SK284676B6

SK284676B6 - Spôsob výroby baccatínu, enzým, spôsob prípravy enzýmu a jeho použitie

Info

Publication number: SK284676B6
Application number: SK1124-2000A
Authority: SK
Inventors: Ezio Bombardelli; Birgitta Menhard; Meinhart Hans Zenk
Original assignee: Indena S.P.A.
Priority date: 1998-02-06
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2005-09-08
Also published as: DE19804815C1; US6514732B1; CA2319136C; EP1053345B1; PL342711A1; CZ300009B6; RU2219242C2; ES2217777T3; NO320104B1; EP1053345A1; JP4278864B2; HU228677B1; SI1053345T1; AU3251999A; DE59908741D1; HUP0100724A3; JP2002502613A; CZ20002723A3; ATE260985T1; NO20003787L

Abstract

Je opísaný spôsob prípravy baccatínu a/alebo baccatínových derivátov, pri ktorom reaguje 10-deacetylbaccatín alebo 10-deacetylbaccatínový derivát v prítomnosti izolovaného enzýmu a acetylového donora, pričom ako enzým sa používa acetyltransferáza s molekulovou hmotnosťou od 70 do 72 kD, stanovené SDS-PAGE, ktorá sa získa z Taxus chinensis.

Description

Vynález sa týka spôsobu prípravy baccatínu a/alebo baccatínových derivátov selektívnou acetyláciou príslušných deacetylzlúčenín, izolovaného enzýmu, ktorý túto acetylačnú reakciu katalyzuje, ako aj spôsobu prípravy tohto enzýmu.

Doterajší stav techniky

Taxol (paclitaxel) je sľubný prostriedok na liečenie rakoviny, ktorý vykazuje antileukemickú a tumorinhibujúcu aktivitu (pozri napríklad: Suffnes et al., in The Alkaloids, Chemistry and Pharmacology, A. Brossi, Hrsg. Academic Press: Orlando, FL, 1985, Vol. XXV, Kapitel 1). Pôvodne sa taxol získaval z kôry určitého druhu (Taxus taxaceae). Izolovanie taxolu z kôry je však ťažké aj nákladné a získajú sa len veľmi malé výťažky požadovaného taxolu z kôry (40 až 165 mg/kg) (pozri napríklad: R. W. Míller et al., J. Org. Chem. 46 (1981) 1469 - 1474; V. Sénilh et al., J. Nat. Procl. 47 (1984) 131 - 137; N. Magri et al., J. Org. Chem. 51 (1986) 797 - 802). Okrem toho vedie používanie kôry k odumieraniu tisov, ktoré rastú veľmi pomaly, takže východiskový materiál je k dispozícii len vo veľmi obmedzenom rozsahu.

Po objavení vlastnosti taxolu, kvôli ktorým sa odporúča ako chemoterapeutický prostriedok proti rakovine, boli mnohé snahy pripraviť ho syntetickým alebo polosyntetickým spôsobom. Skúšala sa tak pripraviť štruktúra taxolu organickou syntézou (pozri napríklad: W. F. Berkovitz et al., J. Org. Chem. 52 (1987) 1119 - 1124). Na základe zložitosti tejto molekuly sa však dodnes nepodarilo pripraviť taxol v prakticky použiteľných množstvách úplnou organickou syntézou. Ďalšia cesta, ktorá bola navrhnutá, aby sa získal taxol, vychádza z čiastočnej syntézy predchádzajúcej látky získateľnej ľahko a vo veľkých množstvách. Jeden z týchto prístupov vychádza z 10-deacetylbaccatínu III, ktorý je možné ľahko a vo veľkých výťažkoch extrahovať z listov Taxus baccata L (G. Chauviere et al., Seances Acad. Sci., Ser. 2, 1981, 293, 501 - 503). Pritom je možné izolovať asi 1 g 10-deacetylbaccatínu III na kg listov, pričom listy rýchlo dorastajú. Tak môže byť získané veľké množstvo predchádzajúceho 10-deacetylbaccatínu III.

Z tejto predchádzajúcej zlúčeniny získanej z biologického materiálu sa môže potom parciálnou syntézou pripraviť požadovaná účinná látka taxol. Ale ukázalo sa, že akokoľvek sa zdajú štruktúry 10-deacetylbaccatínu III a taxolu podobné, táto parciálna syntéza zahrnuje ešte veľké ťažkosti a môže byť uskutočnená úspešne len pri použití špecifických chrániacich skupín, pričom požadovaný produkt taxol sa napokon získa v malých výťažkoch.

Denis et al., (J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 5917 až 5919) opisujú reakciu 10-deacetylbaccatinu III na taxol v dvoch krokoch. V prvom kroku sa acetyluje 10-deacetylbaccatin III chemicky v polohe 10. V druhom kroku sa uskutočňuje prevedenie baccatínu na taxol. Prvý krok však nie je regiošpecifický, takže acetylácia 10-acetylbaccati’nu III prebieha predovšetkým tiež do polohy 7. Je teda nutné hydroxyskupinu v tejto polohe na acetyláciu zneprístupniť chrániacou skupinou. Len použitím chrániacej skupiny mohlo byť dosiahnuté acetylovanie v polohe 10. Použitie chrániacej skupiny však zahrnuje dva ďalšie kroky postupu (pripojenie a odstránenie chrániacej skupiny), čo je jednak nákladné a jednak sú výťažky produktov podstatne znížené. Ďalšia nevýhoda pri použití chrániacich skupín spočíva v tom, že predovšetkým aplikácia produktu ako farmaceutic kej účinnej látky musí mať ďalej zaradené nákladné čistiace a analytické metódy, aby bola istota, že sa v produkte už nenachádza žiadna molekula vybavená chrániacou skupinou.

Zocher et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 229 (1996), 16 - 20) opisujú biosyntézu taxolu. V medzikroku bola pritom uskutočnená acetylácia 10-deacetylbaccatínu III na baccatin III pomocou surových rastlinných extraktov z koreňov Taxus baccata. Nepodarilo sa však izolovať substancie, ktoré spôsobujú acetyláciu, alebo ich charakterizovať. Nevýhodou pri použití surového extraktu je skutočnosť, že ďalšie početné reakcie, predovšetkým acetyl ácie do ďalších polôh, môžu byť vyvolané alebo ovplyvnené takisto látkami existujúcimi v surovom extrakte. Ďalej rastlinný extrakt nevykazuje žiadne definované a reprodukovateľné zloženie, takže použitie surových rastlinných extraktov vedie k nekontrolovateľným a rozmanitým reakciám a výťažkom.

Úlohou predkladaného vynálezu bolo preto dať k dispozícii spôsob, ktorým môže byť pripravený baccatin a baccatínu podobné baccatínové deriváty selektívnou acetyláciou príslušných 10-deacetylzlúčenín v polohe 10. Ďalšia úloha spočívala v poskytnutí izolovanej látky, ktorá túto reakciu špecificky katalyzuje.

Podstata vynálezu

Tieto úlohy sa podľa vynálezu riešia spôsobom prípravy baccatínu alebo baccatínových derivátov, vyznačujúcim sa tým, že 10-deacetylbaccatín alebo 10-deacetylbaccatínový derivát reaguje v prítomnosti izolovaného enzýmu a acetylového donora, pričom ako enzým sa používa acetyltransferáza s molekulovou hmotnosťou od 70 do 72 kD, stanovené SDS-PAGE (natriurododecylsulfátpolyakrylamidgélovou elektroforézou), ktorá sa získa z bunkovej kultúry Taxus chinensis. Zistilo sa, že regioselektívna acetylácia v polohe 10 je katalyzovaná izolovaným enzýmom, ktorý môže byť získaný z bunkovej kultúry Taxus chinensis.

Prekvapivo sa zistilo, že použitím izolovaného a vyčisteného enzýmu môže byť získaná vysoká regiošpecifita, pokiaľ ide o acetyláciu v polohe 10. Táto špecifita je preferovaná > 80 %, viac preferovaná > 90 % a najviac preferovaná > 95 %. Zistilo sa, že použitý enzým môže získať špecifitu > 99 %. Špecifita > 80 % pritom znamená, že acetylácia sa konala na viac ako 80 % v polohelO a menej ako 20 % v iných polohách východiskovej zlúčeniny. Následkom toho ďalšie hydroxylovú skupiny, ktoré existujú vo východiskovej látke, nemusia byť blokované chrániacou skupinou, pretože acetylácia týchto ďalších hydroxyskupín pri použití enzýmu podľa vynálezu sa nevyskytuje, alebo existuje len vo veľmi malom rozsahu.

Prekvapivo sa zistilo, že enzým použitý podľa vynálezu, vykazuje vysokú substrátovú špecifitu. Tak boli podrobené reakcii len 10-deacetylbaccatín, respektíve deriváty 10-deacetyl-baccatínu, ktoré v polohe C 10 a v jej okolí vykazujú konfiguráciu podobnú 10-deacetylbaccatinu III. Predovšetkým neboli acetylované deriváty baccatínu, v prípade ktorých je blokovaný prístup k polohe 10 priestorovo náročnými substituentmi, ako možno 10-deacetyltaxol a 10-deacetylcefalomannín. Predpokladom na to, aby bol derivát baccatínu rozpoznaný enzýmom podľa vynálezu, je teda to, že tieto deriváty vykazujú cyklickú štruktúru taxánu v polohách 7, 8, 9, 10, 11, 12 a 13 v podstate zodpovedajúcu 10-deacetylbaccatínu III, to znamená nemajú v tejto polohe žiadne iné substituenty alebo len substituenty, ktoré majú malý objem. Výhodne sa tento spôsob hodí pre baccatínové deriváty, ktoré majú v polohe 7 až 13 rovnaké substituenty ako 10-dcacctylbaccatín III alebo aspoň čiastočne substituenty s menším objemom než substituenty 1O-deacetylbaccatínu III, predovšetkým vodík. Objemné substituenty v ostatných polohách reakciu nerušia. Veľmi výhodne sa spôsob používa na acetyláciu 10-deacetylbaccatínu III. Ďalej sa spôsob predovšetkým používa na selektívnu acetyláciu 14-hydroxy-10-deacetylbaccatínu III v polohe 10.

Oproti tomu sa deriváty 10-deacetylbaccatinu III, ktorých hydroxylové skupiny sú v polohe 7 blokované objemnou skupinou, ako napríklad 7-TEC-10-DAB-III alebo 7-BOC-IO-DAB-III, sú enzýmom podľa vynálezu ako substrát rozoznané. Takéto blokovanie však nie je nutné, pretože regioselektívna acetylácia v polohe 10 prebieha tiež pri existencii ďalších hydroxyskupín v iných polohách. Spôsobom podľa vynálezu je možné acetylovať taxánové deriváty selektívne v polohe 10, a to také, ktoré majú rovnaké, menšie alebo menej objemné substituenty v polohách 7 až 13, ako napríklad 10-deacetylbaccatín III. Takéto taxánové deriváty, v prípade ktorých sú substituenty existujúce v 10-deacetylbaccatíne III (to znamená OH v polohe 7, CH₃ v polohe 8, =0 v polohe 9, OH v polohe 10, CH₃ v polohe 12 a OH v polohe 13) alebo sú nahradené podobne objemným alebo menším zvyškom, predovšetkým vodíkom, patria pod pojem deriváty 10-deacetylbaccatínu a môžu byť takisto regiošpecificky acetylované, ak vykazujú v polohe 10 skupinu OH. Príkladmi takýchto derivátov sú 10-deacetyltaxuyunnanín-C, 10,14-deacetyltaxuyunnanín-C, 2,10,14-deacetyltaxuyunnanín-C, 5,10,14-deacetyltaxuyunnanín-C a 2,5,10,14-deacetyl-taxuyunnanín-C.

Výhodne sa spôsobom podľa vynálezu pripravuje baccatín-III z 10-deacetylbaccanínu III, 14-hydrobaccatín III z 14-hydroxy-10-deacctylbaccanínu III, alebo taxuyunnanín C z 10-deacetyltaxuyunnanínu C.

Spôsob podľa vynálezu sa uskutočňuje v prítomnosti acetyldonora. Ako acetyldonor sa v podstate hodí každá substancia, ktorá má pri katalytickej reakcii k dispozícii acetylskupinu. Výhodne sa uskutočňuje reakcia v prítomnosti acetylkoenzýmu A ako acetyldonora.

Použitie izolovaného enzýmu podľa vynálezu ponúka technicky mnoho predností. Reakciu je možné predovšetkým s ohľadom na reakčnú rýchlosť a rcprodukovateľnosť pri použití izolovaného enzýmu ľahko kontrolovať.

Výhodný je izoelektrický bod pH 5,4 až 5,8, výhodne 5,5 až 5,7 a predovšetkým výhodne pH 5,6. Ďalej sa zistilo, že enzým použitý podľa vynálezu vykazuje konštantu Michaelisa a Mentenovej K_M pre acetylkoenzým A 55 až 65 μΜ, výhodne 59 až 63 μΜ a mimoriadne výhodne 61 μΜ. Ďalším predmetom vynálezu je izolovaný enzým, vyznačujúci sa tým, že

a) 10-deacetylbaccatín-III acetyluje v prítomnosti acetyldonora, predovšetkým acetylkoenzýmu A v polohe 10 selektívne

b) vykazuje molekulovú hmotnosť 70 až 72 kD, stanovenú SPD-PAGE a

c) získa sa z bunkovej kultúry Taxus chinensis.

Enzým podľa vynálezu je v čistote >50 %, predovšetkým > 80 % a výhodnejšie > 90 %, najvýhodnejšie > 95 %. Enzým podľa vynálezu sa vyznačuje tým, že 10-deacetylbaccatín-III v prítomnosti acetyldonora, predovšetkým acetyl-CoA, selektívne acetyluje v polohe 10. To predovšetkým znamená, že acetylácia zvyšných hydroxyskupín 10-deacetylbaccatínu III sa v polohách 1, 7 a 13 prakticky nepozoruje. Acetylačná reakcia vykazuje predovšetkým selektivitu > 50 %, pokiaľ ide o polohu 10, výhodne > 80 % a výhodnejšie > 90 %, najvýhodnejšie > 95 %. Izolovaný enzým je ďalej charakterizovaný molekulovou hmotnosťou 70 až 72 kD, stanovenou SDS-PAGE. Na stanovenie molekulovej hmotnosti boli chromatografované 0,3 μg homogénneho proteínu v 10 % denaturovanom SDS-géli paralelne s markerovým proteínom so známou molekulovou hmotnosťou (marker Rainbow). Farbením striebrom boli proteíny zviditeľnené, pričom molekulová hmotnosť bola určená porovnaním hodnôt Rf kalibračného proteínu a enzýmu podľa vynálezu. Gélovou SDS-elektroforézou stanovená molekulová hmotnosť bola potvrdená gélovou filtráciou na vhodnom gélovom filtračnom stĺpci. Gélová filtrácia sa uskutočňovala na stĺpci Biosilect-SEC 250-5 (Biorad) ekvilibrovanom 50 mM Tris, pH 8,5, 20 mM 2-merkaptoetanolu v zariadení FPLC (BioLogic Workstation, Biorad) a síce pri prietokovej rýchlosti 0,2 ml/min. Pritom bol stĺpec najprv kalibrovaný proteínmi so známou molekulovou hmotnosťou. Pri identických podmienkach sa cez stĺpec viedlo 50 μg proteínu podľa vynálezu. Eluát bol zhromažďovaný vo frakciách po 250 μΐ a bola určovaná aktivita eluátu, ako je to opísané neskôr. Molekulová hmotnosť bola získaná porovnávaním s clučnými časmi známych štandardov.

Enzým podľa vynálezu môže byť izolovaný z bunkovej kultúry Taxus chinensis. Vykazuje izoelektrický bod pri pH

5,4 až 5,8, výhodne pri pH 5,5 až 5,7 a predovšetkým pH

5,6. Ďalej vykazuje konštantu K_M Michaelisa-Mentenovej pre acetylkoenzým A 55 až 65 μΜ, výhodne 59 až 63 μΜ a predovšetkým 61 μΜ.

V prípade enzýmu podľa vynálezu ide o acetyltransferázu, predovšetkým o acctyl -CoA- 10-hydroxytaxán-O-acetyltransferázu.

Ďalším predmetom vynálezu je spôsob prípravy opísaného enzýmu, vyznačujúci sa tým, že sa enzým izoluje zo zdroja obsahujúceho enzým, pričom sa používajú známe metódy čistenia, a po každom čistení sa určujú frakcie, v ktorých sa enzým vyskytuje tým, že sa pridá 10-deacetylbaccatin alebo derivát 10-deacetylbaccatínu a acetyldonor a dokazuje sa vytvorený produkt acetylácie.

Ako zdroj obsahujúci enzým sa môže používať napríklad rastlinný extrakt. Ako enzým obsahujúci zdroj sa výhodne používa bunková kultúra, predovšetkým suspenzná bunková kultúra. Použitie bunkovej kultúry je výhodné preto, lebo môžu byť získané veľké množstvá východiskového materiálu. V porovnaní s použitím surového extraktu ako zdroja obsahujúceho enzým je pri použití bunkovej kultúry na základe veľkého množstva východiskového materiálu možné vyčistiť enzým od vysokej čistoty. Mimoriadne výhodný je východiskový materiál pochádzajúci z Taxus chinensis, napríklad bunková kultúra z Taxus chinensis. Na čistenie enzýmu z východiskového materiálu môžu byť s cieľom získať enzýmy, respektíve proteíny, použité známe metódy čistenia, výhodne sa používa zrážanie síranom amónnym zo surového extraktu, ako aj chromatografické metódy čistenia, ako je použitie stĺpca Sephadexu G-25, anexové chromatografie, napríklad DEAE-Sephacelu, gélové filtrácie, napríklad na Ultrogelu AcA 44,anexové chromatografie, napríklad na HighQ, stĺpcové chromatografie s hydroxyapatitom, farebné afinitné chromatografie, napríklad na High Trap Blue, hydrofóbne interakčné chromatografie, napríklad na Phenylsepharose a/alebo farebné afinitne chromatografie, napríklad na Mimetic-Griin 1A6XL. Výhodne zahrnuje čistenie aspoň jeden krok pri použití anexovej chromatografie na HighQ. Stĺpec HighQ je vymieňač aniónov so skupinami -N⁺(CH₃)₃ako ligandmi. Zistilo sa, že predovšetkým týmto krokom čistenia je možné odstrániť látky, ktoré katalyzujú acctyláciu v iných polohách ako v polohe 10.

Pri postupe podľa vynálezu sa po každom kroku čistenia stanovuje enzýmová aktivita frakcií, aby sa zistilo, v ktorých frakciách sa enzým nachádza. Na tento cieľ sa podrobí reakcii s acetyldonorom frakcia, respektíve časť frakcie, s 10-deacetylbaccatínom alebo derivátom 10-deacetylbaccatínu, ako bolo definované. Vo frakciách, v ktorých je požadovaný enzým, sa môže dokazovať produkt acetylovaný v polohe 10. Pre tento dôkaz sa výhodne používa 10deacetylbaccatín III alebo 10-deacetyltaxuyunannín-C. Dôkaz vytvoreného acetylovaného produktu je možné získať použitím vhodných značkovaných skupín vo východiskových substanciách. Výhodne sa používa značkovaný acetyldonor. Takýto označkovaný acetyldonor zahrnuje značkovanú acetylovú skupinu, pomocou ktorej potom môže byť určený produkt acetylovaný v polohe 10. Výhodne sa používa rádioaktívne značkovaný acetyldonor. Vhodné rádioaktívne markerové skupiny sú pritom ¹³C a ¹⁴C. Mimoriadne výhodne sa ako acetyldonor používa acetylkoenzým A, predovšetkým [2-^l4C]-acetylkoenzým A.

Dôkaz je tiež možné uskutočniť značkovaním ťažkým izotopom. V tomto prípade sa môže reakčný produkt určiť pomocou hmotnostnej spektrometrie.

Spôsobom prípravy baccatínu alebo derivátov baccatínu podľa vynálezu použitím enzýmu podľa vynálezu je možné pripraviť zlúčeniny baccatínu, respektíve taxánu, špecificky acctylovanc v polohe 10. O takéto zlúčeniny je záujem predovšetkým ako východiskové substancie pre parciálnu syntézu taxolu. Ďalším predmetom vynálezu je preto spôsob prípravy taxolu a/alebo derivátov taxolu, vyznačujúci sa tým, že baccatín alebo deriváty baccatínu, ktoré boli pripravené opísaným spôsobom, môžu byť známou reakciou prevedené na taxol, respektíve deriváty taxolu. Parciálna reakcia baccatínu, respektíve baccatínových derivátov, na taxol, respektíve deriváty taxolu, je podľa stavu techniky známa a opísaná a zahrnuje v princípe privedenie vhodných substituentov k hydroxylovej skupine v polohe 13 baccatínového derivátu. Vhodným spôsobom použité baccatínové deriváty vykazujú preto minimálne v polohe 13 voľnú skupinu OH.

Reakcia premeny baccatínových derivátov na taxol, respektíve deriváty taxolu, sa uskutočňuje esterifikáciou skupín OH v polohe 13 baccatínového derivátu vhodnou kyselinou. Takéto postupy sú v literatúre podrobne opísané, napríklad v US patente 4 814 470 (Colin et al.), v US patente Re. 34,277 (Denis et al.), v EP 0 400 971 A2, v US patente 4 924 011 (Denis et al.), v US patente č. 5 476 954 (Bourzat et al.), ako aj Denis et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 5917 -5919.

Na znázornenie sú ďalej uvedené štruktúrne vzorce baccatínu III a paclitaxelu:

Vynález bude ďalej osvetlený nasledujúcimi príkladmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Kultivácia suspenznej bunkovej kultúry z Taxus chinensis

Boli použité suspenzné bunkové kultúry z Taxus chinensis zo zbierky ústavu Inštitút fúr Pharmazeutisher Biológie der Universität Munchen, ktoré pôvodne pochádzajú z ihličia stromu T. chinensis (tis čínsky). Kultúry sa ponechali rásť 14 dní pri 24 °C, 100 U/min a 1500 lux. Potom sa prenieslo 150 ml bunkovej suspenzie sterilnou 50 ml pipetou do 250 ml média B5+1:

Zloženie média B5+1 (modifikovaného podľa Gambora, Millera a Ojimy: Experimental Research, 1968, 50, 151 až 158)

kyselina naftyloclová	10 pM
benzy 1 aminopurín	0,2 pM
NaH₂PO₄.H₂O	mg/1 150
CaCÍ₂.2H₂O	150
(NH₄)₂SO₄	134
MgSO₄.7H₂O	250
KNO₃	2500
FeSO₄.7H₂O	25,6
Na₂EDTA.2H₂O	34,27
KJ	0,75
MnSO₄.H₂O	10
H₃BO₃	3
ZnSO₄.7H₂O	3
Na₂MO₄.2H₂O	0,25
CuSO₄.5H₂O	0,25
CoC1₂.6H₂O	0,25
kyselina nikotínová	1
tiamíniumchlorid	10
pyridoxylhydrochlorid	1
mezo-inozit	1000
D(+)sacharóza	20000
pH 5,6 NZ-amíny	1000

NZ-amíny boli pridávané k médiu po autoklávovani a ochladení pri sterilných podmienkach ako sterilný zásobný roztok (10 g/1).

Tretí deň po tomto preočkovaní sa pridalo 30 pM metyljasmonátu (firma Serva) a kultúra sa nechala rásť ďalšie 4 dni (Grundlach, H., Muller, M. J., Kutchan, T. M., Zenk, M. H., 1992. Proc. Natl., Acad. Sci. USA 89. 2389 - 2393). Potom sa bunky oddelili od média vákuovou filtráciou a po šokovom vymrazení kvapalným dusíkom sa použili na vylúčenie enzýmu. Pri -20 °C mohli byť ale tiež skladované až do jedného mesiaca, potom aktivita hľadaného enzýmu silne poklesla.

Príklad 2

Enzýmový test na určenie aktivity acetyltransferázy

Na to, aby sa enzým mohol vyčistiť, charakterizovať a dokázať, je nevyhnutným predpokladom dostupnosť presných a dostatočne citlivých testovacích metód. Tu to bolo zisťovanie vytvoreného produktu, napríklad taxuyunnanínu C z 10-deacetyltaxuyunnanínu, na čo bola vyvinutá jednoducho uskutočniteľná a spoľahlivá metóda.

Dostatočné množstvo testovaného roztoku enzýmu bolo pripipetované k 50 μΐ pufra Tris (0,8 M, pH 8,5) v nádobkách Eppendorf. Potom sa pridalo 30 μΐ vyčisteného acetyl-CoA (5 nmol neznačeného a 0,02 gCi-[2-¹⁴C]acetylkoenzýmu-A) a 15 nmol základného, v DMSO rozpusteného, 3 mM roztoku 10-deacetyltaxuyunnanínu C, pri kontrole namiesto tohto taxánu len príslušné množstvo DMSO. Po 30-minútovej inkubácii pri 35 °C bola usadenina okyslená 20 μΐ 12 % H₂SO₄, vytvorený taxuyunnanín C bol vytrepaný (10 minút hore dnom na trepačke) s 600 μΐ terc.butylmetyléterom a usadenina sa potom centrifugovala (4 minúty 14000 U/min., centrifúga Eppendorf). Ešte existujúci nerozložený [2-¹⁴C]acetyl-CoA zostal vo vodnej fáze. 500 μΐ organickej fázy bolo po prebublávaní vzduchom zahustených do sucha, čím mohla byť takisto odstránená eventuálne prítomná [2-¹⁴C] kyselina octová, ktorá bola prítomná po predchádzajúcom okyslení ako prchavá kyselina. Pomocou scintilačného počítača (Multiple Purpose Scintilation Counter LS 6500, firma Beckmann) alebo rádioskeneru pre tenké vrstvy (Automatic TLC linearAnalyzer, firma Berthold) bol určený druh a množstvo vytvoreného produktu. Ten prvý sa použil, aby sa s načítanými hodnotami cpm zistila premena a tým aj aktivita enzýmov. Pomocou chromatografie na tenkej vrstve (DC) (LM: chloroform: acetonitril 7 : 3) a následným vyhodnotením rádioskenerom sa mohlo preskúšať, či rádioaktivita zmeraná scintilačným počítačom skutočne tiež zodpovedá piku vo výške hodnoty Rf očakávaného produktu.

Príklad 3

Čistenie acetyltransferázy

3.1. Získavanie tkanivovej kultúry a odsolenie na Sephadexe G25

Na získavanie surového extraktu proteínu bola použitá sedem dní stará suspenzná kultúra, ktorá bola získaná tretí deň po preočkovaní s 30 μΜ MeJA. 200 gramov čerstvo odsatých buniek bolo vymrazených kvapalným dusíkom. V mažiari chladenom ľadom boli potom bunky zmiešané s 20 gramami PVPP a s 400 ml štandardného pufra A (100 mM kyseliny boritej/NaOH, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu) a pri miešaní ponechané sa roztopiť. PVPP viaže časť fenolov, rušiacich v ďalšom kroku čistenie okrem iného trieslovín obsiahnutých v extrakte. Homogénna bunková kaša bola potom cez štyri razy preložený mul filtrovaná a vylisovaná šťava centrifugovaná pri 15000 x g (10 minút, rotor SS34). Ľadom chladený ostatok bol zmiešaný s 50 ml kalciumfosfátového gélu suspendovaného v štandardnom pufri A (100 mM kyseliny boritej/NaOH, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu). Objemový údaj udáva množstvo gélu, ktoré sa získa po desaťminútovej centrifugácii pri 2500 U/min., a to zodpovedá 1,9 gramu TG Ca₃(PO₄)₂. Táto zmes sa ponechá 10 minút v ľadovom chladiacom kúpeli pri občasnom miešaní. Počas tohto času by sa mali na gél adsorbovať sprievodné látky, ako napríklad triesloviny obsiahnuté vo veľkých množstvách. Acetyltransferáza zostala v roztoku a mohla byť ná slednou centrifugáciou (6000 x g, 5 min., rotor GSA) oddelená od gélového materiálu. Potom bol ako peleta prítomný gél ešte raz zachytávaný v 75 ml štandardného pufra A, miešaný 5 minút sklenou tyčinkou a ešte raz centrifugovaný 5 minút pri 6000 U/min. (rotor GSA), aby sa časť acetyl transferázy adsorbovala na gél a týmto následným spracovaním sa dostala do prebytku. Bez použitia kalciumfosfátového gélu sa vyskytovali v ďalšom kroku čistenia veľké problémy, pretože doteraz obsiahnuté sprievodné látky veľmi rýchlo upchávali membránu miešanej kyvety a potom zafarbovali použité stĺpce tmavohnedo a tým rýchlo znižovali ich väzbové kapacity.

Vyčistený ľadom chladený ostatok bol pri pomalom miešaní po častiach podrobený reakcii s amóniumsulfátom až do 70 % nasýtenia a po úplnom pridaní ešte ďalších 30 minút pomaly miešaný. Potom mohol byť vypadnutý proteín peletovaný pri 15000 U/min. (10 min., rotor SS34). Zrazenina bola opatrne resuspendovaná v 30 ml štandardného pufra B (50 mM, Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu) a roztok bol vysolený použitím tohto pufra pomocou stĺpca Sephadexu G25 (Pharmacia;

2,7 cm 0x7 cm), pričom súčasne bolo oddelených 60 % cudzieho proteínu.

[G25-eluát: 82 ml, 78 mg proteínu]

3.2 Anexová chromatografia na Sephacele DEAE

V prípade Sephacelu DEAE ide o modifikovanú celulózu, na ktorú sú viazané kladne nabité dietylaminoetylové zvyšky. Ak je izoelektrický bod rozpustených proteínov kyslejší než použitý pufer, existujú ako anióny a môžu byť teda viazané na kladne nabitý materiál stĺpca. Prídavkom silnejších aniónov, ako napríklad Cľ alebo SO₄ ², sa zoslabuje elektrostatická interakcia adsorbovaného proteínu a skupín DEAE. Následkom toho sa anióny proteínov vymenia za anorganické anióny a enzým sa tak eluuje.

Týmto krokom čistenia bolo oddelených 24,4 % cudzieho proteínu, ako aj predovšetkým sprievodné látky obsahujúce fenol okrem iného triesloviny. Materiál stĺpca sa farbil už pri prvom použití silne hnedo, mohol však byť čistený 1 M NaOH. Znečistenie stĺpcov, ktoré môžu byť neskôr použité v čistiacom procese, mohlo byť týmto krokom značne redukované.

Priebeh cez stĺpec DEAE (2,5 cm 0 x 5 cm) vrátane 30 ml štandardného pufra B (50 mM, Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu), ktorým bol stĺpec premývaný, bol zahustený tlakovou filtráciou v miešanej kyvete (Amicon, 400 ml, membrána PM10) na 5 ml. [DEAE-eluát: 110 ml, 59 mg proteínu]

3.3. Gélová filtrácia na Ultrogele AcA 44

Princíp gélovej filtrácie spočíva v tom, že makromolekuly, ako napríklad proteíny, sú distribuované v závislosti od ich veľkosť a tvaru do matrice pórov s definovanou veľkosťou (naberacie objemy) a do okolitého kvapalného priestoru. Molekuly, ktoré sú príliš veľké, aby sa mohli dostať do pórov, putujú okolo častíc a sú tak rýchlejšie eluované než stredne veľké proteíny, ktoré sú najprv z pórov retardované bez toho, aby sa do nich dostali. Ešte menšie molekuly, okrem iného ióny solí, sa dostávajú najprv do pórov, ktoré opúšťajú až po určitom čase zdržania, a teda zostávajú na stĺpci najdlhšie.

Táto technika je veľmi šetrná, keďže sa nevyskytujú prakticky žiadne interakcie medzi materiálom a proteínom a nemusia sa používať žiadne špecifické pufre. Okrem toho sa uskutočňuje úplné odsolenie eluátu, keďže menšie ióny, v tomto prípade sulfátové ióny, zostávajú na stĺpci oveľa dlhšie ako aktívny proteín.

Bol používaný polyakrylamid-agarózový gél, pre ktorý sa udáva frakcionačná oblasť 10 - 130 kD (Ultrogel AcA 44 firmy Serva).

Zahustený roztok proteínu bol cez noc rozdeľovaný na ekvilibrovanom stĺpci (2,8 cm o 100 cm) so štandardným pufrom B rýchlosťou 20 ml/hod. 60 frakcií (á 6,5 ml) bolo testovaných na obsah proteínu a aktivitu acetyltransferázy. Frakcie s hlavnou aktivitou boli spojené a ďalej čistené.

S týmto eluátom je možné merať špecifickú aktivitu acetyltransferázy. Chromatogram na tenkej vrstve vykazoval okrem významného piku pri nižšej hodnote Rf tiež pík vo výške hodnoty taxuyunnanínu C. [AcA-eluát: 53 ml, 25,7 mg, celková aktivita 724 pkat bola použitá ako 100 %]. Touto gélovou filtráciou bolo separovaných 57 % cudzieho proteínu.

3.4. Anexová chromatografia na HighQ

Rovnako ako stĺpec DEAE je tiež stĺpec HighQ, ktorý obsahuje skupiny -N⁺(CH₃)₃ ako ligandy, anex, v protiklade k prvému však silnejší; to znamená, že sa nemení v širokej oblasti pH jeho ionizačný stav. V prípade slabých ionexov pri rôznych hodnotách pH značne kolíše stupeň disociácie a teda aj výmenná kapacita. Pretože materiál stĺpcov HighQ je zložený z husto uložených cca 10 pm malých častíc živice a z toho vplýva aj vyšší protitlak, musí sa prevádzkovať na FPLC-zariadení (firmy Biorad).

Odsolený AcA-eluát (53 ml) bol čerpaný prietokovou rýchlosťou 2 ml/min. na pripravený stĺpec 5 ml HighQ ekvilibrovaný štandardným pufrom B (50 mM, Tris/HCl, pH

8.5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu) a tento stĺpec sa tiež týmto pufrom potom premýval. V bezfarebnom prietoku sa nachádzala časť inaktívneho proteínu, s 0,07 M KC1 v štandardnom pufri B (50 mM, Tris/HCl, pH

8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu) bol odstránený ďalší cudzí proteín a žlté sprievodné látky. Pri ďalšom stupni gradientu, 0,14 M KJC1 v štandardnom pufri B (50 mM, Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu), bol eluovaný aktívny proteín a okrem toho tiež žlté sprievodné látky. Tiež eluát získaný s 1 M KC1 v štandardnom pufri B (50 mM, Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu) bol žlto zafarbený a obsahoval 1/3 naneseného proteínu, ale bez aktivity acetyltransferázy. Týmto posledným krokom sa stĺpec súčasne regeneroval.

Veľká výhoda tohto kroku čistenia spočívala v tom, že veľké objemy AcA-eluátu mohli byť rýchlo a šetrne zahustené na 4 ml (4 frakcie ä 1 ml).

Gradient: Čas (min.)	1 ml KC1 v štandardnom pufri B (%)
0	0
35	0
35	7
45	7
45	14
55	14
55	100
70	100

[Eluát HighQ: 4 ml, 8,8 mg proteínu, 796 pkat]

3.5. Hydroxyapatit

Bol použitý stĺpec CHT II (firma Biorad), ktorý bol naplnený sférickými časticami hydroxyapatitu, [Ca₅(PO₄)₃OH]₂. Negatívne nabité proteíny sa môžu v prítomnosti nízkomolekulámeho fosfátového pufra najprv viazať na katióny Ca²⁺ a potom môžu byť vytesnené vyššími koncentráciami fosfátov do elučného pufra.

Zásadité proteíny s vysokým pi majú vyššiu afinitu k materiálu stĺpca než tie s nižším pi. Štruktúra hydroxyapatitu s Ca²' iónmi v kladne nabitých centrách a PO4³· v negatívne nabitých, má za následok zmiešanú ionexovú separáciu. HighQ-eluát bol čerpaný rýchlosťou 0,5 ml/min. na stĺpec CHT II (5 ml) ekvilibrovaný fosfátovým pufrom (10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 6,8, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu) a premývaný 12 ml tohto pufra. Elúcia aktívneho proteínu sa uskutočňovala so 160 mM fosfátového pufra (20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu). Tiež pri ďalšom zvýšení koncentrácie fosfátu na 400 mM nemohol byť eluovaný ďalší proteín.

Gradient: Čas (min.)	160 mM fosfátového pufra (%)
0	0
40	0
40	100
70	100

Zachytené frakcie 0,5 ml boli skúšané na obsah proteínu a aktivitu acetyltransferázy.

[CHT II-eluát: 1,5 ml, 0,73 mg proteínu, 578 pkat]

Týmto krokom čistenia bol docielený faktor obohatenia

8,7 oproti HighQ-eluátu, pričom pri 92 % separácii cudzieho proteínu bola zaznamenaná strata aktivity 27 %.

3.6. Farebná afmitná chromatografia na High Trap Blue

HiTrapBlue 1 ml (firma Pharmacia) obsahuje syntetickú polycyklickú farebnú látku Cibacron Blue F3G-A, ktorá je pripojená na agarózovú matricu. Tieto ligandy vykazujú určitú štruktúrnu podobnosť s prirodzene sa vyskytujúcimi molekulami, (kofaktory NAD⁺ a NADP⁺), čo im umožňuje viazať pevne a špecificky proteíny, okrem iného enzýmy, ktoré potrebujú substancie obsahujúce adenylát. Stĺpcový materiál sa preto označuje ako „skupinošpecifický“. Špecifita je však relativizovaná tým, že až doteraz katalogizované enzýmy potrebujú približne tretinu koenzýmu, ktorý obsahuje nukleotidový komponent. Preto sa môžu proteíny viazať na aromatické ligandy tiež nešpecifický elektrostatickými a/alebo hydrofóbnymi interakciami.

Elúcia sa uskutočňuje špecificky s príslušným kofaktorom alebo nešpecifický s roztokmi soli. Acetyltransferáza, ktorá viaže acetyl-CoA obsahujúci fosfoadenozyldifosfát, sa adsorbovala na modrý stĺpcový materiál a bola nešpecifický eluovaná s lineárnym KCl-gradientom. Na to sa nanášal CHT II-eluát na stĺpci High Trap Blue ekvilibrovanom štandardným pufrom B zariadením FPLC (firmy Biorad) prietokovou rýchlosťou 0,5 ml/min. a týmto pufrom sa potom premýval. Elúcia proteínu viazaného na stĺpce sa uskutočňovala pri 0,5 ml/min. s lineárnym soľným gradientom 0 - 1 M KC1 v štandardnom pufri B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoctanolu) počas 30 min.

Gradient: Čas (min.)	1 M K.C1 štandardného pufra B (%)
0	0
30	0
60	100

Veľkosť frakcie bola 0,5 ml. Získané frakcie, ktoré vykazovali aktivitu, boli spojené.

[High Trap Blue eluát: 1,5 ml, 05 mg proteínu, 168 pkat]

Oproti CHT II-stípci mohol byť týmto krokom čistenia docielený faktor obohatenia 4,2. Pri 93 % separácii cudzieho proteínu bola zaznamenaná strata celkovej aktivity 71 %

3.7. Hydrofóbna interakčná chromatografia na Phenylsepharose

Ak sa pridajú k proteínom rozpusteným vo vodnom prostredí určité neutrálne soli, ako napríklad (NH₄)₂SO₄ alebo KC1, zvýši sa iónová sila roztoku. Pri týchto podmienkach spolu asociujú hydrofóbne oblasti na povrchu proteínu. Práve tak sa adsorbujú tiež na materiáloch stĺpcov s hydrofóbnymi ligandmi, čím dochádza k hydrofóbnym interakciám (HľC = Hydrophobic Interactions Chromatography). Tie sa potom môžu opäť vymyť, pričom sa používa elučný pufer s nižšou koncentráciou solí. Tento čistiaci princíp potom vyžadoval nastaviť High Trap Blue eluát na koncentráciu 0,5 M síranu amónneho. To sa uskutočnilo veľmi pomalým pridávaním po častiach príslušného množstva ľadom chladeného roztoku 1 M síranu amónneho v štandardnom pufri B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu). Potom sa naniesol roztok proteínu na ministípec (1 cm 0 1,3 cm) ekvilibrovaný 0,5 M (NH₄)₃SO₄ v štandardnom pufri B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu). Po jeho preniknutí do gólového lôžka (Phenylsepharose firmy Pharmacia) sa premýva 7 ml 0,5 M (NH₄)₂SO₄ v štandardnom pufri B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu). Na elúciu viazaného proteínu sa používa 0,1 M (NH₄)SO₄ v štandardnom pufri (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu). Eluát sa zozbiera vo frakciách po 0,5 ml a určuje sa relatívna koncentrácia proteínu a enzýmová aktivita. Najaktívnejšie frakcie sa spoja a testujú na aktivitu a obsah proteínu.

[Phenylsepharose-eluát: 2,5 ml, 0,001 mg proteínu, 6,3 pkat]

Ako faktor obohatenia bola oproti HiTrapBlue-eluátu vyčíslená hodnota 1,9 pri súčasnej strate aktivity 96 % a oddelení 98 % cudzieho proteínu.

3.8 Farebná afinitná chromatografia na Mimetic-Griin 1A-6 XL

Ako bolo vyvodené pri stĺpci High Trap Blue, vyskytujú sa tiež v prípade tohto materiálu interakcie medzi väzbovými miestami kofaktora enzýmu s ligandmi farebnej látky. Len tie viazané enzýmy, závislé od kofaktora, sa potom môžu eluovať s kofaktorom, v predpokladanom prípade acetylkoenzýmom A. Nešpecifický adsorbované proteíny zostávajú pritom ešte na stĺpci.

Pred tým, ako sa mohol pipetovať Phenylsepharoseeluát na stĺpce Mimctic-Griin (1 cm 0 x 1,2 cm, Affinity Chromatography Ltd., Freeport, Ballasalla, Isle of Man), musel sa najprv odsoliť, čo sa stalo opäť na stĺpci PD10 (firma Pharmacia). Na to bol nanesený Phenylsepharoseeluát a stĺpec PD10 a ponechaný prenikať. Elúcia sa usku točňovala štandardným pufrom B (50 mM Tris/HCl, pH

8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu), pričom prvých 0,5 ml eluátu sa vyhodilo ďalších 2,5 ml, ktoré obsahovali aktívny proteín, sa zhromažďovalo.

Tento roztok enzýmu sa pipetoval na stĺpec MimeticGriin (1 cm 0 x 1,2 cm) premytý štandardným pufrom B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu). Potom, ako prenikol do gélovcho lôžka, bol úspešne bez pumpy eluovaný nasledujúcimi roztokmi: 3 ml štandardného pufŕa B (50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 20 % glycerínu, 20 mM 2-merkaptoetanolu), 3 ml 0,5 mM acetylkoenzýmu A v štandardnom pufri B, 3 ml 1 M KC1 v štandardnom pufri B. Pritom sa zozbierali frakcie po 1 ml a kontrolovali sa na proteín a aktivitu acetylkoenzýmu A.

Acetylkoenzým A-eluát obsahoval ako jediná frakcia aktivitu acetyltransferázy. Ani v prietoku, ani v KCl-eluáte nemohla byť aktivita zmeraná.

Pred určením aktivity v acetyl-CoA-eluáte sa musel najprv odstrániť kofaktor z roztoku. Veľkým spojením dokopy neznačeného acetylkoenzýmu A by bola nepatrná časť ¹⁴C označeného acetyl-CoA tak zriedená, že by rádioaktívny substrát prakticky nemohol reagovať.

Takmer úplné odstránenie acetylkoenzýmu A sa podarilo pomocou stĺpca PD10, ako bolo opísané. S takto získaným eluátom sa mohol uskutočňovať obvyklý test na aktivitu. Keďže však v PDlO-eluáte existovali ešte stopy acetylkoenzýmu A z elučného pufŕa, a teda úplné odstránenie nebolo možné dosiahnuť, bol v materiáli zhromaždenom pre aktívny test acetyl-CoA označený ^l4C zriedený, a tým bola pre aktivitu a čistiaci faktor získaná príliš malá hodnota.

[Griin-eluát: 2,5 ml, 0,0001 mg proteínu, 0,7 pkat]

Týmto krokom čistenia bol oddelený cudzí proteín a pri 81 % strate aktivity bol dosiahnutý faktor čistenia 1,1.

3.9. Súhrnný opis čistenia a dokumentácie homogenity

Opísaným spôsobom sa získala požadovaná acetyltransferáza zo surového extraktu vyzrážaním 70 % síranom amónnym a 8 krokmi stĺpcovej chromatografie. Tým sa získala preparácia acetyltransferázy, ktorej špecifická aktivita dosahovala 280-násobné hodnoty AcA-eluátu, pričom celkový výťažok bol 0,1 %. Veľkú stratu aktivity počas čistenia, aj keď sa AcA-eluát spracúval v jednom dni, je možné vysvetliť veľkou nestabilitou enzýmu, ako aj jeho citlivosťou na hodnoty pH pod pH 8 a proti iónom soli, okrem iného síranu amónneho.

Na prekontrolovanie čistoty enzýmovej preparácie bola použitá denaturačná disková elektroforéza v prítomnosti SDS. Po rozdelení koncentrovaného eluátu Mimetic-Griinstĺpca s SDS-PAGE a následným farbením striebrom sa objavil len 1 pás.

Krok čistenia	Objem (ml)	Celková aktivita (pkat)	Celkový proteín (mg)	Špecifická aktivita (pkat/mg)	Výťažok (%)	Čistenie (x-krát)
Surový extrakt	272	-	372	-	-	-
Ca₃(PO₄)₂	285	-	194	-	-	-
Sephadex G25-eluát	82	-	78	-	-	-
DEAE-eluát	110	-	59	-	-	-
AcA 44-eluát	53	724	25,7	28	100	1
HighQ-eluát	4	796	8,8	90,5	121	3,2
CHT II-eluát	1,5	578	0,73	792	80	43
High Trap Blue eluát	1,5	168	0,05	3360	23	120
Phenylsepharose -eluát	2,5	6,3	0,001	6300	0,87	225
Mimetic-Griin-eluát	2,5	0,7	0,0001	7000	0,1	280

Príklad 4

Charakterizácia acetyltransferázy zo suspenzných kultúr Taxus chinensis

4.1. pH Optimum

Hodnota pH má veľký účinok na enzýmovú aktivitu, pretože sa mení podľa acidity enzýmového roztoku náboja funkčných skupín určitých aminokyselín. To má dopad na konformáciu aktívneho centra enzýmu a tým aj na jeho aktivitu. Práve tak je model protonácie určitého substrátu závislý od hodnoty pH a môže práve tak ovplyvňovať enzýmovú aktivitu.

Na zistenie optimálnej oblasti pH bol meraný prenos acetylkoenzýmu A na 10-deacetyltaxuyunnanín C pri rôznych hodnotách pH, od pH 5 do pH 11. Na to boli použité 5,6 pkat (1,7 gg, 50 μΐ) 120-krát obohatené acetyl transferázy (HighTrapBlue eluát) v nasledujúcich vsádzkach:

Vsádzky: 50 μΐ 0,8 M Tris, pH 8,5

50/zl acetyltransferázy (5,6 pkat 1,7 pg proteínu, obohatené 120 krát) μΐ acetylkoenzým A (5 nmol, vrátane 0,02 μθ[2-¹⁴C] acetylkoenzýmu A) μΐ 3 mM 10-deacetyltaxuyunnaninu C (15 nmol) 50 μΐ vody Millipore

Inkubácia: 25 min. pri 35 °C

Vsádzky boli pritom 5 minút predinkubované bez acetylkoenzýmu A, potom bola naštartovaná reakcia pridaním kofaktora. Po inkubačnom čase 25 minút pri 35 °C bola reakcia zastavená okyslením a vytrepaním s terc.butylmetyléterom. Rádioaktivita obsiahnutá v extrakte bola vyhodnotená scintilačným počítačom. Aktivita acetyltransferázy sa rozprestiera cez relatívne úzku oblasť pH 8,5 - 9, pričom optimum pH leží pri pH 9. Polovičné maximálne rýchlosti konverzie sa nachádzajú pri pH 6,8 a pH 10,8.

Čistenie sa uskutočňovalo pri pH 8,5, pretože sa potom v prípade afinitných stĺpcov nachádzalo v pretečenom materiáli menej aktívneho proteínu než pri pH 9.

4.2. Teplotné optimum

Okrem zrejmého účinku, ktorý má hodnota pH na enzýmovú aktivitu, ukazuje sa tiež silná závislosť enzýmovej aktivity od inkubačnej teploty. Najprv enzymatická aktivita narastá so stúpajúcou teplotou, do určitej - pre každý enzým špecifickej - teploty však rýchlo klesá. Pri týchto vysokých hodnotách teplôt dochádza k denaturácii a inaktivácii enzýmu. Aby sa stanovilo optimum teploty pre acetyl transferázu, bolo inkubovaných 1,7 μg (5,6 pkat) 120-krát čisteného enzýmu pri teplotách od 0 °C do 50 °C, najprv 10 minút bez acetylkoenzýmu A, potom ďalších 25 minút po pridaní kofaktora. Zastavenie reakcie sa uskutočňovalo pridaním 20 μΐ 12 % H₂SO₄. Potom bol vytvorený taxuyunnanín C vytrepaný so 600 μΐ éteru. Vyhodnotenie vytvoreného množstva produktu bolo uskutočnené prostredníctvom scintilačného počítača.

Vsádzky: 50 μΐ 0,8 M Tris, pH 8,5 μΐ acetyltransferázy (5,6 pkat 1,7 μg proteínu, obohatené 120 krát) μΐ acetylkoenzým A (5 nmol, vrátane 0,02 μθ[2-14C]acetyl-CoA) μΐ 3 mM 10-deacetyltaxuyunnanínu C (15 nmol) μΐ vody Millipore

Inkubácia: 25 min. pri príslušnej teplote Teplotné optimum acetyltransferázy leží pri 35 °C.

4.3. Izoelektrický bod

Izoelektrický bod bol získaný pomocou chromatofokusovania. Na to sa použije špeciálny anex, napríklad Mono P HR 5/20 (firmy Pharmacia), na ktorý sa nanesie požadovaný enzým pri hodnote pH, pri ktorej existuje ako anión. Pri týchto štartovacích podmienkach sa enzým viaže na materiál stĺpca a potom sa môže eluovať pufrovacou zmesou obsahujúcou amfolyt (Polybuffer 94 firmy Pharmacia), s vytváraním gradientov pH cez stĺpec. Enzým sa odlúči od anoxu práve vtedy, keď hodnota pH poklesne tak veľmi, aby enzým prešiel z aniónového do formálne nenabitého stavu. Táto hodnota pH zodpovedá izoelektrickému bodu (IEP).

Pre acetyltransferázu bol určený pomocou BioLogic FPLC Workstation (firmy Biorad) na stĺpci Mono P HR 5/20 (0,5 cm o x 20 cm, firma Pharmacia) pri prietoku 0,7 ml/min. Tento stĺpec bol ekvilibrovaný pufrom 25 mM imidazolu/HCl pH 7,4 a nabíjaný eluátom HighQ. Na to bol 1 ml HighQ-eluátu zahusťovaný na 100 μΐ Centriprepkoncentrátormi (30 kD) a zriedený uvedeným imidazolovým pufrom na 6 ml. Bol tu použitý proteín s týmto stupňom čistoty, keďže sa počítalo s vysokou stratou aktivity chromatofokusovaním, a v HighQ-eluáte bola najvyššia aktivita (pkat/ml). Stĺpec sa premyl 10 ml štartovacieho pufra a 40 ml pufra Polybuffer 74 (zriedeným 1 : 8 vodou Millipore, pH 4) sa proteín eluoval zo stĺpca. Boli zachytávané frakcie 1 ml, pričom na zachovanie aktivity pri nízkych hodnotách pH bolo do každej druhej frakcie predložených 100 μΐ 0,8 M Tris pH 8,5. Vo frakciách medzi nimi bola meraná hodnota pH.

Aby sa zistila aktívna frakcia, bola alikvotná časť každej 2. frakcie inkubovaná 30 min. v nasledujúcej vsádzke:

Vsádzky: 200 μΐ roztoku enzýmu (pufrované na pH 8,5) μΐ acetylkoenzýmu A (5 nmol, vrátane 0,02 μθ[2-14C]AcCoA) μΐ 3 mM 10-deacetyltaxuyunnanínu C (15 nmol)

Inkubácia: 30 min. pri 35 °C.

Vyhodnotenie bolo uskutočnené pomocou scintilačného počítača po vytrepaní s terc.butylneiyléterom.

Hlavná aktivita sa eluovala v oblasti pH od 5,7 a 5,47, takže izoelektrický bod acetyltransferázy mohol byť určený pri pH 5,6.

4.4. Stanovenie molekulovej hmotnosti

Na určenie molekulovej hmotnosti acetyltransferázy boli použité obidve rôzne metódy: gélová filtrácia na kalibrovanom gélovom filtračnom stĺpci a SDS-gélová elektroforéza.

Prvá sa uskutočnila na ekvilibrovanom (50 mM Tris, pH 8,5, 10 mM 2-merkaptoetanol) stĺpci Biosilect-SEC 250-5 (Biorad) v zariadení FPLC (Biológie Workstation, Biorad), prietokovou rýchlosťou 0,2 ml/min. Najprv bol stĺpec kaíibrovaný proteinmi, ktorých molekulová hmotnosť bola známa. Pri identických podmienkach bolo potom

1,5 ml HighTrapBlue-eluátu, zahusteného Centriprep-koncentrátormi (2 ml, membrána 10 kD) na 100 μΐ (3360 pkat, 50 μg proteínu), eluované cez stĺpec. Veľkosť frakcie bola 250 μΐ a bola zisťovaná aktivita eluátu inkubáciou nasledujúcich vsádzok (celkový objem 185 μΐ).

Vsádzky: 50 μ] 0,8 M Tris, pH 8,5

100 μΐ eluátu μΐ acetyl-CoA (5 nmol, v ňom navyše obsiahnutého 0,02 μCi[2-¹⁴C]acetyl-CoA) μΐ mM 10-deacetyltaxuyunnanínu C (15 nmol)

Inkubácia: 30 min. pri 35 °C

Vyhodnotenie rádioaktivity bolo uskutočnené pomocou scintilačného počítača po vytrepaní s terc.butylmetyléterom.

Pre acetyltransferázu bola touto metódou vypočítaná molekulová hmotnosť 72 kD.

Na kontrolu tejto hodnoty bola použitá denaturujúca SDS gélová elektroforéza. Na to sa chromatografovalo 0,3 gg homogénneho proteínu v 10 % SDS-géli paralelne s markerovým proteínom so známou molekulovou hmotnosťou (Rainbowmaker). Farbením striebrom sa proteiny zviditeľnili, takže porovnaním hodnôt Rf kalibračných proteínov a acetyltransferázy sa pre ňu mohla určiť molekulová hmotnosť 70,8 kD.

4.5 Stanovenie hodnoty K_M

Stanovenie hodnoty K_Mpre 10-deacetyltaxuyunnanín C

Aby sa dosiahla informácia o afinite acetyltransferázy k 10-deacetyltaxuyunnanínu C, bola určená hodnota K_M s Phenylsepharosovým eluátom.

Vsádzky: 50 μΐ 0,8 M Tris, pH 8,5

100 μΐ acetyltransferázy (0,25 pkat, 40 ng proteinu, obohacované 225 krát) μΐ acetylkoenzýmu A (5 nmol, v ňom navyše 0,02 μΰί[2-^Ι40^ο^1-ϋοΑ) μΙ 10-deacetyltaxuyunnanínu C (konečná koncentrácia:

0,1/0,3/1/3/5710/30/50/100/200/300/500

Inkubácia: 30 min. pri 35 °C, vyhodnotenie rádioaktivity bolo uskutočnené pomocou scintilačného počítača po extrakcii s terc.-butylmetyléterom.

Dvojitým recipročným vynášaním nameraných hodnôt podľa LINEWEAVER a BURK mohla byť graficky zistená hodnota K_M pre 10-deacetyltaxuyunnanín C 23 μΜ.

4.6 Stanovenie hodnoty K_M pre acetylkoenzým A

Afinitu acetyltransferázy k acetylkoenzýmu A je možné opísať hodnotou K_M, ktorú je možné zistiť pomocou Phenylsepharosového eluátu.

Vsádzky: 50 μΐ 0,8 M Tris, pH 8,5

100 μΐ acetyltransferázy (0,25 pkat 40 ng proteínu, obohatené 225 krát) μΐ acetylkoenzýmu A a H₂O (konečná koncentrácia:

2,1/2,3/3/5/12/32/52/102/152/202/302/502 μΜ, pričom každý raz boli obsiahnuté 2 μΜ (40 000 cpm) [2-¹⁴C]AcCoA) μΐ 3 mM 10-deacetyltaxuyunnanínu C (15 nmol)

Inkubácia: 30 min. pri 35 °C, potom bolo uskutočnené vyhodnotenie vytrepaním s terc.butylmetyléterom a scintilačným počítačom.

Dvojitým recipročným vynášaním nameraných hodnôt podľa LINEWEAVER a BURK mohla byť graficky zistená hodnota K_M pre acetylkoenzým A 61 μΜ.

4.7 Číslo premeny k_cat

Číslo premeny (“tumover“) opisuje reakčnú rýchlosť enzymatickej reakcie, v ktorej sa udáva, koľko molekúl substrátu sa premení za sekundu jednou molekulou enzýmu.

Na stanovenie „tumover“ sa používal Phenylsepharosový eluát. V ňom obsiahnutá koncentrácia acetyltransferázy bola určená na rozdelenie eluátu pomocou SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforézy a následným farbením striebrom. Do susedných prúdov gélu sa nanášali známe množstvá albumínu z hovädzieho séra ako porovnávacie koncentrácie.

S 300 μΐ roztoku enzýmu, zodpovedajúceho 18 ng acetyltransferázy, 10-deacetyltaxuyunnanínom C a acetylkoenzýmom A bola zaznamenávaná kinetika reakcie, ktorá prebiehala lineárne v oblasti od 5 až do 30 min.

Vsádzky: 50 μΐ 0,8 M Tris, pH 8,5

300 μΐ acetyltransferázy (18 ng acetyltransferázy, 0,76 pkat) μ! acetylkoenzýmu A (5 nmol, v ňom 0,02 μθ[2-¹⁴qAcCoA) μΐ 3 mM 10-deacetyltaxuyunnanínu C (15 nmol)

Inkubácia: 30 min. pri 35 °C

Inkubačné vsádzky boli potom vytrepané s terc.butylmetyléterom a vyhodnotené scintilačným počítačom. Z nameraných hodnôt mohla byť vypočítaná premena (pmol). Vydelením molekulovej hmotnosti (72 kD) množstvom enzýmu (18 ng) sa získa koncentrácia enzýmu 0,25 pmol vo vsádzke.

Enzýmová aktivita sa vypočíta tak, že sa zistí premena za jednotku času (sec). Kvocient enzýmovej aktivity (0,05 pmol/sec) a enzýmovej koncentrácie (0,25 pmol) dáva pre tumover acetyltransferázy hodnotu 0,2 kat/mol homogénneho enzýmu (mol/sec/mol enzýmu).

tumover = číslo premeny k_cat:

0,05 pmol/sec: 0,25 pmol = 0,2 kat/mol

To zodpovedá premene 0,2 mol substrátu za sekundu na mol (72 kg) enzýmu pri 35 °C, pH 8,5 a optimálnych množstvách substrátu (60 mol 10-deacetyltaxuyunnanínu C, 20 mol acetyl-CoA).

4.8 Kinetické optimum

Pri fyziologických podmienkach je koncentrácia substrátu v pomere ku koncentrácii enzýmu veľmi malá. Len malá časť aktívnych centier enzýmu je obsadená, takže množstvo enzýmami neobsadených substrátov [E] približne zodpovedá celkovému množstvu enzýmu [E_o],

Ak je koncentrácia substrátu [S] ďaleko pod K_M, to znamená pod koncentráciou, pri ktorej je začiatočná rýchlosť reakcie polovicou maximálnej rýchlosti, prebieha enzymatická reakcia značne pomalšie, než vyjadruje číslo premeny lq._at.

Na charakterizáciu enzýmu pri týchto podmienkach sa používa kvocient k_till/K_M. Ak sa násobí táto hodnota koncentráciou substrátu [S] a celkovým množstvom enzýmu [EJ, získa sa reakčná rýchlosť.

v = (1^,/Km [S] [EJ

Pritom je potrebné dbať na to, aby rýchlosť difúzie molekúl rozpustených vo vodnom prostredí mohla byť maximálne 10⁸ až 10⁹. Tiež pokiaľ ide o veľmi rýchle enzýmy je tým obmedzená reakčná rýchlosť, pretože substrát nemôže rýchlejšie dospieť k enzýmu.

Pre acetyltransferázu sa vypočíta kinetické optimum takto:

K_M(10-deacetyltaxuyunnanínu C) = 23 μΜ, k_caI = 0,2 kat/mol ΜΚ_μ= 0,2 mol s’¹ moľ'/23.10·³ [M] = 8,7 s'M’¹

Príklad 5

Špecifita substrátu

Na preskúšanie špecifity substrátu vyčistenou acetyltransferázou boli použité rôzne zlúčeniny so základným skeletom taxánu ako substrátu:

10-deacetyltaxuyunnanín C

14-deacetyltaxuyunnanín C

10,14-deacetyltaxuyunnanin C

2.10.14- deacetyltaxuyunnanín C

5.10.14- deacetyltaxuyunnanin C

2.5.10.14- deacetyltaxuyunnanin C

2.14- deacetyltaxuyunnanín C

5.14- deacetyltaxuyunnanin C 2,5-dcacctyl-10,14-deacetyitaxuyunnanin C 10-deacetylbaccatín III (=10-DAB III)

10-deacetyltaxol

10-deacetylcefalomannín 10-epi-10-DAB-lII 19-hydroxy-10-DAB-III 14-hydroxy-10-DAB-III

7-TES-10-DAB-I11 7-BOC-10-DAB-III

Ukázalo sa, že z používaných substrátov môžu reagovať len taxány s hydroxylovou skupinou v polohe C-10. Taxánové deriváty s acetylovaňou polohou C-10 však neboli voľnými hydroxylovými skupinami na iných atómoch uhlíka akceptované ako substrát vyčistenej acetyltransferázy. Ak je však prístup k C-10 blokovaný objemnými substituentmi, ako v prípade 10-deacetyltaxolu a 10-deacetylcefalomannínu, k acetylácii nedochádza.

Pri výpočte miery konverzie, vztiahnuté na mieru konverzie 10-deacetyltaxuyunnaninu C, sa ukázalo, že deriváty taxanuyunannínu C reagovali s voľnými skupinami v rovnakom rozsahu. 10-DAB reagoval s konverziou 85 % v porovnaní s 10-deacetyltaxuyunnanínom C k baccatínu III.

Konverzia rôznych substrátov, vztiahnutá na konverziu deacetyltaxuyunnanínu C, je znázornená v nasledujúcej tabuľke.

Konverzia rôznych substrátov, vztiahnutá na konverziu 10-deacetyltaxuyunnaninu C

10-deacetyltaxuyunnanín C Enzým: Phenylsepharosový eluát (225-krát čistený)
_ . Knnveryia	pkat
Substrát	(%)
10-deacetyltaxuyunnanín C	100	1,12
10-deacetylbaccatín III	80	0,9
10,14-deacetyltaxuyunnanin C	102	1,14
2,10,14-deacetyltaxuyunnanin C	81	0,91
5,10,14-deacetyltaxuyunnanin C	88	0,99
2,5,10,14-deacetyltaxuyunnanin C	53	0,59
10-epi-l 0-DAB III	0	0
19-hydroxy-l 0-DABIII	38	0,43
14-hydroxy-DAB III	97	1,09
7-TES-l 0-DAB III	0	0
7-BOC-lO-DAB III	2	2
PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob prípravy baccatínu a/alebo baccatínových derivátov, vyznačujúci sa tým, že reaguje 10-deacetylbaccatín alebo 10-deacetylbaccatínový derivát v prítomnosti izolovaného enzýmu a acetylového donora,

Claims

1. Spôsob prípravy baccatínu a/alebo baccatínových derivátov, vyznačujúci sa tým, že reaguje 10-deacetylbaccatín alebo 10-deacetylbaccatínový derivát v prítomnosti izolovaného enzýmu a acetylového donora, pričom ako enzým sa používa acetyltransferáza s molekulovou hmotnosťou od 70 do 72 kD, stanovené SDS-PAGE s izoelektrickým bodom pri pH 5,4 až 5,8 a konštantou Km Michaelisa a Mentenovej pre acetylkoenzým A 55 až 65 μΜ, ktorá sa získa z Taxus chinensis.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa baccatín-III pripravuje z 10-deacetylbaccatínu.

3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa 14-hydroxybaccatin pripravuje z 14-hydroxy-10-deacetyl-baccatínu-III.

4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa taxuyuannín C pripravuje z 10-deacetyl taxuyunnanínu C.

5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia uskutočňuje v prítomnosti acetylkoenzýmu A ako acetyldonora.

6. Enzým, vyznačujúci sa tým, že

a) 10-deacetylbaccatín-III acetyluje v prítomnosti acetyldonora, predovšetkým acetylkoenzýmu A selektívne v polohe 10

b) vykazuje molekulovú hmotnosť 70 až 72 kD, stanovenú SPD-PAGE

c) vykazuje izoelektrický bod pri pH 5,4 až 5,8,

d) vykazuje konštantu K_M Michaelis-Mentenovej pre acetylkoenzým A 55 až 65 μΜ,

e) je to 10-hydroxytaxa-O-acetyltransferáza a

f) získa sa z bunkovej kultúry Taxus chinensis.

7. Enzým podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že je v čistote > 50 %.

8. Enzým podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že je v čistote > 90 %.

9. Spôsob prípravy enzýmu podľa niektorého z nárokov 6až 8, vyznačujúci sa tým, že sa enzým izoluje z Taxus chinensis čistením a po každom čistení sa určujú frakcie, v ktorých sa enzým vyskytuje, tým, že sa pridá 10-deacetyIbaccatín alebo derivát 10-deacetylbaccatínu a acetyldonor a dokazuje sa vytvorený produkt acetylácie.

10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že metóda čistenia zahrnuje použitie stĺpca High-Q.

11. Spôsob podľa niektorého z nárokov 9 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že sa používa 10-deacetylbaccatín alebo 10-deacetyltaxuyunnanín C na dôkaz frakcií obsahujúcich enzým.

12. Spôsob podľa niektorého z nárokov 9 až 11, vyznačujúci sa tým, že acetylkoenzým A sa používa ako acetyldonor.

13. Spôsob podľa niektorého z nárokov 9 až 12, vyznačujúci sa tým, že dôkaz vytvoreného acetyl-koenzýmu A ako produktu acetylácie sa uskutoční rádioaktívnym značkovaním.

14. Spôsob podľa niektorého z nárokov 9 až 11, vyznačujúci sa tým, že dôkaz vytvoreného produktu acetylácie sa uskutočňuje rádioaktívnym značkovaním ťažkým izotopom.

15. Spôsob prípravy taxolu a/alebo taxolových derivátov, vyznačujúci sa tým, že sa najprv pripravuje baccatin alebo baccatínový derivát podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a ten esterifikáciou OH skupín v polohe 13 baccatinového derivátu s vhodnou kyselinou reaguje na taxol alebo taxolový derivát.