CN1190445C - 制备功能丝心蛋白的方法及该蛋白的用途 - Google Patents

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Abstract

一种制备没有降解的丝心蛋白的方法，其中将新鲜的、烘干的或煮过的茧的茧层或茧纱，粗丝，或者丝纤维，或者其残留的纱溶解于中性盐的水溶液中，然后使得到的溶液分级沉淀以从丝胶蛋白中分离丝心蛋白；使得到的溶液进行下面的步骤a)或b)，从而去除丝胶蛋白：a)在温和条件下用碱性水溶液处理，或b)在温和条件下用脲水溶液处理；或者用加压热水处理或者酶促脱胶。因此可有利地制备出与从液体丝获得的产物功能相当的没有降解的丝心蛋白(分子量：350000-370000)。通过使用由此得到的丝心蛋白，可获得用于细胞培养、伤口愈合促进剂和化妆品组合物的极好的添加剂。

Description

制备功能丝心蛋白的方法及该蛋白的用途
技术领域
本发明涉及制备具有极好的细胞增殖促进作用的没有降解的丝心蛋白的方法；以及其在药物和化妆品领域中的应用。
技术背景
丝心蛋白通常以粉状和膜状形式作为伤口敷料而加以研究，因为其对遭受创伤、烧伤等的皮肤组织具有愈合促进作用(日本专利特许公开No.平1-254164，平8-198970，平9-192210，或平11-104228)。这样的作用也允许作为化妆品组合物使用丝心蛋白。
然而常规丝心蛋白的伤口敷料愈合促进作用的用途不完全令人满意，有提供更有效伤口愈合促进剂这样的要求。
因此，本发明的一个目的是提供获得对毁坏皮肤组织的再生能力极好，换句话说，细胞增殖促进作用极好的天然存在的成分的方法，以及该成分的用途。
发明的公开
因此，本发明人进行了各种各样的研究，关注丝心蛋白的常规制备方法，并且发现在常规的丝纱制备方法中，丝心蛋白已经降解并且具有减小的分子量。
本发明人第一次发现这样的利用电泳的分析结果，即常规的丝纱制备方法由下面的步骤组成：新鲜茧-烘茧步骤-煮茧步骤-卷于轴上步骤-粗丝-脱胶步骤-丝纱，通过粗丝步骤丝心蛋白的分子量稍微有所减小，但是减小的程度取决于新鲜茧或干燥茧的贮存条件，或者各步骤的温度或时间；以及在随后的步骤中，这种减小还由于降解所致。
已发现这样的降解的丝心蛋白几乎没有细胞增殖促进作用，而在特殊条件下从茧纱，粗纱或丝纱获得的没有降解的丝心蛋白具有选择性的有效的细胞增殖促进作用，且它的应用使得有可能产生高度选择性和安全性的伤口愈合促进剂和化妆品组合物，使本发明得以完成。
在本发明中，因此提供了从新鲜的、烘干的或煮过的茧的茧层或茧纱，粗丝，或者丝纤维，或者其残留的纱可得到的没有降解的丝心蛋白。
在本发明中，也提供了制备没有降解的丝心蛋白的方法，该方法包括将新鲜的、烘干的或煮过的茧的茧层或茧纱，粗丝，或者丝纤维，或者其残留的纱溶解于中性盐的水溶液中，并且使得到的溶液分级沉淀，从而从丝的丝胶蛋白中分离丝心蛋白。
在本发明中，也提供了制备没有降解的丝心蛋白的方法，该方法包括通过进行下面的步骤a)或b)，使新鲜的、烘干的或煮过的茧的茧层或茧纱，粗丝，或者丝纤维，或者其残留的纱脱胶：
a)在温和条件下用碱性水溶液处理，或者
b)在温和条件下用脲水溶液处理。
在本发明中，也提供了制备没有降解的丝心蛋白的方法，该方法包括将新鲜的、烘干的或煮过的茧的茧层或茧纱，粗丝，或者丝纤维，或者其残留的纱酶促脱胶。
在本发明中，还提供了细胞增殖促进剂和伤口愈合促进剂，各自包括通过上述方法任意之一获得的没有降解的丝心蛋白作为有效成分。
在本发明中，还提供了含有通过上述方法任意之一获得的没有降解的丝心蛋白的化妆品组合物。
附图的简要描述
图1是说明实施例1中每个材料的丝心蛋白降解状态的电泳图；图2说明在沸腾的碳酸钠水溶液中没有降解的丝心蛋白保留的范围；图3是说明用脲水溶液处理的丝心蛋白的降解条件的电泳图；图4是说明用中性盐的水溶液处理之后的丝心蛋白的分级状态和分级沉淀的电泳图；图5说明丝心蛋白对成纤维细胞增殖的作用。
实施本发明的最佳方式
蚕将液体形式的丝分泌到其丝腺腔中，并且将这种丝称为“液体丝”。液体丝由丝心蛋白和丝胶蛋白组成。液体丝心蛋白具有大约370000的分子量(Tasiro Yutaka和Otsuki Eiichi，细胞生物学杂志(Journal of CellBiology)，Vol.46，P1(1970))。通过还原作用将具有大约370000的分子量的丝心蛋白分为大约350000分子量的一部分和大约25000分子量的另一部分。这里，将具有大约350000或370000分子量的丝心蛋白称之为“没有降解的丝心蛋白”。
构成茧时，蚕将液体丝吐丝，并且形成茧(由茧纱和蛹制成)。丝心蛋白存在于茧纱的中心部位，而丝胶蛋白存在于周围。已知比例是70至80(丝心蛋白)/20至30(丝胶蛋白)。粗纱由收集的几个或几十个茧纱形成(卷取)。从茧纱，粗丝或者粗丝纤维去除丝胶蛋白的步骤称之为“脱胶”，而脱胶之后的纤维称之为“丝纱”或“丝纱丝心蛋白”。通过脱胶不总是完全去除丝胶蛋白。有时，50％脱胶或者70％脱胶用于去除大约一半或者70％的丝胶蛋白，而这样的纤维也称之为“丝纱”，因为它已经被脱胶。术语“粗丝纤维”指还没有脱胶的丝纤维。一般情况下，术语“丝”包括丝心蛋白本身、丝胶蛋白本身以及丝心蛋白和丝胶蛋白的混合物。任何形式例如膜、粉末和纤维形式的丝心蛋白或丝胶蛋白都称为丝。术语“丝丝心蛋白”和“丝心蛋白”或者术语“丝丝胶蛋白”和“丝胶蛋白”具有相同的含义。“丝心蛋白”包括“丝心蛋白膜”、“丝心蛋白粉末”和“丝纱丝心蛋白”，其中，术语“丝纱丝心蛋白”指通过将茧纱，粗丝或者粗丝纤维，或者其残留的纱脱胶获得的纤维。
常规的丝纱制备方法如下：通过烘干蚕农生产的鲜茧(鲜茧：没有贮存处理的茧)，煮茧，然后卷轴，获得粗丝或者粗丝纤维之后，将得到的粗丝或者粗丝纤维脱胶，从而获得丝纱或者丝纤维。来自这些步骤的废纱称为“残留的纱”。通过在5-6小时内将温度从115℃至120℃逐渐降低至大约80℃进行茧的烘干。煮茧时，用100℃至105℃的蒸汽或热水处理茧大约10分钟。常规脱胶方法的例子包括在含有碱性钠盐例如碳酸钠或碳酸氢钠或皂的水溶液中煮(最常见方法)，通过在加压热水(例如120℃的热水)中浸渍脱胶，和酶促脱胶。有人认为在这样的常规丝纱生产步骤中，丝纱丝心蛋白没有降解。但是本申请人的研究发现在该常规丝纱生产步骤中丝心蛋白降解。具体地说，使用常规丝纱作为原材料的细胞培养床或者伤口敷剂的丝心蛋白已经降解，并且没有留下没有降解的丝心蛋白。
也可以从液体丝获得丝心蛋白。例如通过从蚕的丝腺的中心部分和后面的部分取出胶样内含物(液体丝)，并且通过使用水溶液等去除附着于内含物的少量的丝胶蛋白，能够获得没有降解的丝心蛋白。但是该方法需要从蚕的剖开的体内取出丝腺，然后从丝腺腔提取丝心蛋白。从一只蚕可获得的丝心蛋白的量最多大约0.4克。这种方法不适合工业化生产，因为这样获得的丝心蛋白趋向于含有杂质，例如蚕的体液和丝腺细胞，并且这样获得丝心蛋白费时费力。
在本发明中，使用工业上有利的新鲜的、烘干的或煮过的茧的茧层或茧纱，粗丝，或者丝纤维，或者其残留的纱作为原材料。丝心蛋白在贮存期间有降解趋势，这样，使用鲜茧作为原材料是最优选的。优选在不高于室温的温度下贮存鲜茧，烘干的茧，粗丝，丝纱或者其残留的纱，同时避光。使用之前，需要研究是否保留没有降解的丝心蛋白。
当使用中性盐的水溶液时，将上述原材料溶解于中性盐的水溶液中，接着分级沉淀。所述中性盐的例子包括硫氰酸锂、氯化钙、溴化锂和硫氰酸钠。尽管所述中性盐的浓度随着中性盐的类型而不同，但是对于任何中性盐来说优选饱和水溶液或50％饱和浓度或更大浓度。特别地，优选80％饱和浓度或更大浓度。当使用硫氰酸锂时，其饱和水溶液具有大约80％(重量(克)/体积(毫升))浓度。下文只是简单地表示为“％”。上述中性盐的水溶液具有5-8的pH。
制备原材料的溶液之后进行分级沉淀时，优选加入丙酮或醇，特别是乙醇，以使无定形丝心蛋白结晶。连续加入乙醇的同时优选收集沉淀。
步骤a)中用碱性水溶液的温和处理条件是选择以使不降解丝心蛋白的pH、温度和时间条件。在根据需要变化的在下面范围之内的条件下优选进行处理：在大气压下于沸点温度下在具有pH10-11.5的碱性水溶液中处理2-60分钟。在小于10的pH下脱胶不充分，而pH超过11.5，则丝心蛋白的降解速度变得不可控制地高。水溶液的优选的pH范围是10.5-11.5。用于该处理的碱性水溶液是碱性钠盐例如碳酸钠、碳酸氢钠、硅酸钠、偏硅酸钠(sodium metasilicate)、磷酸钠或氢氧化钠的水溶液。在碱脱胶中，碳酸钠水溶液是特别优选的，因为其具有足够的缓冲作用。
为了通过脱胶而不降解丝来获得没有降解的丝心蛋白，根据需要，需要控制处理条件，例如脱胶pH、温度和时间。例如，在沸点或者更高的温度下(例如110℃或120℃)的处理需要接近中性的pH或者短的处理时间。在不高于沸点的温度下处理需要高pH或者更长的处理时间。因此，根据需要变化条件。不用说，当使用碳酸钠以外的钠盐时，参照对于碳酸钠的那些根据需要变化条件。在步骤a)的处理中，必需将原材料浸在碱性水溶液中，并且在浸渍期间可以进行搅拌。
步骤b)中脲水溶液中的温和条件是选择以使不引起丝心蛋白降解的温度和时间条件。从防止丝心蛋白降解、反应效率和工业可操作性的角度看，用30％或更大浓度的脲水溶液在70℃至90℃下处理60-180分钟是优选的。用45％或更大浓度的脲水溶液在75℃至85℃下处理90-150分钟是更优选的。脲水溶液中可以加入巯基乙醇等。
不用说，和步骤a)类似，可以根据需要组合脲脱胶的温度、浓度和时间来设置适当的处理条件。在步骤b)的处理中，必需将上述材料浸在脲水溶液中，并且可以在搅拌下进行处理。
酶促脱胶是应用蛋白酶将粗丝或鲜茧脱胶的方法。取代常常使用的木瓜蛋白酶，近来使用Alcalase(Koshindo Kagaku Kogyosho)作为酶。Alcalase酶促脱胶需要预处理，更具体地说，在pH9-10，优选pH9.0-9.6下，10分钟之内，优选5分钟，在80℃下预处理，或者在60分钟内，优选10分钟，在60℃下预处理。然后通过加入Alcalase进行主要处理，并且在50℃-60℃下脱胶。优选在60分钟之内，特别是在20分钟之内进行脱胶。在该情况下，优选尽可能好地散开茧层。在散开工作过程中可以进行搅拌。
将使用中性盐水溶液获得的分级沉淀(没有降解的丝心蛋白)，通过步骤a)或b)可获得的没有降解的丝心蛋白、或者通过加压热水处理或者通过酶促脱胶可获得的没有降解的丝心蛋白溶解于含有加溶剂的溶液中，接着通过渗析进行脱矿质，从而可以获得没有降解的丝心蛋白的水溶液。加溶剂的例子包括硫氰酸锂、氯化钙、溴化锂、硫氰酸钠、乙醇等等。
降解的丝心蛋白几乎没有细胞增殖促进作用，而这样获得的没有降解的丝心蛋白表现出极好的细胞增殖促进作用。因此称其为“功能丝心蛋白”并且对于用于细胞培养(特别是用于包括人细胞的动物细胞的添加剂)，和伤口愈合促进剂和化妆品组合物(也可以概括称为“外部施用制剂”)的各种添加剂是有用的。
用作伤口愈合促进剂或者化妆品组合物时，水凝胶、膜、粉末等形式的没有降解的丝心蛋白(功能丝心蛋白)优选为能够施用给伤口或皮肤的外部施用制剂。通过在平板上浇注上没有降解的丝心蛋白的水溶液然后烘干可获得膜形式的没有降解的丝心蛋白。通过粉碎上述膜；将没有降解的丝心蛋白的水溶液空气雾化；或者将通过搅拌没有降解的丝心蛋白的水溶液或者通过向没有降解的丝心蛋白的水溶液中加入醇而获得的沉淀洗涤、干燥和粉碎，可获得粉末状形式。
没有降解的丝心蛋白也可以以常规制剂形式用于外部施用，例如软膏、乳膏、泥敷剂等。只有通过将没有降解的丝心蛋白掺入常规使用的软膏基质、乳膏基质或者泥敷剂基质中才可获得这样的软膏、乳膏或泥敷剂。
以0.001-30％，特别是0.1-10％的量向这样的外部施用的制剂中加入没有降解的丝心蛋白，但是量取决于剂型或基质。
实施例
下面通过实施例将进一步详细说明本发明。但是应该记住本发明不局限于此或者受此限制。
实施例1(证明在丝纱生产步骤中丝心蛋白的降解)
作为样品，使用的是造茧之后一个月内的鲜茧的茧层，烘干的茧的茧层，煮过的茧的茧层(通过用于茧试验的煮茧机进行标准煮茧)，粗丝和通过在大气压下在50倍重量的(浴比：50倍)0.05％碳酸钠水溶液中将粗丝煮沸1小时而获得的丝纱。将每一种样品溶解于大约80％的硫氰酸锂水溶液(pH7)中。该溶液对30％的脲水溶液渗析，接着通过SDS聚丙烯酰胺凝胶(2-15％梯度凝胶)电泳分析加入4％2-巯基乙醇溶液的溶液中的丝心蛋白和没有加入4％2-巯基乙醇溶液的溶液中的丝心蛋白。附带地，分别用常规方法制备烘干的茧，煮过的茧，粗丝和丝纱。作为结果，从加入2-巯基乙醇溶液的溶液中，清楚地识别相应于大约350000的丝心蛋白泳带。从烘干的茧中，清楚地识别相应于大约350000的丝心蛋白泳带，但是该泳带有一点浅。煮过的茧和粗丝中的泳带变得更浅，提示存在没有降解的丝心蛋白但是也存在降解的丝心蛋白。从丝纱中，没有识别相应于大约350000的丝心蛋白泳带。当溶液中不加入2-巯基乙醇溶液时，在鲜茧、烘干的茧或煮过的茧的茧层，和粗丝中出现相应于大约370000的丝心蛋白泳带，但是在丝纱中则没有。不管使用大约350000或者大约370000的泳带，证实没有降解的丝心蛋白存在的电泳给出相同结果。为了获得没有降解的丝心蛋白，优选使用鲜茧、但是也可以使用烘干的茧、煮过的茧或粗丝(参见图1)。
实施例2
将鲜茧的茧层充分散开，接着浸入大气压下的沸腾的0.05％碳酸钠水溶液(浴比：50倍)中。分别浸渍5、10、15、20、30、40和60分钟之后，用水洗涤样品并且烘干。用和实施例1类似的方法溶解和渗析之后，通过电泳分析丝心蛋白的降解程度。作为结果，浸渍的时间越长，相应于大约350000的丝心蛋白的泳带逐渐变得越浅。通过浸渍40分钟，泳带还稍微可见。浸渍60分钟的结果是没有可见的泳带。茧层浸渍在碳酸钠水溶液之前和之后的重量测定表明浸渍5分钟、10分钟和60分钟分别引起重量减少21.5％、24.5％和25.1％，通过浸渍大约10分钟，丝胶蛋白几乎被去除。丝胶蛋白的去除取决于茧层的散开程度或浴比。
实施例3
用和实施例2相似的方法，除了改变碳酸钠的浓度和在其中的浸渍时间外，在大气压下在沸腾时进行试验。图2给出结果。图2中，没有降解的丝心蛋白保持在A的范围内(0.012-1.0％浓度下2-60分钟)，优选在B的范围内(0.02-0.2％浓度下5-40分钟)。
实施例4
在50毫克鲜茧浸在含有48％脲和4％2-巯基乙醇的溶液中之后，在各个不同温度下(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃)处理2小时。这样处理过的茧用水洗涤，溶解于大约80％硫氰酸锂的水溶液中，脱矿质，并且进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果(图3)表明，在不高于70℃的处理温度下没有充分去除丝胶蛋白，而同时丝心蛋白在90℃下容易降解；在80℃下处理不会降解丝心蛋白，但是去除了丝胶蛋白。
实施例5
通过将鲜茧的茧层溶解于大约80％的硫氰酸锂的水溶液(pH7)中获得大约5％的丝溶液。如表1所示连续加入乙醇并且收集丝沉淀。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析它们中的每一个的丝心蛋白。结果在图4中给出。从表1中No.5、6和7中获得的沉淀观察到相应于大约350000的丝心蛋白泳带。乙醇浓度不大于大约74％获得的沉淀被去除，且在乙醇浓度为74％或者更大，优选大约80％或更大但是不大于90％下可获得的沉淀可以用作没有降解的丝心蛋白。
                        表1
   泳道No.                   处理
   1   向50毫升上清液中加入80毫升乙醇形成的沉淀
   2   向泳道No.1的上清液中加入20毫升乙醇形成的沉淀
   3   向泳道No.2的上清液中加入20毫升乙醇形成的沉淀
   4   向泳道No.3的上清液中加入20毫升乙醇形成的沉淀
   5   向泳道No.4的上清液中加入60毫升乙醇形成的沉淀
   6   向泳道No.5的上清液中加入20毫升乙醇形成的沉淀
   7   使泳道No.6的上清液静置过夜形成的沉淀
实施例6
将以常规方法从这些鲜茧获得的鲜茧的茧层和粗丝酶促脱胶。将茧层很好地散开。在脱胶之前用“Rahzen Power II”(商品名；Koshindo KagakuKogyosho的产品)处理茧层和粗丝。首先，在60℃下将它们中的每一个用“Rahzen Power II”水溶液(pH9.7)处理10分钟(茧层-1，粗丝-1)或者70分钟(茧层-2，粗丝-2)。然后将溶液稀释至1/2，接着加入2.5升的Alcalase和纱的量的1％量的“Rahzen Power”。在55℃下15分钟(茧层-1，粗丝-1)或者40分钟(茧层-2，粗丝-2)，在25倍浴比下进行脱胶。和实施例1一样通过电泳研究它们的丝心蛋白的降解程度。结果表明，在茧层-1中证实了没有降解的丝心蛋白的泳带，但是在其它样品中没有出现泳带。
各样品表现出23％或更大的脱胶损耗比，提示丝胶蛋白几乎被去除。
实施例7
用加压的热水(100℃或者更高)将常规方法获得的鲜茧的茧层(已经充分散开)和粗丝脱胶。将温度和时间分别设置在105℃、110℃和120℃和10分钟、30分钟和60分钟。通过电泳研究脱胶之后没有降解的丝心蛋白是否保留，没有识别到粗丝中有保留。在105℃处理10分钟(脱胶损耗比：15％)和在110℃处理10分钟(脱胶损耗比：20％)的茧层中，证实存在没有降解的丝心蛋白，但是从其它样品没有明确地证实这种存在。
在100℃或者更高下脱胶的加压热水中，温度优选设置在115℃或更低。当温度设置在110℃时，脱胶在20分钟内优选在10分钟内进行。
实施例8
将分别在实施例2-5中获得的干燥的没有降解的丝心蛋白溶解于大约80％硫氰酸锂水溶液中，接着用水渗析，从而获得没有降解的丝心蛋白的水溶液。通过将得到的溶液浇注在平板上并且烘干，获得膜。将上述膜粉碎成粉末。另一方面，通过将没有降解的丝心蛋白的水溶液空气雾化获得另一种粉末。搅拌这种没有降解的丝心蛋白的水溶液或者通过向没有降解的丝心蛋白的水溶液中加入醇而获得沉淀，接着用水洗涤，干燥和粉碎，从而获得没有降解的丝心蛋白粉末。
实施例9
将来自人皮肤的成纤维细胞接种到24-孔板上。培养24小时之后，更换培养基。分别以125微克/毫升的浓度向培养基加入三种丝心蛋白，即来自丝腺的液体丝心蛋白，在实施例4中于80℃脲水溶液中处理2小时而获得的来自鲜茧的没有降解的丝心蛋白和来自粗丝的丝心蛋白。48小时之后，加入MTT(用于测定细胞呼吸作用的氧化还原指示剂)，并且将该混合物温育4小时。将成活量与没有丝心蛋白组相比较。如图5所示，液体丝心蛋白(丝腺)和来自鲜茧的丝心蛋白(脱胶产物)表现出相同水平的增殖促进作用，但是在来自粗丝(脱胶纱)的常规丝心蛋白中没有发现促进作用。发现表1中所示实施例5的No.5、6和7中获得的丝心蛋白沉淀表现出至少可与图5的脱胶产物相比较的细胞增殖促进作用。
工业实用性
本发明使得有可能有利地生产与从液体丝可获得的产物相当的没有降解的丝心蛋白(分子量：350000-370000)。通过使用该产物，可获得用于细胞培养、伤口愈合促进剂和化妆品组合物的极好的添加剂。

Claims (7)

1.制备没有降解的丝心蛋白的方法，该方法包括使新鲜的、烘干的或煮过的茧的茧层或茧纱，粗丝，或者丝纤维，或者其残留的纱进行下面的步骤a)或b)：
a)在大气压下于沸点温度下在具有pH为10-11.5的碱性水溶液中处理2-60分钟；或者
b)用30％或更大浓度的脲水溶液在70-90℃下处理60-180分钟，从而进行脱胶。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的pH为10.5-11.5。
3.根据权利要求1的方法，其中所述步骤b)的条件为，用45％或更大浓度的脲水溶液在75-85℃下处理90-150分钟。
4.制备没有降解的丝心蛋白的方法，该方法包括将新鲜的、烘干的或煮过的茧的茧层或茧纱，粗丝，或者丝纤维，或者其残留的纱酶促脱胶，其中对所述新鲜的、烘干的或煮过的茧的茧层或茧纱，粗丝，或者丝纤维，或者其残留的纱，在pH为9-10的条件下，在10分钟内、80℃下预处理，或在60分钟内、60℃下预处理，然后用Alcalase和木瓜蛋白酶之任一进行处理，并在50-60℃下，60分钟内脱胶。
5.一种细胞增殖促进剂，其包括作为有效成分的通过权利要求1-4中任一项的制备方法获得的没有降解的丝心蛋白。
6.一种伤口愈合促进剂，其包括通过权利要求1-4中任一项的制备方法获得的没有降解的丝心蛋白。
7.一种化妆品组合物，其包括通过权利要求1-4中任一项的制备方法获得的没有降解的丝心蛋白。
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