PL197703B1 - Sposób wytwarzania bakatyny, enzym, sposób wytwarzania enzymu i sposób wytwarzania taksolu - Google Patents
Sposób wytwarzania bakatyny, enzym, sposób wytwarzania enzymu i sposób wytwarzania taksoluInfo
- Publication number
- PL197703B1 PL197703B1 PL342711A PL34271199A PL197703B1 PL 197703 B1 PL197703 B1 PL 197703B1 PL 342711 A PL342711 A PL 342711A PL 34271199 A PL34271199 A PL 34271199A PL 197703 B1 PL197703 B1 PL 197703B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- ceat
- eaceat
- acstra
- enzyme
- iii
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 241001149649 Taxus wallichiana var. chinensis Species 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 229930190007 Baccatin Natural products 0.000 claims description 20
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims 2
- 241000283283 Orcinus orca Species 0.000 claims 1
- XVQUOJBERHHONY-UHFFFAOYSA-N isometheptene Chemical compound CNC(C)CCC=C(C)C XVQUOJBERHHONY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 88
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 88
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 abstract description 78
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 abstract description 41
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 abstract description 41
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 abstract description 33
- YWLXLRUDGLRYDR-ZHPRIASZSA-N 5beta,20-epoxy-1,7beta,10beta,13alpha-tetrahydroxy-9-oxotax-11-ene-2alpha,4alpha-diyl 4-acetate 2-benzoate Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](O)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 YWLXLRUDGLRYDR-ZHPRIASZSA-N 0.000 abstract description 29
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 abstract description 7
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 59
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 34
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 24
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 23
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 23
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 23
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 23
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 23
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 18
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 11
- OVMSOCFBDVBLFW-VHLOTGQHSA-N 5beta,20-epoxy-1,7beta,13alpha-trihydroxy-9-oxotax-11-ene-2alpha,4alpha,10beta-triyl 4,10-diacetate 2-benzoate Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@H](O)C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 OVMSOCFBDVBLFW-VHLOTGQHSA-N 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 9
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 9
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 9
- -1 OH in position 7 Chemical group 0.000 description 8
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N taxane Chemical group C([C@]1(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1C1)C[C@H]2[C@H](C)CC[C@@H]1C2(C)C DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N 0.000 description 7
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 6
- TYLVGQKNNUHXIP-MHHARFCSSA-N 10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=4C=CC=CC=4)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 TYLVGQKNNUHXIP-MHHARFCSSA-N 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- ZSLZBFCDCINBPY-WZEPSTEZSA-N S-[2-[3-[[(2R)-4-[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] (214C)ethanethioate Chemical compound C([14CH3])(=O)SCCNC(CCNC([C@@H](C(COP(OP(OC[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC1=2)O)OP(=O)(O)O)(=O)O)(=O)O)(C)C)O)=O)=O ZSLZBFCDCINBPY-WZEPSTEZSA-N 0.000 description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 229930014667 baccatin III Natural products 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- 229930182986 10-Deacetyltaxol Natural products 0.000 description 3
- 125000003241 10-deacetylbaccatin III group Chemical group 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- 241001116498 Taxus baccata Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 3
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 3
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 3
- 150000004579 taxol derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GEWDNTWNSAZUDX-WQMVXFAESA-N (-)-methyl jasmonate Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(=O)OC)CCC1=O GEWDNTWNSAZUDX-WQMVXFAESA-N 0.000 description 2
- YWLXLRUDGLRYDR-LUPIKGFISA-N 7-epi-10-deacetylbaccatin iii Chemical group O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](O)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 YWLXLRUDGLRYDR-LUPIKGFISA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009065 Taxus cuspidata Nutrition 0.000 description 2
- 108010087926 acetyl coenzyme A - 10-hydroxytaxane O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 2
- GEWDNTWNSAZUDX-UHFFFAOYSA-N methyl 7-epi-jasmonate Natural products CCC=CCC1C(CC(=O)OC)CCC1=O GEWDNTWNSAZUDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YWLXLRUDGLRYDR-UHFFFAOYSA-N 10-deacetylbaccatin Chemical compound CC(=O)OC12COC1CC(O)C(C(C(O)C1=C(C)C(O)CC3(O)C1(C)C)=O)(C)C2C3OC(=O)C1=CC=CC=C1 YWLXLRUDGLRYDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-FBXJDJJESA-N D-sucrose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-FBXJDJJESA-N 0.000 description 1
- 229910017621 MgSO4-7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017234 MnSO4 H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017237 MnSO4-H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017228 MnSO4—H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001116500 Taxus Species 0.000 description 1
- YPTPYQSAVGGMFN-KQYNXXCUSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methyl phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O YPTPYQSAVGGMFN-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-NJFSPNSNSA-N acetic acid Chemical compound [14CH3]C(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012259 ether extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002446 heavy isotope labeling Methods 0.000 description 1
- 229910001412 inorganic anion Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 125000004674 methylcarbonyl group Chemical group CC(=O)* 0.000 description 1
- 239000013580 millipore water Substances 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000002456 taxol group Chemical group 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D305/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms
- C07D305/14—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Epoxy Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania bakatyny, znamienny tym, ze 10-deacetylobakatyn e albo 10-deacety- lotaksujunanin e C, 10,14-deacetylotaksujunanin e C, 2,10,14-deacetylotaksujunanin e C, 5,10,14-deacety- lotaksujunanin e C lub 2,5,10,14-deacetylotaksujunanin e C poddaje si e reakcji w obecno sci wyizolo- wanego enzymu i donora acetylu, przy czym tym enzymem jest transferaza acetylowa o masie cz astecz- kowej 70000 - 72000 wyznaczonej metod a SDS-PAGE, maj aca punkt izoelektryczny przy pH 5,4 - 5,8 i sta la Michaelisa-Mentena K M dla acetylokoenzymu A wynosz ac a 55 - 65 µM, z tym ze t e transferaz e acetylow a mo zna otrzyma c z hodowli komórkowych Taxus chinensis. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sposób wytwarzania bakatyny, enzym, sposób wytwarzania enzymu i sposób wytwarzania taksolu.
Taksol (paklitaksel) jest obiecującym środkiem do leczenia raka, wykazującym aktywność przeciwbiałaczkową i hamowania nowotworów (patrz, np.: M. Suffnes i inni, w „The Alkaloids, Chemistry and Pharmacology”, A. Brossi, red., Academic Press: Orlando, FL, 1985, tom XXV, rozdział 1). Pierwotnie taksol otrzymano z kory pewnych cisów (Taxus taxaceae). Jednakże wyodrębnianie taksolu z kory jest trudne i kosztowne, a żądany taksol otrzymuje się z kory tylko z bardzo małą wydajnością (40 - 165 mg/kg) (patrz np. R.W. Miller i inni, J. Org. Chem. 46 (1981) 1469-1474; V. Senilh i inni, J. Nat. Procl. 47 (1984) 131-137; N. Magri i inni, J. Org. Chem. 51 (1986) 797-802). Ponadto w wyniku stosowania kory zamierają cisy, które odrastają bardzo wolno, a zatem ilość materiału wyjściowego jest ograniczona.
Od odkrycia właściwości taksolu, które wskazywały na jego użyteczność jako środka chemioterapeutycznego do leczenia raka, czyniono wiele wysiłków w celu wytworzenia tego związku w sposób syntetyczny lub półsyntetyczny. Starano się zatem wytworzyć strukturę taksolu drogą syntezy organicznej (patrz, np. W.F. Berkowitz i inni, J. Org. Chem. 52 (1987) 1119-1124). Jednakże, ze względu na złożoność cząsteczki, jak dotychczas wytworzenie taksolu drogą totalnej syntezy organicznej w ilościach praktycznie użytecznych nie było możliwe.
Innym sposobem stosowanym do otrzymania taksolu była częściowa synteza, w której wychodzi się z prekursora, który można łatwo otrzymać w dużych ilościach. W jednym z tych sposobów jako związek wyjściowy stosuje się 10-deacetylobakatynę III, którą można łatwo i w dużych ilościach wyekstrahować z liści Taxus baccata L (G. Chauviere i inni, Seances Acad. Sci., Ser. 2, 1981,293, 501-503). W tym przypadku można wyizolować około 1 g 10-deacetylobakatyny III z kilograma liści, a liście odrastają szybko. Zatem można bezproblemowo otrzymywać duże ilości prekursora, 10-deacetylobakatyny III.
Żądaną substancję czynną, taksol, można wytwarzać z tego prekursora otrzymanego z materiału biologicznego drogą częściowej syntezy. Jednakże stwierdzono, że bez względu na to jak podobne mogą być struktury 10-deacetylobakatyny III i taksolu, taka częściowa synteza nadal stwarza znaczne problemy i w większej części można ją skutecznie prowadzić tylko z użyciem specyficznych grup zabezpieczających, przy czym wydajność żądanego produktu, taksolu, jest niewielka.
Denis i inni (J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 5917-5919) opisali syntezę taksolu z 10-deacetylobakatyny III w dwóch etapach. W pierwszym etapie 10-deacetylobakatynę III acetyluje się chemicznie w pozycji 10. W drugim etapie bakatynę przeprowadza się w taksol. Pierwszy etap nie jest jednak regiospecyficzny, tak że acetylowanie 10-deacetylobakatyny zachodzi również zwłaszcza w pozycji 7. Z tego względu trzeba zablokować grupą zabezpieczającą grupę hydroksylową w tej pozycji przed acetylowaniem. Acetylowanie wyłącznie w pozycji 10 można osiągnąć tylko stosując grupę zabezpieczającą. Jednakże zastosowanie grupy zabezpieczającej wymaga przeprowadzenia dwóch dodatkowych etapów obróbki (wprowadzenia i usunięcia grupy zabezpieczającej), co powoduje wzrost kosztów, a ponadto znacząco zmniejsza wydajność otrzymanego produktu. Kolejna wada stosowania grup zabezpieczających polega na tym, że, w szczególności gdy produkt stosuje się jako substancję farmaceutycznie czynną, należy następnie przeprowadzić skomplikowane procedury jego oczyszczania i analizy w celu upewnienia się, że w produkcie nie występują już cząsteczki ze związanymi grupami zabezpieczającymi.
Zocher i inni (Biochem. Biophys. Res. Commun., 229 (1996), 16-20) opisali biosyntezę taksolu. W etapie pośrednim acetylowanie 10-deacetylobakatyny III do bakatyny III przeprowadzono z użyciem surowych ekstraktów roślinnych z korzeni Taxus baccata. Jednakże wyizolowanie lub scharakteryzowanie substancji powstałych w wyniku acetylowania nie było możliwe. Wadą stosowania surowych ekstraktów jest to, że wiele innych reakcji, zwłaszcza acetylowanie w innych pozycjach, może zostać zapoczątkowane lub przebiegać pod wpływem substancji występujących w surowym ekstrakcie. Ponadto surowy ekstrakt roślinny nie ma określonego i powtarzalnego składu, a zatem użycie surowych ekstraktów roślinnych prowadzi do niekontrolowanych i różnorodnych reakcji i różnej wydajności.
Istniała zatem potrzeba opracowania sposobu wytwarzania bakatyny i podobnych do bakatyny pochodnych bakatyny drogą selektywnego acetylowania w pozycji 10 odpowiednich związków 10-deacetylowych, a także uzyskania wyizolowanej substancji specyficznie katalizującej tę reakcję.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania bakatyny, polegającego na tym, że 10-deacetylobakatynę albo 10-deacetylotaksujunaninę C, 10,14-deacetylotaksujunaninę C, 2,10,14^-^^^(^^t:ylo^aksujunaninę C, 5,10,14-deacetylotaksujunaninę C lub 2,5,10,14-deacetylotaksujunaninę C poddaje się reakcji
PL 197 703 B1 w obecności wyizolowanego enzymu i donora acetylu, przy czym tym enzymem jest transferaza acetylowa o masie cząsteczkowej 70000 - 72000 wyznaczonej metodą SDS-PAGE, mająca punkt izoelektryczny przy pH 5,4 - 5,8 i stałą Michaelisa-Mentena Km dla acetylokoenzymu A wynoszącą 55 - 65 μΜ, z tym że tę transferazę acetylową można otrzymać z hodowli komórkowych Taxus chinensis.
Korzystnie bakatynę III wytwarza się z 10-deacetylobakatyny III.
Korzystnie 14-hydroksybakatynę III wytwarza się z 14-hydroksy-10-deacetylobakatyny III.
Korzystnie taksujunaninę C wytwarza się z 10-deacetylotaksujunaniny C.
W szczególności reakcję prowadzi się w obecności acetylokoenzymu A jako donora acetylu.
Wynalazek dotyczy również enzymu, charakteryzującego się tym, że
a) acetyluje 10-deacetylobakatynę III w obecności donora acetylu, szczególnie acetylokoenzymu A, selektywnie w pozycji 10,
b) ma masę cząsteczkową 70000 - 72000 wyznaczoną metodą SDS-PAGE,
c) ma punkt izoelektryczny przy pH 5,4 - 5,8,
d) ma stałą Michaelisa-Mentena Km dla acetylokoenzymu A wynoszącą 55 - 65 μΜ,
e) jest transferazą 10-hydroksytaksan-O-acetylową i
f) można go otrzymać z hodowli komórkowych Taxus chinensis.
Korzystnie enzym ma czystość > 50%, korzystniej > 90%.
Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania enzymu określonego powyżej, polegającego na tym, że enzym izoluje się z Taxus chinensis drogą oczyszczania, przy czym po każdym oczyszczaniu oznacza się frakcje, w których obecny jest enzym, przez dodanie 10-deacetylobakatyny albo 10-deacetylotaksujunaniny C, 10,14-deacetylotaksujunaniny C, 2,10,14-deacetylotaksujunaniny C, 5,10,14-deacetylotaksujunaniny C lub 2,5,10,14-deacetylotaksujunaniny C i donora acetylu oraz wykrycie powstałego produktu acetylowania.
Korzystnie w sposobach oczyszczania stosuje się kolumnę HighQ.
Korzystnie do wykrycia frakcji zawierających enzym stosuje się 10-deacetylobakatynę III lub 10-deacetylotaksujunaninę C.
Korzystnie jako donor acetylu stosuje się acetylokoenzym A.
Powstały produkt acetylowania korzystnie wykrywa się metodą znakowania radioaktywnego.
Powstały produkt acetylowania korzystnie wykrywa się zwłaszcza metodą znakowania ciężkim izotopem.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania taksolu, polegającego na tym, że najpierw wytwarza się bakatynę sposobem przedstawionym powyżej, a następnie poddaje się ją reakcji estryfikacji grupy OH w pozycji 13 pochodnej bakatyny odpowiednim kwasem z wytworzeniem taksolu.
Stwierdzono, że regioselektywne acetylowanie w pozycji 10 jest katalizowane przez wyizolowany enzym, który można otrzymać z zawiesinowych hodowli komórkowych Taxus chinensis. Nieoczekiwanie stwierdzono, że dzięki użyciu wyizolowanego i oczyszczonego enzymu możliwe jest osiągnięcie wysokiej regiospecyficzności acetylowania w pozycji 10. Specyficzność ta korzystnie wynosi >80%, korzystniej >90%, a najkorzystniej >95%. Stwierdzono, że dzięki enzymowi stosowanemu zgodnie z wynalazkiem można uzyskać specyficzność >99%. Specyficzność >80% oznacza tu, że acetylowanie zaszło w powyżej 80% w pozycji 10 i w poniżej 20% w innych pozycjach związku wyjściowego. Zatem innych grup hydroksylowych obecnych w związku wyjściowym nie trzeba blokować grupą zabezpieczającą, gdyż przy stosowaniu enzymu według wynalazku acetylowanie tych innych grup hydroksylowych zachodzi tylko w ograniczonym stopniu, jeśli zachodzi w ogóle.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że enzym według wynalazku wykazuje wysoką specyficzność względem substratu. Tak więc przemianie ulegają tylko 10-deacetylobakatyna lub pochodne 10-deacetylobakatyny o konfiguracji podobnej do 10-deacetylobakatyny III i w sąsiedztwie pozycji C10. W szczególności nie są acetylowane pochodne bakatyny, w których dostęp do pozycji 10 jest zablokowany przez podstawniki o dużej objętości, jak to jest np. w przypadku 10-deacetylotaksolu i 10-deacetylocefalomanniny. Zatem warunkiem rozpoznania przez enzym według wynalazku pochodnych bakatyny jako substratów jest to, by pochodne o strukturze pierścieniowej taksanu zasadniczo odpowiadały 10-deacetylobakatynie III w pozycjach 7, 8, 9, 10, 11, 12 i 13, to jest aby nie miały one innych podstawników w tych pozycjach albo miały tylko podstawniki o małej objętości. Sposób ten jest szczególnie odpowiedni w przypadku pochodnych bakatyny mających takie same podstawniki jak 10-deacetylobakatyna III w pozycjach od 7 do 13 albo mających co najmniej niektóre podstawniki o mniejszej objętości niż podstawniki 10-deacetylobakatyny III, a zwłaszcza atomy wodoru. Podstawniki o dużej objętości w innych pozycjach nie wpływają na tę reakcję. Sposób ten szczególnie korzystnie
PL 197 703 B1 stosuje się w przypadku acetylowania 10-deacetylobakatyny III. Ponadto sposób ten stosuje się szczególnie korzystnie do selektywnego acetylowania 14-hydroksy-10-deacetylobakatyny III w pozycji 10.
Natomiast pochodne 10-deacetylobakatyny III z grupą hydroksylową w pozycji 7 zablokowaną grupą zabezpieczającą o dużej objętości, takie jak np. 7-TES-10-DAB III lub 7-BOC-10-DAB III, nie są rozpoznawane jako substraty przez enzym według wynalazku. Jednakże takie zablokowanie nie jest konieczne, gdyż regioselektywne acetylowanie w pozycji 10 zachodzi nawet wtedy, gdy inne grupy hydroksylowe występują w innych pozycjach.
Zastosowanie enzymu według wynalazku umożliwia selektywne acetylowanie w pozycji 10 pochodnych taksanu mających takie same podstawniki, mniej podstawników lub podstawniki o mniejszej objętości w pozycjach 7 - 13 w porównaniu z 10-deacetylobakatyną III. Takie pochodne taksanu, w których takie podstawniki jak w 10-deacetylobakatynie III (to jest OH w pozycji 7, CH3 w pozycji 8, =O w pozycji 9, OH w pozycji 10, CH3 w pozycji 12 i OH w pozycji 13) są obecne lub są zastąpione przez grupę mniejszą lub o tej samej objętości, a zwłaszcza przez atomy wodoru, objęte są tu nazwą „pochodne 10-deacetylobakatyny” i mogą one być podobnie regiospecyficznie acetylowane, jeżeli mają grupę OH w pozycji 10. Do takich pochodnych należą 10-deacetylotaksujunanina C, 10,14-deacetylotaksujunanina C, 2,10,14-deacetylotaksujunanina C, 5,10,14-deacetylotaksujunanina C i 2,5,10,14-deacetylotaksujunanina C.
Sposób według wynalazku prowadzi się w obecności donora acetylu. Odpowiednimi donorami acetylu są zasadniczo wszelkie substancje dostarczające grupę acetylową w katalitycznej przemianie 10-deacetylowego związku wyjściowego. Reakcję korzystnie prowadzi się w obecności acetylokoenzymu A jako donora acetylu.
Z technicznego punktu widzenia, zastosowanie wyizolowanego enzymu ma wiele zalet. W szczególności użycie wyizolowanego enzymu umożliwia łatwe kontrolowanie stopnia przemiany i powtarzalności reakcji.
Enzym według wynalazku ma punkt izoelektryczny przy pH 5,4 - 5,8, korzystnie przy pH 5,5 - 5,7, a zwłaszcza przy pH 5,6. Ponadto stwierdzono, że ten enzym ma stałą Michaelisa Km dla acetylokoenzymu A wynoszącą 55 - 65 μΜ, korzystnie 59 - 63 μΜ, a zwłaszcza 61 μΜ.
Zgodnie z wynalazkiem stosuje się wyizolowany enzym, który ponadto cechuje się tym, że a) acetyluje selektywnie 10-deacetylobakatynę III w pozycji 10 w obecności donora acetylu, a zwłaszcza acetylokoenzymu A, b) ma masę cząsteczkową 70000 - 72000 określoną metodą SDS-PAGE i c) można go otrzymać z hodowli komórkowych Taxus chinensis.
Enzym według wynalazku ma korzystnie czystość >50%, w szczególności >80%, korzystniej >90%, a najkorzystniej >95%. Wyróżniającą cechą enzymu według wynalazku jest to, że acetyluje on selektywnie 10-deacetylobakatynę III w pozycji 10 w obecności donora acetylu, a zwłaszcza acetylo-CoA. Oznacza to w szczególności, że w zasadzie nie obserwuje się acetylowania innych grup hydroksylowych 10-deacetylobakatyny III w pozycjach 1,7 i 13. Reakcja acetylowania ma w szczególności selektywność >50%, korzystnie >80%, korzystniej >90%, a najkorzystniej >95%, w odniesieniu do pozycji 10.
Wyizolowany enzym ma masę cząsteczkową 70000 - 72000, oznaczoną metodą SDS-PAGE. Aby oznaczyć masę cząsteczkową, 0,3 μg homogenicznego białka poddano chromatografii w 10% żelu denaturującym z SDS równolegle z białkami znacznikowymi o znanej masie cząsteczkowej (Rainbow Marker). Białka wizualizowano przez barwienie srebrem i wyznaczono masę cząsteczkową porównując wartości Rf białek wzorcowych i enzymu według wynalazku. Masę cząsteczkową wyznaczoną metodą elektroforezy w żelu z SDS potwierdzono przez filtrację żelową stosując odpowiednią kolumnę do filtracji żelowej. Filtrację żelową przeprowadzono w kolumnie biosilect-SEC 250-5 (Biorad) równoważonej buforem 50 mM Tris, pH 8,5, 20 mM 2-merkaptoetanol, w jednostce FPLC (Biologic Workstation, Biorad), przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min.. Początkowo kolumnę kalibrowano z użyciem białek o znanej masie cząsteczkowej. W takich samych warunkach przez kolumnę przepuszczono 50 μg białka. Zbierano frakcje po 250 μl eluatu i oznaczano aktywność eluatu w sposób opisany poniżej. Masę cząsteczkową oznaczono przez porównanie czasów elucji ze znanymi wzorcami.
Enzym według wynalazku można wyizolować z hodowli komórkowych Taxus chinensis. Ma on punkt izoelektryczny przy pH 5,4 - 5,8, korzystnie przy pH 5,5 - 5,7, a zwłaszcza przy pH 5,6. Ponadto stała Michaelisa-Mentena Km wyznaczona dla użytego enzymu wynosiła 55 - 65 μΜ, korzystnie 59 - 63 μΜ, a zwłaszcza 61 μΜ dla acetylokoenzymu A.
Enzym według wynalazku to transferaza acetylowa, a zwłaszcza transferaza acetylo-CoA-10-hydroksytaksan-O-acetylowa.
PL 197 703 B1
Enzym można wytwarzać przez izolowanie ze źródła zawierającego enzym znanymi metodami oczyszczania, przy czym po każdym oczyszczaniu frakcje, w których obecny jest enzym, oznacza się przez dodanie 10-deacetylobakatyny lub pochodnej 10-deacetylobakatyny i donora acetylu, oraz wykrycie powstałego produktu acetylowania.
Jako źródło zawierające enzym można stosować np. ekstrakt roślinny. Źródłem zawierającym enzym jest korzystnie hodowla komórkowa, a zwłaszcza zawiesinowa hodowla komórkowa. Zaletą hodowli komórkowej jest możliwość uzyskania dużych ilości materiału wyjściowego. W porównaniu z użyciem surowego ekstraktu jako źródła zawierającego enzym, stosowanie hodowli komórkowej umożliwia oczyszczenie enzymu do wysokiego stopnia czystości dzięki dużej ilości materiału wyjściowego. Szczególnie korzystny jest materiał wyjściowy pochodzący z Taxus chinensis, przykładowo hodowla komórkowa Taxus chinensis.
W celu oczyszczania enzymu z materiału wyjściowego można stosować znane sposoby oczyszczania przy otrzymywaniu enzymów lub białek. Korzystne są sposoby, w których prowadzi się wytrącanie siarczanem amonu z surowego ekstraktu, a także chromatograficzne metody oczyszczania, takie jak np. zastosowanie kolumny Sephadex G-25, chromatografia anionowymienna, np. z użyciem DEAE-Sephacel, filtracja żelowa, np. na Ultrogel AcA 44, chromatografia anionowymienna, np. na HighQ, chromatografia w kolumnie hydroksyapatytowej, chromatografia z powinowactwem do barwnika, np. na High Trap Blue, chromatografia z oddziaływaniami hydrofobowymi, np. na fenylosefarozie i/lub chromatografia z powinowactwem do barwnika, np. na Mimetic Green 1A6XL. Oczyszczanie korzystnie obejmuje co najmniej jeden etap z zastosowaniem chromatografii anionowymiennej na HighQ. Kolumna HighQ to kolumna z wymieniaczem anionowym zawierającym grupy N+(CH3)3 jako ligandy. Stwierdzono, że szczególnie w tym etapie oczyszczania usuwane są substancje katalizujące acetylowanie w pozycjach innych niż 10.
W sposobie według wynalazku aktywność enzymatyczną frakcji oznacza się po każdym etapie oczyszczania dla oznaczenia, które frakcje zawierają enzym. W tym celu frakcję lub jej część miesza się z 10-deacetylobakatyną lub pochodną 10-deacetylobakatyny, jak zdefiniowano powyżej, i z donorem acetylu. We frakcjach, w których występuje żądany enzym, można wykryć produkt acetylowany w pozycji 10. Korzystnie dla potrzeb tego testu stosuje się 10-deacetylobakatynę III lub 10-deacetylotaksujunaninę C. Otrzymany produkt acetylowania można wykryć z użyciem odpowiednich grup znacznikowych w związkach wyjściowych. Korzystne jest stosowanie znakowanych donorów acetylu. Taki znakowany donor acetylu zawiera znakowaną grupę acetylową, którą następnie można zastosować do oznaczenia produktu, który został zacetylowany w pozycji 10. Korzystne jest stosowanie donorów acetylu znakowanych radioaktywnie. Odpowiednimi radioaktywnymi grupami znacznikowymi są 13C i 14C. Szczególnie korzystnym donorem acetylu jest acetylokoenzym A, a zwłaszcza [2-14C]acetylokoenzym A.
Możliwe jest także oznaczenie produktu z użyciem ciężkiego izotopu. W tym przypadku produkt reakcji można oznaczyć metodą spektrometrii masowej.
Z zastosowaniem enzymu według wynalazku można wytworzyć pochodne bakatyny lub taksanu specyficznie zacetylowane w pozycji 10. Takie związki są szczególnie interesujące zwłaszcza jako substancje wyjściowe w częściowej syntezie taksolu. Bakatynę lub pochodne bakatyny można znanymi sposobami przeprowadzić w taksol lub pochodne taksolu. Częściowa przemiana bakatyny lub pochodnych bakatyny w taksol lub pochodne taksolu jest znana i polega zasadniczo na wprowadzeniu odpowiednich podstawników do grupy hydroksylowej w pozycji 13 pochodnych bakatyny. Pochodne bakatyny odpowiednie do tego celu muszą mieć zatem wolną grupę OH w pozycji 13.
Reakcję pochodnych bakatyny z wytworzeniem taksolu lub pochodnych taksolu prowadzi się w szczególności drogą estryfikacji grupy OH w pozycji 13 pochodnych bakatyny odpowiednim kwasem. Takie sposoby opisano szczegółowo w literaturze, np. w opisach patentowych US 4814470 i US Re. 34277, opisie patentowym EP 0400971 A2, opisach patentowych US 4924011 i US 5476954 oraz w Denis i inni, J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 5917-5919.
PL 197 703 B1
Dla ilustracji podano poniżej strukturalne wzory bakatyny III i paklitakselu.
Bakatyna III
Paklitaksel: R1 = COCeHs; R2 = CH3CO.
Wynalazek zilustrowano bardziej szczegółowo poniższymi przykładami.
P r z y k ł a d 1
Hodowla zawiesin komórkowych Taxus chinensis
Zastosowano hodowle zawiesinowe Taxus chinensis ze zbioru Instytutu Biologii Farmaceutycznej Uniwersytetu w Monachium, pochodzące z igieł drzewa T. chinensis. Hodowlę prowadzono w 24°C, przy 100 obr/min. i 1500 lx przez 14 dni. Za pomocą jałowej 50 ml pipety przeniesiono 150 ml zawiesiny komórkowej do 250 ml pożywki B5 + 1:
Skład pożywki B5 + 1 (zmodyfikowanej według Gamborg, Miller, Ojima: Experimental Research, 1968, 50, strony 151-158).
| Kwas naftylooctowy | 10 pM |
| Benzyloaminopuryna | 0,2 μ mgfl |
| NaH2PO4-H2O | 150 |
| CaCl2-2H2O | 150 |
| (NH4)2SO4 | 134 |
| MgSO4-7H2O | 250 |
| KNO3 | 2500 |
| FeSO4-’7H2O | 25,6 |
| Na2EDTA-2H2O | 34,27 |
| KI | 0,75 |
| MnSO4-H2O | 10 |
| H3BO3 | 3 |
| ZnSO4-’7H2O | 3 |
| Na2MoO4'2H2O | 0,25 |
| CuSO4-5H2O | 0,25 |
| C0CI2OH2O | 0,25 |
| Kwas nikotynowy | 1 |
PL 197 703 B1
Dichlorek tiaminy 10
Chlorowodorek pirydoksolu 1 mezo-Inozytol 1000
D-(+)-sacharoza 20000 pH 5,6 aminy NZ 1000
Do pożywki dodano aminy NZ w postaci jałowego roztworu podstawowego (10 g/l) w jałowych warunkach po autoklawowaniu i ochłodzeniu.
Trzeciego dnia po zaszczepieniu dodano 30 μΜ jasmonianu metylu (Serva) i hodowlę kontynuowano przez 4 dni (Gundlach, H., Muller, M. J., Kutchan, T. M., Zenk, M. H., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, strony 2389-2393). Komórki oddzielono od pożywki drogą filtracji próżniowej i po gwałtownym zamrożeniu w ciekłym azocie poddano maceracji enzymatycznej. Możliwe było także przechowywanie komórek w -20°C przez okres do jednego miesiąca; po tym okresie aktywność żądanego enzymu znacząco obniżała się.
P r z y k ł a d 2
Test enzymatyczny oznaczania aktywności transferazy acetylowej
Do oczyszczania, charakteryzowania i wykrywania enzymu dostępne są precyzyjne i wystarczająco czułe metody badawcze. W tym przypadku wykrywano powstały produkt, np. taksujunaninę C otrzymaną z 10-deacetylotaksujunaniny, i w tym celu opracowano prostą i wiarygodną metodę badawczą.
Wystarczającą ilość badanego roztworu enzymu odpipetowano do 50 μl buforu Tris (0,8 M, pH 8,5) w probówce Eppendorfa. Następnie dodano 30 μl oczyszczonego acetylo-CoA (5 nmoli nieznakowanego i 0,02 μφ [2-14C]acetylokoenzymu A) oraz 15 nmoli 3 mM roztworu podstawowego 10-deacetylotaksujunaniny C w DMSO (do kontroli zamiast tego taksanu dodano tylko odpowiednią ilość DMSO). Mieszaninę inkubowano w 35°C przez 30 minut, a następnie zakwaszono z użyciem 20 μl 12% H2SO4, powstałą taksujunaninę C wyekstrahowano z użyciem 600 μl eteru metylowo-t-butylowego (10 min. w wytrząsarce) i mieszaninę odwirowano (4 min. przy 14000 obr/min. w wirówce Eppendorfa). Nieprzereagowany [2-14C]-acetyloCoA pozostał w fazie wodnej. Porcję 500 μl fazy organicznej odparowano do sucha w strumieniu powietrza, co jednocześnie spowodowało usunięcie resztek kwasu [2-14C]octowego, który po wcześniejszym zakwaszeniu był obecny w postaci kwasu, a zatem był lotny. Za pomocą licznika scyntylacyjnego (Multipurpose Scintillation Counter LS 6500, Beckmann) lub radioskanera do chromatografii cienkowarstwowej (Automatic TLC Linear Analyser, Berthold) oznaczono typ i ilość powstałego produktu. Pierwszy z wymienionych aparatów zastosowano do oznaczania stopnia przemiany, a zatem aktywności enzymu na podstawie wartości cpm (liczby impulsów na minutę). Metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) (faza ruchoma: chloroform:acetonitryl 7:3), a następnie jej oceny za pomocą radioskanera sprawdzono, czy radioaktywność zmierzona za pomocą licznika scyntylacyjnego w rzeczywistości odpowiadała pikowi w regionie wartości Rf oczekiwanego produktu.
P r z y k ł a d 3
Oczyszczanie transferazy acetylowej
3.1. Maceracja tkanek i odsalanie z użyciem kolumny Sephadex G25
Do otrzymania surowego ekstraktu białkowego zastosowano 7-dniowe hodowle zawiesinowe poddane działaniu 30 μM jasmonianu metylu w trzecim dniu po zaszczepieniu. Porcję 200 g komórek świeżo odfiltrowanych przez odessanie zamrożono gwałtownie za pomocą ciekłego azotu. Komórki wymieszano w schłodzonym lodem moździerzu z 20 g PVPP i rozmrożono mieszając z 400 ml standardowego buforu A (100 mM kwas borowy/NaOH, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol). PVPP wiąże niektóre fenole, między innymi garbniki obecne w ekstrakcie, które wpływają na dalsze procesy oczyszczania. Następnie jednorodną miazgę komórkową przefiltrowano przez 4-warstwową gazę i wyciśnięty sok odwirowano przy 15000 x g (10 min., wirnik SS34).
Ochłodzony lodem supernatant zmieszano z 50 ml żelu fosofranu wapnia zdyspergowanego w standardowym buforze A (100 mM kwas borowy/NaOH, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol). Objętościowo taka ilość żelu jest to ilość żelu uzyskana po 10 minutach wirowania przy 2500 obr/min. i odpowiada 1,9 g Ca2(PO4)2 (sucha masa). Mieszaninę pozostawiono do odstania w łaźni lodowej na 10 minut, mieszając ją co jakiś czas. W tym czasie na żelu powinny zostać zaadsorbowane, substancje towarzyszące, np. garbniki obecne w dużych ilościach. Następnie transferazę acetylową pozostałą w roztworze oddzielono od materiału żelowego przez wirowanie (6000 x g, 5 minut, wirnik GSA).
PL 197 703 B1
Następnie osad żelowy jeszcze raz doprowadzono do objętości 75 ml standardowym buforem A, wymieszano bagietką i odwirowano przy 6000 obr/min. (wirnik GSA) przez kolejne 5 minut, gdyż część transferazy acetylowej zaabsorbowanej w żelu została uwolniona do supernatantu w wyniku tej dodatkowej obróbki. Gdy nie użyto żelu fosforanu wapnia, w dalszych etapach oczyszczania pojawiały się duże trudności ze względu na to, że substancje towarzyszące, nadal obecne w tych przypadkach, szybko blokowały membranę komory mieszającej oraz barwa następnie stosowanych kolumn zmieniała się na ciemnobrązową, a ich pojemność wiązania szybko obniżała się.
Następnie połączone zimne supernatanty powoli zmieszano z siarczanem amonu, dodając go w niewielkich porcjach, do osiągnięcia 70% stopnia nasycenia i powolne mieszanie kontynuowano przez 30 minut po zakończeniu dodawania. Następnie z wytrąconego białka otrzymano osad przez odwirowanie przy 15000 obr/min. (10 minut, wirnik SS34). Osad dokładnie zdyspergowano ponownie w 30 ml standardowego buforu B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol), roztwór odsolono z użyciem tego buforu i kolumny Sephadex G25 (Pharmacia: 2,7 cm φ x 7 cm) i jednocześnie oddzielono 60% obcych białek. [Eluat G25: 82 ml, 78 mg białka].
3.2. Chromatografia anionowymienna na DEAE Sephacel
DEAE Sephacel to modyfikowana celuloza z dodatnio naładowanymi grupami dietyloaminoetylowymi. Gdy punkt izoelektryczny rozpuszczonych białek jest bardziej kwasowy niż użyty bufor, są one obecne w postaci anionów, a zatem mogą wiązać się z dodatnio naładowanym materiałem kolumny. Dodatek mocniejszych anionów, takich jak np. Cl lub SO42', zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne zaabsorbowanych białek i grup DEAE. Zatem aniony białkowe są wymieniane na aniony nieorganiczne i enzym jest wymywany.
Na tym etapie oczyszczania usunięto 24,4% obcych białek oraz szczególnie substancje towarzyszące, między innymi garbniki zawierające fenol. Nawet podczas pierwszego użycia materiał kolumny zmienił barwę na ciemnobrązową, ale można go było w znacznym stopniu oczyścić z użyciem 1 M NaOH. Etap ten zasadniczo ograniczał zanieczyszczanie kolumn stosowanych później w procesie oczyszczania.
Początkowy eluat z kolumny DEAE (2,5 cm φ x 5 cm) zawierający 30 ml standardowego buforu B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol) użytego do przemycia kolumny, zatężono przez filtrację pod ciśnieniem w komorze mieszającej (Amicon, 400 ml, membrana PM 10) do objętości 5 ml. [Eluat DEAE: 110 ml, 59 mg białka].
3.3. Filtracja żelowa na Ultrogel AcA 44
Zasada filtracji żelowej polega na tym, że makrocząsteczki, takie jak np. białka, są rozdzielane pomiędzy złoże o określonej wielkości porów (eliminacja ze względu na objętość) i otaczający je płyn, zależnie od ich wielkości i formy. Cząsteczki, które są za duże aby mogły wniknąć do porów żelu, omijają cząstki i w efekcie są wymywane szybciej niż białka o średniej wielkości, które są początkowo opóźniane przez pory, ale nie wnikają do nich. Jeszcze mniejsze cząsteczki, między innymi jony soli, początkowo wnikają do porów, a następnie opuszczają je tylko po pewnym czasie pozostawania wewnątrz, a zatem pozostają w kolumnie najdłużej.
W technice tej stosuje się bardzo łagodne warunki - nie występują żadne oddziaływania pomiędzy materiałem a białkiem i nie jest konieczne użycie specjalnych buforów.
Ponadto eluat jest całkowicie odsolony, ponieważ małe jony, w tym przypadku jony siarczanowe, pozostają w kolumnie znacznie dłużej niż aktywne białko.
Zastosowano żel poliakryloamidowo-agarozowy odpowiedni do frakcjonowania w zakresie 10-130 kD (Ultrogel AcA 44, Serva).
Zatężony roztwór białka rozdzielano przez noc w kolumnie (2,8 cm φ x 100 cm) równoważonej standardowym buforem B przy przepływie 20 ml/godzinę. W 60 frakcjach (po 6,5 ml) oznaczono stężenie białka i aktywność transferazy acetylowej. Frakcje wykazujące właściwą aktywność połączono i dalej oczyszczano.
Z użyciem tego eluatu zmierzono aktywność właściwą transferazy acetylowej. Na chromatogramie cienkowarstwowym oprócz wyraźnych pików przy niskich wartościach Rf zaobserwowano także pik na poziomie wartości Rf taksujunaniny. [Eluat AcA: 53 ml, 25,7 mg, całkowitą aktywność 724 pkat przyjęto jako 100%]. Metodą tej filtracji żelowej oddzielono 57% obcych białek.
3.4. Chromatografia anionowymienna na HighQ
Tak jak kolumna DEAE, kolumna HighQ, z grupami -N+(CHa)3 jako ligandami, jest także wymieniaczem anionowym, ale w odróżnieniu od tej poprzedniej jest silnym wymieniaczem anionowym, tak że jej stan jonizacji nie zmienia się w szerokim zakresie pH. Stopień dysocjacji, a zatem zdolność
PL 197 703 B1 jonowymienna słabych wymieniaczy jonowych, różni się znacząco przy różnych wartościach pH. Ze względu na to, że materiał kolumny HighQ składa się z gęsto upakowanych cząstek żywicy o wielkości około 10 pm, występuje na niej wysokie przeciwciśnienie, toteż kolumnę tę należy obsługiwać z użyciem aparatury do FPLC (Biorad).
Wolny od soli eluat AcA (53 ml) wprowadzono za pomocą pompy do przygotowanej 5 ml kolumny HighQ, równoważonej standardowym buforem B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol) z natężeniem przepływu 2 ml/min., a następnie kolumnę przemyto tym samym buforem. Początkowy bezbarwny eluat zawierał część nieaktywnego białka, a dalsze obce białka razem z żółtymi substancjami towarzyszącymi usunięto z użyciem 0,07 M KCl w standardowym buforze B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol). Aktywne białko i dodatkowo także żółte substancje towarzyszące wymyto w kolejnym etapie elucji gradientowej roztworem 0,14 M KCl w standardowym buforze B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol). Eluat otrzymany z użyciem 1 M KCl w standardowym buforze B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol) był także żółty i zawierał 1/3 wprowadzonego białka, ale nie wykazywał aktywności transferazy acetylowej. W tym ostatnim etapie kolumna ulegała równocześnie regeneracji.
Zaletą tego etapu oczyszczania było to, że dużą objętość eluatu AcA szybko i w łagodnych warunkach zatężono do 4 ml (4 frakcje po 1 ml każda).
Gradient
Czas (minuty) 1 M KCl w standardowym buforze B (%)
100
100
[Eluat HighQ: 4 ml, 8,8 mg białka, 796 pkat].
W tym etapie oczyszczania uzyskano wskaźnik wzbogacenia 121% w porównaniu z eluatem AcA i usunięto 66% obcych białek.
3.5. Hydroksyapatyt
Zastosowano kolumnę CHT II (Biorad) wypełnioną sferycznymi cząstkami hydroksyapatytu [Ca5(PO4)3OH]2. W obecności niskocząsteczkowego buforu fosforanowego ujemnie naładowane białka mogą początkowo wiązać się z kationami Ca2+, a następnie są wypierane przy wyższym stężeniu fosforanu w buforze eluującym.
Białka zasadowe o wysokiej wartości pl mają stosunkowo wysokie powinowactwo do materiału kolumny w porównaniu z tymi o stosunkowo niskiej wartości pl. Struktura hydroksyapatytu z jonami Ca2+ w dodatnio naładowanych centrach i PO43 w ujemnie naładowanych centrach powoduje mieszany rozdział wymiany jonowej. Eluat HighQ wprowadzono za pomocą pompy z natężeniem przepływu 0,5 ml/min. do kolumny CHT II (5 ml) równoważonej buforem fosforanowym (10 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 6,8, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol), a następnie kolumnę przemyto 12 ml tego samego buforu. Aktywne białko wymyto buforem fosforanowym o stężeniu 160 mM (20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol). Nawet przy zwiększeniu stężenia fosforanu do 400 mM nie można było wymyć więcej białka.
Gradient
Czas (minuty) 160 mM bufor fosforanowy (%)
0
0
100
100
Zebrane frakcje po 0,5 ml zbadano na obecność białka i aktywność transferazy acetylowej. [Eluat CHT II: 1,5 ml, 0,73 mg białka, 578 pkat].
W tym etapie oczyszczania osiągnięto wskaźnik wzbogacenia 8,7 w porównaniu z eluatem HighQ i usunięto 92% obcych białek, co spowodowało utratę 27% aktywności.
PL 197 703 B1
3.6. Chromatografia z powinowactwem do barwnika na High Trap Blue
HiTrapBlue 1 ml (Pharmacia) zawiera syntetyczny barwnik policykliczny Cibacron Blue F3 G-A sprzężony z podłożem agarozowym. Ligandy te wykazują pewne podobieństwo strukturalne do naturalnie występujących cząsteczek, takich jak kofaktory NAD+ i NADP+, co umożliwia silne i specyficzne wiązanie przez nie białek, między innymi enzymów wymagających substancji zawierających grupy adenylanowe. Zatem materiał w kolumnie także określa się jako „specyficzny względem grup”. Jednakże specyficzność ocenia się na podstawie tego, że około jednej trzeciej enzymów, które dotychczas zostały skatalogowane, wymaga koenzymu zawierającego składnik nukleotydowy. Ponadto możliwe jest także niespecyficzne wiązanie białek z aromatycznymi ligandami w wyniku oddziaływań elektrostatycznych i/lub hydrofobowych.
Wymywanie prowadzi się specyficznie z użyciem odpowiedniego kofaktora lub niespecyficznie roztworami soli.
Transferaza acetylowa wiążąca acetylo-CoA zawierający fosfoadenozylodifosforan została zaadsorbowana na niebieskim materiale kolumny i wymyta przy niespecyficznie liniowym gradiencie KCl. W tym celu do kolumny High Trap Blue równoważonej standardowym buforem B z użyciem aparatury FPLC (Biodra) wprowadzono eluat CHT II przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min., a następnie kolumnę przemyto tym samym buforem. Białko związane z kolumną wymyto przy przepływie 0,5 ml/min. i liniowym gradiencie soli 0-1 M KCl w standardowym buforze B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol) przez 30 minut.
Gradient Czas (minuty) 0
M KCl w standardowym buforze B (%)
100
Objętość frakcji wynosiła 0,5 ml. Frakcje wykazujące aktywność połączono do dalszego oczyszczania. [Eluat High Trap Blue: 1,5 ml, 0,05 mg białka, 168 pkat].
W tym etapie oczyszczania, w porównaniu z kolumną CHT II, otrzymano wskaźnik wzbogacenia 4,2. Usunięcie 93% obcych białek było związane z utratą 71% aktywności.
3.7. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych na fenylosefarozie
Gdy do białek rozpuszczonych w środowisku wodnym doda się pewnych obojętnych soli, takich jak np. (NH4)2SO4 lub KCl, wzrasta siła jonowa roztworu. W tych warunkach następuje asocjacja hydrofobowych regionów na powierzchni białka. W ten sam sposób zostają one zaadsorbowane na materiale kolumny mającym hydrofobowe ligandy, a zatem występują tam oddziaływania hydrofobowe (HIC = chromatografia z oddziaływaniami hydrofobowymi). Oddziaływania te można następnie ponownie zmniejszyć przez użycie buforu do wymywania o niskim stężeniu soli.
Przy takim sposobie oczyszczania konieczne jest doprowadzenie eluatu High Trap Blue do stężenia 0,5 M siarczanu amonu. Wykonano to dodając bardzo powoli, małymi porcjami, odpowiednią ilość schłodzonego lodem 1 M roztworu siarczanu amonu w standardowym buforze B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol). Następnie roztwór białka wprowadzono do małej kolumny (1 cm φ x 1,3 cm) równoważonej 0,5 M (NH4^SO4 w standardowym buforze B. Gdy roztwór białka spenetrował złoże żelu (fenylosefaroza, Pharmacia), kolumnę przemyto 7 ml 0,5 M (NH4)2SO4 w standardowym buforze B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol). Aby wymyć związane białko zastosowano 0,1 M (NH4^SO4 w standardowym buforze B (50 mM Tris, HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol). Eluat zbierano we frakcjach 0,5 ml i oznaczano stężenie białka i aktywność enzymatyczną. Najbardziej aktywne frakcje połączono i oznaczono w nich aktywność i zawartość białka. [Eluat fenylosefarozowy: 2,5 ml, 0,001 mg, 6,3 pkat]. W porównaniu z eluatem HiTrapBlue uzyskano wskaźnik wzbogacenia 1,9 z równoczesną utratą 96% aktywności i usunięciem 98% obcych białek.
3.8. Chromatografia z powinowactwem do barwnika na Mimetic Green 1A-6 XL
Jak wcześniej opisano dla kolumny High Trap Blue, w tym przypadku także występują oddziaływania pomiędzy miejscem wiązania kofaktora na enzymie a barwnikowym ligandem materiału. Tylko związane enzymy zależnie od kofaktora mogą być wymyte z użyciem kofaktora, w tym przypadku acetylokoenzymu A. Niespecyficznie zaabsorbowane białka pozostają w kolumnie.
Przed wprowadzeniem eluatu fenylosefarozowego do kolumny Mimetic Green (1 cm φ x 1,2 cm. Affinity Chromatography Ltd., Freeport, Ballasalla, Isle of Man) należało go pozbawić soli, co przeprowadzono stosując kolumnę PD10 (Pharmacia). W tym celu 2,5 ml eluatu fenylosefarozowego wprowadzono
PL 197 703 B1 do kolumny PD 10 i odczekano aż wniknie on w złoże. Wymywanie przeprowadzono z użyciem standardowego buforu B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol), pierwsze 0,5 ml odrzucono, a następne 2,5 ml, zawierające aktywne białko, zebrano.
Ten roztwór enzymatyczny wprowadzono do kolumny Mimetic Green (1 cm φ x 1,2 cm) przemytej standardowym buforem B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol). Po wniknięciu roztworu w złoże żelu kolumnę przemyto bez użycia pompy kolejno stosując następujące roztwory: 3 ml standardowego buforu B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20% gliceryny, 20 mM 2-merkaptoetanol), 3 ml 0,5 mM acetylokoenzymu A w standardowym buforze B, 2 ml standardowego buforu B, 3 ml 1 M KCl w standardowym buforze B. Zbierano 1 ml frakcje i oznaczano w nich białko i aktywność acetylokoenzymu A.
Frakcja acetylokoenzymu A była jedyną frakcją wykazującą aktywność transferazy acetylowej. Ani początkowy eluat, ani eluat KCl nie wykazywały jakiejkolwiek aktywności.
Przed oznaczeniem aktywności acetyloCoA w eluacie należało usunąć kofaktor z roztworu. Duża ilość nieznakowanego acetylokoenzymu A rozcieńczyłaby niewielką ilość acetyloCoA znakowanego 14C w takim stopniu, że faktycznie żaden radioaktywny substrat nie zostałby przekształcony.
Acetylokoenzym A usunięto prawie całkowicie z użyciem kolumny PD 10 w sposób opisany powyżej. Dla tak otrzymanego eluatu przeprowadzono normalny test aktywności. Jednakże ze względu na to, że eluat PD 10 nadal zawierał ślady acetylo-CoA z buforu do wymywania, czyli nie można było osiągnąć całkowitego usunięcia, całość CoA znakowanego 14C była rozcieńczona w teście aktywności, co spowodowało, że wartości aktywności i wskaźnika oczyszczenia były za niskie. [Eluat Green: 2,5 ml, 0,0001 mg białka, 0,7 pkat].
W tym etapie oczyszczania usunięto pozostałe obce białka i uzyskano wskaźnik oczyszczenia 1,1 przy utracie 81% aktywności.
3.9. Podsumowanie prób oczyszczania i udokumentowanie jednorodności
Opisanym sposobem otrzymano żądaną transferazę acetylową z surowego ekstraktu przez wytrącanie 70% siarczanem amonu w ośmiu etapach chromatografii kolumnowej. Otrzymano preparat transferazy acetylowej o aktywności właściwej 280 razy większej od wartości dla eluatu AcA, z całkowitą wydajnością 0,1%. Dużą utratę aktywności podczas oczyszczania, nawet gdy eluat AcA poddano obróbce przez jeden dzień, można wytłumaczyć dużą nietrwałością enzymu i jego wrażliwością na wartości pH poniżej 8 i na jony soli, a zwłaszcza siarczan amonu.
Aby sprawdzić czystość preparatu enzymu wykonano dyskową elektroforezę w warunkach denaturujących w obecności SDS. Rozdzielenie zatężonego eluatu z kolumny Mimetic Green z użyciem SDS-PAGE i wybarwienie srebrem ujawniło pojedynczy prążek.
| Etap oczyszczania | Objętość (ml) | Całkowita aktywność (pkat) | Całkowite białko (mg) | Aktywność właściwa (pkat/mg) | Wydajność (%) | Oczyszczenie (x-razy) |
| Surowy ekstrakt | 278 | - | 372 | - | - | - |
| Ca3(PO4)2 | 285 | - | 194 | - | - | - |
| Eluat Sephadex G25 | 82 | - | 78 | - | - | - |
| Eluat DEAE | 110 | - | 59 | - | - | - |
| Eluat AcA 44 | 53 | 724 | 25,7 | 28 | 100 | 1 |
| Eluat HighQ | 4 | 796 | 8,8 | 90,5 | 121 | 3,2 |
| Eluat CHT II | 1,5 | 578 | 0,73 | 792 | 80 | 43 |
| Eluat High Trap Blue | 1,5 | 168 | 0,05 | 3360 | 23 | 120 |
| Eluat fenylosefarozowy | 2,5 | 6,3 | 0,001 | 6300 | 0,87 | 225 |
| Eluat Mimetic Green | 2,5 | 0,7 | 0,0001 | 7000 | 0,1 | 280 |
PL 197 703 B1
P r z y k ł a d 4
Charakteryzowanie transferazy acetylowej z hodowli zawiesin komórkowych Taxus chinensis
4.1. Optimum pH
Wartość pH ma bardzo duży wpływ na aktywność enzymatyczną, ze względu na to, że wpływa ona na zmiany ładunku grup funkcyjnych pewnych aminokwasów zależnie od kwasowości roztworu enzymu. Wpływa to na konformacje centrum aktywnego enzymu, a tym samym na jego aktywność. Podobnie profil protonacji pewnych substratów zależy od pH i może także wpływać na aktywność enzymu.
W celu wyznaczenia optymalnego zakresu pH mierzono przeniesienie acetylokoenzymu A na 10-deacetylotaksujunaninę C przy różnych wartościach pH w zakresie 5 - 11. W tym celu zastosowano 5,6 pkat (1,7 pg, 50 pl) 120-krotnie wzbogaconej transferazy acetylowej (eluat High Trap Blue) w następujących mieszaninach:
Mieszaniny:
pl 0,8 M Tris, pH 8,5 pl transferazy acetylowej (5,6 pkat, 1,7 pg, 120-razy wzbogacona) pl acetylokoenzymu A (5 nmoli, zawierające 0,02 pCi [2-14C]acetylokoenzymu A pl 3 mM 10-deacetylotaksujunaniny C (15 nmoli) pl wody destylowanej (Millipore)
Inkubacja: 25 minut w 35°C.
Mieszaninę wstępnie inkubowano bez acetylokoenzymu A przez 5 minut, a następnie reakcję rozpoczynano przez dodanie kofaktora. Po 25 minutach inkubacji w 35°C reakcję zatrzymano przez zakwaszenie i ekstrakcję eterem metylowo-t-butylowym. Radioaktywność jaką wykazywał ekstrakt eterowy zmierzono za pomocą licznika scyntylacyjnego.
Aktywność transferazy acetylowej występowała w stosunkowo wąskim zakresie pH 8,5 - 9, z optimum przy pH 9. Wartości przemiany odpowiadające połowie maksimum obserwowano przy pH 6,8 i 10,8.
Oczyszczanie przeprowadzano przy pH 8,5 ze względu na to, że w tym przypadku w początkowych eluatach z kolumn powinowactwa występowało mniej aktywnego białka niż przy pH 9.
4.2. Optimum temperatury
Oprócz znaczącego wpływu wartości pH na aktywność enzymatyczną, aktywność enzymatyczna w znacznym stopniu zależy także od temperatury inkubacji. Początkowo ze wzrostem temperatury aktywność enzymatyczna wzrasta, ale następnie obniża się ona szybko powyżej pewnej temperatury właściwej dla każdego enzymu. W tej wysokiej temperaturze zachodzi denaturacja i dezaktywacja enzymu. Aby wyznaczyć optimum temperatury dla transferazy acetylowej, 1,7 pg (5,6 pkat) 120-krotnie oczyszczonego enzymu inkubowano w temperaturze 0-50°C, początkowo przez 10 minut bez acetylokoenzymu A, a następnie, po dodaniu kofaktora, przez kolejne 25 minut. Reakcję przerwano przez dodanie 20 pl 12% H2SO4. Następnie powstałą taksujunaninę C wyekstrahowano z użyciem 600 pl eteru. Ilość wytworzonego produktu oznaczono za pomocą licznika scyntylacyjnego.
Mieszaniny:
pl 0,8 M Tris, pH 8,5 pl transferazy acetylowej (5,6 pkat, 1,7 pg, 120-razy wzbogacona) pl acetylokoenzymu A (5 nmoli, zawierające 0,02 pCi [2-14C]AcCoA) pl 3 mM 10-deacetylotaksujunaniny C (15 nmoli) pl wody destylowanej (Millipore)
Inkubacja: 25 minut w odpowiedniej temperaturze.
Optimum temperatury dla transferazy acetylowej wynosiło 35°C.
4.3. Punkt izoelektryczny
Punkt izoelektryczny wyznaczono metodą chromatoogniskowania. W tym celu stosuje się specyficzny wymieniacz anionowy, np. Mono P HR 5/20 (Pharmacia), na który nanosi się żądany enzym przy wartości pH, przy której występuje on w postaci anionu. W tych początkowych warunkach enzym wiąże się z materiałem kolumny i może być wymyty mieszaniną buforującą zawierającą amfolit (Polybuffer 94, Pharmacia) tworzącą gradient pH w kolumnie. Enzym sam odłącza się od wymieniacza anionowego dokładnie w punkcie, w którym wartość pH została obniżona w takim stopniu, że enzym zmienił swój stan z anionowego do praktycznie nienaładowanego. Ta wartość pH odpowiada punktowi izoelektrycznemu (IEP).
Dla transferazy acetylowej wartości IEP wyznaczono z użyciem BioLogic FPLC Workstation (Biorad) z kolumną Mono P HR 5/20 (0,5 cm φ x 20 cm, Pharmacia) z natężeniem przepływu 0,7 ml/min.
PL 197 703 B1
Kolumnę równoważono 25 mM imidazolem/HCI pH 7,4 i nałożono na nią eluat HighQ. W tym celu 1 ml eluatu HighQ zatężono do 100 μΙ z użyciem koncentratorów Centriprep (30 kD) i rozcieńczono do 6 ml wyżej wymienionym buforem imidazolowym. Zastosowano tutaj białko o tym stopniu czystości ze względu na to, że eluat HighQ wykazywał najwyższą aktywność (pkat/ml), a podejrzewano, że chromatoogniskowanie spowoduje dużą utratę aktywności. Kolumnę przemyto 10 ml buforu wyjściowego, a następnie białko wymywano 40 ml roztworu Polybuffer 74 (rozcieńczonego 1:8 wodą z Millipore, pH 4). Zbierano 1 ml frakcje oraz, by utrzymać niskie wartości pH, dodawano początkowo do każdej innej frakcji po 100 μl 0,8 M Tris pH 8,5. Wartości pH mierzono w pośrednich frakcjach.
Aby oznaczyć frakcję aktywną równe części każdej z innych frakcji inkubowano w następującej mieszaninie przez 30 minut.
Mieszaniny:
200 μl roztworu enzymu (buforowany do pH 8,5) μl acetylokoenzymu A (5 nmoli, zawierające 0,02 μφ [2-14C]acetyloCoA) μl 3 mM 10-deacetylotaksujunaniny C (15 nmoli)
Inkubacja: 30 minut w temperaturze 35°C.
Oznaczenia prowadzono za pomocą licznika scyntylacyjnego po ekstrakcji eterem metylowo-t-butylowym.
Główną aktywność wymyto w pH w zakresie 5,7 - 5,47, a zatem punkt izoelektryczny transferazy acetylowej wyznaczono na 5,6.
4.4. Wyznaczenie masy cząsteczkowej
Aby wyznaczyć masę cząsteczkową transferazy acetylowej zastosowano dwie różne metody: filtrację żelową z użyciem skalibrowanej kolumny do filtracji żelowej i elektroforezę w żelu z SDS.
Pierwsze z oznaczeń przeprowadzono z użyciem aparatury FPLC (BioLogic Workstation, Biorad) z natężeniem przepływu 0,2 ml/min. oraz kolumny Biosilect-SEC 250-5 (Biorad) równoważonej buforem 50 mM Tris, pH 8,5, 10 mM 2-merkaptoetanol. Początkowo kolumnę kalibrowano z użyciem białek o znanej masie cząsteczkowej. W tych samych warunkach przez kolumnę przepuszczono 1,5 ml eluatu High Trap Blue zatężonego do 100 μl (3360 pkat, 50 μl białka) z użyciem koncentratorów Centriprep (2 ml, membrana 10 kD). Objętość zbieranych frakcji wynosiła 250 μΙ, a aktywność wyznaczono przez inkubację następujących mieszanin (całkowita objętość 185 μΙ).
Mieszaniny:
pl 0,8 M Tris, pH 8,5
100 μl eluatu μl acetylokoenzymu A (5 nmoli, zawierające 0,02 μφ [2-14C]acetyloCoA) μl 3 mM 10-deacetylotaksujunaniny C (15 nmoli)
Inkubacja: 30 minut w temperaturze 35°C.
Oznaczenia wykonano za pomocą licznika scyntylacyjnego po ekstrakcji eterem metylowo-t-butylowym.
Masa cząsteczkowa transferazy acetylowej wyznaczona tą metodą wynosiła 72 kD.
Aby potwierdzić tę wartość zastosowano elektroforezę w żelu denaturującym z SDS. W tym celu 0,3 μg homogenicznego białka poddano chromatografii w 10% żelu SDS równolegle z białkami znacznikowymi o znanych masach cząsteczkowych (Rainbow Marker). Białka wizualizowano przez barwienie srebrem, co umożliwia porównanie wartości Rf białek wzorcowych i transferazy acetylowej; stwierdzono masę cząsteczkową 70,8 kD dla enzymu.
4.5. Wyznaczanie wartości Km
Wyznaczanie wartości Km dla 10-deacetylotaksujunaniny C
Aby uzyskać informację o powinowactwie transferazy acetylowej do 10-deacetylotaksujunaniny C, wyznaczono wartość Km dla eluatu fenylosefarozowego.
Mieszaniny:
pl 0,8 M Tris, pH 8,5
100 μ transferazy acetylowej (0,25 pkat, 40 ng białka, 225-krotne wzbogacenie) μl acetylokoenzymu A (5 nmoli, zawierające 0,02 μφ [2-14C]acetyloCoA) μl 10-deacetylotaksujunaniny C (końcowe stężenie: 0,1/0,3/1/3/5710/30/50/100/200/300/500 μΜ)
Inkubacja: 30 minut w temperaturze 35°C; ocenę radioaktywności powyższej mieszaniny wyekstrahowanej eterem metylowo-t-butylowym, przeprowadzono za pomocą licznika scyntylacyjnego.
Na podstawie sporządzonego wykresu odwrotności obu zmierzonych wartości metodą Lineweavera i Burka wyznaczono graficznie wartość Km dla 10-deacetylotaksujunaniny C jako 23 μΜ.
PL 197 703 B1
4.6. Wyznaczanie wartości Km dla acetylokoenzymu A.
Powinowactwo transferazy acetylowej do acetylokoenzymu A można określić wartością Km, którą wyznaczono stosując eluat fenylosefarozowy.
Mieszaniny:
μΙ 0,8 M Tris, pH 8,5
100 μΙ transferazy acetylowej (0,25 pkat, 40 ng białka, 225-krotne wzbogacenie) μl acetylokoenzymu A i H2O (końcowe stężenie: 2,1/2,3/3/5/12/32/52/102/152/202/302/502 μΜ, każde zawierające 0,02 μΜ (40000 zliczeń/min.) [2-14C]acetyloCoA) μl 3 mM 10-deacetylotaksujunaniny C (15 nmoli)
Inkubacja: 30 minut w temperaturze 35°C. Następnie przeprowadzono oznaczenia po wyekstrahowaniu eterem t-butylowo-metylowym za pomocą licznika scyntylacyjnego. Na podstawie sporządzonego wykresu odwrotności obu zmierzonych wartości metodą Lineweavera i Burka wyznaczono wartość Km dla acetylokoenzymu A jako 61 μΜ.
4.7. Liczba obrotów kkat
Liczba obrotów opisuje szybkość reakcji enzymatycznej przez stwierdzenie jak wiele cząsteczek substratu jest przekształcanych w ciągu sekundy przez jedną cząsteczkę enzymu.
Aby wyznaczyć obrót zastosowano eluat fenylosefarozowy. Stężenie zawartej w nim transferazy acetylowej wyznaczono rozdzielając eluat metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS, a następnie barwienie srebrem. Do sąsiednich szczelinek żelu wprowadzono znane ilości albuminy surowicy bydlęcej, jako stężenia porównawcze.
Przy zastosowaniu 300 μl roztworu enzymu odpowiadającego 18 ng transferazy acetylowej, 10-deacetylotaksujunaniny C i acetylokoenzymu A, zmierzona kinetyka obrotów wykazywała liniowość w zakresie 5-30 minut.
Mieszaniny:
pl 0,8 M Tris, pH 8,5
300 μI transferazy acetylowej (18 ng transferazy acetylowej, 0,76 pkat) μl acetylokoenzymu A (5 nmoli, zawierające 0,02 μφ [2-14C]acetyloCoA) μl 3 mM 10-deacetylotaksujunaniny C (15 nmoli)
Inkubacja: 30 minut w 35°C.
Następnie mieszaniny inkubacyjne ekstrahowano eterem metylowo-t-butylowym i wykonano pomiar za pomocą licznika scyntylacyjnego. Obroty (pmol) obliczono na podstawie zmierzonych wartości. Podzielenie masy cząsteczkowej (72 kD) przez ilość enzymu (18 ng) daje stężenie enzymu wynoszące 0,25 pmola na partię.
Aktywność enzymu obliczono wyznaczając obrót w jednostce czasu (sekundy). Iloraz aktywności enzymu (0,05 pmola/s) i stężenia (0,25 pmola) daje wartość wynoszącą 0,2 kat/mol homogenicznego enzymu (mol/s/mol enzymu) dla obrotu transferazy acetylowej.
Obrót = liczba obrotów kkat; 0,05 pmola/s: 0,25 μmola = 0,2 kat/mol.
Wartość ta odpowiada obrotowi 0,2 mola substratów na sekundę na mol (72 kg) enzymu w 35°C, pH 8,5 i przy optymalnych stężeniach substratów (60 moli 10-deacetylotaksujunaniny C, 20 moli acetyloCoA).
4.8. Optimum kinetyczne
W warunkach fizjologicznych stężenie substratu jest bardzo niskie w porównaniu ze stężeniem enzymu. Tylko niewielka liczba centrów aktywnych enzymu jest zajęta, tak że ilość enzymu nie zajętego przez substrat [E] odpowiada w przybliżeniu całkowitej ilości enzymu [Eo].
Jeżeli stężenie substratu [S] jest znacznie niższe od Km, stężenia przy którym początkowa szybkość reakcji wynosi połowę szybkości maksymalnej, reakcja enzymatyczna postępuje znacznie wolniej niż wyznaczona liczba obrotów kkat.
W celu scharakteryzowania enzymu w tych warunkach zastosowano iloraz kkat/KM. Jeżeli wartość tę pomnoży się przez stężenie substratu [S] i całkowite stężenie enzymu [Eo] uzyskuje się szybkość reakcji.
v = (kkat/KM) [S] [E0]
Wzięto pod uwagę, że szybkość dyfuzji cząsteczek rozpuszczonych w środowisku wodnym może wynosić najwyżej 108 do 109. Tak więc szybkość reakcji jest ograniczona nawet dla bardzo szybkich enzymów, ze względu na to, że substrat nie może dotrzeć szybciej do enzymu.
Optimum kinetyczne wyznaczone dla transferazy acetylowej jest następujące:
Km (10-deacetylotaksujunanina C) = 23 μΜ, kkat = 0,2 kat/mol
PL 197 703 B1 kkat/KM = 0,2 mol s’1 mol'1/23 · 10'3 [M] =8,7 s^M1
P r z y k ł a d 5
Specyficzność substratowa
Aby zbadać specyficzność substratową oczyszczonej transferazy acetylowej jako substraty zastosowano różne związki mające szkielet taksanu.
- 10-deacetylotaksujunaninę C
- 14-deacetylotaksujunaninę C
- 10,14-deacetylotaksujunaninę C
- 2,10,14-deacetylotaksujunaninę C
- 5,10,14-deacetylotaksujunaninę C
- 2,5,10,14-deacetylotaksujunaninę C
- 2,14-deacetylotaksujunaninę C
- 5,14-deacetylotaksujunaninę C
- 2,5-deacetylo-10,14-deacetylotaksujunaninę C
- 10-deacetylobakatynę III (=10-DAB III)
- 10-deacetylotaksol
- 10-deacetylocefalomanninę
- 10-epi-10-DAB III
- 19-hydroksy-10-DAB III
- 14-hydroksy-10-DAB III
- 7-TES-10-DAB III
- 7-BOC-10-DAB III
Stwierdzono, że wśród zastosowanych substratów przekształcane mogą być tylko taksany mające grupę hydroksylową w pozycji C-10. Pochodne taksanu z acetylowaną pozycją C-10, ale wolnymi grupami hydroksylowymi przy innych atomach węgla, nie były akceptowane jako substraty przez oczyszczoną transferazę acetylową. Jednakże jeżeli dostęp do C-10 był zablokowany przez podstawniki o dużej objętości, tak jak w przypadku 10-deacetylotaksolu i 10-deacetylocefalomanniny, acetylowanie nie zachodziło.
Gdy obliczono szybkość przemiany w oparciu o szybkość przemiany 10-deacetylotaksujunaniny C, stwierdzono, że wszystkie pochodne taksujunaniny C mające wolne grupy hydroksylowe ulegają przemianie w tym samym stopniu. 10-DAB ulega przemianie ze stopniem przemiany wynoszącym 85%, w porównaniu z 10-deacetylotaksujunaniną C do bakatyny III.
Przemianę różnych substratów, w odniesieniu do przemiany deacetylotaksujunaniny C, przedstawiono w tabeli poniżej.
Przemiana różnych substratów, w odniesieniu do przemiany 10-deacetylotaksujunaniny C
10-deacetylotaksujunanina C
Enzym: eluat fenylosefarozowy (oczyszczony 225-krotnie)
| Substrat | Przemiana [%] | pkat |
| 10-deacetylotaksujunanina C | 100 | 1,12 |
| 10-deacetylobakatyna III | 80 | 0,90 |
| 10,14-deacetylotaksujunanina C | 102 | 1,14 |
| 2,10,14-deacetylotaksujunanina C | 81 | 0,91 |
| 5,10,14-deacetylotaksujunanina C | 88 | 0,99 |
| 2,5,10,14-deacetylotaksujunanina C | 53 | 0,59 |
| 10-epi-10-DAB III | 0 | 0,00 |
| 19-hydroksy-10-DAB III | 38 | 0,43 |
| 14-hydroksy-10-DAB III | 97 | 1,09 |
| 7-TES-10-DAB III | 0 | 0,00 |
| 7-BOC-10-DAB III | 2 | 2,00 |
Claims (15)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposóbwytwarzaniabakatyny,zznmieenntym, że 1 0-deacetylobakatynęalbo1 0-deacetylotaksujunaninę C, 10,14-eaceatnlstcaóujuycyiyę C, 2,10,14-eaceatnlstcaóujuycyiyę C, 5,10,14-eaceat-Istcaóujuycyiyę C luO 2,5,10,14-eaceatnlotcasujuncninę C ooeecja się rackeji w oaaenośei w-iaolowcnago ana-mu i eonorc ceat-lu, pra- ea-m t-m ana-mam jast trcnsfarcac ceat-lowc o mcsia eaąstaeakowaj 70000 - 72000 w-anceaonaj matoeą PDP-PAGE, mcjąec punkt iaoalaktr-ean- prz- pH 5,4 - 5,8 i stcłą Miehcalisc-Mantanc Km elc ceat-lokoana-mu A w-nosaąeą 55 - 65 μΜ, a t-m ża tę trcnsfarcaę ceat-lową możnc otra-mcć a hoeowli kombrkow-eh Taxus chinensis.
- 2. PposbO waeług acstra. 1, znamienny tym, ża Ockct-nę III w-twcrac się a 10-eaceat-loackct-n- III.
- 3. PposbO waeług acstra. 1, znamienny tym, ża 14-h-eroks-Ockct-nę III w-twcrac się a 14-h-eroks--10-eaceat-loOckct-n- III.
- 4. PposbO waeług acstra. 1, znamienny tym, ża tcksujuncninę C w-twcrac się a 10-eaceat-lotcksujuncnin- C.
- 5. PposbO waeług acstra. 1 clOo 2, clOo 3, clOo 4, znamienny tym, ża rackeję prowceai się w oOaenośei ceat-lokoana-mu A jcko eonorc ceat-lu.
- 6. Ena-m, znamienny tym, żac) ceat-luja 10-eaceat-loOckct-nę III w oOaenośei eonorc ceat-lu, saeaagblnia ceat-lokoana-mu A, salakt-wnia w poa-eji 10,O) mc mcsę eaąstaeakową 70000 - 72000 w-anceaoną matoeą PDP-PAGE, e) mc punkt iaoalaktr-ean- pra- pH 5,4 - 5,8,e) mc stcłą Miehcalisc-Mantanc Km elc ceat-lokoana-mu A w-nosaąeą 55 - 65 μΜ, a) jast trcnsfarcaą 10-h-eroks-tckscn-O-ceat-lową if) możnc go otrz-mcć a hoeowli kombrkow-eh Taxus chinensis.
- 7. Ena-m waeług acstra. 6, znamienny tym, ża mc ea-stość > 50%.
- 8. Ena-m waeług acstra. 7, znamienny tym, ża mc ea-stość > 90%.
- 9. PposbO w-twcracnic ana-mu okraślonago w acstra. 6, znamienny tym, ża ana-m iaoluja się a Taxus chinensis erogą oea-saeacnic, pra- ea-m po kcże-m oea-saeacniu oanceac się frckeja, w ktbr-eh oOaen- jast ana-m, praaa eoecnia 10-eaceat-loOckct-n- clOo 10-eaceat-lotcksujuncnin- C, 10,14-eaceat-lotcksujuncnin- C, 2,10,14-eaceat-lotcksujuncnin- C, 5,10,14-eaceat-lotcksujuncninC luO 2,5,10,14-eaceat-lotcksujuncnin- C i eonorc ceat-lu orca w-kr-eia powstcłago proeuktu ceat-lowcnic.
- 10. PposbO waeług acstra. 9, znamienny tym, ża w sposoOceh oea-saeacnic stosuja się kolumnę HighQ.
- 11. PposbO waeług acstra. 9 clOo 10, znamienny tym, ża eo w-kr-eic frckeji acwiarcjąe-eh ana-m stosuja się 10-eaceat-loOckct-nę III luO 10-eaceat-lotcksujuncninę C.
- 12. PposbO waeług acstra. 9 clOo 10, znamienny tym, ża jcko eonor ceat-lu stosuja się ceat-lokoana-m A.
- 13. PposbO waeług acstra. 9 clOo 10, znamienny tym, ża powstcły proeukt ceat-lowcnic w-kr-wc się matoeą anckowcnic rceiockt-wnago.
- 14. PposbO waeług acstra. 9 clOo 10, znamienny tym, ża powstał- proeukt ceat-lowcnic w-kr-wc się matoeą anckowcnic eiężkim iaotopam.
- 15. PposbO w-twcracnic tcksolu, znamienny tym, ża ncjpiarw w-twcrac się Ockct-nę sposoOam praaestcwion-m w acstra. 1, c ncstępnia poeecja się ją rackeji astr-fikceji grup- OH w poa-eji 13 poehoenaj Ockct-n- oepowiaenim kwcsam a w-tworaaniam tcksolu.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19804815A DE19804815C1 (de) | 1998-02-06 | 1998-02-06 | Verfahren zur Herstellung von Baccatin |
| PCT/EP1999/000599 WO1999040216A1 (de) | 1998-02-06 | 1999-01-29 | Verfahren zur herstellung von baccatin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL342711A1 PL342711A1 (en) | 2001-07-02 |
| PL197703B1 true PL197703B1 (pl) | 2008-04-30 |
Family
ID=7856891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL342711A PL197703B1 (pl) | 1998-02-06 | 1999-01-29 | Sposób wytwarzania bakatyny, enzym, sposób wytwarzania enzymu i sposób wytwarzania taksolu |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6514732B1 (pl) |
| EP (1) | EP1053345B1 (pl) |
| JP (1) | JP4278864B2 (pl) |
| KR (1) | KR100575488B1 (pl) |
| CN (1) | CN1226416C (pl) |
| AT (1) | ATE260985T1 (pl) |
| AU (1) | AU760122B2 (pl) |
| CA (1) | CA2319136C (pl) |
| CZ (1) | CZ300009B6 (pl) |
| DE (2) | DE19804815C1 (pl) |
| DK (1) | DK1053345T3 (pl) |
| ES (1) | ES2217777T3 (pl) |
| HU (1) | HU228677B1 (pl) |
| NO (1) | NO320104B1 (pl) |
| PL (1) | PL197703B1 (pl) |
| PT (1) | PT1053345E (pl) |
| RU (1) | RU2219242C2 (pl) |
| SI (1) | SI1053345T1 (pl) |
| SK (1) | SK284676B6 (pl) |
| WO (1) | WO1999040216A1 (pl) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6287835B1 (en) | 1999-09-30 | 2001-09-11 | Washington State University Research Foundation | Transacylases of the paclitaxel biosynthetic pathway |
| DE10013942B4 (de) * | 2000-03-21 | 2010-01-14 | Air Liquide Deutschland Gmbh | Verfahren zum Herstellen von Arzneimitteln aus Ausgangsstoffen der traditionellen chinesischen Medizin |
| US20080053911A1 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Qiagen Gmbh | Separation of an organic phase from a mixture comprising organic and aqueous phases by solid phase systems |
| CN103808853A (zh) * | 2012-11-15 | 2014-05-21 | 刘胜远 | 一种红豆杉中7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的薄层色谱检测方法 |
| CN103808850A (zh) * | 2012-11-15 | 2014-05-21 | 刘胜远 | 一种红豆杉中10-去乙酰基巴卡亭ⅲ的薄层色谱检测方法 |
| CN103808851A (zh) * | 2012-11-15 | 2014-05-21 | 刘胜远 | 一种红豆杉中10-去乙酰基紫杉醇的薄层色谱检测方法 |
| CN103808854A (zh) * | 2012-11-15 | 2014-05-21 | 刘胜远 | 一种红豆杉中巴卡亭ⅲ的薄层色谱检测方法 |
-
1998
- 1998-02-06 DE DE19804815A patent/DE19804815C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-01-29 ES ES99934214T patent/ES2217777T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 PL PL342711A patent/PL197703B1/pl unknown
- 1999-01-29 US US09/582,223 patent/US6514732B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 AU AU32519/99A patent/AU760122B2/en not_active Ceased
- 1999-01-29 SI SI9930568T patent/SI1053345T1/xx unknown
- 1999-01-29 DE DE59908741T patent/DE59908741D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 PT PT99934214T patent/PT1053345E/pt unknown
- 1999-01-29 JP JP2000530627A patent/JP4278864B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 KR KR1020007008519A patent/KR100575488B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-01-29 CZ CZ20002723A patent/CZ300009B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-01-29 CA CA002319136A patent/CA2319136C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-01-29 DK DK99934214T patent/DK1053345T3/da active
- 1999-01-29 SK SK1124-2000A patent/SK284676B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-01-29 RU RU2000123174/13A patent/RU2219242C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-01-29 AT AT99934214T patent/ATE260985T1/de active
- 1999-01-29 EP EP99934214A patent/EP1053345B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 HU HU0100724A patent/HU228677B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-01-29 WO PCT/EP1999/000599 patent/WO1999040216A1/de active IP Right Grant
- 1999-01-29 CN CNB998027057A patent/CN1226416C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-07-24 NO NO20003787A patent/NO320104B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK1053345T3 (da) | 2004-06-21 |
| ES2217777T3 (es) | 2004-11-01 |
| DE59908741D1 (de) | 2004-04-08 |
| SK11242000A3 (sk) | 2001-09-11 |
| CZ20002723A3 (cs) | 2001-01-17 |
| CN1290305A (zh) | 2001-04-04 |
| RU2219242C2 (ru) | 2003-12-20 |
| JP2002502613A (ja) | 2002-01-29 |
| PL342711A1 (en) | 2001-07-02 |
| PT1053345E (pt) | 2004-07-30 |
| HUP0100724A3 (en) | 2002-04-29 |
| CA2319136C (en) | 2008-09-09 |
| JP4278864B2 (ja) | 2009-06-17 |
| US6514732B1 (en) | 2003-02-04 |
| DE19804815C1 (de) | 1999-04-15 |
| WO1999040216A1 (de) | 1999-08-12 |
| NO20003787D0 (no) | 2000-07-24 |
| KR20010040647A (ko) | 2001-05-15 |
| EP1053345B1 (de) | 2004-03-03 |
| AU3251999A (en) | 1999-08-23 |
| CA2319136A1 (en) | 1999-08-12 |
| SI1053345T1 (en) | 2004-08-31 |
| CN1226416C (zh) | 2005-11-09 |
| NO320104B1 (no) | 2005-10-24 |
| EP1053345A1 (de) | 2000-11-22 |
| ATE260985T1 (de) | 2004-03-15 |
| HU228677B1 (en) | 2013-05-28 |
| NO20003787L (no) | 2000-07-24 |
| KR100575488B1 (ko) | 2006-05-03 |
| AU760122B2 (en) | 2003-05-08 |
| HUP0100724A2 (hu) | 2001-12-28 |
| CZ300009B6 (cs) | 2009-01-14 |
| SK284676B6 (sk) | 2005-09-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Davin et al. | On the stereoselective synthesis of (+)-pinoresinol in Forsythia suspensa from its achiral precursor, coniferyl alcohol | |
| Poincelot | Isolation and lipid composition of spinach chloroplast envelope membranes | |
| Ritala et al. | Evaluation of tobacco (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1) hairy roots for the production of geraniol, the first committed step in terpenoid indole alkaloid pathway | |
| Walker et al. | Partial purification and characterization of acetyl coenzyme A: taxa-4 (20), 11 (12)-dien-5α-olO-acetyl transferase that catalyzes the first acylation step of Taxol biosynthesis | |
| Eilert et al. | Elicitor-induced accumulation of acridone alkaloid epoxides in Ruta graveolens suspension cultures | |
| US5891504A (en) | Flavor composition | |
| Hahlbrock et al. | Comparison of chalcone-flavanone isomerase heteroenzymes and isoenzymes | |
| PL197703B1 (pl) | Sposób wytwarzania bakatyny, enzym, sposób wytwarzania enzymu i sposób wytwarzania taksolu | |
| Goldberg et al. | Fatty acid synthetases in Euglena gracilis | |
| WO2000040573A1 (en) | Method for high yield extraction of paclitaxel from paclitaxel-containing material | |
| Frenzel et al. | Purification and characterization of three isoforms of S-adenosyl-L-methionine:(R, S)-tetrahydrobenzylisoquinoline-N-methyltransferase from Berberis koetineana cell cultures | |
| US20130237712A1 (en) | Method for isolating flavonoid dihydroquercetin (taxifolin) from conifer wood species | |
| Menhard et al. | Special publication Purification and characterization of acetyl coenzyme a: 10-hydroxytaxane O-acetyltransferase from cell suspension cultures of Taxus chinensis | |
| DiCosmo et al. | Plant cell culture secondary metabolism | |
| Tunlid et al. | Differences in fatty acid composition between vegetative cells and N2-fixing vesicles of Frankia sp. strain CpI1 | |
| Dixon et al. | Hydrophobic esters of cellulose: properties and applications in biochemical technology | |
| Bowien et al. | Influence of the activation state on the sedimentation properties of ribulose bisphosphate carboxylase from Alcaligenes eutrophus. | |
| Nanduri et al. | Fermentation and isolation of C10‐deacetylase for the production of 10‐deacetylbaccatin III from baccatin III | |
| Schick et al. | The morphogenesis of the bacterial photosynthetic apparatus III. The features of a pheophytin-protein-carbohydrate complex excreted by the mutant M 46 of Rhodospirillum rubrum | |
| Pennington et al. | Acetyl CoA: 10-deacetylbaccatin-III-10-O-acetyltransferase activity in leaves and cell suspension cultures of Taxus cuspidata | |
| Holmquist et al. | Affinity Chromatography of Influenza Virus on Immobilized α‐and β‐Ketosides of Neuraminic Acid Derivatives | |
| Pras et al. | Production of secondary metabolites by bioconversion | |
| Friese et al. | Biosynthesis of the axenomycin chromophore | |
| JPS6034556B2 (ja) | 抗生物質ｃ−１５００３ | |
| Jaus et al. | Continuous Synthesis of NAD in a Nuclear Column |