WO2001042300A1 - Procede de production de fibroine de soie et mise en oeuvre dudit procede - Google Patents

Procede de production de fibroine de soie et mise en oeuvre dudit procede Download PDF

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Kozo Tsubouchi
Hiroo Yamada
Yoko Takasu
Hiroshi Nakao
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National Institute Of Agrobiological Sciences
Kowa Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing undegraded silk fibroin having an excellent cell growth promoting action and its application to the fields of medicine and cosmetics.
  • silk-fiber mouth-in has been studied as a wound dressing material in the form of a powder or a film because it has an action of promoting the healing of skin tissue that has been lost due to a wound or burn. No. 416, No. 8—198, 790, No. 9-1192, 210, No. 11—104, 228). In addition, silk fiber mouth-in has been applied as a cosmetic because it has such an effect.
  • An object of the present invention is to provide a naturally derived component excellent in the ability to regenerate defective skin tissue, that is, a cell growth promoting effect, and to provide the use thereof. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted various studies focusing on the conventional method for producing silk fibroin, and as a result, it has been found that silk fibroin is degraded and reduced in molecular weight in the conventional method for producing silk thread.
  • the degraded fiber mouth-in has almost no cell growth promoting effect
  • undegraded silk fiber mouth-in obtained from cocoon thread, raw silk or silk thread under specific conditions has a selectively strong cell growth-stimulating effect.
  • the present inventors have found that the use of such a composition provides a highly effective and safe wound healing promoter and cosmetics, and has completed the present invention. That is, the present invention provides an undecomposed silk fibroin obtained from a raw cocoon, a cocoon layer of a dried cocoon or a cooked cocoon, or a raw silk, a silk fabric, or a residual yarn thereof.
  • the present invention provides a method for separating a cocoon layer or a cocoon thread of a raw cocoon, a dried cocoon or a cooked cocoon, or a raw silk, a silk fabric or a residual thread thereof in a neutral salt aqueous solution, and subjecting the cocoon layer to a sedimentation sedimentation process.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing undegraded silk fiber mouth, which is characterized by being separated from sericin.
  • the present invention relates to the following a) and b) of a raw cocoon, a dried cocoon, or a cocoon layer of a boiled cocoon,
  • the present invention provides a method for producing undegraded silk fiber mouth, characterized by being obtained by scouring.
  • the present invention also provides an undecomposed silk fibroin characterized by being obtained by subjecting a cocoon layer or a cocoon thread of a raw cocoon, a dried cocoon or a cooked cocoon, or a raw silk, a silk woven fabric or a remaining thread thereof to enzyme scouring. Is provided.
  • the present invention also provides a cell growth promoter and a wound healing promoter containing the undegraded silk fiber mouth obtained by the above-mentioned production method as an active ingredient.
  • the present invention contains undegraded silk fiber mouth obtained by the above production method. To provide cosmetics. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is an electrophoretic image showing the decomposition state of silk fibroin of each material in Example 1.
  • FIG. 2 is a view showing a range in which undegraded silk fiber mouth remains in boiling water of sodium carbonate.
  • FIG. 3 is an electrophoretic image showing the decomposition state of silk fibroin by treatment with an aqueous urea solution.
  • FIG. 4 is an electrophoretic image showing the state of fractionation of silk fibroin by a fractional precipitation treatment with a neutral salt aqueous solution.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of silk fiproin on fibroblast proliferation.
  • Silkworms secrete liquid silk into the silk gland cavity of the body and are called liquid silk.
  • Liquid silk consists of silk fiber mouth and silk sericin, and liquid silk fiber mouth has a molecular weight of about 370,000 (Tasiro Yutka and Otsuki Eiichi, Jo Thigh 1 of Cell Biology, Vol. 46, PI (1970) ).
  • a silk fiber mouth with a molecular weight of about 370,000 is divided into a molecular weight of about 350,000 and 250,000 by reduction.
  • a silk fiber mouth with a molecular weight of about 350,000 or 370,000 is called an undegraded silk fiber mouth.
  • Silkworms spin liquid silk during cocoon production to make cocoons (consisting of cocoons and pupae). It is known that cocoon silk has silk fibrous mouth in the center and silk sericin around it, with an abundance ratio of 70-80 (fibrous mouth in): 20-30 (sericin).
  • Raw silk is made by collecting several to several tens of cocoons (reeling). The process of removing silk sericin from cocoon, raw silk or raw weave is called scouring, and the fibers after scouring are called silk or silk fibroin. It is not always the case that silk sericin is completely removed by scouring.
  • silk thread refers to unrefined silk fabric.
  • silk refers to fiber mouth-in alone, sericin alone, or coexistence of fiber mouth-in and sericin at the same time.
  • silk fiber mouth and fibroin and silk sericin and sericin have the same meaning.
  • Silk fibroin refers to silk fibroin film, silk fiber mouth-in powder, silk fiber mouth-in, etc.
  • the silk fiber mouth-in is a fiber obtained by scouring cocoon thread, raw silk, raw weaving, or their remaining yarn.
  • raw cocoons raw cocoons: cocoons that have not been treated for storage
  • raw silk or raw weave is refined to obtain silk yarn or silk fabric. Debris generated in these processes is called residual yarn.
  • the dry cocoon is performed by gradually lowering the raw cocoon from a temperature of 115 to 120 to a temperature of about 80 ° C over 5 to 6 hours.
  • Boiled cocoons are treated with steam and hot water at 100 to 105 ° C for about 10 minutes.
  • scouring As a conventional scouring method, there is a case of boiling and scouring in an aqueous solution containing sodium salt such as sodium carbonate and sodium hydrogencarbonate or stone (the most common method).
  • scouring may be performed by immersing in pressurized hot water (for example, hot water of 120 ⁇ ) or scouring with an enzyme.
  • pressurized hot water for example, hot water of 120 ⁇
  • scouring with an enzyme it was thought that the silk fiber mouth was not decomposed.
  • the silk fiber mouth is decomposed.
  • silk fibroin is degraded in these conventional cell culture beds and wound dressings using silk, and undecomposed silk fibroin does not remain.
  • silk fiber mouths can also be obtained from liquid silk.
  • a gel-like content liquid silk
  • a gel-like content liquid silk
  • this method requires dissection of the silkworm, removal of the silk gland from the body of the silkworm, and removal of the silk fiber mouth from the silk gland cavity.
  • the maximum amount of silk-fiber mouth-in obtained from one silkworm is about 0.4 g, and it is easy to contain impurities such as silk fluid and silk gland cells, and it takes time to obtain silk-fiber mouth-in. Therefore, it does not become an industrial production method.
  • an industrially advantageous raw cocoon, a cocoon layer or a cocoon thread of a dried or boiled cocoon, or a raw silk, a silk fabric, or a residual thread thereof is used as a material. Since silk fibroin is easily decomposed during storage, it is most desirable to use fresh raw cocoons as a raw material.
  • Raw cocoons, dried cocoons, raw silk, silk yarn and their remaining yarns are preferably stored at room temperature or lower while blocking light.However, before using, check whether undegraded silk fiber mouth is left. There is a need.
  • a neutral salt aqueous solution When a neutral salt aqueous solution is used, the above raw materials are dissolved in a neutral salt aqueous solution, and then subjected to a fractional precipitation treatment.
  • the neutral salt include lithium thiocyanate, calcium chloride, lithium bromide, and sodium thiocyanate.
  • concentration of the neutral salt varies depending on the type of the neutral salt, a saturated aqueous solution or a concentration of 50% saturation or more is preferable for any neutral salt. Particularly, a concentration of 80% saturated aqueous solution or more is preferable.
  • the saturated aqueous solution is about 80% (weight (g) Z capacity (mL)).
  • the pH of these neutral salt aqueous solutions is 5-8.
  • acetate alcohol particularly ethanol
  • ethanol for crystallizing the amorphous silk fibroin.
  • this operation for example, it is preferable to sequentially add ethanol and collect a precipitate.
  • the mild treatment conditions with an aqueous alkaline solution in step a) are conditions in which the pH, temperature and time are selected so that the silk fiber mouth does not decompose, preferably with an aqueous alkaline solution having a pH of IO to 11.5.
  • the treatment is carried out by appropriately changing the conditions within the boiling temperature range of 2 to 60 minutes under the atmospheric pressure.
  • ⁇ If ⁇ is less than 10, scouring is not sufficient, and if the pH exceeds 11.5, silk fiber mouth-in is rapidly decomposed and control becomes difficult. Also preferred The pH is between 10.5 and 11.5.
  • alkaline aqueous solution to be used examples include an aqueous solution of an alkaline sodium salt such as sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sodium silicate, sodium metasilicate, sodium phosphate, sodium hydroxide, and the like.
  • an aqueous solution of sodium carbonate is particularly preferable since it has an appropriate buffer effect.
  • the processing conditions such as pH, temperature and time during refining as appropriate, for example, by controlling the temperature above the boiling temperature (for example, 11 When treating at 0 or 120 ° C), adjust the pH to neutral or shorten the time.
  • the conditions When treating at a temperature lower than the boiling temperature, change the conditions appropriately, such as raising the pH and lengthening the time.
  • the treatment in this step a) may be such that the raw material is immersed in an aqueous alkaline solution, and may be stirred during this.
  • the mild condition using an aqueous urea solution in step b) is a condition in which the temperature and time are selected so as not to decompose the silk fiber mouth, preferably preventing the decomposition of silk fibroin, reaction efficiency and industrial operability. From the viewpoint, it is treated with an aqueous urea solution of 30% or more at 70 to 90 ° C. for 60 to 180 minutes. More preferably, it is treated with a urea aqueous solution of 45% or more at 75 to 85 ° C. for 90 to 150 minutes. Mercaptoethanol or the like may be added to the aqueous urea solution.
  • step b) The treatment in this step b) may be such that the material is immersed in an aqueous urea solution, and stirring may be performed during this.
  • Enzyme scouring is a method in which proteolytic enzymes are applied to scouring raw silk and cocoons.
  • papain was often used, but in recent years, Alcalase (Koshindo Chemical Co., Ltd.) has been used.
  • Pretreatment is necessary for enzymatic scouring with Alcalase, and the pretreatment is at pH 9 to 10 and preferably at pH 9.0 to 9.6. It is carried out within 10 minutes, preferably within 5 minutes, at 60 ° C within 60 minutes, preferably within 10 minutes.
  • alkalase is added and scouring is performed at 50 to 60 ° C.
  • the scouring time is preferably within 60 minutes, particularly preferably within 20 minutes. In this case, it is preferable to separate the cocoon layer as much as possible. Also, stirring may be performed during this time.
  • the obtained undegraded silk fibroin can be dissolved in a solution containing a solubilizing agent, and then desalted by dialysis or the like to obtain an undegraded silk fiber mouth aqueous solution.
  • the dissolving agent lithium thiocyanate, calcium chloride, lithium bromide, sodium thiocyanate, ethanol, or the like is used.
  • the undegraded silk fiber mouth-in thus obtained is referred to as a functional silk fiber mouth-in because the degraded silk fibroin shows almost no cell growth-promoting action, whereas it exhibits an excellent cell growth-stimulating action. It is useful as a culture additive (especially an additive for animal cells including humans), a wound healing promoter and a cosmetic (hereinafter also referred to as an external preparation).
  • undegraded silk fiber mouth When used as a wound healing promoter or cosmetic, undegraded silk fiber mouth (functional silk fiber mouth) is used as a gel, film, powder, etc., for external application to wounds or skin. Is preferred.
  • an undecomposed silk fiber-in-aqueous solution may be poured on a flat plate and dried.
  • the film is ground, or an aqueous solution of undecomposed silk fibroin is sprayed in the air, or the precipitate obtained by stirring the aqueous solution of undecomposed silk fibroin or adding alcohol to the aqueous solution of undecomposed silk fibroin is used. It can be washed, dried, and powdered.
  • the undegraded silk fiber mouth can be used in the form of ordinary external preparations, for example, ointments, creams, cataplasms and the like.
  • an undegraded silk fiber mouth may be mixed with a usual ointment base, a cream base, a cataplasm and the like.
  • the amount of undecomposed silk fiber mouth in these external preparations varies depending on the dosage form and the base, but is preferably 0.001 to 30%, particularly preferably 0:! To 10%.
  • a silk thread obtained by boiling in a 0.05% aqueous sodium carbonate solution (bath ratio: 50 times) at atmospheric pressure for 1 hour was used as a sample.
  • Each sample was dissolved in an aqueous solution of about 80% lithium thiocyanate (pH 7), dialyzed with a 30% aqueous urea solution, and then added with and without a 4% 2-mercaptoethanol solution.
  • Silk fiber mouth was analyzed by SDS polyacrylamide gel (2-15% gradient gel) electrophoresis. Dry cocoons, boiled cocoons, raw silk, and silk threads are in line with conventional production methods. As a result, in the case of the solution to which 2-mercaptoethanol solution was added, a band equivalent to about 350,000 of silk fiber mouth was clearly recognized in the raw cocoon. A band equivalent to about 350,000 of silk-fiber mouth-in is clearly observed in the dry cocoon, but the band is slightly thinner, and the boiled cocoon and raw silk become thinner, leaving undegraded silk-fiber mouth-in. However, it is considered that decomposed silk fiber mouths also exist. However, no band equivalent to about 350,000 of silk-five mouth-in was found in the silk thread.
  • the cocoon layer of the raw cocoon was well loosened, and the loosened cocoon layer was immersed in a boiling 0.05% aqueous sodium carbonate solution (bath ratio 50 times) under atmospheric pressure. After immersion for 5, 10, 15, 20, 30, 40, and 60 minutes, they were rinsed and dried. Each sample was dissolved and dialyzed in the same manner as in Example 1, and the degree of degradation of silk fiber mouth was analyzed by electrophoresis. As a result, as the immersion time became longer, the band corresponding to about 350,000 of the silk-fiber mouth-in gradually became thinner, and it could only be confirmed at 40 minutes. The band could not be confirmed in 60 minutes.
  • Example 2 The same test as in Example 2 was carried out while boiling under atmospheric pressure while changing the concentration of sodium carbonate and the treatment time.
  • Figure 2 shows the results.
  • the area where the undegraded silk fiber mouth remains is indicated by A (concentration of 0.012 to 1.0% for 2 to 60 minutes), preferably B (concentration of 0.02 to 0.2% at 5% in FIG. 2). ⁇ 40 minutes).
  • the cocoon layer of the raw cocoon was dissolved in an approximately 80% aqueous solution of lithium thiocyanate (pH 7) to obtain an approximately 5% silk solution.
  • pH 7 lithium thiocyanate
  • ethanol was sequentially added thereto, and the precipitated silk material was recovered.
  • Each precipitate was analyzed for silk fiber mouth by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Fig. 4 shows the results.
  • the precipitate obtained at an ethanol concentration of about 74% or less the precipitate obtained at an ethanol concentration of about 74% or more, preferably about 80% or more and 90% or less can be used as undegraded silk fiber mouth. .
  • Enzyme scouring was performed on the cocoon layer of the raw cocoon and the raw silk obtained from the raw cocoon by the conventional method.
  • the cocoon layer was loosened well.
  • the cocoon layer and raw silk were subjected to scouring pretreatment with Rasen Power II at Koshindo Chemical Industry. First, treatment was carried out at 60 ° C for 10 minutes (cocoon layer 1, raw silk-1) or 70 minutes (cocoon layer 1, raw silk-2) using an aqueous solution of Rasen Power II (pH 9.7).
  • the rate of reduction was 23% or more, and sericin was almost completely removed.
  • a temperature of 115 15 or less is good, and a temperature of 110 is performed within 20 minutes, preferably within 10 minutes.
  • the dried undegraded silk fibroin obtained in Examples 2 to 5 was dissolved in an aqueous solution of about 80% lithium thiocyanate and dialyzed against water to obtain an undegraded silk fibroin aqueous solution.
  • This liquid was poured on a flat plate and dried to obtain a film.
  • This film was pulverized into powder.
  • an undecomposed silk fiber mouth-in aqueous solution was sprayed in the air to obtain a powder.
  • the aqueous solution of the undegraded silk fiber mouth was stirred, and a precipitate was obtained by adding alcohol. The precipitate was washed with water, dried and ground to obtain undegraded silk fiber mouth mouth powder.
  • undegraded silk fiber mouth-in (molecular weight: 350,000 to 37,000) similar to that obtained from liquid silk can be industrially advantageously obtained, and by using this, excellent addition for cell culture can be achieved. Preparations, wound healing promoters and cosmetics.

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Description

明 細 書 機能性絹フイブロインの製造法とその利用 技術分野
本発明は優れた細胞増殖促進作用を有する未分解絹フイブロインの製造法及び その医薬分野、 化粧料分野への応用に関する。 背景技術
従来より、 絹フイブ口インには創傷、 火傷等により欠損した皮膚組織の治癒促 進作用があることから、 粉末状やフィルム状にして創傷被覆材として研究されて いる （特開平 1 一 2 5 4 1 6 4号、 同平 8— 1 9 8 9 7 0号、 同平 9一 1 9 2 2 1 0号、 同平 1 1— 1 0 4 2 2 8号） 。 また絹フイブ口インは、 このよ うな作用を有することから化粧料としても応用されている。
しかしながら、 これら従来の絹フィブロインを利用した創傷被覆材の治癒促進 作用は充分満足すべきものではなく、 さらに効果の優れた創傷治癒促進剤の提供 が望まれている。
本発明は、 欠損した皮膚組織の再生能力、 すなわち細胞増殖促進効果に優れた 天然由来成分の取得及びその利用を提供することを目的とする。 発明の開示
そこで本発明者らは、 従来の絹フィブロインの製造法に着目して種々検討した 結果、 従来の絹糸の生産方法では絹フィブロインは分解して低分子化しているこ とが判明した。
すなわち、 従来の絹糸生産方法である生繭一乾繭工程一煮繭工程一繰糸工程一 生糸一精練工程一絹糸においては、 生繭や乾繭の保存状態及び各工程の温度や時 間条件で程度は異なるが、 生糸の段階までにフイブロインが幾分低分子化され、 その後の精練工程では、 さらに分解して低分子化していることが発明者らによ り、 電気泳動法による分析によって始めて明らかにされた。
このように分解したフイブ口インには細胞増殖促進効果はほとんどなく、 繭 糸、 生糸又は絹糸から特定の条件下で得られる未分解絹フイブ口インには選択的 に強力な細胞増殖促進効果があり、 これを用いれば有効性が高く、 かつ安全な創 傷治癒促進剤及び化粧料が得られることを見出し、 本発明を完成するに至つた。 すなわち、 本発明は、 生繭、 乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、 あるいは生糸、 絹織物又はそれらの残糸から得られる未分解絹フイブロインを提 供するものである。
また、 本発明は、 生繭、 乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、 ある いは生糸、 絹織物又はそれらの残糸を中性塩水溶液に溶解後、 分別沈澱処理に付 し、 絹セリシンと分けることを特徴とする未分解絹フイブ口インの製造法を提供 するものである。
また、 本発明は、 生繭、 乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、 ある いは生糸、 絹織物又はそれらの残糸を次の a ) 、 b ) の工程
a ) アルカリ水溶液による温和な処理条件
b ) 尿素水溶液による温和な処理条件
に付し、 精練して得ることを特徴とする未分解絹フイブ口インの製造法を提供す るものである。
また、 本発明は、 生繭、 乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、 ある いは生糸、 絹織物又はそれらの残糸を酵素精練に付して得ることを特徴とする未 分解絹フイブロインの製造法を提供するものである。
また、 本発明は、 上記の製造法により得られる未分解絹フイブ口インを有効成 分とする細胞増殖促進剤及び創傷治癒促進剤を提供するものである。
さらに本発明は、 上記の製造法により得られる未分解絹フイブ口インを含有す る化粧料を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1における各材料の絹フイブロインの分解状態を示す電気泳動 像である。
図 2は、 炭酸ナトリウムの沸騰水中で、 未分解絹フイブ口インが残されている 範囲を示す図である。
図 3は、 尿素水溶液を用いた処理による絹フイブロインの分解状態を示す電気 泳動像である。
図 4は、 中性塩水溶液一分別沈澱処理による絹フイブロインの分画状態を示す 電気泳動像である。
図 5は、 線維芽細胞の増殖に対する絹フィプロインの作用を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
蚕は体内の絹糸腺腔に液状の絹を分泌し、 液状絹と言われている。 液状絹は絹 フイブ口インと絹セリシンから成り、 液状絹フイブ口インは分子量約 37万であ る (Tasiro Yut ka and Otsuki Ei ichi, Jo腿 1 of Cell Biology, Vol. 46, PI (1970)) 。 分子量約 37万の絹フイブ口インは還元により分子量約 35万と 2. 5万に分かれるが、 ここでは分子量約 35万又は 37万の絹フイブ口インを 未分解絹フイブ口インと言う。
蚕は営繭時に液状絹を吐糸して繭 （繭糸と蛹で構成） を作る。 繭糸には中心部 に絹フイブ口イン、 周囲に絹セリシンが存在し、 存在比は 70〜80 (フイブ口 イン） ： 20〜30 (セリシン） であることが知られている。 生糸は繭糸を数本 から数 10本集合 （繰糸） して作られる。 繭糸、 生糸又は生織から絹セリシンを 除去する工程を精練といい、 精練後の繊維を絹糸又は絹糸フィブロインと言う。 精練によつて絹セリシンを完全に除去すると限らない。 5分練りや 7分練りとい つて、 セリシンの半分又は 7 0 %程度を除去することもあるが、 この場合も精練 工程を経ているので絹糸という。 生織とは未精練の絹織物を言う。 一般に、 絹は フイブ口イン単独、 セリシン単独、 又はフイブ口インとセリシンが同時に存在す るものを言い、 フイブ口イン、 セリシンのいずれに対しても、 またフィルム、 粉 末、 繊維等のいずれの形態に対しても絹と言う。 従って、 絹フイブ口インとフィ ブロイン及び絹セリシンとセリシンは同じ意味である。 絹フィブロインは絹フィ プロインフィルム、 絹フイブ口イン粉末、 絹糸フイブ口イン等を言う力 このう ちの絹糸フイブ口インは繭糸、 生糸、 生織又はそれらの残糸を精練して得られた 繊維を言う。
従来の絹糸の製造法は、 まず、 養蚕農家で生産された生繭 （生繭：貯蔵のため 処理をしていない繭） を乾繭、 煮繭、 繰糸して生糸とし、 生織を作る。 次いでこ の生糸又は生織の精練を行い、 絹糸また絹織物とする。 また、 これらの工程で生 じる屑を残糸という。 乾繭は生繭を 1 1 5〜1 2 0 の温度から 5〜6時間かけ て 8 0 °C程度の温度に徐々に下げて行う。 煮繭では 1 0 0〜1 0 5 °Cの水蒸気及 び熱水で 1 0分間程度処理される。 従来の精練方法としては、 炭酸ナトリウム、 炭酸水素ナトリゥム等のアル力リ性ナトリゥム塩や石鹼を含む水溶液中で煮沸し 精練する場合 （最も一般的な方法） がある。 その他に加圧熱水 （例えば 1 2 0 ^ の熱水） に浸漬して精練する場合、 酵素で精練する場合等がある。 このような従 来の絹糸生産工程では、 絹糸フイブ口インは分解されていないと考えられてい た。 ところが、 本発明者らの研究によれば、 このような従来の絹糸の生産方法で は、 絹フイブ口インは分解していることが分かった。 つまり、 これら従来の絹糸 を素材とした細胞培養床や創傷被覆剤では絹フイブロインは分解しており、 未分 解の絹フイブロインは残っていない。
一方、 絹フイブ口インは液状絹からも得ることができる。 例えば、 蚕の絹糸腺 の中部及び後部糸腺からゲル状の内容物 （液状絹） を取り出し、 水溶液等で洗浄 することにより付着している少量の絹セリシンを除く方法で、 未分解の絹フイブ 口インを得ることができる。 しかし、 この方法は蚕を解剖して蚕体内から絹糸腺 を取り出し、 さらに絹糸腺腔から絹フイブ口インを取り出さなければならない。 蚕 1頭から得られる絹フイブ口インは最大で 0 . 4 g程度であり、 蚕体液や絹糸 腺細胞等の不純物を含みやすいこと、 及び絹フイブ口インを得るのに手間がかか ること等により、 工業的な生産方法にはならない。
本発明においては工業的に有利な生繭、 乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしく は繭糸を、 あるいは生糸、 絹織物又はそれらの残糸を材料として用いる。 絹フィ ブロインは保存中に分解しやすいので、 新鮮な生繭を原料とするのが最も望まし い。 生繭、 乾繭、 生糸、 絹糸及びそれらの残糸の保存は室温以下の温度で光を遮 断することが好ましいが、 使用する前に未分解絹フイブ口インが残されているか どうかを調べておく必要がある。
中性塩水溶液を用いる場合は、 上記原料を中性塩水溶液に溶解後、 分別沈澱処 理する。 中性塩としては、 チォシアン酸リチウム、 塩化カルシウム、 臭化リチウ ム、 チォシアン酸ナトリウム等が挙げられる。 当該中性塩の濃度は中性塩の種類 によって異なるが、 いずれの中性塩においても飽和水溶液又は 5 0 %飽和以上の 濃度が好ましい。 特に 8 0 %飽和水溶液以上の濃度が好ましい。 チォシアン酸リ チウムの場合飽和水溶液は約 8 0 % (重量 （g ) Z容量 （mL) ) である。 以下単 に％で示す。 なお、 これらの中性塩水溶液の pHは 5〜 8である。
原料が溶解した後の分別沈澱には非結晶絹フイブロインを結晶化させるァセト ンゃアルコール、 特にエタノールを用いるのが好ましい。 この操作は、 例えばェ 夕ノールを順次添加して沈澱物を採取するのが好ましい。
工程 a ) におけるアルカリ水溶液による温和な処理条件とは、 絹フイブ口イン が分解しないように pH、 温度及び時間を選択した条件であり、 好ましくは pH I O 〜 1 1 . 5のアル力リ水溶液で、 大気圧下の沸縢温度、 2〜 6 0分の範囲で条件 を適宜変えて処理する。 ί)Ηが 1 0未満では精練が充分でなく、 pHが 1 1 . 5を超 えると絹フイブ口インの分解が速く、 コントロールが困難となる。 また好ましい pHは 1 0 . 5〜1 1 . 5である。 用いるアルカリ水溶液としては、 炭酸ナトリウ ム、 炭酸水素ナトリウム、 ケィ酸ナトリウム、 メタケイ酸ナトリウム、 リン酸ナ トリゥム、 水酸化ナ卜リゥム等のアル力リ性ナトリゥム塩の水溶液が挙げられ、 アル力リ精練の場合、 炭酸ナトリゥム水溶液は適度なバッファー効果があるた め、 特に好ましい。
絹を分解することなく精練し、 未分解絹フィブロインを得るには精練時の pH、 温度、 時間等の処理条件を適宜変化させてコントロールすればよく、 例えば沸縢 温度以上の温度 （例えば 1 1 0 や 1 2 0 °C) で処理するときは、 pHを中性寄り に、 又は時間を短くする。 沸騰温度以下の温度で処理するときは pHを高く、 時間 を長くする等適宜条件を変える。 さらに、 炭酸ナトリウムの他のナトリウム塩を 使う時も炭酸ナトリウムに合わせ、 適宜条件を変えることは言うまでもない。 こ の工程 a ) における処理とは、 前記原料がアルカリ水溶液中に浸漬されていれば よく、 この間攪拌してもよい。
工程 b ) における尿素水溶液による温和な条件とは、 絹フイブ口インが分解し ないように温度及び時間を選択した条件であり、 好ましくは絹フイブロインの分 解防止、 反応効率及び工業的操作性の点から、 3 0 %以上の尿素水溶液で 7 0〜 9 0 °C、 6 0〜 1 8 0分処理する。 より好ましくは 4 5 %以上の尿素水溶液で 7 5〜8 5 °C、 9 0〜 1 5 0分処理される。 尿素水溶液には、 メルカプトエタノ 一ル等を加えてもよい。
尿素精練における温度、 濃度、 時間についても工程 a ) と同様に適宜条件を組 み合わせ得ることは言うまでもない。 この工程 b ) における処理とは、 前記材料 が尿素水溶液に浸漬されていればよく、 この間攪拌してもよい。
酵素精練はタンパク質分解酵素を生糸や生繭の精練に応用した方法である。 従 来はパパインがよく利用されていたが、 近年はアルカラーゼ （幸新堂化学工業 所） が使われている。 アルカラーゼによる酵素精練では前処理が必要で、 前処理 は pH 9〜l 0、 好ましくは pH 9 . 0〜9 . 6において、 処理時間は 8 0 °Cでは 1 0分以内、 好ましくは 5分以内、 6 0 °Cでは 6 0分以内、 好ましくは 1 0分以 内で行う。 その後、 本処理としてアルカラ一ゼを添加して 5 0〜6 0 °Cで精練す る。 精練時間は 6 0分以内、 特に 2 0分以内が好ましい。 この場合、 繭層をでき るだけ分繊することが好ましい。 また、 この間攪拌してもよい。
中性塩水溶液を用いて得られた分別沈澱物 （未分解絹フイブ口イン） 、 及びェ 程 a ) 、 b ) により得られた未分解絹フイブ口イン、 及び加圧熱水や酵素精練に よって得られた未分解絹フィブロインは溶解剤を含む溶液に溶解させた後、 透析 等により脱塩を行い、 未分解絹フイブ口イン水溶液とすることができる。 ここで 溶解剤としてはチオシアン酸リチウム、 塩化カルシウム、 臭化リチウム、 チオシ ァン酸ナトリゥム等及びエタノール等が用いられる。
かくして得られる未分解絹フイブ口インは、 分解絹フイブロインが細胞増殖促 進作用をほとんど示さないのに対し、 優れた細胞増殖促進作用を示すので、 機能 性絹フイブ口インといい、 種々の細胞培養添加剤 （特に、 ヒトを含む動物細胞用 添加剤） 、 創傷治癒促進剤や化粧料 （以下、 あわせて外用剤ということもある） として有用である。
創傷治癒促進剤又は化粧料として用いる場合には、 未分解絹フイブ口イン （機 能性絹フイブ口イン） をハイド口ゲル、 フィルム、 粉末等にして創傷部又は皮膚 に適用する外用剤として用いるのが好ましい。 フィルム状にするには、 未分解絹 フイブ口イン水溶液を平板上に流し、 乾燥すればよい。 また粉末にするにはこの フィルムを粉碎、 又は未分解絹フイブ口イン水溶液を空中噴霧、 又は未分解絹フ ィブロイン水溶液を攪拌や未分解絹フィブロイン水溶液にアルコール添加等によ り得た沈澱物を、 水洗、 乾燥、 粉枠すればよい。
一方、 未分解絹フイブ口インは、 通常の外用剤、 例えば軟膏剤、 クリーム剤、 パップ剤等の形態で用いることもできる。 かかる軟膏剤、 クリーム剤、 パップ剤 等にするには、 通常の軟膏基剤、 クリーム基剤、 パップ基剤等に未分解絹フイブ 口インを配合すればよい。 これら外用剤への未分解絹フイブ口インの配合量は、 剤型、 基剤によって異な るが、 0 . 0 0 1〜3 0 %、 特に 0 . ：!〜 1 0 %が好ましい。 実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する力 本発明はこれに何ら限定 されるものではない。
実施例 1 (絹糸生産工程における絹フイブロインの分解の確認）
営繭後 1ヶ月以内の生繭を用い、 生繭の繭層、 乾繭後の繭層、 煮繭 （繭検定用 煮繭機による標準煮繭） 後の繭層、 生糸、 及び生糸を 5 0倍重量 （浴比 5 0倍） の 0 . 0 5 %炭酸ナトリゥム水溶液中で 1時間大気圧で煮沸して得た絹糸を試料 とした。 各試料を約 8 0 %のチオシアン酸リチウム （pH 7 ) 水溶液に溶解し、 3 0 %尿素水溶液で透析し、 次いで 4 % 2—メルカプトエタノール溶液を添加し た溶液と添加しなかった溶液について、 S D Sポリアクリルアミドゲル （2 _ 1 5 %グラジェントゲル） 電気泳動で絹フイブ口インを分析した。 乾繭、 煮繭、 生糸、 絹糸は従来の生産方法にそった方法である。 その結果、 2—メルカプトェ 夕ノール溶液を添加した溶液の場合、 絹フイブ口インの約 3 5万に相当するバン ドは生繭には明確に認められた。 乾繭にも絹フイブ口インの約 3 5万に相当する バンドは明確に認めらるが、 バンドは少し薄く、 煮繭、 生糸ではさらに薄くな り、 未分解絹フイブ口インは残されているが、 分解された絹フイブ口インも存在 すると考えられる。 ところ力 絹糸には絹フイブ口インの約 3 5万に相当するバ ンドは認められなかった。 一方、 2—メルカプトエタノール溶液を添加しなかつ た溶液の場合、 絹フイブ口インの約 3 7万に相当するバンドは生繭、 乾繭、 煮繭 の繭層及び生糸には現れ、 絹糸には確認できなかった。 このことから、 未分解絹 フイブ口インの確認を電気泳動で行う場合、 約 3 5万又は約 3 7万のどちらのバ ンドを用いても同じ結果となる。 未分解絹フイブ口インを得るには生繭を利用す ることが好ましいが、 乾繭、 煮繭、 生糸を用いてもよい （図 1参照） 。 実施例 2
生繭の繭層をよくほぐし、 ほぐした繭層を大気圧下で沸騰中の 0. 05%炭酸 ナトリウム水溶液 （浴比 50倍） 中に浸漬した。 浸漬時間 5, 10， 15， 20， 30， 40， 60分について、 浸漬処理後、 水洗乾燥した。 それぞれの試 料は実施例 1と同様に溶解、 透析後に、 絹フイブ口インの分解程度を電気泳動で 分析した。 その結果、 浸漬時間が長くなるに従って、 絹フイブ口インの約 35万 に相当するバンドは徐々に薄くなり、 40分ではようやく確認できる程度であつ た。 60分ではバンドを確認できなかった。 一方、 繭層を炭酸ナトリウム水溶液 中に浸漬する前後の重量測定から、 重量減少は 5分で 21. 5%、 10分で 24. 5%、 60分で 25. 1 %であり、 約 10分で絹セリシンはほとんど除去 されていた。 絹セリシンの除去はほぐし方の程度、 浴比の程度に影響される。 実施例 3
実施例 2と同様の試験を炭酸ナトリゥムの濃度と処理時間を変え、 大気圧下の 沸騰中で行った。 その結果を図 2に示す。 未分解絹フイブ口インが残されている 範囲は図 2の A (濃度 0. 012〜1. 0%で2〜60分） 、 好ましくは B (濃 度 0. 02〜0. 2 %で 5〜 40分） の部分である。
実施例 4
生繭 5 Omgを 48%尿素、 4% 2—メルカプトエタノール溶液に浸漬後、 種々 の温度 （40， 50, 60, 70, 80， 90 °C) で 2時間処理した。 水洗後、 約 80%チォシアン酸リチウム溶液に溶解し、 脱塩後、 SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を行った。 その結果 （図 3) 、 処理温度 70 以下ではセリシン が充分除去できず、 また、 90 °Cでは絹フィブロインが分解しやすいことが認め られた。 80 °Cでは絹フィブロインが分解せず、 絹セリシンは除去できることが 認められた。
実施例 5
生繭の繭層を約 80 %のチオシアン酸リチウム （pH7) 水溶液に溶解し、 約 5%の絹溶液を得た。 これに表 1のようにエタノールを順次加え、 沈澱した絹物 質を回収した。 それぞれの沈澱物について、 SDSポリアクリルアミドゲル電気 泳動で絹フイブ口インを分析した。 その結果を図 4に示す。 表 1の No. 5， 6， 7で得られる沈澱物には絹フイブ口インの約 35万に相当するバンドが見ら れる。 従って、 約 74%のエタノール濃度以下で得られる沈澱物を除き、 約 74%以上、 好ましくは約 80%以上 90 %以下のエタノール濃度で得られる沈 澱物を未分解絹フイブ口インとして利用できる。
Lane
処 理 方 法
No.
1 上清 5 OmLにェタノール 8 OmLを加えたとき生じた沈澱
2 その上清にエタノール 2 OmLを加えたとき生じた沈澱
3 その上清にエタノール 2 OmLを加えたとき生じた沈澱
4 その上清にエタノール 2 OmLを加えたとき生じた沈澱
5 その上清にエタノール 6 OmLを加えたとき生じた沈澱
6 その上清にエタノー -ル 2 OmLを加えたとき生じた沈澱
7 その上清を一夜放置したとき生じた沈澱 実施例 6
生繭の繭層及びこの生繭から従来の方法で得た生糸について酵素精練を行つ た。 繭層はよくほぐれた。 繭層と生糸は幸新堂化学工業所のラーゼンパワー IIで 精練の前処理をした。 まず、 ラーゼンパワー II水溶液 （pH9. 7) を用い 60°C で 10分 （繭層一 1、 生糸— 1) 又は 70分 （繭層一 2、 生糸— 2) 間処理し た。 次いで、 この液を 1Z2に薄め、 アルカラーゼ 2. 5 Lとラ一ゼンパワーを 糸量の 1%添加し、 55 °Cで 1 5分 （繭層— 1、 生糸一 1) 又は 40分 （繭層一 2、 生糸一 2) 間、 浴比 25倍で精練した。 これらの絹フイブ口インの分解の程 度を実施例 1と同様に電気泳動で調べた。 その結果、 繭層一 1には未分解絹フィ ブロインのバンドが確認できたが、 その他は明確ではなかった。
練減率はいずれも 23%以上で、 セリシンはほとんど除去されていた。
実施例 7
生繭の繭層 （よくほぐしてある） と従来の方法で得た生糸について、 加圧熱水
(100で以上） 精練した。 温度は 105°c、 11 o , 120 で時間を 1 o 分、 30分、 60分と変えた。 精練後に未分解絹フイブ口インが残されているか を、 電気泳動で調べたところ、 生糸には確認できなかった。 繭層には、 温度が
1 0 5 °C、 1 0分 （練減率 1 5 % ) と 1 1 0 ：、 1 0分 （練減率 20%) の処理については、 未分解絹フイブ口インを確認できたが、 その他は明 確に確認できなかった。
100 以上の加圧熱水精練では、 1 15^以下の温度がよく、 1 10ででは 20分以内、 好ましくは 10分以内で行う。
実施例 8
実施例 2〜 5で得られた未分解絹フィブロイン乾燥物を約 80 %チォシアン酸 リチウム水溶液に溶解後水に透析して未分解絹フィブロイン水溶液を得た。 この 液を平板上に流し、 乾燥してフィルムを得た。 また、 このフィルムを粉砕して粉 末とした。 一方、 未分解絹フイブ口イン水溶液を空中噴霧して粉末を得た。 ま た、 この未分解絹フイブ口イン水溶液を攪拌、 またアルコール添加により沈澱物 を得た後、 これを水洗、 乾燥、 粉碎により未分解絹フイブ口イン粉末とした。 実施例 9
ヒト皮膚由来の線維芽細胞を 24穴プレートに播種し、 24時間培養したのち 培養液を交換し、 絹糸腺液状絹フイブ口イン、 実施例 4において、 80°C尿素溶 液中で 2時間処理して得られた未分解生繭由来未分解絹フイブロイン及び生糸由 来絹フイブロインの 3種をそれぞれ 1 2 5 g ZmLの濃度で細胞培養液に添加し た。 その 4 8時間後にM T T (細胞の呼吸を測る酸化還元指示薬） を添加し、 4 時間インキュベートして、 細胞数を絹フイブ口イン無添加群と比較した。 図 5に 示すように、 液状絹フイブ口イン （絹糸腺） 及び生繭由来絹フイブ口イン （精製 品） では同程度の細胞増殖促進作用が認められたが、 従来の生糸由来絹フイブ口 イン （精練糸） では促進作用が認められなかった。 また、 実施例 5、 表 1の N o . 5、 6、 7で得られた絹フイブ口イン沈澱物には、 図 5の精製品と同程度 かそれ以上の細胞増殖促進作用が認められた。 産業上の利用分野
本発明によれば液状絹から得られるものと同様の未分解絹フイブ口イン （分子 量 3 5万〜 3 7万） が工業的に有利に得られ、 これを用いれば優れた細胞培養用 添加剤、 創傷治癒促進剤、 化粧料が得られる。

Claims

請求の範囲
1 . 生繭、 乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、 あるいは生糸、 絹 織物又はそれらの残糸を精練に付して得られる未分解絹フイブ口イン。
2 . 生繭、 乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、 あるいは生糸、 絹 織物又はそれらの残糸を中性塩水溶液に溶解後、 分別沈殿処理に付し、 絹セリシ ンと分けることを特徴とする未分解絹フイブ口インの製造法。
3 . 生繭、 乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、 あるいは生糸、 絹 織物又はそれらの残糸を次の a ) 又は b ) の工程
a ) アルカリ水溶液による温和な処理条件
b ) 尿素水溶液による温和な処理条件
に付し、 精練して得ることを特徴とする未分解絹フイブ口インの製造法。
4 . 生繭、 乾繭もくしは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、 あるいは生糸絹織 物又はそれらの残糸を酵素精練に付して得られることを特徴とする未分解絹フィ プロインの製造法。
5 . 請求項 2、 3又は 4の製造法により得られる未分解絹フイブ口インを有効 成分とする細胞増殖促進剤。
6 . 請求項 2、 3又は 4の製造法により得られる未分解絹フイブ口インを含有 する創傷治癒促進剤。
7 . 請求項 2、 3又は 4の製造法により得られる未分解絹フイブ口インを含有 する化粧料。
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