CN115181758A - 一种固定化酶催化合成活性维生素ｄ的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种固定化酶催化合成活性维生素Ｄ的方法，其是将底物、固定化的催化酶及过氧化物加入到含有有机溶剂的缓冲液体系中反应得到骨化二醇或骨化三醇，其中所述底物为维生素D3或阿法骨化醇，所述催化酶是不需要提供辅因子参与催化，而是利用单加氧酶的方式催化单氧原子从过氧化物转移到产物的过氧化酶。本发明制备工艺简便，底物和产物负载量高，收率高，且下游处理工艺简单。该方法具有较高的原子经济性和步骤经济性，与化学法相比可大幅简化骨化二醇和骨化三醇的生产工艺并降低三废排放，与生物法相比可大幅提高底物与产物的浓度，进而可以大幅提升产业化的前景。

Description

一种固定化酶催化合成活性维生素Ｄ的方法
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及通过固定化酶高效酶催化合成两种活性维生素D3（骨化二醇和骨化三醇）化合物的方法。
背景技术
维生素D（VD）是机体必需的微量营养素，对健康至关重要。VD是一类脂溶性维生素，共包含VD1- VD5共五种类型，其中VD3和VD2对人体健康影响最大。VD部分来源于食物，部分可来源于皮肤中胆固醇前体通过阳光中UVB的暴露进行内源性合成VD3，再经肝脏25-羟化酶（CYP2R1和CYP27A1）催化为25-羟基维生素D3（骨化二醇）。循环中的骨化二醇在肾脏中可以进一步发生羟化反应，被1-α羟化酶（CYP27B1）羟化为具有更高活性的1, 25-二羟基维生素D3（骨化三醇）。
骨化三醇作为VD3的生理活性型，不需经过肝、肾进一步代谢，即可被身体直接吸收利用，凭借其独特的作用机制，被列为治疗骨质疏松症的首选药物。但由于骨化三醇的结构特殊，分子中存在多个手性分子及活泼基因，因而分子结构很不稳定，且在合成过程中存在多达50余个杂质及异构体，在贮存过程中也会发生分子异构化，得到足量具有生物活性的骨化三醇极其困难。骨化二醇是另一种活性维生素Ｄ，本身有一定活性，可用于治疗骨质疏松症、佝偻病、骨软化症等代谢性骨病的治疗，还可以用于血液透析所致的低血钙症。此外，另一种活性维生素D阿法骨化醇是目前研制出的较理想的活性VD的衍生物制剂，在体内起调节钙和磷平衡的作用，可用于治疗佝偻病和软骨病、骨质疏松症、肾性骨病和甲状旁腺功能减退。并且可以经肝脏25-羟化酶作用后形成具有活性的骨化三醇。现在我国的VD3及其活性形式正处于供不应求的状态，且化学法面临步骤冗长、污染严重、收率低等问题，迫切需要寻找一条高效绿色的合成路线来满足市场需求。
相比于化学合成，酶催化合成具有一定的优势。酶催化反应具有底物专一性、催化高效性、反应条件温和等优点，符合绿色化学的要求。但是，游离酶的重复使用性差并且容易失活，一定程度上限制了其在工业应用中的使用效率。因此，发展固定化方法对促进酶的工业化应用具有重要意义。
酶的固定化技术发展迅猛，种类繁多，可分为吸附、包埋、化学交联和共价结合法。固定化技术在保持酶分子活性的基础上，增强其对外界因素的耐受性，使得酶可以被循环利用，降低生产成本。目前，高占文等（CN201811326531 .4）提供了一种青霉素酰化酶的固定化方法，并将固定化青霉素酰化酶应用于市场。郑妍等（CN201110170701.6）提供了一种固定化TL脂肪酶的方法，所固定化酶具有高活性和稳定性，操作简单，大大降低了油脂加工的成本。
发明内容
本发明旨在提供一种可靠的固定化过氧化酶的方法，有效实现载体对酶的负载，使获得的固定化酶稳定性高、活性高、可循环利用，获得的固定化酶应用于活性维生素D的合成领域。本发明的目的是提供一种由维生素D3为底物，经固定化酶催化一步合成高产量、高收率的骨化二醇（式I），或由阿法骨化醇为底物，经固定化酶催化一步合成高产量、高收率的骨化三醇（式II）。本发明所制备的固定化酶能够在含有40-100%有机溶剂的缓冲液体系中，在底物浓度高达10-20g/L的条件下，合成目标产物。将底物、固定化酶及过氧化物加入到含有有机溶剂的缓冲液体系中，反应一段时间后，萃取、干燥，即可得到骨化二醇、或骨化三醇。
Figure 536373DEST_PATH_IMAGE001
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明所提供过氧化氢依赖的氧化酶的固定化方法及固定化酶，具体的可用于固定化的载体及预处理过程包括以下六种：
环氧人工树脂：采用缓冲液进行固定化前平衡预处理。
氨基人工树脂：采用缓冲液进行固定化前平衡预处理。
大孔吸附人工树脂：采用缓冲液进行固定化前平衡预处理。
含羧基四氧化三铁粒子：先通过碳二亚胺类的化合物（例如EDC）对羧基进行活化处理，生成一种容易与氨基反应的中间体，然后再与酶上的氨基生成酰胺键。
硅藻土：采用物理吸附的方式固定化酶，直接使用。
金属有机框架材料（MOFs）：采用物理吸附的方式固定化酶，在MOFs的合成过程中或合成之后添加酶达到物理固定化目的。
本发明所提供合成两种活性维生素D3，即骨化二醇和骨化三醇的固定酶催化合成方法，由维生素D3作为底物合成骨化二醇，及由阿法骨化醇作为底物合成骨化三醇，路线如下图7所示。以维生素D3为反应底物，在有机溶剂-缓冲液反应体系中，在过氧化物和固定化酶存在下反应，得到骨化二醇。而以阿法骨化醇为反应底物，在有机溶剂-缓冲液反应体系中，在过氧化物和固定化酶存在下反应，得到骨化三醇。
反应体系中，底物维生素D3或阿法骨化醇的浓度为5 – 20g/L。
所述反应助溶剂可为甲醇、乙腈、乙醇、丙醇、异丙醇、二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲酰二甲胺、乙酸乙酯中的一种或几种的混合物。
反应助溶剂占反应体系体积的40%-100 %。
所述缓冲溶液可为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCl、Tris-H2SO4缓冲液中的任一种，其pH值为6，具体可为4-10。
具体实施方式中，所述过氧化物为过氧化氢或有机过氧化物；所述有机过氧化物具体选自过氧化叔丁醇、四氢呋喃过氧化物、过氧化苯甲酰、乙二醇二甲醚过氧化物、过氧化甲乙酮、过氧乙酰硝酸酯、三过氧化三丙酮、双环氧乙烷及其衍生物、乙醚过氧化物、过氧乙酸和过氧化氢异丙苯中的至少一种。
所述过氧化酶不需要提供辅因子参与催化，而是利用单加氧酶的方式催化单氧原子从过氧化物（H2O2，ROOH）选择性转移到不同的目标分子上，所述过氧化酶可包括以下不同物种来源，均适合于本发明。例如：
(1)来源于Agrocybeaegerita的过氧化酶AaeUPO(优选地，其PDB: 5OXT_A)
(2) 来源于Marasmius rotula的过氧化酶MroUPO (优选地，其PDB: 5FUJ_A)
(3)来源于Coprinopsis cinerea的过氧化酶CciUPO (优选地，其NCBI ReferenceSequence: XP_001831910.1)
(4)来源于Collariella virescens的过氧化酶CviUPO (优选地，其PDB: 7ZCL_B)。
所述过氧化酶均以固定化酶的形式发挥催化作用；反应体系中，过氧化物酶的浓度可为100 nmol/L -5000 nmol/L（0.1~35 U/ml，1个酶活力单位是指在最适条件（25℃）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量）。
所述反应的反应时间为8-48 h，反应温度可为15-60 ℃。
反应结束后，将反应液用有机溶剂萃取、干燥、过滤即得。
本发明针对所述维生素的水溶性非常差的性质，研究发明发现采用固定化酶，结合反应体系中的高比例的有机溶剂，可以大幅提升底物、产物的溶度，并且固定化酶在该反应条件下稳定性和转化率很高，即可以合成两种重要活性维生素骨化二醇和骨化三醇的高浓度及高产率合成。本发明制备工艺简便，底物和产物负载量高，收率高，且下游处理工艺简单，制备过程中除使用水与简单小分子有机溶剂异丙醇（或其他有机助溶剂类，例如甲醇、乙腈、乙醇、丙醇、二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲酰二甲胺、乙酸乙酯）外，没有使用其他任何辅助溶剂。该方法具有较高的原子经济性和步骤经济性，并可大幅简化骨化二醇和骨化三醇的生产工艺并降低三废排放，进而可以大幅提升产业化的前景。
附图说明
图1环氧基树脂固定化MroUPO催化羟化阿法骨化醇合成骨化三醇转化率。
图2环氧基树脂固定化MroUPO催化羟化阿法骨化醇合成骨化三醇HPLC图。
图3金属有机框架固定化过氧化酶AaeUPO催化羟化阿法骨化醇合成骨化三醇转化率。
图4金属有机框架固定化过氧化酶AaeUPO催化羟化阿法骨化醇合成骨化三醇HPLC图。
图5环氧基树脂固定化CciUPO催化羟化VD3合成骨化二醇转化率。
图6环氧基树脂固定化CciUPO催化羟化VD3合成骨化二醇HPLC图。
图7 骨化二醇及骨化三醇的合成路线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1：6种载体的酶固定化方法
方法1：环氧人工树脂固定化过氧化酶：AaeUPO（PDB: 5OXT_A），MroUPO(PDB:5FUJ_A)，CciUPO (NCBI Reference Sequence: XP_001831910.1)，CviUPO (PDB: 7ZCL_B)
取20g环氧树脂加入1000 mL的磷酸盐缓冲溶液，洗涤平衡3次，抽滤后取200mg载体，加入100 μL的上述4种酶中的一种（酶活为2~20 U/mL），然后加入2000μL的磷酸盐缓冲溶液，固定化温度为20-25 ℃，800-1000rpm，固定化时间为3-24h，然后放入4 ℃冰箱静置1h。用去离子水洗涤2次后，取上清液用A280测蛋白浓度，计算结合率，结合率（%）=
Figure 515831DEST_PATH_IMAGE002
。抽滤后得到固定化的过氧化酶。
方法2：氨基人工树脂固定上述过氧化酶（AaeUPO，MroUPO，CciUPO，CviUPO）
取10g氨基树脂加入1000 mL的磷酸盐缓冲溶液，洗涤平衡3次，抽滤后取200mg载体，加入200 μL的上述4种酶中的一种（酶活为2~20 U/ml），然后加入1400μL的磷酸盐缓冲溶液，固定化温度为20-25 ℃，800-1000rpm，固定化时间为3-24h，然后放入4 ℃冰箱静置1h，然后用去离子水洗涤2次，取上清液用A280测蛋白浓度，计算结合率。抽滤后得到固定化过氧化酶。
方法3：大孔吸附人工树脂固定过氧化酶（AaeUPO，MroUPO，CciUPO，CviUPO）
取400 mg环氧树脂，加入4000μL的磷酸盐缓冲溶液，洗涤平衡3次，抽滤后加入200μL的上述4种酶中的一种（酶活为2~20 U/ml），然后加入1400μL的磷酸盐缓冲溶液，固定化温度为20-25 ℃，800-1000rpm，固定化时间为3-24h，然后放入4 ℃冰箱静置1h，然后用去离子水洗涤2次，取上清液用A280测蛋白浓度，计算结合率。抽滤后得到固定化过氧化酶。
方法4：羧基四氧化三铁固定上述过氧化酶（AaeUPO，MroUPO，CciUPO，CviUPO）
将500mg磁珠加入1000μL去离水中，取200 μL的悬浮液放入离心管中，放置于磁石上待磁珠完全被吸附，去除上清液，加入1mL 2-(N-吗啉)乙磺酸-水合物溶液（pH 6.0）洗涤磁珠，重复两次，加入200 μL的碳二亚胺进行活化，25℃，1h。然后磁分离后弃上清液，加入200 μL的上述4种酶中的一种（酶活为2~20 U/ml），然后加入2000μL的磷酸盐缓冲溶液，固定化温度为20-25 ℃，800-1000rpm，固定化时间为3-24h，然后放入4 ℃冰箱静置1h，然后用去离子水洗涤2次，取上清液用A280测蛋白浓度，计算结合率。抽滤后得到固定化过氧化酶。
方法5：海藻酸钠固定化上述过氧化酶（AaeUPO，MroUPO，CciUPO，CviUPO）
将500 mg的硅藻土加入1 mL去离子水中，然后加入酶溶液（200 μL的上述4种酶中的一种（酶活为2~20 U/ml），加入200-1400μL的磷酸盐缓冲溶液，固定化温度为20-25 ℃，800-1000rpm，固定化时间为3-24h，然后放入4 ℃冰箱静置1h，然后用去离子水洗涤2次，取上清液用A280测蛋白浓度，计算结合率。抽滤后得到固定化过氧化酶。
方法6：金属有机框架固定化上述过氧化酶（AaeUPO，MroUPO，CciUPO，CviUPO）
取100mg的硝酸锌和600mg的2-甲基咪唑于10mL去离子水中，室温下磁力搅拌3h，然后离心收集白色胶体，60℃干燥，取50mg白色粉末加入200 μL的上述4种酶中的一种（酶活为2~20 U/ml），然后加入200-1400μL的磷酸盐缓冲溶液，固定化温度为20-25 ℃，800-1000rpm，固定化时间为3-24h，然后放入4 ℃冰箱静置1h，然后用去离子水洗涤2次，取上清液用A280测蛋白浓度，计算结合率。抽滤后得到固定化过氧化酶。
实施例2：化合物骨化三醇的制备
化合物骨化三醇的结构式为：
Figure 295568DEST_PATH_IMAGE003
将200mg经方法1固定后的MroUPO酶装到4 mL棕色反应瓶中，加入400μL磷酸盐缓冲溶液（pH=6），加入含21.67 mM阿法骨化醇（8.7g/L）的异丙醇溶液600 μL，终浓度为5 g/L并加入过氧化氢，其终浓度为15mmol/L，在30 ℃反应24 h后，取上清进行液相色谱（HPLC）检测骨化三醇的含量。HPLC检测条件为：色谱柱：shim-pack GIST-C18shim-pack GIST-C184.6×250mm×5
Figure 877728DEST_PATH_IMAGE004
M；流动相：水：乙腈 = 45 : 55；流速：1 mL/min；检测波长265 nm。所用标准品为骨化三醇（ 上海阿拉丁生化科技股份有限公司），液相检测结束后根据液相色谱图峰面积计算摩尔转化率，转化率（%）=
Figure 692100DEST_PATH_IMAGE005
，产物转化率-时间曲线如图1所示，HPLC见图2。24 h转化率为97%.
其中MroUPO酶的制备：
重组蛋白表达：将MroUPO基因(PDB: 5FUJ_A)构建到载体pET28a上，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。重组细胞直接接种到含有50 μg mL-1卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220 rpm条件下过夜培养。按照1%接种量将菌液转接到含有50μg mL-1卡那霉素的TB液体培养基中，37℃，220 rpm条件下培养至OD600达到0.6-0.8后添加最终浓度为0.5 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）并将培养温度降至16 ℃，220 rpm 培养20小时后。使用低温离心机4℃ 4500 rpm离心15分钟，收集细胞，并用磷酸盐缓冲液（20 mM，pH 7.4，100 mMNaCl）对湿细胞清洗一次。将浓度为0.05 g mL-1的细胞悬液使用超声破碎仪进行细胞破碎，高速离心后将细胞裂解液收集起来通过vivaflow装置进行浓缩并储存在-80℃。
蛋白纯化：将细胞裂解液结合到预先用缓冲液A（20 mM Tris–HCl ,pH=7.0）平衡的HisTrap HP预装柱，流速为1.5 mL/min。经洗涤缓冲液B洗20个柱体积（20 mM Tris–HCl,20 mM Imidazole，NaCl pH=7.0），洗脱缓冲液C（20 mM Tris–HCl ,400 mM Imidazole，NaCl pH=7.0,）洗脱5个柱体积。收集获得目的蛋白。获得目标蛋白使用 ABTS 测定其活性。
ABTS 测定：将1uL样品加入200 uL ABTS混合液，使用酶标仪在25℃、420nm下进行吸光值测定，每5s测一次，取线性变化区间计算斜率，带入公式计算酶活 (酶活
Figure 576879DEST_PATH_IMAGE006
) ，其中Vsample代表待测酶液体积；
Figure 843913DEST_PATH_IMAGE007
摩尔吸光度值；d为比色皿直径；Vtotal代表测定体系总体积；Ew样品变化率（斜率），经计算酶活为0.037 U/ml，浓缩两倍后使用。
ABTS 混合溶液：pH4.4 柠檬酸-磷酸盐缓冲液、1mM ABTS、1mM H2O2。
实施例3：化合物骨化三醇的制备
将200mg经方法2固定后的AaeUPO酶装到4 mL反应瓶中，加入200 μL磷酸盐缓冲溶液（pH=6），加入300 μL乙腈，加入500 μL阿法骨化醇（50 mM，20 g/L）的异丙醇溶液，终浓度为10 g/L。并加入过氧化氢，其终浓度为25mmol/L，上述反应体系于30 ℃摇床中反应24小时。
检测方法和数据处理同实施例2，24 h转化率为87%。
其中AaeUPO酶的制备：
重组蛋白表达：AaeUPO核酸序列（PDB: 5OXT_A）亚克隆至pPICZαA载体，在C端加上His标签。将pPICZαA- PaDa-I重组质粒转化至P. pastoris strain X-33，取100μL感受态细胞加线性化质粒DNA进行电转，细胞涂布于YPD培养基平板（含100 μg/mL博来霉素），置于30 ℃，培养2天。待YPD板上长出单菌落，挑取单菌落，随后进行PCR菌落筛选验证，根据阳性结果，转接入含50mLBMGY培养基的三角瓶中，30℃，200rpm，培养至OD600=1-1.5；4000rpm，5min收菌；沉淀用BMMY重悬至OD600=0.3（约100-200mL）；转移至500mL的三角瓶中，30℃，200rpm开始诱导表达培养3天，每24h添加3%甲醇。
蛋白纯化：将菌液在4℃，4000 rpm离心20分钟，收集上清液（即PaDa-I粗酶液）。将上清液结合到预先用缓冲液A（20 mM Tris–HCl ,pH=7.0）平衡的HisTrap HP预装柱，，流速为1.5 mL/min。经洗涤缓冲液B洗20个柱体积（20 mM Tris–HCl ,20 mM Imidazole，NaClpH=7.0），洗脱缓冲液C（20 mM Tris–HCl ,400 mM Imidazole， NaCl pH=7.0,）洗脱5个柱体积。收集获得目的蛋白。使用超滤管浓缩目标蛋白洗脱液，并更换其缓冲液为分子排阻层析缓冲液（NaPi缓冲液）。
将浓缩后的蛋白进一步通过分子筛（Superdex® 200 Increase 10/300 GL）纯化，流速为0.5 mL/min。分管收集目标蛋白。获得目标蛋白使用 ABTS 测定其活性。
ABTS 测定PaDa-I活：将1uL样品加入200 uL ABTS混合液，使用酶标仪在25℃、420nm下进行吸光值测定，每5s测一次，取线性变化区间计算斜率，带入公式计算酶活 (酶活
Figure 105130DEST_PATH_IMAGE006
) ，其中Vsample代表待测酶液体积；
Figure 774008DEST_PATH_IMAGE007
摩尔吸光度值；d为比色皿直径；Vtotal代表测定体系总体积；Ew样品变化率（斜率），经计算酶活为0.02 U/ml。
ABTS 混合溶液：pH4.4 柠檬酸-磷酸盐缓冲液、1mM ABTS、1mM H2O2。
实施例4：化合物骨化三醇的制备
将500mg经方法3固定后的CciUPO酶装到4 mL反应瓶中，加入400μL磷酸盐缓冲溶液（pH=6），加入43.5 mM阿法骨化醇（17.4g/L）的甲醇溶液600 μL，终浓度为10 g/L。并加入过氧化氢，其终浓度为15mmol/L，上述反应体系于30 ℃摇床中反应24h。
检测方法和数据处理同实施例2，24 h转化率为90%。
其中CviUPO酶的制备：
重组蛋白表达：将CviUPO基因(PDB: 7ZCL_B)构建到载体pET28a上，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。重组细胞直接接种到含有50 μg mL-1卡那霉素的LB液体培养基中，37 oC，220 rpm条件下过夜培养。按照1%接种量将菌液转接到含有50μg mL-1卡那霉素的TB液体培养基中，37℃，220 rpm条件下培养至OD600达到0.6-0.8后添加最终浓度为0.5 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）并将培养温度降至16 oC，220 rpm 培养20小时后。使用低温离心机4 oC 4500 rpm离心15分钟，收集细胞，并用磷酸盐缓冲液（20 mM，pH 7.4，100 mMNaCl）对湿细胞清洗一次。将浓度为0.05 g mL-1的细胞悬液使用超声破碎仪进行细胞破碎，高速离心后将细胞裂解液收集起来通过vivaflow装置进行浓缩并储存在-80 oC。
蛋白纯化：将细胞裂解液结合到预先用缓冲液A（20 mM Tris–HCl ,pH=7.0）平衡的HisTrap HP预装柱，流速为1.5 mL/min。经洗涤缓冲液B洗20个柱体积（20 mM Tris–HCl,20 mM Imidazole，NaCl pH=7.0），洗脱缓冲液C（20 mM Tris–HCl ,400 mM Imidazole，NaCl pH=7.0,）洗脱5个柱体积。收集获得目的蛋白。获得目标蛋白使用 ABTS 测定其活性。
ABTS 测定：将1uL样品加入200 uL ABTS混合液，使用酶标仪在25℃、420nm下进行吸光值测定，每5 s测一次，取线性变化区间计算斜率，带入公式计算酶活，(酶活
Figure 850197DEST_PATH_IMAGE006
)其中Vsample代表待测酶液体积；
Figure 604526DEST_PATH_IMAGE007
摩尔吸光度值；d为比色皿直径；Vtotal代表测定体系总体积；Ew样品变化率（斜率），经计算酶活为0.06 U/ml。
ABTS 混合溶液：pH4.4 柠檬酸-磷酸盐缓冲液、1mM ABTS、1mM H2O2。
实施例5：化合物骨化三醇的制备
将300mg经方法4固定后的CviUPO酶装到4 mL反应瓶中，加入600μL磷酸盐缓冲溶液（pH=6），加入含32.5 mM阿法骨化醇（13g/L）的乙酸乙酯溶液400 μL，终浓度为5 g/L。并加入过氧化氢，其终浓度为15mmol/L，上述反应体系于30 ℃摇床中反应24小时。
检测方法和数据处理同实施例2，24 h转化率为90 %。
实施例6：化合物骨化三醇的制备
将400mg经方法6固定后的AaeUPO酶装到4 mL棕色反应瓶中，加入300 μL磷酸盐缓冲溶液（pH=6），加入含28.57 mM阿法骨化醇（11.4g/L）的丙酮溶液700 μL，终浓度为10 g/L。并采用流加的方式加入过氧化氢，其终浓度为60mmol/L。上述反应体系于30 ℃摇床中反应24 h。
检测方法和数据处理同实施例2，24h转化率为20%，产物转化率-时间曲线如图3所示，HPLC见图4。
实施例7：化合物骨化二醇的制备
Figure 403855DEST_PATH_IMAGE008
将500mg经方法1固定后的CciUPO酶装到4 mL反应瓶中，加入200μL磷酸盐缓冲溶液（pH=6），加入含31.25 mM维生素D3（12g/L）的异丙醇溶液800 μL，终浓度为10 g/L。并加入过氧化氢，其终浓度为30mmol/L，上述反应体系于30 ℃摇床中反应24 h。
检测方法同实施例2。液相检测结束后根据液相色谱图峰面积计算摩尔转化率，转化率（%）=
Figure 927240DEST_PATH_IMAGE009
，24h转化率为50%，产物转化率-时间曲线如图5所示。生成骨化二醇HPLC见图6。
实施例8：化合物骨化二醇的制备
将300mg经方法2固定后的MroUPO酶装到4 mL反应瓶中，加入200 μL磷酸盐缓冲溶液（pH=6），加入31.25 mM 维生素D3（12g/L）的丙酮溶液800 μL，终浓度为10 g/L。并加入过氧化氢，其终浓度为30mmol/L。上述反应体系于30 ℃摇床中反应24 h。
检测方法和数据处理同实施例7，转化率为42 %。
实施例9：化合物骨化二醇的制备
将400mg经方法2固定后的AaeUPO酶装到4 mL反应瓶中，加入300 μL磷酸盐缓冲溶液（pH=6），加入31.25 mM 维生素D3（12g/L）的丙酮溶液700 μL，终浓度为8.4 g/L。并加入过氧化氢，其终浓度为60mmol/L。上述反应体系于30 ℃摇床中反应24 h。
检测方法和数据处理同实施例7，转化率为29 %。
实施例10：化合物骨化二醇的制备
将400mg经方法6固定后的CviUPO酶装到4 mL反应瓶中，加入200μL磷酸盐缓冲溶液（pH=6），加入31.25 mM 维生素D3（12g/L）的正丙醇溶液800 μL，终浓度为10 g/L。并加入过氧化氢，其终浓度为30mmol/L。上述反应体系于30 ℃摇床中反应24 h。
检测方法和数据处理同实施例7，转化率为33%。
以上所述，实施例仅为本发明较好的实施方式，本领域的技术人员应当理解的是，实施示例并不是范例性的，不对本发明的保护范围构成任何限制。任何熟悉本技术领域的术人在本发明所提出的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思，在其细节或者形式的做出等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种合成骨化二醇的方法，其特征在于，将底物、固定化的催化酶及过氧化物加入到含有有机溶剂的缓冲液体系中反应得到，其中所述底物为维生素D3，所述催化酶是不需要提供辅因子参与催化，而是利用单加氧酶的方式催化单氧原子从过氧化物转移到产物的过氧化酶所述过氧化酶可选自以下不同物种来源：
(1) 来源于Agrocybeaegerita的过氧化酶AaeUPO；
(2) 来源于Marasmius rotula的过氧化酶MroUPO ；
(3)来源于Coprinopsis cinerea的过氧化酶CciUPO；
(4)来源于Collariella virescens的过氧化酶CviUPO。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在含有40-100%的有机溶剂的缓冲液体系中进行。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化采用的载体及预处理过程选自以下六种：
（1）环氧人工树脂，采用缓冲液进行固定化前平衡预处理；
（2）氨基人工树脂，采用缓冲液进行固定化前平衡预处理；
（3）大孔吸附人工树脂，采用缓冲液进行固定化前平衡预处理；
（4）含羧基四氧化三铁粒子，先通过碳二亚胺类的化合物对羧基进行活化处理，生成易与氨基反应的中间体，然后再与酶上的氨基生成酰胺键；
（5）硅藻土：采用物理吸附的方式固定化酶，直接使用；
（6）金属有机框架材料，采用物理吸附的方式固定化酶，在所述材料的合成过程中或合成之后添加酶达到物理固定化目的。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物在反应体系中的浓度高达5-20g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液体系是磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCl、Tris-H2SO4缓冲液中的任一种，其pH值为4-10。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、丙醇、异丙醇、二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲酰二甲胺、乙酸乙酯中的一种或几种的混合物。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过氧化物为过氧化氢或有机过氧化物；所述有机过氧化物选自过氧化叔丁醇、四氢呋喃过氧化物、过氧化苯甲酰、乙二醇二甲醚过氧化物、过氧化甲乙酮、过氧乙酰硝酸酯、三过氧化三丙酮、双环氧乙烷或其衍生物、乙醚过氧化物、过氧乙酸和过氧化氢异丙苯中的一种。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化酶的浓度为100 nmol/L -5000nmol/L。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的反应时间为8-48 h，反应温度可为15-60 ℃。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在反应结束后还包括分离纯化步骤，具体是将反应液用有机溶剂萃取、干燥、过滤即可。
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