, puesto que, dependiendo de la acidez de la solución enzimática, se modifican las cargas de los grupos funcionales de determinados aminoácidos. Esto tiene repercusiones sobre la conformación del centro activo de la enzima y, por consiguiente, sobre su actividad. Exactamente igual, el modelo de protonización de determinados substratos es dependiente del valor del pH y por consiguiente puede influir igualmente sobre la actividad enzimática.

Para la determinación del intervalo óptimo de valores de pH se midió la transferencia de la acetil-coenzima A sobre 10-desacetil-taxuyunanina C a diferentes valores del pH, desde un pH de 5 hasta un pH de 11. Para ello se emplearon 5,6 pcat (1,7 \mug, 50 \mul) de una acetil-transferasa enriquecida a 120 veces (material eluido con High Trap Blue) en las siguientes tandas:

Tandas:	50 \mul de Tris 0,8 M, de pH 8,5
	50 \mul de acetil-transferasa (5,6 pcat, 1,7 \mug, enriquecida en 120 veces).
	30 \mul de la acetil-coenzima A (5 nmol, inclusive 0,02 \muCi de [2-^{14}C]acetil-coenzima A
	5 \mul de 10-desacetil-taxuyunanina C 3 mM (15 nmol)
	50 \mul de Millipore - agua
Incubación:	durante 25 min a 35ºC.

En tales casos, las tandas fueron incubadas previamente sin acetil-coenzima A durante 5 min, después de ello se comenzó la reacción mediante adición del cofactor. Después de un período de tiempo de incubación de 25 min a 35ºC, se detuvo la reacción mediante acidificación y extracción por agitación con terc.-butil-metil-éter. La radiactividad contenida en el extracto con éter se valoró mediante un contador de escintilación. La actividad de acetil-transferasa se extiende a lo largo del intervalo relativamente estrecho de valores del pH de 8,5-9, estando el valor óptimo del pH situado en un pH de 9. Las velocidades de reacción semimáximas se han de encontrar en un pH de 6,8 y un pH de 10,8.

La purificación se llevó a cabo a un pH de 8,5, puesto que entonces se encontraba, en el caso de las columnas de afinidad, en la fracción que había pasado menos cantidad de proteína activa que a un pH de 9.

4.2 Valor óptimo de la temperatura

Junto a la manifiesta influencia, que ejerce el valor del pH sobre la actividad enzimática, la actividad enzimática muestra también una gran dependencia con respecto de la temperatura de incubación. En primer lugar, con una temperatura creciente aumenta la actividad enzimática, pero, a partir de una determinada temperatura, que es específica para cada enzima, ésta disminuye de nuevo con rapidez. A estos altos valores de la temperatura se efectúan una desnaturalización y una desactivación de la enzima. Con el fin de determinar el valor óptimo de la temperatura para la acetil-transferasa, 1,7 \mug (5,6 pcat) de la enzima purificada en 120 veces se incubaron a unas temperaturas de 0ºC a 50ºC primeramente durante 10 min sin acetil-coenzima, y luego durante otros 25 min después de la adición del cofactor. La detención de la reacción se efectuó mediante adición de 20 \mul de H_{2}SO_{4} al 12%. Después de ello, la taxuyunanina C formada se extrajo por agitación con 600 \mul de un éter. La evaluación de la cantidad formada de producto se llevó a cabo mediante un contador de escintilación.

Tandas:	50 \mul de Tris 0,8 M, de pH 8,5
	50 \mul de acetil - transferasa (5,6 pcat, 1,7 \mug de proteína, enriquecida en 120 veces).
	30 \mul de la acetil-coenzima A (5 nmol, inclusive 0,02 \muCi de [2-^{14}C]AcCoA)
	5 \mul de 10-desacetil-taxuyunanina C 3 mM (15 nmol)
	50 \mul de Millipore
Incubación:	durante 25 min a la respectiva temperatura.

El valor óptimo de la temperatura de la acetil-transferasa está situado en 35ºC.

4.3 Punto isoeléctrico

El punto isoeléctrico se determinó mediante enfoque cromatográfico. Para ello, se utiliza un intercambiador de aniones especial, p.ej. Mono P HR 5/20 (de la entidad Pharmacia), sobre el que se había aplicado la deseada enzima a un valor del pH, en el que éste se presentaba en forma de un anión. En estas condiciones de partida, la enzima se fija al material de la columna y luego se puede eluir con una mezcla tamponadora que contiene un anfolito (Polybuffer 94, de la entidad Pharmacia), que forma un gradiente de valores del pH a través de la columna. La enzima se disuelve desde el material intercambiador de aniones exactamente cuando el valor del pH ha disminuido de tal manera, que éste pasa desde el estado aniónico al estado formalmente no cargado. Este valor del pH corresponde al punto isoeléctrico (IEP).

Para la acetil-transferasa se determinó con un puesto de trabajo BioLogic FPLC Workstation (de la entidad Biorad) en presencia de una columna con Mono P HR 5/20 (0,5 cm de \diameter x 20 cm, de la entidad Pharmacia), a una velocidad de flujo de 0,7 ml/min. Esta columna fue equilibrada con 25 mM de imidazol / HCl de pH 7,4 y se cargó con el material eluido con HigHQ. Para ello, 1 ml del material eluido con HighQ se concentró por evaporación hasta 100 \mul con aparatos concentradores Centriprep (de 30 kD) y se diluyó hasta 6 ml con el tampón de imidazol antes mencionado. Aquí se utilizó una proteína de esta etapa de purificación, puesto que mediante el enfoque cromatográfico se tenia que contar con una alta pérdida de actividad, y en el material eluido con HighQ estaba presente la actividad más alta (en pcat/ml). La columna se lavó posteriormente con 10 ml de un tampón de iniciación, y con 40 ml de Polybuffer 74 (diluido a 1:8 con Millipore-agua, de pH 4) se eluyó la proteína desde la columna. Se recogieron fracciones de 1 ml, realizándose que para conservar la actividad a bajos valores del pH en una de cada 2 fracciones se dispusieron previamente 100 \mul de Tris 0,8 M de pH 8,5. En las fracciones situadas entremedias se midió el valor del
pH.

Con el fin de determinar la fracción activa, una parte alicuota de una de cada 2 fracciones se incubó durante 30 min en la siguiente tanda:

Tandas:	200 \mul de una solución de enzima (tamponada a un pH de 8,5)
	\begin{minipage}[t]{136mm} 30 \mul de la acetil-coenzima A (5 nmol, allí estaban contenidos 0,02 \muCi de [2-^{14}C]acetil-CoA \end{minipage}
	5 \mul de 10-desacetil-taxuyunanina C 3 mM (15 nmol)
Incubación:	durante 30 min a 35ºC.

La valoración se efectúa mediante un contador de escintilación, después de haber extraído por agitación con terc.-butil-metil-éter.

La actividad principal se eluia en el intervalo de los valores del pH de 5,7 y 5,47, de manera tal que se pudo determinar que el punto isoeléctrico de la acetil-transferasa era de pH 5,6.

4.4 Determinación de los pesos moleculares

Para la determinación del peso molecular de la acetil-transferasa se emplearon dos métodos diferentes: la filtración en gel en presencia de una columna calibrada de filtración a través de gel, y la electroforesis en SDS-gel.

La primera se llevó a cabo en una columna con Biosilect-SEC 250-5 (de Biorad) (equilibrada con 50 mM de Tris, de pH 8,5, 10 mM de 2-mercapto-etanol, en una instalación para FPLC (BioLogic Workstation, de Biorad), con una velocidad de flujo de 0,2 ml/min. Primeramente, la columna se calibró con proteínas, cuyo peso molecular era conocido. En condiciones idénticas, se eluyeron a través de la columna entonces 1,5 ml de material eluido con High Trap Blue, que se había concentrado por evaporación con aparatos concentradores de Centriprep (2 ml, membrana de 10 kD) hasta 100 \mul (3.360 pcat, 50 \mug de proteína). El tamaño de las fracciones fue de 250 \mul y la actividad del material eluido se determinó por incubación de las siguientes tandas (185 \mul de volumen total).

Tandas:	50 \mul de Tris 0,8 M, de pH 8,5
	100 \mul de material eluido
	\begin{minipage}[t]{136mm} 30 \mul de la acetil-CoA (5 nmol, allí estaban contenidos adicionalmente 0,02 \muCi de [2-^{14}C]acetil CoA) \end{minipage}
	5 \mul de 10-desacetil-taxuyunanina C 3 mM (15 nmol)
Incubación:	durante 30 min a 35ºC.

La evaluación se efectuó mediante un contador de escintilación después de haber extraído por agitación con terc.-butil-metil-éter.

Para la acetil-transferasa se calculó con este método un peso molecular de 72 kD.

Con el fin de comprobar este valor, se empleó la electroforesis en gel de SDS desnaturalizante. Para ello, se cromatografiaron 0,3 \mug de una proteína homogénea en un gel de SDS al 10% paralelamente con proteínas marcadoras que tenían un peso molecular conocido (marcador de arco iris). Mediante coloración plateada se hicieron visibles las proteínas, de manera tal que por comparación de los valores de Rf de las proteínas de calibración y de la acetil-transferasa se pudo determinar para esta última un peso molecular de 70,8 kD.

4.5 Determinación del valor de K_{M}

Determinación del valor de K_{M} para 10-desacetil-taxuyunanina C

Con el fin de sacar conclusiones acerca de la afinidad de la acetil-transferasa con la 10-desacetil-taxuyunanina C, se determinó el valor de K_{M} con el material eluido con fenil-Sepharose.

Tandas:	50 \mul de Tris 0,8 M, de pH 8,5
	\begin{minipage}[t]{136mm} 100 \mul de acetil - transferasa (0,25 pcat, 40 ng de proteína, enriquecida en 225 veces) \end{minipage}
	\begin{minipage}[t]{136mm} 30 \mul de la acetil-coenzima A (5 nmol, en ellos adicionalmente 0,02 \muCi de [2-^{14}C]acetil CoA) \end{minipage}
	10 \mul de 10-desacetil-taxuyunanina C
	[Concentración final: 0,1/0,3/1/3/5/10/30/50/100/200/300/500 \muM).
Incubación:	\begin{minipage}[t]{136mm} durante 30 min a 35^{o}C; evaluación de la radiactividad extraída con terc.-butil-metil-éter mediante un contador de escintilación. \end{minipage}

Mediante registro doble - recíproco de los resultados de la medición de acuerdo con LINEWEAVER y BURK, se pudo determinar gráficamente que el valor de K_{M} era de 23 \muM para la 10-desacetil-taxuyunanina C.

4.6 Determinación del valor de K_{M} para la acetil-coenzima A

La afinidad de la acetil-transferasa con la acetil-coenzima A se puede describir mediante el valor de K_{M}, que se determinó con el material eluido con fenil-Sepharose.

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Tandas: \+ 50  \mu l de Tris 0,8 M, pH 8,5\cr 
\+ \begin{minipage}[t]{136mm} 100  \mu l de acetil - transferasa
(0,25 pcat, 440 ng de proteína, enriquecida en 225 veces)
\end{minipage} \cr  \+ 30  \mu l de la
acetil  -  coenzima A y H _{2} O\cr  \+
 \begin{minipage}[t]{136mm} [Concentración final
2,1/2,3/3/5/12/32/52/102/152/202/302/502  \mu M, estando  contenidos
en cada caso 2  \mu M (40.000 cpm) de
[2- ^{14} C]acetil  CoA).
\end{minipage} \cr  \+ 5  \mu l de
10  -  desacetil  -  taxuyunanina 3 mM (15
nmol)\cr  Incubación: \+  \begin{minipage}[t]{136mm} durante 30
min a 35 ^{o} C, a continuación se efectuó la evaluación mediante
extracción por agitación con terc.-butil-metil-éter
y el contador de escintilación. Por registro doble - recíproco de
los valores medidos de acuerdo con LINEWEAVER y BURK se pudo
determinar que el valor de K _{n}  para la acetil- coenzima A era de
61  \mu M. 
\end{minipage} \cr}

4.7 Índice de conversión k_{cat}

El índice de conversión (en inglés Turnover) describe la velocidad de reacción de una reacción enzimática, realizándose que ésta indica cuantas moléculas de substrato por segundo habían sido convertidas por una molécula de enzima.

Para la determinación del índice de conversión, se utilizó un material eluido con fenil-Sepharose. La concentración de la acetil-transferasa allí contenida se determinó por separación del material eluido mediante una electroforesis en SDS-gel de poli-(acrilamida) y subsiguiente coloración plateada. En los vestigios contiguos del gel se habían aplicado cantidades conocidas de albúmina de suero bovino como concentraciones de comparación.

Con 300 \mul de una solución enzimática, que correspondían a 18 ng de acetil-transferasa, 10-desacetil-taxuyunanina C y acetil-coenzima A, se registró una cinética del grado de conversión, que transcurría de manera lineal en el intervalo de 5 a 30 min

Tandas:	50 \mul de Tris 0,8 M, de pH 8,5
	300 \mul de acetil-transferasa (18 ng de acetil-transferasa, 0,76 pcat)
	30 \mul de la acetil-coenzima (5 mmol) contenidos allí 0,02 \muCi de [2-^{14}C]AcCoA)
	5 \mul de 10-desacetil-taxuyunanina C 3 mM (15 nmol)
Incubación:	durante 30 min a 35ºC.

Las tandas de incubación se extrajeron a continuación por agitación con terc.-butil-metil-éter y se evaluaron con el contador de escintilación. A partir de los valores medidos, se pudo calcular el grado de conversión (en pmol). Si se divide el peso molecular (72 kD) por la cantidad de enzima (18 mg), se obtiene una concentración de enzima de 0,25 pmol en la tanda.

La actividad enzimática se calcula determinando el grado de conversión por unidad de tiempo (s = segundos). El cociente de la actividad enzimática (0,05 pmol/s) y la concentración de enzima (0,25 pmol) proporciona para el índice de conversión de la acetil-transferasa un valor de 0,2 cat/mol de enzima homógenea (mol/s/mol de enzima).

Turnover = índice de conversión k_{cat}: 0,05 pmol/s: 0,25 pmol = 0,2 cat/mol.

Esto corresponde a un grado de conversión de 0,2 moles de substrato por segundo y por mol (72 kg) de enzima a 35ºC, de pH 8,5, y cantidades óptimas de substrato (60 moles de 10-desacetil-taxuyunanina C, 20 moles de la acetil-CoA).

4.8 Valor óptimo cinético

En condiciones fisiológicas, la concentración del substrato es muy pequeña en relación con la concentración de la enzima. Solamente está ocupada una pequeña parte de los centros activos de la enzima, de manera tal que la cantidad de las enzimas [E] no ocupadas por el substrato corresponde aproximadamente a la cantidad total de enzimas [E_{0}].

Si la concentración del substrato [S] está situada muy por debajo de la K_{M}, que es la concentración a la que es semimáxima la velocidad inicial de la reacción, la reacción enzimática transcurre de una manera manifiestamente más lenta que lo que se expresa por el índice de conversión k_{cat}.

Para la caracterización de una enzima en estas condiciones, se utiliza el cociente k_{cat}/K_{M}. Si este valor se multiplica por la concentración de substrato [S] y por la cantidad total de enzima [E_{0}], se obtiene la velocidad de reacción

v = (k_{cat}/K_{M}) [S] [E_{0}]

En este caso, hay que tener en cuenta que la velocidad de difusión de las moléculas disueltas en el medio acuoso puede ser como máximo de 10^{8} a 10^{9}. También en el caso de enzimas muy rápidas, se limita por consiguiente la velocidad de reacción, puesto que el substrato no puede llegar a la enzima con mayor rapidez.

Para la acetil-transferasa, el valor óptimo cinético se calcula de la siguiente manera:

K_{M} (de la 10-desacetil-taxuyunanina C) = 23 \muM, k_{cat} = 0,2 cat/mol

K_{cat}/K_{m} = 0,2 mol s^{-1} mol^{-1}/ 23\cdot10^{-3}[M] = 8,7 s^{-1} M^{-1}.

Ejemplo 5 Especificidad para el substrato

Con el fin de comprobar la especificidad para el substrato de la acetil – transferasa purificada, se emplearon como substrato diferentes compuestos con el entramado fundamental del taxano.

- 10-desacetil-taxuyunanina C

- 14-desacetil-taxuyunanina C

- 10,14-desacetil-taxuyunanina C

- 2,10,14-desacetil-taxuyunanina C

- 5,10,14-desacetil-taxuyunanina C

- 2,5,10,14-desacetil-taxuyunanina C

- 2,14-desacetil-taxuyunanina C

- 5,14-desacetil-taxuyunanina C

- 2,5-desacetil-10,14-desacetil-taxuyunanina C

- 10-desacetil-bacatina III (= 10-DAB III)

- 10-desacetil-taxol

- 10-desacetil-cefalomanina

- 10-epi-10-DAB-III

- 19-hidroxi-10-DAB-III

- 14-hidroxi-10-DAB-III

- 7-TES-10-DAB-III

- 7-BOC-10-DAB-III

Se comprobó que por los substratos empleados solamente se pueden convertir taxanos con un grupo hidroxilo en la posición C-10. Los derivados de taxano con una posición C-10 acetilada, pero con grupos hidroxilo libres en otros carbonos, no fueron aceptados como substratos por la acetil-transferasa purificada. Sin embargo, si el acceso al C-10 está bloqueado por sustituyentes que llenan el espacio, tal como en el caso del 10-desacetil-taxol y de la 10-desacetil-cefalomanina, no se produce ninguna acetilación.

Al realizar el cálculo de los grados de conversión, referidos al grado de conversión de la 10-desacetil-taxuyunanina C se demostró que todos los derivados de taxuyunanina C con un grupo hidroxilo libre eran convertidos en el mismo grado. La 10-DAB es convertida en bacatina III con un grado de conversión de 85% en comparación con la desacetil-taxuyunanina C.

El grado de conversión de diferentes substratos, referidos al grado de conversión de la desacetil-taxuyunanina C, se representa en la siguiente Tabla.

Grado de conversión de diferentes substratos, referido al grado de conversión de la 10-desacetil-taxuyunanina C

10-desacetil-taxuyunanina C

Enzima: material eluido con fenil-Sepharose (purificado en 225 veces).

Substrato	Grado de conversión [%]	pcat
10-desacetil-taxuyunanina C	100	1,12
10-desacetil-bacatina III	80	0,9
10,14-desacetil-taxuyunanina C	102	1,14
2,10,14-desacetil-taxuyunanina C,	81	0,91
5,10,14-desacetil-taxuyunanina C	88	0,99
2,5,10,14-desacetil-taxuyunanina C	53	0,59
10-epi-10-DAB-III	0	0
19-hidroxi-10-DAB-III	38	0,43
14-hidroxi-10-DAB-IIII	97	1,09
7-TES-10-DAB III	0	0
7-BOC-10-DAB III	2	2

Claims

1. Procedimiento para la preparación de bacatina y/o derivados de bacatina,

caracterizado porque

se hace reaccionar 10-desacetil-bacatina o un derivado de 10-desacetil-bacatina en presencia de una enzima aislada y de un agente donante de acetilo, utilizándose como enzima una acetil-transferasa que tiene un peso molecular de 70 a 72 kD, determinado por medio de una SDS-PAGE con un punto isoeléctrico de pH 5,4 a 5,8 y una constante K_{M} de Michaelis Menten para la acetil-coenzima A de 55 a 65 \muM, que es obtenible a partir de cultivos de células de Taxus chinensis.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1,

caracterizado porque

se prepara bacatina-III a partir de 10-desacetil-bacatina.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1,

caracterizado porque

se prepara 14-hidroxi-bacatina III a partir de 14-hidroxi-10-desacetil-bacatina.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1,

caracterizado porque

se prepara taxuyunanina C a partir de 10-desacetil-taxuyunanina C.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo en presencia de la acetil-coenzima A como agente donante de acetilo.

6. Enzima,

caracterizada porque

a) acetila selectivamente en la posición 10 a la 10-desacetil-bacatina en presencia de un agente donante de acetilo, en particular la acetil-coenzima A,

b) tiene un peso molecular de 70 a 72 kD, determinado por una SDS-PAGE, y

c) tiene un punto isoeléctrico de pH 5,4 a 5,8,

d) tiene una constante K_{M} de Michaelis Menten para la acetil-coenzima A de 55 a 65 \muM,

e) es una 10-hidroxitaxa-O-acetil - transferasa y

f) es obtenible a partir de cultivos de células de Taxus chinensis.

7. Enzima de acuerdo con la reivindicación 6,

caracterizada porque

se presenta en una pureza de > 50%.

8. Enzima de acuerdo con la reivindicación 7,

caracterizada porque

se presenta en una pureza de > 90%.

9. Procedimiento para la preparación de una enzima de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 8,

caracterizado porque

la enzima se aísla por purificación a partir de Taxus chinensis, y después de cada purificación se determinan las fracciones en la que se presenta la enzima, añadiendo 10-desacetil-bacatina o un derivado de 10-desacetil-bacatina y un agente donante de acetilo, y detectando el producto de acetilación que se ha formado.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9,

caracterizado porque

los procesos de purificación comprenden la utilización de una columna con HighQ.

11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 ó 10,

caracterizado porque

se utiliza 10-desacetil-bacatina III o 10-desacetil-taxuyunanina C para la detección de las fracciones que contienen la enzima.

12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 11,

caracterizado porque

la acetil-coenzima A se utiliza como agente donante de acetilo.

13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 12,

caracterizado porque

la detección del producto de acetilación formado se lleva a cabo mediante una marcación radiactiva.

14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 12,

caracterizado porque

la detección del producto de acetilación formado se efectúa mediante una marcación con un isótopo pesado.

15. Procedimiento para la preparación de taxol y/o derivados de taxol,

caracterizado porque

primeramente se prepara bacatina o un derivado de bacatina de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, y este compuesto se hace reaccionar por esterificación del grupo OH, situado en la posición 13 del derivado de bacatina, con un ácido apropiado, para formar taxol o un derivado de taxol.