KR20010040647A - 백캐틴의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 백캐틴 및/또는 백캐틴 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 방법에 따르면, 10-데아세틸백캐틴 또는 10-데아세틸백캐틴 유도체는 분리된 효소 및 아세틸 공여체의 존재하에 반응된다. SDS-PAGE에 의해 측정한 바 70 내지 72 kD의 분자량을 갖는 아세틸 전이효소가 효소로서 사용된다. 상기 아세틸 전이효소는 택수스 치넨시스(Taxus chinensis) 세포 배양물로 부터 얻어질 수 있다.
Description
본 발명은, 상응하는 10-데아세틸 화합물의 선택적인 아세틸화에 의한 백캐틴 또는 백캐틴 유도체의 제조 방법, 이 아세틸화 반응을 촉진하는 분리된 효소 및 이 효소의 제조 방법에 관한 것이다.
탁솔(taxol)은, 항백혈 및 종양-억제 활성을 갖는 암을 치료하기 위한 유망한 약품이다 (예컨대, M. Suffnes와 그의 동료들의 "알칼로이드, 화학 및 약학", A. Brossi, Ed., Academic Press: Orlando, FL, 1985, 25권, 제1장 참조). 원래 탁솔은 특정한 주목 나무의 껍질로 부터 얻어졌다(Taxus taxaceae). 그러나, 나무껍질로 부터 탁솔을 분리하는 것은 어렵고 비용이 많이 들며, 요구되는 탁솔이 나무 껍질로 부터 단지 매우 낮은 수율(40 내지 165mg/kg)로 얻어진다(예컨대, R.W. Miller와 그의 동료들의 J. Org. Chem. 46 (1981) 1469-1474; V. Senilh와 그의 동료들의 J. Nat. Procl. 47 (1984) 131-137; N. Magri와 그의 동료의 J. Org. Chem. 51 (1986) 797-802). 더욱이, 나무껍질의 사용은 주목 나무를 매우 천천히 퇴행시켜 죽이므로, 개시 물질을 한정적으로 공급한다.
암에 대한 화학치료제로서 사용하기 위해 추천되는 탁솔의 특성을 발견한 이래로, 합성 또는 반-합성 방법에 의하여 화합물을 제조하기 위해 상당한 노력을 기울여 왔다. 따라서, 유기 합성에 의한 탁솔 구조를 제조하기 위해 시도해 왔다(예컨대, W.F. Berkowitz와 그의 동료들의 J. Org. Chem. 52 (1987) 1119-1124 참조). 그러나, 분자의 복잡성 때문에, 지금까지는 전체 유기 합성에 의해 사실상 유용한 양으로 탁솔을 제조할 수 없었다.
탁솔을 얻기 위해 사용되는 추가적 루트는 대량으로 쉽게 얻을 수 있는 전구물질로 부터 시작되는 부분적 합성이다. 이 루트들 중 하나는 택수스 백캐타 엘(Taxus baccata L)의 잎들로 부터 다량으로 쉽게 추출될 수 있는 10-데아세틸백캐틴-Ⅲ로 개시된다(G. Chauviere와 그의 동료들의 Seances Acad. Sci., Ser. 2, 1981, 293, 501-503). 여기서, 잎 1kg 당 약 1g의 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ을 분리할 수 있는데, 이 잎들은 다시 급속히 생장한다. 따라서, 다량의 전구물질 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ을 얻는 것은 혹종의 문제점 없이 가능하다.
요구되는 활성 화합물 탁솔은 부분 합성에 의해 생물학적 물질로 부터 얻어지는 이 전구물질로 부터 제조될 수 있다. 그러나, 이 부분적 합성은 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ 및 탁솔의 구조와 유사할 수 있으므로 상당한 문제점을 여전히 야기시키므로, 대부분의 부분들에 대하여 특정 보호 그룹만을 사용함으로써 성공적으로 수행될 수 있어 이로써 낮은 수율의 요구 생성물 탁솔이 얻어질 수 있다.
Denis와 그의 동료들 (J. Am. Chem. Soc. 110 (1998), 5917-5919)은 두 단계로 탁솔을 제공하는 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ의 합성법에 대하여 기술하고 있다. 제 1 단계에서, 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ은 10-위치에 화학적으로 아세틸화된다. 제 2 단계에서, 백캐틴은 탁솔로 전환된다. 그러나, 제 1 단계는 위치특이성이 없으므로 또한 10-데아세틸백캐틴의 아세틸화가 특히 위치 7에서 일어난다. 이 때문에 보호 그룹을 사용함으로써 아세틸화에 대항하여 이 위치에 하이드록실 그룹을 블록킹시킬 필요가 있다. 10-위치에서의 배타적인 아세틸화는 단지 보호 그룹을 사용하여 달성될 수 있다. 그러나, 보호 그룹의 사용은 두개 이상의 가공단계(보호 그룹의 도입 및 제거)를 수반하므로, 한편으로는 비용이 많이들고, 다른 한편으로는 얻어지는 생성물의 수율을 상당히 감소시킨다. 보호 그룹을 사용하는 또 다른 단점은, 특히 생성물이 제약적 활성 화합물로서 사용되는 경우 생성물 내에 존재하는 보호 그룹을 여전히 가지고 있는 분자들이 없도록 확실히 하기 위해서 복잡한 정제 및 분석 방법이 연속적으로 수행되어야 한다는 점이다.
Zocher와 그의 동료들 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 229 (1996), 16-20)은 탁솔 생물합성에 관하여 기술하고 있다. 여기서, 중간 단계인, 백캐틴 Ⅲ를 제공하는 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ의 아세틸화는 택수스 배캐타(Taxus baccata)의 뿌리로 부터 얻어진 조 식물 추출물의 도움으로 수행되었다. 그러나, 아세틸화를 초래하는 기질들을 분리 또는 특성화하는 것은 불가능하다. 조 추출물을 사용하는 것의 단점은 조 추출물 내에 존재하는 기질에 의해 수많은 다른 반응, 특히 다른 위치에서 아세틸화가 개시되거나 영향받을 수 있다는 것이다. 더욱이, 조 식물 추출물은 정의되고 재생가능한 조성물을 가지지 않으므로 이 조 식물 추출물의 사용은 조절불가능하고 다양한 반응 및 수율을 얻게한다.
따라서, 본 발명의 목적은 위치 10에서 상응하는 10-데아세틸 화합물의 선택적인 아세틸화에 의해 백캐틴 및 백캐틴과 같은 백캐틴 유도체를 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 이 반응을 특히 촉진하는 분리된 물질을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 이 목적들은, 10-데아세틸백캐틴 또는 10-데아세틸백캐틴 유도체가 분리된 효소, 즉 SDS-PAGE에 의한 측정에 의해 약 70 내지 72 kD의 분자량을 갖는 아세틸 전이효소로서 이 전이효소가 택수스 치넨시스(Taxus chinensis) 세포 배양물에 의해 얻어질 수 있는 효소 및 아세틸 공여체의 존재하에 반응하는 것을 특징으로 하는 백캐틴 또는 백캐틴 유도체를 제조하는 방법에 의해 달성된다. 이는 위치 10에서의 위치선택성 아세틸화가 현탁된 택수스 치넨시스(Taxus chinensis) 세포 배양물로 부터 얻어질 수 있는 분리된 효소에 의해 촉진되는 것이 발견되었다. 놀랍게도, 분리되고 정제된 효소를 사용하는 것은 위치 10에서 아세틸화에 관하여 높은 위치특이성을 달성시킬 수 있게 한다는 것이 발견되었다. 이 특이성은 바람직하게 〉80%, 더 바람직하게는 〉90%이고, 가장 바람직하게는 〉95%이다. 본 발명에 따라 사용되는 효소를 사용하는 것은 〉99%의 특이성을 달성하게 하는 것으로 발견되었다. 여기서, 〉80%의 특이성이라함은 아세틸화가 위치 10에서 80% 이상으로, 개시 물질의 다른 위치에서 20% 미만으로 일어남을 의미하는 것이다. 결과적으로, 본 발명에 따른 효소가 사용되는 경우는 결국 이 다른 하이드록시 그룹의 아세틸화가 매우 한정된 범위에서만 일어나므로, 개시 물질에 존재하는 다른 하이드록시 그룹들은 보호 그룹으로 블록킹될 필요가 없다.
놀랍게도, 본 발명에 따라 사용되는 효소는 높은 기질 특이성을 갖는 것으로 발견되었다. 따라서, C10-위치 및 이 부근에서의 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ와 같은 구조를 갖는 10-데아세틸백캐틴 또는 10-데아세틸백캐틴 유도체는 전환되었다. 특히, 위치 10에 접근한 곳에 있는 백캐틴 유도체는 부피가 큰 치환체, 예컨대 10-데아세틸탁솔 및 10-아세틸-세팔로만닌으로 블록킹되지 않으며, 아세틸되지도 않는다. 따라서 본 발명에 따른 효소에 의해 기질로서 인식되는 백캐틴 유도체에 대한 선행조건은, 탁산 고리 구조를 갖는 이 유도체들이 위치 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13 내 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ, 즉 이들이 작은 부피를 갖는 치환체 또는 상기 위치에서의 혹종의 다른 치환체를 갖지 않는 것에 필수적으로 해당하는 것이다. 위치 7 내지 13에서 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ으로서 동일한 치환체를 갖거나, 또는 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ의 치환체 더 작은 부피를 갖는 적어도 몇몇의 치환체, 특히 수소를 갖는 백캐틴 유도체가 상기 방법에 있어 적당하다. 다른 위치에 있는 부피가 큰 치환체들은 반응을 방해하지 않는다. 본 방법은 특히 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ을 아세틸화하는 데 사용되는 것이 바람직하다. 더욱이, 본 방법은 위치 10에서 14-하이드록시-10-데아세틸백캐틴 Ⅲ을 선택적으로 아세틸화하기 위해 사용되는 것이 바람직하다.
대조적으로, 예컨대, 위치 7에서의 하이드록시 그룹이 7-TES-10-DAB Ⅲ 또는 7-BOC-10-DBA Ⅲ과 같은 부피가 큰 보호 그룹에 의해 블록킹되는 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ 유도체는 본 발명에 따른 효소에 의해 기질로서 인식되지 않는다. 그러나, 위치 10에서의 위치선택성 아세틸화는 기타 하이드록실 그룹이 기타 위치에 존재하는 경우에 일어나므로 이러한 블록킹은 불필요하다.
본 발명에 따른 방법을 사용하면, 선택적으로 위치 10의 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ 보다 위치 7 내지 13의 동일하거나 더 적은 부피 큰 치환체를 갖는 탄산 유도체를 아세틸화하는 것이 가능하다. 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ에 존재하는 치환체들이 존재하거나 더 작거나 동일한 부피를 갖는 라디칼, 특히 수소로 대체되는 이러한 탁산 유도체는 본원에 언급된 용어 10-디아세킬백캐틴 유도체에 포함되며, 이들이 위치 10에서 OH 그룹을 갖는 경우, 이와는 다르게 위치특이성 아세틸화될 수 있다. 이러한 유도체들의 예로는 10-데아세틸택서윤나닌 C (10-deacetyltaxuyunnanin C), 10,14-데아세틸택서윤나닌 C, 2,10,14-데아세틸택서윤나닌 C 및 2,5,10,14-데아세틸택서윤나닌 C가 있다.
본 발명에 따른 방법은 아세틸 공여체의 존재하에 수행된다. 적당한 아세틸 공여체는 원칙상 10-데아세틸 개시 물질의 촉매 전환율로 아세틸 그룹을 공여하는 혹종의 물질이다. 반응은 바람직하게 아세틸 공여체 아세틸 조효소 A의 존재하에 수행된다.
기술적 관점에서, 분리된 효소의 본 발명에 따른 사용은 많은 이점을 제공한다. 특히 전환 속도의 관점 및 재생산성의 관점에서, 본 발명은 분리된 효소가 사용되는 경우 쉽게 조절될 수 있다.
바람직하게 사용되는 효소는 pH 5.4 내지 5.8, 바람직하게는 5.5 내지 5.7 및 특히 5.6의 등전점을 갖는다. 더욱이, 본 발명에 따라 사용되는 효소는 55 내지 65㎛, 바람직하게는 59 내지 63μM 및 특히 61μM의 아세틸 조효소 A에 대한 Michaelis 상수 KM을 갖는다.
더욱이 본 발명은 a) 이는 위치 10에서 선택적으로 아세틸 공여체, 특히 아세틸 조효소 A의 존재하에 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ을 아세틸화하고, b) SDS-PAGE로 측정한 바 70 내지 72kD의 분자량을 가지며, c) 택수스 치넨시스(Taxus chinensis) 세포 배양물에 의해 얻을 수 있다는 점을 특징으로 하는 분리된 효소를 제공한다.
본 발명에 따른 효소는 바람직하게 〉50%, 특히 〉80%, 더 바람직하게는 〉90% 및 가장 바람직하게는 〉95%의 순도로 존재한다. 본 발명에 따른 효소는 이것이 위치 10에서 선택적으로 아세틸 공여체, 특히 아세틸 CoA의 존재하에 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ을 아세틸화한다는 점에서 구별된다. 이는 특히 위치 1, 7 및 13 에서 10-데아세틸백캐틴Ⅲ의 다른 하이드록실 그룹의 아세틸화가 사실상 관찰되지 않았음을 의미하는 것이다. 아세틸화 반응은 특히 위치 10에 관하여 〉50%, 바람직하게는 〉80%, 더 바람직하게는 〉90% 및 가장 바람직하게는 〉95%의 선택성을 갖는다.
분리된 효소는 더욱이 SDS-PAGE로 측정한 바 70 내지 72kD의 분자량을 갖는 것을 특징으로 한다. 분자량을 측정하기 위해, 0.3㎍의 균일한 단백질은 공지된 분자량의 마커(Marker) 단백질 (Rainbow Marker)과 동시에 변성화 10% 농도의 SDS 겔 내에서 크로마토그래피로 수행되었다. 단백질은 은 오염(staining)에 의해 가시화될 수 있이며, 분자량은 본 발명에 따른 보정 단백질 및 효소의 Rf 값을 비교하여 측정되었다. SDS 겔 전기영동에 의해 측정되어진 분자량은 적당한 겔 여과 칼럼을 사용하는 겔 여과에 의해 확인되었다. 겔 여과는, FPLC 장치 (Biologic Workstation, Biorad) 내 50mM의 트리스, pH 8.5, 20mM의 2-머캡토에탄올을 사용하여 0.2ml/분의 유속으로 평형유지된 바이오실렉트-SEC 250-5 칼럼(Biorad)를 사용하여 수행되었다. 공지된 분자량의 단백질을 사용하여 칼럼을 초기 보정하였다. 그후, 동일한 조건하에, 본 발명에 따른 50μg의 단백질은 칼럼을 통하여 통과되었다. 용출액 중 250㎕ 분획물들을 수집하고, 후술되는 바와 같이 용출액의 활성을 측정하였다. 공지된 표준을 갖는 용출 시간과 비교하여 분자량을 측정하였다.
본 발명에 따른 효소는 택수스 치넨시스(Taxus chinensis) 세포 배양물로 부터 분리될 수 있다. 이는 pH 5.5 내지 5.7, 바람직하게는 5.5 내지 5.7 및 특히 pH 5.6의 등전점을 갖는다. 더욱이, 사용된 효소에 대하여 발견된 Michaelis Menten 상수 KM은 아세틸 조효소 A에 대하여 55 내지 65μM, 바람직하게는 59 내지 63μM 및 특히 61μM이었다.
본 발명에 따른 효소는 아세틸 전이효소, 특히 아세틸 CoA 10-하이드록시탁산-O-아세틸 전이효소이다.
더욱이, 본 발명은 상술된 효소의 제조 방법을 제공하는 것이며, 이는 효소가 공지된 정제 방법을 사용하여 효소-함유 공급원으로 부터 분리되고, 각각의 정제 후 효소가 존재하는 부분들이 10-데아세틸백캐틴 또는 10-데아세틸백캐틴 유도체 및 아세틸 공여체를 가함으로써 측정되며, 생성된 아세틸화 생성물이 검출되는 것을 특징으로 하는 상술된 효소의 제조 방법을 제공한다.
사용된 효소-함유 공급원은, 예컨대 식물 추출물일 수 있다. 사용되는 효소-함유 공급원은 바람직하게 세포 배양물이다. 세포 배양물을 사용하는 것이 대량의 개시 물질이 얻어질 수 있으므로 유리하다. 효소-함유 공급원으로서 조 추출물을 사용하는 것과 비교하여, 세포 배양물을 사용하는 경우, 대량의 개시 물질에 기인하여 고 순도로 효소를 정제하는 것이 가능하다. Taxus chinensis, 예컨대 Taxus chinensis 세포 배양물로 부터 비롯하는 개시물질을 사용하여 특정한 선택물이 주어진다.
개시물질로 부터 효소를 정제하기 위하여, 효소 또는 단백질의 분리를 위한 공지된 정제 방법을 사용하는 것이 가능하다. 바람직하게 사용되는 방법은 조 추출물로 부터 암모늄 설페이트 침전, 또한 예컨대 Sephadex G-25 칼럼의 사용과 같은 크로마토그래피 정제 방법, 예컨대 DEAE-Sephacel을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 Ultrogel AcA 44을 사용한 겔 여과, HighQ을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피, 수산화인회석 칼럼을 사용한 크로마토그래피, 예컨대 High Trap Blue를 사용한 염료 친화성 크로마토그래피, 예컨대 페닐 세파로스를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 모의 녹색(Mimetic Green) 1A6XL을 사용한 염료 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 정제는 바람직하게 HighQ에 의한 음이온 교환 크로마토그래피가 사용되는 한개 이상의 단계를 포함한다. HighQ 칼럼은 리간드로서 -N+(CH3)3그룹을 갖는 음이온 교환기이다. 이 정제 단계에서는 특히 위치 10 이외의 위치에서 아세틸화를 촉진하는 물질이 제거된다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 분획물들의 효소 활성은 어떤 분획물들이 효소를 함유하는지 측정하기 위해 각각의 정제 단계 후 측정되었다. 이 때문에, 분획물 또는 상기 분획물의 엘리콧은 상술한 바와 같이 10-데아세틸백캐틴 또는 10-데아세틸백캐틴 유도체 및 아세틸 공여체와 혼합되었다. 요구되는 효소가 존재하는 분획물에 있어서는 위치 10에서 아세틸화된 생성물이 검출될 수 있다. 이 테스트를 위하여 10-데아세틸백캐틴Ⅲ 또는 10-데아세틸택서윤나닌 C를 사용하는 것이 바람직하다. 생성된 아세틸화 생성물은 개시 물질 내 적당한 마커(marker) 그룹을 사용하여 검출될 수 있다. 표지(labelled) 아세틸 공여체를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 표지 아세틸 공여체는 위치 10에 아세틸화된 생성물을 측정하기 위해 사용될 수 있는 표지 아세틸 그룹을 포함한다. 방사능으로 표지된 아세틸 공여체를 사용하는 것이 바람직하다. 여기서, 적당한 방사성 마커 그룹은13C 및14C이다. 사용된 아세틸 공여체는 특히 바람직하게 아세틸 조효소 A, 특히 [2-14C]-아세틸 조효소이다.
무거운 동위원소로 표지하기 위해 사용하는 검출을 수행하는 것이 또한 가능하다. 이 경우에 있어서, 반응 생성물은 질량분석기로 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 효소를 사용하여 백캐틴 또는 백캐틴 유도체를 제조하는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 10-위치에 특이적으로 아세틸화되는 백캐틴 또는 탁산 화합물을 제조하는 것이 가능하다. 이러한 화합물들은 특히 탁솔의 부분 합성법을 위한 개시 물질로서 관심을 끈다. 따라서, 본 발명은 또한 상술된 방법에 의해 제조된 백캐틴 또는 백캐틴 유도체가 공지된 방법으로 반응하여 탁솔 또는 탁솔 유도체를 제공한다는 점을 특징으로 하는 탁솔 및/또는 탁솔 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 탁솔 또는 탁솔 유도체를 제공하기 위한 백캐틴 또는 백캐틴 유도체의 부분적 전환은 선행 기술로 기술되어 있으며, 이는 백캐틴 유도체의 위치 13의 하이드록실 그룹에서 적당한 치환체의 도입을 필수적으로 수반시킨다. 결과적으로 이 목적을 위해 적당한 백캐틴 유도체는 위치 13에서는 적어도 자유로운 OH그룹을 갖는다.
탁솔 또는 탁솔 유도체를 제공하는 백캐틴 유도체의 반응은 특히 적당한 산과 함께 백캐틴 유도체의 위치 13의 OH그룹을 에스테르화함으로써 수행된다. 이러한 방법들은 예컨대 미국 특허 제 4,814,470 호(Colin와 그의 동료들), 미국 특허 제 4,924,011 호(Denis와 그의 동료들), 미국 특허 제 5,476,954 호(Bourzat와 그의 동료들) 및 Denis와 그의 동료들의 J. Am. Chem. Soc. 110(1988), 5917-5919와 같은 문헌들에 상세히 기술되어 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명된다.
실시예 1
택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 세포 현탁물의 배양
사용된 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 현탁 배양물은 Munich 대학교의 약 생물학 연구소로 부터 수집되었으며, 이들은 T. chinensis 나무의 침엽으로 부터 얻어진 것이다. 이 배양물들을 14일 동안 약 24℃, 100rpm 및 1500lux로 생장시켰다. 이후, 살균된 50ml 피펫을 사용하여, 150ml의 세표 현탁물을 250ml의 B5 + 1배지, 즉 (Gamborg, Miller, Ojima: 실험 연구, 1968, 50, 151-158쪽에 따라 개질된) B5 + 1배지의 조성물로 옮겼다.
NZ 아민을 고압 및 냉각시킨 후, 살균 상태하에 살균 저장 용액(10g/l)으로서 배지에 가하였다.
이 접종후 3째날, (Serva사로 부터 입수한) 30μM의 메틸 야스모네이트를 가하고, 배양물을 추가의 4일동안 생장시켰다 (Gundlach, H., Muller, M. J., Kutchan, T.M., Zenk, M.H., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 89, 2389-2393쪽). 이후, 진공 여과에 의해 배지로 부터 세포들을 분리하였고, 액체 질소로 부터 충격 냉각 후, 이 세포들을 효소 침연시켰다. 그러나, 세포들을 한달 미만 동안 -20℃로 저장하는 것 또한 가능하였다; 이 후, 요구되는 효소의 활성은 상당히 감소되었다.
실시예 2
아세틸전이효소 활성의 측정을 위한 효소 테스트
효소를 정제, 특성화 및 검출할 수 있기 위해서는 단순하고 충분히 민감한 테스트 방법이 사용되는 것이 필수적이다. 이 경우에 있어, 이는 생성된 생성물의 검출, 예컨대 10-데아세틸택서윤나닌으로 부터의 택서윤나닌 C의 검출이고, 확실한 방법이 이 목적을 위해 개발되었다.
테스트하기에 충분한 양의 효소 용액을 Eppendorf cap 내 50㎕의 트리스 완충용액 (0.8M, pH 8.5)에 피펫팅하였다. 이후, DMSO 내 용해된 10-데아세틸택서윤나닌 C의 3mM 저장 용액 (15mmol) 및 30㎕의 정제된 아세틸 CoA (5nmol의 분류되지 않은 0.02 μCi-[2-14C] 아세틸 조효소 A)을 (단지 이 탁산 대신 이에 상응하는 양의 DMSO를 조절하기 위해) 가하였다. 이 혼합물을 30분 동안 35℃에서 배양하고, 20㎕의 12% H2SO4를 사용하여 산화하고, 생성된 택서윤나닌 C는 600㎕의 터트-부틸 메틸 에테르를 사용하여 추출되었으며 (오버헤드 교반기 내 10분), 이후 혼합물을 원심분리시켰다 (Eppendorf 원심분리기 내 14,000rpm로 4분). 여전히 존재하는 반응하지 않은 [2-14C]아세틸 CoA는 수성상에 남아있었다. 500㎕의 유기상을 공기 증기로 건조시켜 증발시켰더니, 초기 산성화로 인하여 산으로서 존재하고 휘발성인 혹종의 [2-14C] 아세트산이 점차적으로 제거되었다. 섬광계측기 (Beckmann사로 부터 입수한 다목적 섬광계측기 LS 6500) 또는 박-층 방사스캐너 (Berthold사로 부터 입수한 자동 TLC 선형 분석장치)를 사용하여, 생성된 생성물의 유형 및 양을 측정하였다. 전자의 장치가 전환율을 측정하기 위해 사용되었으며, 따라서 cpm값을 사용하여 효소의 활성도를 계산하였다. 박-층 크로마토그래피(TLC)(이동상 : 7:3의 클로로포름:아세토니트릴) 및 연이은 방사스캐너의 분석을 토대로, 섬광계측기를 사용하여 측정된 방사능이 진실로 기대된 생성물의 Rf값의 영역의 피크에 해당하는지를 검토하는 것이 가능하다.
실시예 3
아세틸 전이효소의 정제
3.1. Sephadex G25에 의한 조직 침연(meceration) 및 탈염
조 단백질 추출물을 얻기 위해서, 접종 후 3일째 30μM의 메틸 야소네이트로 도출된 7일 지난 현탁 배양물을 사용하였다. 흡입으로 깨끗하게 여과되는 200g의 세포는 액체 질소로 충격-냉각되었다. 이후, 얼음-냉각된 모르타르에 있어서, 이 세포들은 20g의 PVPP로 혼합되었고, 400ml의 표준 완충용액 A(100mM의 보르산/NaOH, pH 8.5, 20%의 글리세롤, 20mM의 2-메캡토에탄올)을 사용하여 교반되어 방해되었다. PVPP는 추가의 정제 방법을 방해하는 몇몇의 페놀, 특히 추출물 내 존재하는 매질화제를 결착시킨다. 이후, 균일한 세포 펄프를 4개 층의 천(mull)을 통하여 여과시키고, 프레스-쥬스를 15,000 ×g(10분, SS34 로터)로 원심분리하였다.
얼음-냉각된 상청액을 표준 완충용액 A(100mM의 보르산/NaOH, pH 8.5, 20% 글리세롤, 20mM의 2-머캡토에탄올)로 현탁된 50ml의 칼슘 포스페이트 겔과 혼합하였다. 그 부피 양은 2500rpm으로 원심분리를 10분 동안 한 후 얻어지는 겔의 함량으로서 이는 1.9g의 Ca3(PO4)2(건조 중량)에 해당한다. 이 혼합물을 10분 동안 경우에 따라 교반하면서 얼음-중탕 내에 정치시켰다. 이 시간 동안, 예컨대 과량으로 존재하는 유제제(tanning agent)와 같은 수반되는 물질은 겔로 흡수될 수 있다. 용액에 잔류하는 아세틸 전이효소는 연이은 원심분리(6000 ×g, 5분, GSA 로터)에 의해 겔 물질로 부터 분리되었다.
겔 펠릿을, 몇몇의 아세틸 전이 효소가 겔로 흡수되고 이 처리후 상층액으로 방출되기 때문에, 연이어 한번 이상의 70ml 표준 완충용액 A로 테이크업하고 5분 동안 유리 막대로 교반한 후 추가의 5분 동안 6000rpm(GSA 로터)로 원심분리하였다. 칼슘 포스페이트 겔이 사용되지 않는 경우는, 수반되는 물질이 여전히 존재하여 혼합기 세포의 멤브레인을 급속히 블록시키고, 연이서 사용된 칼럼의 색이 흑갈색으로 변하게 하며, 이들의 결합능력을 급격히 감소시키므로 추가의 정제 공정이 있어야 한다는 것이 주로 어려운점이다.
천천히 교반하면서, 수거된 얼음-냉각된 상층액을 70%의 포화액에 도달할 때 까지 약간 혼합하고, 부가를 종료한 후 추가의 30분 동안 계속해서 천천히 교반하였다. 이 침전된 단백질을 연이어 15,000rpm(10분, SS34 로터)로 펠릿화하였다. 이 침전물을 조심스럽게 30ml의 표준 완충용액 B(50mM 트리스/HCl, pH 8.5, 20%의 글리세롤, 20mM의 2-머켑토-에탄올)로 재현탁시키고, 이 완충용액 및 Sephadex G25칼럼을 사용하여 탈염화하였으며, 동일한 시간으로 60%의 이종 단백질(foreign protein)을 분리제거하였다.
[G25 용출액: 82ml, 78mg의 단백질]
3.2. DEAE Sephacel에 의한 음이온 교환 크로마토그래피
DEAE Sephacel은 양전하를 띤 디에틸아미노에틸 라디칼들이 결합된 개질된 셀룰로스이다. 용해된 단백질의 등전점이 사용된 완충용액 보다 산성인 경우, 이들은 음이온으로서 존재하며 따라서 양전하를 띤 칼럼 물질에 결착될 수 있다. 예컨대, Cl-또는 내 SO4 2-와 같은 보다 강한 음이온의 부가는 흡수된 단백질 및 DEAE 그룹의 정전기 상호작용을 감소시킨다. 결국, 단백질 음이온은 무기 음이온으로 교환되며, 따라서 효소는 용출된다.
이 정제 단계에 있어서, 24.4%의 이종 단백질, 또한 특히 수반된 물질, 특히 페놀-함유 유제제(tanning agent)가 제거되었다. 심지어 첫번째 사용하는 동안, 흑갈색으로 변화된 칼럼 물질의 색, 하지만 1M의 NaOH를 사용하여 사실상 이를 정제할 수 있다. 이 단계는 후에 정제 공정에서 사용되는 칼럼의 오염을 감소시킨다.
칼럼을 세척하기 위해 사용되는 30ml의 표준 완충용액 B(50ml 트리스/HCl, pH 8.5, 20%의 글리세롤, 20mM의 머캡토에탄올)를 포함하는 DEAE 칼럼(2.5cm φ×5cm)의 초기 흐름 통과는 혼합기 세포(Amicon, 400ml, 맴브레인 PM 10) 내 가압 여과에 의해 농축되어 5ml의 부피가 된다.
[DEAE 용출액: 110ml, 59mg의 단백질]
3.3 Ultrogel AcA 44에 의한 겔 여과
겔 여과의 원칙은, 예컨대 단백질과 같은 거대 분자가 규정된 구멍 크기(부피는 제외함)를 갖는 매트릭스와 이 크기 및 형태에 의존하는 주위 액체들 사이에서 분포된다는 것을 근거로 한다. 너무 커서 겔 구멍 안으로 침투할 수 없는 분자는 입자들을 통과시키고, 결국 이들로 침투되지는 않지만 초기에 구멍에 의해 지연되는 중간-크기의 단백질 보다 급속히 용출된다. 더 작은 분자, 특히 염이온 조차도 초기에는 구멍에 들어가고, 이들은 가장 긴 시간 동안 잔류하기 때문에, 특정 잔류 시간 후 이들을 이탈시킨다.
이 기술은, 사실상 물질과 단백질간에 상호작용이 없기 때문에 가장 양호한 것이므로 특별한 완충용액을 사용할 필요가 없다.
더욱이, 더 작은 이온들, 이 경우 설페이트 이온들은 활성 단백질 보다 더 오랫동안 칼럼에 잔류하므로 용출액은 완전히 탈염된다.
사용된 겔은 10-130kD(Serve사로 부터 입수한 Ultrogel AcA 44)의 분획 범위에 적당한 폴리아크릴아미드 아가로스 겔이었다.
농축된 단백질 용액은 20ml/시간의 유속에서 표준 완충용액 B로 평형을 유지하는 칼럼(2.8cm φ×100cm)을 사용하여 밤새도록 분리되었다. 60개의 분획물들(각각 6.5ml)을 단백질 함량 및 아세틸 전이효소 활성도에 대하여 테스트하였다. 주 활성도를 나타내는 분획물들을 수거하여 추가로 정제하였다.
이 용출액을 사용하여, 아세틸 전이효소의 특정 활성도를 측정하는 것이 가능하였다. 박-층 크로마토그램은 또한 낮은 Rf값에서의 별개 피크들 뿐만 아니라, 택서윤나닌크의 Rf값의 크기에서의 피크를 나타내었다. [AcA 용출액: 53ml, 25.7mg, 724pcat의 전체 활성도는 100%임]. 이 겔 여과로, 57%의 이종 단백질을 분리제거하였다.
3.4 HighQ에 의한 음이온 교환 크로마토그래피
DEAE 칼럼과 같이, 리간드로서 -N+(CH3)3그룹을 갖는 HighQ 칼럼은 음이온 교환기이지만, 전자의 강한 음이온 교환기와는 대조적으로 예컨대 이의 이온화 상태는 넓은 pH 범위에 의해 변화되지 않는다. 해리도 및 결국 약한 교환기의 교환 용량이 상이한 pH 값에서 상당히 다양하다. HighQ 칼럼 물질은 약 10㎛의 크기를 갖는 빽빽하게 채워진 수지 입자들로 구성되기 때문에, 높은 역압이 있는 경우 칼럼은 (Biorad로 부터 입수한) FPLC 장치를 사용하여 작동되어야 한다. 염이 배제된 AcA 용출액(53ml)은 HighQ 5ml의 미리 준비된 칼럼 상에 펌핑되었고, 이는 표준 2ml/분의 유속을 사용하여 표준 완충용액 B로 평형 유지되었으며, 칼럼은 동일한 완충용액으로 세척되었다. 무색의 초기 흐름통과물은 이미 불활성 단백질의 일부를 함유하며, 추가의 이종 단백질 및 황색의 수반되는 물질은 표준 완충용액 B(50mM 트리스/HCl, pH 8.5, 20% 글리세롤, 20mM의 2-머캡토에탄올) 내 0.07M의 KCl을 사용하여 제거되었다. 활성 단백질 및 추가로 또한 황색의 수반되는 물질은 표준 완충용액 B(50mM 트리스/HCl, pH 8.5, 20% 글리세롤, 20mM 2-머캡토에탄올) 내 0.14M의 KCl, 경사도의 다음 단계에서 용출되었다. 표준 완충용액 B(50mM 트리스/HCl, pH8.5, 20% 글리세롤, 20mM 2-머캡토에탄올) 내 1M의 KCl을 사용하여 얻어진 용출액은 또한 황색이며, 로딩되었던 단백질의 1/3을 함유하지만, 아세틸 전이효소 활성도는 없었다. 이 최종 단계에서, 칼럼은 점차적으로 재발생되었다.
이 정제 단계의 가장 큰 이점은 큰 부피의 AcA 용출액이 빠르고 부드럽게 4ml(각각 1ml의 4개 분획물)로 농축된다는 것이다.
[HighQ 용출액: 4ml, 8.8mg의 단백질, 796pcat]
이 정제 단계는 AcA 용출액과 비교하여 121%의 농축인자 및, 이종 단백질의 66% 제거율을 달성하였다.
3.5 수산화인회석(hydroxyapatite)
사용된 칼럼은 구형 수산화인회석[Ca5(PO4)3OH]2입자들로 채워진 (Biorad사로 부터 입수한) CHT Ⅱ 칼럼이었다. 낮은 분자량의 포스페이트 완충용액의 존재하에, 음전하를 띤 단백질은 초기에 Ca2 +음이온으로 결착된 후 용출 완충용액 내에서 보다 높은 포스페이트 농도로 교체될 수 있다.
높은 pl을 갖는 기본 단백질은 상대적으로 낮은 pl을 갖는 것 보다 칼럼 물질에 대하여 상대적으로 높은 친화성을 갖는다. 양전하를 띤 중심 내 Ca2+이온 및 음전하를 띤 중심 내 PO4 3-을 갖는 수산화인회석 구조는 혼합된 이온 교환 분리를 야기시킨다. HighQ 용출액은 포스페이트 완충용액(10mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH6.8, 20% 글리세롤, 20mM 2-머캡토에탄올)으로 평형 유지된 CHT Ⅱ 칼럼(5mml) 상에 0.5ml/분의 유속으로 펌핑된 후, 그 칼럼은 12ml의 이 완충용액으로 세척되었다. 활성 단백질은 160mM 포스페이트 완충용액의 농도(20% 글리세롤, 20mM 2-머캡토에탄올)로 용출되었다. 포스페이트 농도가 400mM로 증가되는 경우, 단백질은 더 이상 용출될 수 없다.
수집된 0.5ml 분획물들을 단백질 및 아세틸 전이효소 활성도에 대하여 측정하였다. [CHT Ⅱ 용출액: 1.5ml, 0.73mg의 단백질, 578pcat]
이 정제 단계는 HighQ 용출액과 비교하여 8.7의 농축인자를 달성시켰고, 92%의 이종 단백질 제거로 수거되어, 27%의 활성 손실을 가져왔다.
3.6 High Trap Blue에 의한 염료 친화성 크로마토그래피
(Pharmacia사로 부터 입수된) HiTrapBlue 1ml은 아가로스 매트릭스와 커플링되는 합성 폴리사이클릭 염료 Cibacron Blue F3 G-A를 함유한다. 이 리간드는 공동인자 NAD+및 NADP+와 같은 중성적으로 나타나는 분자와 특정한 구조 유사성을 나타내고, 이는 이들이 단백질, 상세히 말하면 특히 아데닐레이트-함유 물질을 요구하는 효소를 강하게 결착시킨다. 따라서, 칼럼 물질은 또한 "그룹-특이성"으로서 설명되어진다. 그러나, 특이성은 본원에 기술된 효소의 약 1/3이 뉴클레오티드 성분을 함유하는 조효소를 필요라 한다는 사실로 한정된다. 더욱이, 단백질은 또한 정전기 및/또는 소수성 상호작용에 기하여 원자 리간드에 대하여 비특이적으로 결합될 수 있다.
용출은 적당한 공동요소와 특이적으로 또는 염 용액과 비특이적으로 일어난다.
포스포아데노실 디포스페이트-함유 아세틸 CoA과 결착되는 아세틸 전이효쇼는 청색 칼럼 물질에 흡수되고 선형 KCl 기울기를 이용하여 비특이적으로 용출되었다. 이 목적을 위하여, CHT Ⅱ 용출액은 표준 완충용액 B로 평형 유지되는 High Trap Blue 칼럼 상에 0.5ml/분의 유속으로 (Biorad사로 부터 입수한) FPLC 장치 내 로딩되었고, 이 칼럼은 이 완충용액으로 세척되었다. 칼럼에 결착된 단백질은 30분 동안 표준 완충용액 B(50mM의 트리스/HCl, pH8.5, 20% 글리세롤, 20mM 2-머캡토에탄올) 내 0 - 1M KCl의 선형 염 기울기를 사용하여 0.5ml/분으로 용출되었다.
분획물 부피는 0.5ml이었다. 활성을 함유하는 분획물들을 추가의 정제로 수거하였다.
[High Trap Blue 용출액: 1.5ml, 0.05g의 단백질, 168pcat]
CHT Ⅱ 칼럼과 비교하여, 4.2의 농축인자가 이 정제 단계에서 달성되었다. 이종 단백질의 93% 제거는 71%의 전체 활성 손실과 관련이 있다.
3.7 페닐세파로스 상의 소수성 상호작용 크로마토그래피
예컨대, (NH4)2SO4또는 KCl과 같은 특정 중성염은 수성 배지 내 용해된 단백질에 가해지고, 용액의 이온 농도는 증가되었다. 이 조건하에, 단백질 표면 상의 소수성 부분들이 결합된다. 동일한 방법에 있어서, 이는 또한 소수성 리간드를 갖는 칼럼 물질 상에 흡수되며, 결과적으로 소수성 상호작용이 있다 (HIC=소수성 상호작용 크로마토그래피). 이 상호작용은 낮은 염 농도를 갖는 용출 완충용액을 사용하여 결과적으로 다시 감소될 수 있다.
이 정제 원리에 대하여, 0.5M 암모늄 설페이트의 농도로 High Trap Blue 용출액을 적정할 필요가 있다. 이는 표준 완충용액 B(50mM 트리스/HCl, pH 8.5, 20%의 글리세롤, 20m의 머텝토에탄올) 내 적당량의 얼음-냉각된 1M의 암모늄 설페이트 용액을 동시에 매우 천천히 약간 가함으로써 달성되었다. 그후에 단백질 용액을 표준 완충용액 B 내 0.5M (NH4)2SO4로 평형 유지되는 미니 칼럼(1cm φ×1.3cm)에 로딩시켰다. 단백질 용액을 겔 배드(Pharmacia사로 부터 입수한 페닐세파로스)로 침투시킨 후, 칼럼을 표준용액 내 7ml의 0.5M (NH4)2SO4로 세척하였다. 결착된 단백질을 용출하기 위해, 표준 완충용액 B(50mM 트리스, HCl, pH8.5, 20% 글리세롤, 20mM 2-머캡토에탄올) 내 0.1M (NH4)2SO4가 사용된다. 용출액은 각각 0.5ml의 분획물들로 수집되고, 상대적 단백질 농도 및 효소 활성도가 측정된다. 가장 활성적인 분획물들을 수집하고, 활성도 및 단백질 함량에 대하여 측정하였다.
[페닐세파로스 용출액: 2.5ml, 0.001mg, 6.3pcat]
HiTrapBlue 용출액과 비교하여, 96%의 활성도 점차적인 손실과 98%의 이종 단백질의 제거와 함께 농축인자는 1.9로 계산되었다.
3.8 모의 녹색(Mimetic Green) 1A-6XL 상의 염료 친화성 크로마토그래피
High Trap Blue 칼럼에 대하여 이미 언급한 바와 같이, 이 물질들의 염료 리간드와 효소의 공동인자 결착 부위 사이에도 상호작용이 있다.
단지 공동인자-독립 결착된 효소들은, 아세틸 조효소가 존재하는 경우에 있어 또한 공동인자를 사용하여 용출될 수 있다. 비특이적으로 흡수된 단백질들은 칼럼 상에 잔류한다.
페닐세파로스 용출액이 모의 녹색(Mimetic Green) 칼럼(1cm φ×1.2cm, 친화성 크로마토그래피 lTD., Freeport, Ballasalla, Isle of Man) 상에 피펫팅될 수 있기 전에 탈염되어야 하며, 이는 교대로 (Pharmacia사로 부터 입수한) PD10 칼럼을 사용하여 수행되었다. 이 종료를 위하여, 2.5ml의 페닐세파로스 용출액을 PD 10 칼럼에 적용하여 이 안에 침투되게 하였다. 용출은 표준 완충용액 B(50ml 트리스/HCl, pH 8.5, 20% 글리세롤, 20mM 2-머캡토에탄올)을 사용하여 수행되었고, 첫번째 버려지는 0.5ml의 용출액 및 다음 2.5ml이 수집되는데 이는 활성 단백질을 함유한다.
이 효소 용액은 표준 완충용액 B(50mM 트리스/HCl, pH 8.5, 20% 글리세롤, 20mM 2-머캡토에탄올)로 세척되었던 모의 녹색 칼럼(1cm φ×1.2cm) 상에 피펫팅되었다. 이 용액은 겔 배드에 침투된 후, 펌프의 없이 다음과 같은 용액을 연속적으로 사용하여 용출되었다 : 3ml의 표준 완충용액 B(50mM 트리스/HCl, pH 8.5, 20% 글리세롤, 20mM 2-머탭토에탄올), 표준 완충용액 B 내 0.5mM 아세틸 조효소 A 3ml, 2ml의 표준 완충용액 B, 표준 완충용액 B 내 1M KCl 3ml. 1ml 분획물들을 수집하여 단백질 및 아세틸 조효소 A 활성도에 대하여 테스트하였다.
아세틸 조효소 A 용출액은 아세틸 전이효소 활성도를 함유하는 분획물이었다. 초기 흐름 통과물 또는 KCl 용출액은 모두 혹종의 활성을 함유하지 않는다.
아세틸 CoA 용출액 내 활성도를 측정하기에 앞서, 보조인자는 용액으로 부터 제거되어야 한다. 큰 풀의 표지되지 않은 아세틸 조효소 A는 사실상 방사성 물질이 전환되지 않을 정도의 범위로 작은 양의14C-표지된 아세틸 CoA를 희석시킬 것이다.
아세틸 조효소 A는 상술한 바와 같이 PD 10 칼럼을 사용하여 거의 완전하게 제거되었다. 통상의 활성 테스트는 이 방법으로 얻어지는 용출액 상에서 수행되었다. 그러나, PD 10 용출액은 여전히 용출 완충용액으로 부터 아세틸 CoA의 흔적을 함유하기 때문에, 즉 완전한 제거가 달성되지 않았으므로 풀의14C-표지된 CoA가 활성 테스트로 희석되어 아주 낮은 활성 및 정제인자 값을 제공한다.
[녹색 용출액; 2.5ml, 0.0001mg의 단백질, 0.7pcat]
이 정제 단계에 있어서, 잔류하는 이종 단백질이 제거되어 81%의 활성도 손실에서 1.1의 정제 인자가 얻어졌다.
3.9 정제법의 요약 및 동일성의 증거
기술된 방법을 사용하여, 요구되는 아세틸 전이효소가 70% 농도 암모늄 설페이트 침전물 및 8단계의 칼럼 크로마토그래피에 의해 조 추출물로 부터 얻어졌다. 이는 특이 활성이 AcA 용출액의 값에 280배이고 전체 수율이 0.1%인 아세틸 전이효소 침전물을 제공한다. 심지어 AcA 용출액이 하루만에 세척되더라도 정제 동안의 활성도의 큰 손실은 효소의 상당한 불안정도 및 pH8 미만의 pH값에 대한 및 염 이온, 특히 암모늄 설페이트에 대한 이의 민감도로 표현될 수 있다.
효소 제조의 순도를 확인하기 위해, SDS의 존재하에 디스크 전기영동을 변성하는 것이 사용되었다. SDS-PAGE 및 연이은 은 오염을 사용하는 모방 녹색 칼럼의 농축된 용출액의 분리는 단지 1개의 밴드로 나타내었다.
실시예 4
택수스 치넨시스(Taxus chinensis) 현탁 배양물로 부터 얻은 아세틸 전이효소의 특성화
4.1 pH 최적화
특정 아미노산의 관능 그룹의 전하는 효소 용액의 산성도에 따라 변하므로 pH는 효소의 활성에 상당한 영향을 미친다. 이는 효소의 활성 중심의 형태 및 이에 따른 이의 활성도에 밀접한 관계를 갖는다. 이와는 달리, 혹종의 물질의 단백질화 모양은 pH에 의존되며, 따라서 또한 효소 활성도에 영향을 미칠수 있다.
최적의 pH 범위를 측정하기 위해, 10-데아세틸택서윤나닌 C에 대한 아세틸 조효소 A의 전이는 다양한 pH값, 즉 pH5 내지 pH11에서 측정되었다. 이 목적을 위해, 5.6pcat(1.7㎍, 50㎕)의 120배 농축된 아세틸 전이효소(High Trap Blue 용출액)가 다음과 같은 혼합물로 사용되었다:
혼합물 : 50㎕ 0.8M 트리스, pH 8.5
50㎕ 아세틸 전이효소 (5.6pcat, 1.7㎍, 120-배 농축됨)
30㎕ 아세틸 조효소 A(5nmol, 0.02μCi [2-14C]아세틸 조효소 A를 포함)
5㎕ 3mM 10-데아세틸택서윤나닌 C (15nmol)
50㎕의 밀리포어수(millipore water)
배양 : 35℃에서 25분
혼합물들은 5분 동안 아세틸 조효소 A 없이 미리배양된 후, 보조인자를 가함으로써 반응이 개시되었다. 35℃에서 25분의 배양시간이 경과한 후, 반응은 터트-부틸 메틸 에테르로 추출 및 산성화되어 종료되었다. 에테르 추출물에 존재하는 방사능은 섬광계측기를 사용하여 분석되었다.
아세틸 전이효소 활성도는 상대적으로 좁은 범위의 pH8.5 내지 9에 미치며, 최적의 pH는 pH9이다. 반-최대 전환 속도는 pH6.8 및 pH10.8에서 이다.
이 경우 pH9에서 보다 친화성 칼럼의 초기 흐름통과에 있어 보다 작은 활성 단백질이 존재하기 때문에 정제는 pH8.5에서 수행되었다.
4.2 최적의 온도
효소 활성에 대하여 pH가 상당한 영향을 미치는 것과 아울러, 효소 활성은 또한 배양 온도에도 매우 의존된다. 효소 활성은 초기에는 온도 상승에 따라 증가되지만, 특정한 상승 온도에서 급속히 감소되는데, 이는 각각의 효소에 대하여 독특하다. 이 고온에서는 효소의 변성 및 불활성이 일어난다. 아세틸 전이효소의 최적 온도를 측정하기 위해, 1.7μg(5.6pcat)의 120배 정제된 효소는 0℃ 내지 50℃의 온도에서, 초기에는 아세틸 조효소 없이 10분 동안, 보조인자의 부가 후에는 추가의 25분 동안 배양되었다. 반응물은 20㎕의 12% H2SO4를 가함으로써 급냉되었다. 생성된 택서윤나닌 C는 600㎕의 에테르를 사용하여 추출되었다. 생성된 생성물의 양은 섬광계측기를 사용하여 분석되었다.
혼합물 : 50㎕의 0.8M 트리스, pH 8.5
50㎕의 아세틸 전이효소 A(5.6pcat, 1.7㎍, 120-배 농축됨)
30㎕의 아세틸 조효소 (5nmol, 0.02μCi [2-14C]아세틸 조효소 A를 포함)
5㎕의 3mM 10-데아세틸택서윤나닌 C (15nmol)
50㎕의 밀리포어수(millipore water) [lacuna]
배양 : 각각의 온도에서 25분
아세틸 전이효소에 대한 최적의 온도는 35℃이다.
4.3 등전점
등전점은 크로마토초점조정에 의해 측정되었다. 특수한 음이온 교환기, 예컨대 (Pharmacia사로 부터 입수한) Mono P HR 5/20이 본 목적을 위해 사용되며, 음이온 교환기는 음이온으로서 존재하는 pH에서 요구되는 효소로 로딩되었다. 이 초기 조건하에서, 효소는 칼럼 물질에 결착되며, 칼럼을 통하여 pH 기울기를 형성하는 양염색성세포-함유 완충용액 혼합물(Pharmacia사로 부터 입수한 폴리완충용액 94)을 사용하여 용출될 수 있다. 효소가 음이온성에서 정상적인 전하를 띠지 않는 상태로 변할 만큼의 정도로 pH가 낮아지는 점에서 정확히 음이온 교환기로부터 그 자체가 떼어진다. 이 pH는 등전점(IEP)에 해당한다.
아세틸 전이효소에 대하여, IEP는 0.7ml/분의 유속으로 Mono P HR 5/20 칼럼 (Pharmacia사로 부터 입수함, 0.5cm φ×20cm)를 갖는 (Biorad사로 부터 입수한) BioLogic FPLC Workstation을 사용하여 측정되었다. 이 칼럼은 25mM 이미다졸/HCl pH7.4를 사용하여 평형유지되었으며, HighQ 용출액으로 로딩되었다. 이를 종료하기 위해, 1ml의 HighQ 용출액은 Centriprep 농축기(30kD)를 사용하여 100㎕로 농축된 후, 상술된 이미다졸 완충용액을 사용하여 6ml으로 희석되었다. 가장 높은 활성도(pcat/ml)를 함유하는 HighQ 용출액 및 크로마토초점조정이 높은 손실의 활성도를 초래하게 될 것으로 기대되기 때문에 이 정도 순도의 단백질이 여기에 사용되었다. 칼럼은 10ml의 개시 완충용액으로 세척되었고, 단백질은 40ml의 (밀리포어수(Millipore water)로 1:8로 희석됨, pH 4인)폴리완충용액 74을 사용하여 칼럼으로 부터 용출되었다. 1ml의 분획물들을 수집하였고, 낮은 pH값에서 활성도를 유지시키기 위해, 100㎕의 0.8M 트리스 pH8.5를 초기에 모두 다른 분획물들에 채웠다. pH들은 중간생성물 분획물들로 측정되었다.
활성 분획물을 측정하기 위해서, 모든 다른 분획물의 엘리콧을 다음과 같은 혼합물 내 30분 동안 배양하였다:
혼합물 : 200㎕의 (pH 8.5로 완충된 효소 용액)
30㎕의 아세틸 조효소 A(5nmol, 0.02μCi [2-14C]아세틸 조효소 A를 함유)
5㎕의 3mM 10-데아세틸택서윤나닌 C (15nmol)
배양 : 35℃에서 25분
터트-부틸 메틸 에테르로 추출한 후 섬광계측기를 사용한 분석임.
주 활성도는 5.7 내지 5.47의 pH 범위에서 용출되어, 아세틸 전이효소의 등전점은 pH 5.6인 것으로 측정되었다.
4.4 분자량의 측정
아세틸 전이효소의 분자량을 측정하기 위해, 두개의 상이한 방법을 사용하였다: 보정 겔 여과 칼럼 및 SDS 겔 전기영동을 사용하는 겔 여과방법.
전자는 50mM 트리스, pH8.5, 10mM 2-머캡토에탄올로 평형 유지되는 Biosilect-SEC 250-5 칼럼(Biorad사) 및 0.2ml/분의 유속에서 FPLC 장치(BioLogic Workstation, Biorad)를 사용하여 수행되었다. 우선, 칼럼은 공지된 분자량의 단백질을 사용하여 보정되었다. 동일한 조건하에, Centriprep 농축기(2ml, 멤브레인 10kD)를 사용하여 100㎕(3360pcat, 50㎍의 단백질)로 농축되었던 1.5ml의 High Trap Blue 용출액은 칼럼을 통하여 용출되었다. 이 분획물 크기는 250㎕이었으며, 용출액의 활성도는 다음 혼합물의 배양에 의해 측정되었다(185㎕ 전체 부피):
혼합물 : 50㎕의 0.8M 트리스, pH 8.5
100㎕의 용출액
30㎕의 아세틸-Co A (5nmol, 0.02μCi [2-14C]아세틸 CoA를 부가적으로 함유함)
5㎕의 3mM 10-데아세틸택서윤나닌 C (15nmol)
배양 : 각각의 온도에서 25분
분석은 터트-부틸 메틸 에테르로 추출한 후 섬광계측기를 사용하여 수행되었다.
이 방법을 사용하였더니, 아세틸 전이효소에 대하여 72kD의 분자량이 계산되었다.
이 값을 확인하기 위해, 변성화 SDS 겔 전기영동이 사용되었다. 이 종료를 위해, 0.3㎍의 균일한 단백질은 공지된 분자량을 갖는 마커 단백질과 동시에 10% 농도 SDS 겔로 크로마토그래피가 수행되었다 (Rainbow 표시물). 이 단백질은 은 얼룩으로 가시화되어, 보정 단백질 및 아세틸 전이효소의 Rf값이 비교될 수 있어 후자에 대하여 70.8kD의 분자량이 얻어졌다.
4.5 KM값 측정
10-데아세틸-택서윤나닌 C에 대한 KM의 측정
10-데아세틸택서윤나닌 C에 대한 아세틸 전이효소의 친화성에 대한 정보를 얻기 위해, 페닐세파로스 용출액의 KM값을 측정하였다.
혼합물 : 50㎕의 0.8M 트리스, pH 8.5
100㎕의 아세틸 전이효소 (0.25pcat, 40ng의 단백질, 225-배 농축됨)
30㎕의 아세틸 조효소 A(5nmol, 0.02μCi [2-14C]아세틸 CoA를 추가적으로 함유함)
10㎕의 10-데아세틸택서윤나닌 C (최종농도: 0.1/0.3/1/3/5710/30/50/100/ 200/300/500μM)
배양 : 35℃에서 30분; 터트-부틸 메틸 에테르를 사용하고, 섬광계측기를 사용하여 추출된 방사능의 분석.
Lineweaver 및 Burk에 따른 두곱으로 상호 방법에서 측정된 경과물을 플롯팅함으로써 10-데아세틸택서윤나닌 C에 대한 KM값은 23μM로 도식적으로 측정되었다.
4.6 아세틸 조효소 A에 대한 KM값의 측정
아세틸 조효소 A에 대한 아세틸 전이효소의 친화성은 KM값에 의해 기술될 수 있는데, 이는 페닐세파로스 용출액을 사용하여 측정되었다.
혼합물 : 50㎕의 0.8M 트리스, pH 8.5
100㎕의 아세틸 전이효소 (0.25pcat, 40ng의 단백질, 200-배 농축됨)
30㎕의 아세틸 조효소 A 및 H2O (최종 농도: 2.1/2.3/3/5/12/32/52/102/ 152/202/302/502 μM, 각각은 2μM(40,000cpm) [2-14C]아세틸 CoA를 함유함)
5㎕의 3mM 10-데아세틸택서윤나닌 C (15nmol)
배양 : 35℃에서 30분. 분석은 연이어 터트-부틸 메틸 에테르를 사용한 추출 및 섬광계측기의 사용으로 수행되었다. Lineweaver 및 Burk에 따른 두곱으로 상호 방법에서 측정된 경과물을 플롯팅함으로써 아세틸 조효소 A에 대한 KM값이 61μM에서 측정되었다.
4.7 전환수 kcat
전환수는, 물질 중 얼마나 많은 분자들이 효소 한 분자에 의해 1초당 전환되는지 나타냄으로써 효소 반응의 반응 속도를 기술한 것이다.
전환을 측정하기 위해서, 페닐세파로스 용출액이 사용되었다. 거기에 함유된 아세틸 전이효소의 농도는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 및 연이어 은 얼룩을 사용하여 용출액을 분리함으로써 측정되었다. 공지된 양의 소 혈청 알부민이 겔의 인접 슬롯에 대한 비교 농도로서 사용되었다.
18 ng의 아세틸 전이효소, 10-데아세틸택서윤나닌 C 및 아세틸 조효소 A에 해당하는 300㎕의 효소 용액을 사용하여, 기록된 전환 속도는 5 내지 30분의 범위에서 선형이었다.
혼합물 : 50㎕의 0.8M 트리스, pH 8.5
300㎕의 아세틸 전이효소 (18ng의 아세틸 전이효소, 0.76pcat)
30㎕의 아세틸 조효소 A (5nmol, 0.02 μCi-[2-14C]의 아세틸 CoA를 함유함)
5㎕의 3mM 10-데아세틸택서윤나닌 C (15nmol)
배양 : 35℃에서 30분.
배양 혼합물을 터트-부틸 메틸 에테르로 추출하였고, 연이어 섬광계측기를 사용하여 분석하였다. 전환(pmol)은 측정된 값으로 부터 계산되었다. 효소의 함량(18ng)에 의한 분자량(72kD) 분할은 배치 당 0.25pmol의 효소 농도를 제공한다.
효소 활성은 기준 시간(초) 당 전환수를 측정함으로써 계산된다. 효소 활성(0.05pmol/초) 및 농도 (0.25pmol)의 비율은 아세틸 전이효소의 전환수에 대한 균일한 효소(mol/초/mol의 효소)의 0.2 cat/mol의 값을 제공한다.
전환 = 전환수 kcat: 0.05 pmol/초: 0.25 μ㏖ = 0.2 cat/mol.
이는 35℃, pH8.5하에, 1mol(72kg)의 효소, 및 최적량의 물질(60mol의 10-데아세틸택서윤나닌 C, 20mol의 아세틸 CoA)에 대한 1초당 0.2mol의 전환수에 해당한다.
4.8 반응속도 최적화
생리학 조건하에, 물질의 농도는 효소의 농도와 비교하여 매우 작다. 단지 소수의 효소 활성 중심들이 사용되어, 기질[E]에 차지되지 않은 효소의 양은 거의 효소의 전체량[Eo]에 상응한다.
기질[S]의 농도가 상당히 KM, 초기 반응 속도가 최대치 절반인 농도 미만인 경우, 효소 반응은 전환수 kcat에 의해 언급된 것 보다 상당히 더 느리게 진행된다.
이 조건들하에 효소를 특성화하기 위해, 비율 kcat/KM이 사용된다. 이 값은 기질 농도[S] 및 효소의 전체량[Eo]에 의해 증가되는 경우, 반응속도가 얻어진다.
v = (kcat/kM) [S] [Eo]
수성 매질 내 용해된 분자의 확산 속도는 기껏해야 108내지 109일수 있다는 것이 고려되어야 한다. 따라서, 반응 속도는, 기질이 더 빠르게 효소로 도착될 수 없기 때문에, 매우 빠른 효소에 대하여 심지어 제한된다.
아세틸 전이효소에 대하여 계산된 최적의 반응속도는 다음과 같다:
KM(10-데아세틸택서윤나닌 C) = 23μM, kcat= 0.2 cat/mol
kcat/KM= 0.2 mol s-1mol-1/23·10-3[M] = 8.7 s-1M-1
실시예 5
기질 특이성
정제된 아세틸 전이효소의 기질 특이성을 확인하기 위해, 탁산 골격을 갖는 다양한 화합물을 기질로서 사용하였다.
- 10-데아세틸택서윤나닌 C
- 14-데아세틸택서윤나닌 C
- 10,14-데아세틸택서윤나닌 C
- 2,10,14-데아세틸택서윤나닌 C
- 5,10,14-데아세틸택서윤나닌 C
- 2,5,10,14-데아세틸택서윤나닌 C
- 2,14-데아세틸택서윤나닌 C
- 5,14-데아세틸택서윤나닌 C
- 2,5-데아세틸-10,14-데아세틸택서윤나닌 C
- 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ (=10-DAB Ⅲ)
- 10-데아세틸탁솔
- 10-데아세틸세팔로만닌
- 10-에피-10-DAB Ⅲ
- 19-하이드록시-10-DAB Ⅲ
- 14-하이드록시-10-DAB Ⅲ
- 7-TES-10-DAB Ⅲ
- 7-BOC-10-DAB Ⅲ
사용된 기질들 중 위치 C-10의 하이드록실 그룹을 갖는 탁산만이 전환될 수 있음이 발견되었다. 다른 탄소들에서 유리 하이드록실 그룹을 제외한 아세틸화된 C-10을 갖는 탁산 유도체들은 정제된 아세틸 전이효소를에 의한 기질로서 받아들여지지 않았다. 그러나, C-10에 대한 접근이 큰 부피의 치환체로서 블록킹되는 경우, 10-데아세틸탁솔 및 10-데아세틸세팔로만닌의 경우에는 아세틸화가 발생되지 않았다.
10-데아세틸택서윤나닌 C의 전환율을 기초로하여 전환율을 계산하는 경우, 유리 하이드록실 그룹을 갖는 모든 택서윤나닌 C 유도체가 동일한 정도로 전환되었음을 발견하였다. 10-DAB는 백캐틴 Ⅲ에 대한 10-데아세틸택서윤나닌 C와 비교하여 85%의 전환율로 전환되었다.
데아세틸택서윤나닌 C의 전환율을 기초로 하는 다양한 기질의 전환은 하기 표에 나타나 있다.
10-데아세틸택서윤나닌 C의 전환율을 기초로하는 다양한 기질들의 전환율.
10-데아세틸택서윤나닌 C
효소 : 페닐세파로스 용츨액 (225배 정제됨)
Claims (15)
10-데아세틸백캐틴 또는 10-데아세틸백캐틴 유도체가 분리된 효소 및 아세틸 공여체의 존재하에 반응되는 것을 특징으로 하는 백캐틴 및/또는 백캐틴 유도체를 제조하는 방법으로서, 상기 효소가 pH 5.4 내지 5.8의 등전점, 55 내지 65μM의 아세틸 조효소 A에 대한 Michaelis Menten 상수 KM및 SDS-PAGE에 의한 측정에 의하여 70 내지 72kD의 분자량을 갖는, 택수스 치넨시스(Taxus Chinensis) 세포 배양물로 부터 얻어질 수 있는 아세틸 전이효소인 방법.
제 1 항에 있어서, 백캐틴-Ⅲ가 10-데아세틸백캐틴-Ⅲ로 부터 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 14-하이드록시백캐틴-Ⅲ가 14-하이드록시-10-데아세틸백캐틴-Ⅲ로 부터 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 택서윤나닌 C(taxuyunnanin C)가 10-데아세틸택서윤나닌 C로 부터 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
전기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 반응이 아세틸 공여체로서 아세틸 조효소 A의 존재하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
a) 아세틸 공여체, 특히 아세틸 조효소 A의 존재하에 선택적으로 위치 10에서 10-디아세틸백캐틴 Ⅲ을 아세틸화하고,
b) SDS-PAGE에 의해 측정한 바, 70 내지 72 kD의 분자량을 가지며,
c) pH 5.4 내지 5.8의 등전점을 갖고,
d) 55 내지 65μM의 아세틸 조효소 A에 대한 Michaelis Menten 상수를 가지며,
e) 10-하이드록시택사-O-아세틸 전이효소이고,
f) 택수스 치넨시스(Taxus chinensis) 세포 배양물로 부터 얻어질 수 있는 것을 특징으로 하는 효소.
제 7 항에 있어서, 50% 초과의 순도로 존재하는 것을 특징으로 하는 효소.
제 7 항에 있어서, 90% 초과의 순도로 존재하는 것을 특징으로 하는 효소.
제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 공지된 정제 방법을 사용하여 효소-함유 공급원으로 부터 분리되고, 각각의 정제 후 분획물들이 10-데아세틸백캐틴 또는 10-데아세틸백캐틴 유도체 및 아세틸 공여체를 가함으로써 존재하는 효소를로 측정되고, 생성된 아세틸화 생성물이 검출되는 것을 특징으로 하는 효소를 제조하는 방법.
제 9 항에 있어서, 정제 방법이 HighQ 칼럼의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 10-데아세틸백캐틴 Ⅲ 또는 10-데아세틸택서윤나닌 C가 효소-함유 분획물을 검출하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 아세틸 공여체가 아세틸 조효소 A인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 아세틸화 생성물이 방사능 표지를 사용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 아세틸화 생성물이 무거운 동위원소로 방사능 표지를 사용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따라 초기에 백캐틴 또는 백캐틴 유도체를 제조하고, 이것이 공지된 방법으로 반응하여 탁솔 또는 탁솔 유도체가 얻어지는 것을 특징으로 하는 탁솔 및/또는 탁솔 유도체를 제조하는 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19804815A DE19804815C1 (de) | 1998-02-06 | 1998-02-06 | Verfahren zur Herstellung von Baccatin |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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