CN1189177C - 甲壳低聚糖硫酸酯和/或壳聚糖硫酸酯作为制备降血糖药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种甲壳低聚糖硫酸酯和/或壳聚糖硫酸酯作为制备降血糖药物中的应用。该防治糖尿病的药物化合物，其包括：甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)和/或壳聚糖硫酸酯(CSB)。两该化合物的典型结构式为：见右式，其中n为聚合度：3～600，R1为SO3Na或H，R2为SO3Na或H或Ac，R1与R2同为H或Ac者除外；该化合物的活性基团——硫酸酯基(OSO3 -)的含量为40.73～42.21%；其中，淡黄色棉花状的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)分子量为1～6KD，淡黄色棉花状的壳聚糖硫酸酯(CSB)分子量为30～100KD。该药物化合物在抗血糖、调血脂、增强免疫力、抗凝血等方面显示出的活性，受活性基团硫酸酯基及其分子量影响。其制备方法属均相反应，简单易行，操作成本低，污染少，原料利用率高。
Description
(一)技术领域
本发明涉及海洋药物的研究与开发，具体讲是一种防治糖尿病的药物化合物——甲壳低聚糖硫酸酯和/或壳聚糖硫酸酯作为制备降血糖药物中的应用，其属于海洋生物技术领域。
(二)背景技术
众所周知，高血糖是糖尿病的一个重要特征。糖尿病是一种常见的内分泌代谢紊乱性疾病，其是由于胰岛素分泌绝对或相对不足引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，出现持续性的高血糖状态。糖尿病的久病者常伴发动脉硬化，心血管，肾脏，眼病及神经系统等慢性并发症，严重者威胁生命，其发病率高，并发症多，严重影响人们的身体健康。全世界有糖尿病患者1.25亿人，我国的糖尿病患者已达4000万人，并还有上升趋势，世界卫生组织将糖尿病列为世界三大疑难病之一。
当前临床上常用于治疗糖尿病的降糖药物主要有两种，一种是磺脲类，一种是双胍类。其中，磺脲类药物主要是通过刺激胰岛素分泌，从而降低血糖水平。有一种消渴丸药物，就是目前市场上常用的治疗糖尿病的药物，其主药成分优降糖属磺脲类降血糖药。比法国施维雅药厂生产的第二代药达美康，其降糖作用高，具有剂量小、作用快、疗效高、持续时间长、副作用轻等优点。但是，这种药物在人体内有蓄积作用，这就增加了肝、肾等内脏器官的负荷，尤其对老年人和肝、肾功能不全者，更是不适应的，此外还易发生低血糖。
鉴于糖尿病对人体健康的危害极大，而目前市场上尚无十分理想的治疗糖尿病的药物，人们一直在努力以寻求治疗糖尿病的最佳途径。经过研究发现壳聚糖具有一定的降血糖作用，推测其作用机理在于壳聚糖能刺激胰岛β细胞合成、分泌及释放胰岛素，并降低胰岛α细胞分泌胰高血糖素，同时作用于肝脏，抑制肝糖元异生和体内糖分的吸收，减少糖输出，并增强周围组织对糖的利用而降低血糖，还可能会增加胰岛素受体和葡萄糖受体，提高胰岛素敏感性，加强生物活性，使受体后的抵抗减弱，抑制细胞内氧化酶系统而致组织缺氧，增强葡萄糖代谢，加速其利用，从而降低血糖。
众所周知，壳聚糖是自然界大量存在的一类天然生物多糖，无毒，具有很多生物活性，如抗肿瘤、增强免疫力等，但壳聚糖不溶于水的性质限制了它的应用。现有技术中对壳聚糖硫酸酯(CSB)研究的主要内容有：壳聚糖硫酸酯含硫量较低，硫酸酯基含量小于33％。因壳聚糖不溶于水，很多人用非均相反应，这就造成壳聚糖利用率很低。现又有人研究，用均相反应，但其所使用的酸溶剂为二氯乙酸。此酸溶剂价格高(94元/500ml)，虽然可增加壳聚糖的利用率，但总成本未见起色。还有人，在N2气氛下反应2～8h制备壳聚糖硫酸酯，其方可使壳聚糖硫酸酯的含硫酸酯基量仅达到32.7％；还有人主要研究壳聚糖硫酸酯的抗凝血活性，抗艾滋病方面应用，而对其降血糖方面功效，还未见报道。
(三)发明内容
本发明的目的是要提供一种降血糖的海洋药材，即一种防治糖尿病的药物化合物——甲壳低聚糖硫酸酯和/或壳聚糖硫酸酯作为制备降血糖药物中的应用。由于研究发现，壳聚糖经磺化后所得聚糖硫酸酯(CSA、CSB)衍生物，具有与肝素类似的结构，并具有强聚阴离子性质，因而引起了广大学者的关注。因此对壳聚糖进行化学改性和修饰，以扩大其应用范围，已成为当今的热门。本发明的防治糖尿病的药物化合物具有与肝素类似结构和强聚阴离子性质，已研究其除了具有抗凝、抗栓和抗病毒等作用外，且对人体无毒副作用，有望在深层次研究而被开发利用，为人类造福。
本发明的任务是有以下技术方案完成的，研制了一种防治糖尿病的药物化合物——甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)和/或壳聚糖硫酸酯(CSB)作为制备降血糖药物中的应用。两该聚糖硫酸酯(CSA、CSB)可以有效量的组分与药用载体和/或赋形剂，制成口服液，气雾剂。
所述的两该聚糖硫酸酯(CSA、CSB)还可用0.5％羧甲基纤维素钠溶液配成所需浓度混悬液。
两该聚糖硫酸酯(CSA、CSB)化合物的典型结构式为：
其中n为聚合度：3～600，R1为SO3Na或H，R2为SO3Na或H或Ac，R1与R2同为H或Ac者除外；该化合物的活性基团——硫酸酯基(OSO3 -)的含量为40.73～42.21％；其中，淡黄色棉花状的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)分子量为1～6KD，淡黄色棉花状的壳聚糖硫酸酯(CSB)分子量为30～100KD。
所述的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)，其聚合度：3～15；所述的壳聚糖硫酸酯(CSB)，其聚合度：100～600。
所述防治糖尿病药物的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的制备步骤如下：
(1)酯化试剂的制备：一定量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)置与三口瓶中，经冰盐浴冷却后，搅拌下缓慢滴加适量氯磺酸，始终保持反应体系温度小于5℃；
(2)称取定量的壳聚糖原料；
(3)加适量的2％乙酸溶液，将原料充分溶解；
(4)将上述充分溶解的原料，放于微波炉中反应数分钟；
(5)将上述加热反应的原料，用2N的NaOH溶液中和至中性，再放置一段时间；
(6)将中和至中性的上述料液进行抽滤；
(7)取滤饼进行烘干，所得的淡黄色固体物质；再粉碎烘干的该物质，测其分子量，该物质即为较低分子量的甲壳低聚糖；
(8)取适量上述粉碎烘干的产物，加入适量甲酰胺溶剂；
(9)将上述混合物，搅拌均匀后，加入适量甲酸或二氯乙酸，混合均匀后；
(10)再加入一定量磺化剂DMF·SO3，搅拌均匀后；
(11)再在40～60℃温度下，搅拌反应1～2h；
(12)将上述反应液再加入3倍体积的95％乙醇，当出现大量白色絮状沉淀时，放置4℃冷藏柜中沉化30min，得到的沉淀物即是甲壳低聚糖硫酸酯的粗产品；
(13)将上述沉淀物进行抽滤，取滤饼；
(14)将上述滤饼再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；
(15)将上述溶液用透析袋进行透析，除盐后取透析液；或使用超滤方法除盐，取截留溶液；
(16)再将上述溶液，浓缩至1/10体积；
(17)将上述浓缩液放于冰柜中冻结，然后冷冻干燥得淡黄色棉花状物质；
(18)粉碎该棉花状物质，测定其含硫量及分子量，取符合规定的低分子量1～6KD的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)作为防治糖尿病的药物。
本发明的防治糖尿病药物制备方法的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的制备步骤中所述的(1)中的DMF与氯磺酸的体积比为10～5∶1；所述的(3)中的2％乙酸溶液的量与(2)中壳聚糖的体积重量比为：6～30∶1(V/W)；所述的(4)在微波炉中反应到100℃，反应时间：3～6min；所述的(7)中的淡黄色固体物质的分子量为9.21×103～3.86×104道尔顿；所述的(8)中取适量烘干产物与适量甲酰胺溶剂的体积重量比为：15～50∶1(V/W)；所述的(9)中加入88％的浓甲酸量与(8)中的混合物的体积比为：1∶3～10(V/V)；所述的(10)中加入磺化剂DMF·SO3的量为50～100ml；所述的(11)中的搅拌反应，是在大气气氛下常压反应的；所述的(1 5)中的透析袋是用1和8KD的两种膜包，所截取透析液是截留1～6KD分子量大小的产物。
所述防治糖尿病的药物的壳聚糖硫酸酯(CSB)的制备步骤如下：
(1)酯化试剂的制备：一定量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)置与三口瓶中，经冰盐浴冷却后，搅拌下缓慢滴加适量氯磺酸，始终保持反应体系温度小于5℃；
(2)取适量壳聚糖原料，加入适量甲酰胺溶剂；
(3)将上述混合物，搅拌均匀后，加入适量甲酸或二氯乙酸，混合均匀后；
(4)再加入一定量磺化剂DMF·SO3，搅拌均匀后；在40～60℃温度下，搅拌反应1～2h；
(5)将上述反应液再加入3倍体积的95％乙醇，当出现大量白色絮状沉淀时，放置4℃冷藏柜中沉化30min，得到的沉淀物即是壳聚糖硫酸酯的粗产品；
(6)将上述沉淀物进行抽滤，取滤饼；
(7)将上述滤饼再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；
(8)将上述溶液用透析袋进行透析，除盐后取透析液；或使用超滤方法除盐取截留溶液；
(9)再将上述溶液，浓缩至1/10体积；
(10)将上述浓缩液放于冰柜中冻结，然后冷冻干燥得淡黄色棉花状物质——壳聚糖硫酸酯(CSB)；
(11)粉碎该棉花状物质，测定其含硫量及分子量，取符合规定分子量30～100KD的壳聚糖硫酸酯(CSB)作为防治糖尿病的药物。
本发明的防治糖尿病药物的制备方法中的壳聚糖硫酸酯(CSB)的制备步骤中，所述的(1)中DMF与氯磺酸的体积比为10～5∶1；所述的(2)中的取适量壳聚糖原料的量与适量甲酰胺溶剂的比为15～50∶1(V/W)；所述的(3)中加入88％浓甲酸量为3～10ml；所述的(4)中加入磺化剂DMF·SO3的量为50～100ml其中的搅拌反应是在大气气氛下常压反应的；所述的(8)中所用的透析袋是用截留分子量最低限为1.2KD的透析袋，进行透析脱盐。
本发明的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)和/或壳聚糖硫酸酯(CSB)作为制备降血糖海洋药物的应用是本发明的重要保护范围。
所述的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)和/或壳聚糖硫酸酯(CSB)可以有效量的组分与药用载体和/或赋形剂，制成口服液，气雾剂。
所述的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)和/或壳聚糖硫酸酯(CSB)还可用0.5％羧甲基纤维素钠溶液配成所需浓度混悬液。
本发明的防治糖尿病的药物化合物，其包括：甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)和/或壳聚糖硫酸酯(CSB)，这两种防治糖尿病药物的试验积极效果如下：
(A)甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的毒理学试验：
1.实验动物
实验动物：昆明种小鼠，体重18-22克，雌雄各半，由山东省新药药理研究中心实验动物室提供，合格证号：970102
饲养条件：室温18-22℃，小鼠每笼5只，自由摄水摄食，饲料为颗粒鼠料，由山东省新药药理研究中心实验动物室提供。
试验方法：预试验表明，本品毒性较低，难以测出LD50，故进行其小鼠一日内最大耐受量测定。
2.给药方式
2.1 i.g给药：样品甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)溶液配制25g/100ml，给药量0.4ml/10g，取健康昆明种小鼠20只，雌雄各半，试验前12小时禁食不禁水，第二日按0.4ml/10g体重i.g CSA混悬液，于8:00am ig一次，药后立即观察动物反应情况，并记录动物行为活动、呼吸、精神状态、大小便性状及颜色、被毛、鼻、眼、口腔分泌物和死亡情况，连续观察7天。
2.2 i.p给药：选择样品CSA，配制溶液浓度12.5g/100ml，给药量0.2ml/10g，取健康昆明种小鼠20只，雌雄各半，试验前12小时禁食不禁水，第二日按0.2ml/10g体重i.p混悬液，于8∶00am i.p一次，药后立即观察动物反应情况，并记录动物行为活动、呼吸、精神状态、大小便性状及颜色、被毛、鼻、眼、口腔分泌物和死亡情况，连续观察7天。
3实验结果
3.1.CSA.ig给药后小鼠行为活动、呼吸、精神状态、大小便性状及颜色、被毛、鼻、眼、口腔等均未见明显异常，连续观察7天未见明显变化，第7天处死并剖检部分小鼠，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器均无肉眼可见异常。表明CSA小鼠ig给药的一日最大耐受量大于10g/kg，本品一次用药无明显毒性作用。
3.2.CSA i.p给药后小鼠活动立即增加，十分钟后动物逐渐出现扭体，活动减少，一小时后扭体症状消失，动物开始出现俯卧，闭目不动，直至药物后八小时仍少动，药后第二天动物恢复正常。连续观察7天未见明显变化，第7天处死并剖检部分小鼠，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器均无肉眼可见异常。表明CSA小鼠i.p给药的一日最大耐受量大于2.5g/kg，本品一次用药无明显毒性作用。
该样品的原料壳聚糖天然无毒，具有生物相容性并在体内降解，经磺化引入SO4 2-，结构类似肝素，与其它含SO4 2-的天然多糖一样，其毒副作用小。经过我们的实验证明CSA毒副作用小，可见甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)作为新药开发是可行的。
(B)壳聚糖硫酸酯(CSB)(CSB)的降血糖试验1：
1.实验动物：昆明种小鼠，体重24-28克，雌雄各半，由山东省新药药理研究中心实验动物室提供，合格证号：970102
2.主要药品试剂及设备
淡黄色粉末CSA用0.5％羧甲基纤维素钠溶液配成所需浓度混悬液。Lab-500型全自动生化分析法，由南京桃园应用生物技术有限公司生产。血糖试剂盒(葡萄糖氧化酶法)，由北京中生生物工程高技术公司生产，批号981129。
3.试验分组及高血糖症造型
取小鼠6组，各组小鼠经尾静脉注射四氧嘧啶70mg/kg造成高血糖模型，72h后测定空腹血糖水平。结果表明，四氧嘧啶可造成小鼠血糖显著升高。然后分别给药igCSA、CSB 300mg/kg和1000mg/kg，阳性对照组消渴丸组1250mg/kg，阴性对照组给等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液。分别与给药后2、4、6、12和24h测定血糖水平，甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)能明显抑制四氧嘧啶所致小鼠血糖升高，见表1：
表1：壳低聚糖硫酸酯对四氧嘧啶所致小鼠高血糖的影响：
| 组 别 | 剂量(mg/kg) | 血糖(mmol/L)(h) | |||||
| 0 | 2 | 4 | 6 | 12 | 24 | ||
| 四氧嘧啶组 | 70 | 19.80±3.11 | 20.41±3.16 | 19.54±3.50 | 20.65±4.16 | 19.04±4.77 | 20.54±4.66 |
| 消渴丸组 | 1250 | 21.03±2.99 | 20.07±2.34*1 | 18.48±1.62*1 | 17.54±1.93*1 | 16.42±2.72*1 | 16.12±3.86*1 |
| CSA | 300 | 20.04±4.11 | 19.98±3.27*2 | 17.59±3.50*2 | 16.33±3.87*2 | 15.21±4.13*2 | 15.03±3.14*2 |
| 1000 | 19.92±3.44 | 19.48±3.77*2 | 16.70±3.28*2 | 15.24±3.62*2 | 14.03±3.95*2 | 13.99±4.01*2 | |
| CSB | 300 | 19.84±3.41 | 19.65±2.75*2 | 17.62±2.97*2 | 16.04±3.57*2 | 14.99±3.98*2 | 14.87±2.95*2 |
| 1000 | 18.72±3.21 | 18.97±3.65*2 | 16.45±3.16*2 | 15.01±3.46*2 | 13.87±3.67*2 | 13.52±3.76*2 |
注：x±s，n＝10，各对照组比较，*1p＜0.001，*2p＜0.01
从上表可以看出，甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)低高剂量组对四氧嘧啶所致的小鼠高血糖有明显的抑制作用，高剂量组比低剂量组抑制率高，说明高低剂量组之间有明显的量效关系。它们抑制血糖的效果要比对照组消渴丸好，抑制率比消渴丸高。高分子量壳聚糖硫酸酯(CSB)由表中可以看出，它的降血糖效果比低分子量壳聚糖硫酸酯(CSB)的效果好，也表现出明显的量效关系。说明分子量是影响降血糖活性的一重要因素。
四氧嘧啶能选择性地破坏胰岛β细胞，而壳聚糖硫酸酯(CSB)对四氧嘧啶所致的血糖升高有明显的抑制作用，这表明壳聚糖硫酸酯(CSB)可能减弱四氧嘧啶对胰岛β细胞的损伤或改善受损伤的β细胞的功能。从而具有抗四氧嘧啶所致血糖升高的效果。
(C)甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的调节血糖试验2：
1.实验动物：Wistar大鼠，体重200-300克，雌雄各半。由山东省新药药理中心实验动物室提供，合格证号970102
2.试验分组及高血糖症造型
将小鼠随机分成6组，每组10只。阳性对照组ig优降糖25mg/kg，阴性对照组给等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，其余四组分别ig CSA、CSB300mg/kg和1000mg/kg。与给药后4h，各组小鼠ip肾上腺素0.02mg/kg，于注射后1h断头取血测血糖。结果表明甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)300mg/kg和1000mg/kg可明显抑制肾上腺素的升高血糖作用，见表2。
表2：壳聚糖硫酸酯(CSB)对肾上腺素引起血糖升高的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 血糖(mmol/L) |
| 肾上腺素组 | 0.02 | 13.67±3.25 |
| 加优降糖组 | 25 | 8.60±3.73* |
| CSA | 3001000 | 7.03±2.60**5.41±3.47** |
| CSB | 3001000 | 6.79±2.69**4.97±2.99** |
从上表可以看出，甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)低高剂量组对肾上腺素所致的小鼠高血糖有明显的抑制作用，高剂量组比低剂量组抑制率高，说明高低剂量组之间有明显的量效关系。它们抑制血糖的效果要比对照组优降糖好，抑制率比优降糖高。由表中还可以看出高分子量壳聚糖硫酸酯(CSB)降血糖效果比低分子量甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)效果好，也表现出明显的量效关系。说明分子量是影响降血糖活性的一重要因素。肾上腺素能促进肝糖原和肌糖原的分解而引起血糖升高，甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)能拮抗肾上腺素的升血糖作用，可能与抑制糖原分解有关。
本发明所述甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的制备步骤(9)中与所述壳聚糖硫酸酯(CSB)的制备步骤(3)中所加入的酸溶剂都是88％的浓甲酸(本发明的实施例中优选使用88％的浓甲酸5ml)。使用该酸溶剂时不用除水及其它杂质，简化了工艺程序，节约了干燥成本。选择甲酸还由于甲酸的价格(10元/500ml)远远低于二氯乙酸(94元/500ml)，用此酸溶剂所进行的均相反应，所得产物的含硫量和产率均与用二氯乙酸相当，其性格价能比大大提高了。在本领域技术中使用甲酸作为酸溶剂还未见有报道。
本发明所述甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的制备步骤(11)中与所述壳聚糖硫酸酯(CSB)的制备步骤(4)中的搅拌反应，是在大气气氛下常压进行反应的。此项改进与前人“在N2气氛下反应2～8h”的技术相比，其方法更简单易行，而且节省了能源。
综上所述，本发明的防治糖尿病的药物化合物的两种聚糖硫酸酯(CSA、CSB)的活性含硫量高，壳聚糖原料利用率也高；所用制备材料与前人所用的相比，性能价格比高。两种聚糖硫酸酯(CSA、CSB)首次作为降血糖的海洋药物方面的应用。由于受活性基团硫酸酯基及其分子量的影响，该防治糖尿病的药物化合物在抗血糖、调血脂、增强免疫力、抗凝血等方面显示出的活性。本防治糖尿病的药物化合物的制备方法采用均相反应，简单易行，操作成本低，污染少，原料利用率高。
(四)附图说明 本发明的保护范围不仅局限于以下实施例中。
本发明的实施例结合附图进一步说明如下：
图1为壳聚糖原料的红外光谱图。
图2为壳聚糖硫酸酯的红外光谱图。
图3为壳低聚糖硫酸酯的13C-NMR图谱。
(五)具体实施方式
本发明防治糖尿病的海洋药物的制备方法实施例如下：
I、甲壳低聚糖硫酸酯的制备实施例：
①.酯化试剂的制备
采用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为反应介质制备磺化试剂——DMF·SO3(二甲基甲酰胺-氯磺酸)磺化剂。向装有搅拌装置的三口烧瓶中加入50mlN，N-二甲基甲酰胺，置于冰盐水浴中。在搅拌状态下，滴加一定体积氯磺酸，控制滴加的速度，使反应体系的温度保持在5℃以下。滴加完毕后在室温下继续搅拌一定时间，使磺化试剂更为安全有效。氯磺酸加入量如表3：
表3：DMF与氯磺酸的比例对磺化剂状态的影响
| DMF(ml) | 氯磺酸ml | 状态 |
| 50 | 50 | 反应液粘稠，搅拌不动 |
| 50 | 40 | 反应液粘稠，比上述粘度稍小些 |
| 50 | 30 | 反应液粘稠，已可搅拌 |
| 50 | 20 | 仍具有一定的粘度 |
| 50 | 10 | 混合物呈液体状，混合均匀 |
| 60 | 10 | 混合物呈液体状，混合均匀 |
| 100 | 10 | 混合物呈液体状，混合均匀 |
由上表可知，本实验选择DMF与氯磺酸的比为10～5∶1均可，但5∶1效果最佳。
②.微波作用下壳聚糖的降解，制备如下：
(1)取2～5g上述粉碎烘干的产物，加入30～150ml甲酰胺溶剂；
(2)将上述混合物，搅拌均匀后，加入3～10ml甲酸或二氯乙酸，混合均匀后；
(3)再加入50～100ml磺化剂DMF·SO3，搅拌均匀后；
(4)再在40～60℃温度下，搅拌反应1～2h；
(5)将上述反应液再加入3倍体积的95％乙醇，当出现大量白色絮状沉淀时，放置4℃冷藏柜中沉化30min；
(6)将上述沉淀物进行抽滤，取滤饼；
(7)将上述滤饼再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；
(8)将上述溶液用透析袋进行透析，除盐后取透析液；或使用超滤方法除盐，取截留溶液；
(9)再将上述溶液，浓缩至1/10体积；
(10)将上述浓缩液放于冰柜中冻结，然后冷冻干燥得淡黄色棉花状物质；
(11)粉碎该棉花状物质，测定其含硫量及分子量，取符合规定的低分子量1～6 KD的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)作为防治糖尿病的药物。
④制取本发明的两种聚糖硫酸酯(CSA，CSB)的条件见表5、6：
表5：在二氯乙酸作用下甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)制备条件及结果
| 实例号 | 溶剂 | 溶剂用量ml | 壳聚糖用量g | 磺化剂用量ml | 反应时间h | 反应温度℃ | 产率％ | 硫酸根含量％ | 分子量 |
| 1 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 40 | 95 | 40.15 | 7509 |
| 2 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 45 | 91 | 41.70 | 7089 |
| 3 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 1 | 50 | 90 | 40.33 | 6562 |
| 4 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 1 | 55 | 87 | 40.17 | 5869 |
| 5 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 50 | 84 | 40.39 | 3809 |
| 6 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 55 | 79 | 41.27 | 2763 |
表6：在甲酸作用下甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)制备条件及结果：
| 实例号 | 溶剂 | 溶剂用量ml | 壳聚糖用量g | 磺化剂用量ml | 反应时间h | 反应温度℃ | 产率％ | 硫酸根含量％ | 分子量 |
| 1 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 40 | 95 | 40.73 | 7209 |
| 2 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 45 | 93 | 42.21 | 6889 |
| 3 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 1 | 50 | 93 | 40.62 | 6352 |
| 4 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 1 | 55 | 89 | 41.15 | 5469 |
| 5 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 50 | 86 | 40.59 | 3789 |
| 6 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 55 | 83 | 41.25 | 2564 |
由上两表可知，甲酸作为溶剂效果与二氯乙酸作为酸溶剂效果相当，某种程度来讲稍微好些，且甲酸价格远远低于二氯乙酸，因此用性价比来衡量，甲酸优于二氯乙酸。
II、壳聚糖硫酸酯(CSB)的制备实施例：
①.酯化试剂的制备与甲壳低聚糖硫酸酯中酯化试剂的制备相同。
②.高分子量的壳聚糖硫酸酯(CSB)的制备，制备步骤如下：
(1)取2～5g壳聚糖原料，加入30～150ml甲酰胺溶剂；将上述混合物，搅拌均匀后，加入3～10ml甲酸或二氯乙酸，混合均匀后；
(2)再加入50～100ml磺化剂DMF·SO3，搅拌均匀后；
(3)再在40～60℃温度下，搅拌反应1～2h；
(4)将上述反应液再加入3倍体积的95％乙醇，当出现大量白色絮状沉淀时，放置4℃冷藏柜中沉化30min，得到的沉淀物即是壳聚糖硫酸酯的粗产品；
(5)将上述沉淀物进行抽滤，取滤饼；
(6)将上述滤饼再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；
(7)将上述溶液用透析袋进行透析，除盐后取透析液；或使用超滤方法除盐取截留溶液；
(8)再将上述溶液，浓缩至1/10体积；
(9)将上述浓缩液放于冰柜中冻结，然后冷冻干燥得淡黄色棉花状物质——壳聚糖硫酸酯(CSB)；
(10)粉碎该棉花状物质，测定其含硫量及分子量，取符合规定分子量30～100KD的壳聚糖硫酸酯(CSB)作为防治糖尿病的药物。
制取的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)条件见表7、8：
表7：在二氯乙酸作用下甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)制备条件及结果
| 实例号 | 溶剂 | 溶剂用量(ml) | 壳聚糖用量(g) | 磺化剂用 量(ml) | 反应时间(h) | 反应温度(℃) | 产率(％) | 硫酸根含量(％) | 分子量(×104) |
| 1 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 40 | 95 | 40.10 | 10.71 |
| 2 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 45 | 93 | 41.37 | 6.63 |
| 3 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 1 | 50 | 95 | 40.24 | 9.62 |
| 4 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 1 | 55 | 95 | 40.05 | 8.75 |
| 5 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 50 | 92 | 40.27 | 5.16 |
| 6 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 55 | 90 | 41.03 | 3.05 |
表8：在甲酸作用下甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)制备条件及结果
| 实例号 | 溶剂 | 溶剂用量ml | 壳 聚糖 用量g | 磺化剂用量ml | 反应时间h | 反应温度℃ | 产率％ | 硫酸根含量％ | 分子量 |
| 1 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 40 | 95 | 40.23 | 8.91 |
| 2 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 45 | 95 | 42.01 | 7.01 |
| 3 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 1 | 50 | 95 | 40.22 | 8.59 |
| 4 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 1 | 55 | 95 | 41.25 | 7.89 |
| 5 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 50 | 93 | 40.19 | 4.46 |
| 6 | 甲酰胺 | 50 | 2 | 50 | 2 | 55 | 91 | 41.35 | 3.16 |
由上两表可知，甲酸作为溶剂效果与二氯乙酸作为酸溶剂效果相当，某种程度来讲稍微好些，且甲酸价格远远低于二氯乙酸，因此用性能价格比来衡量，甲酸优于二氯乙酸。
④.壳聚糖硫酸酯(CSB)的图谱分析
(1).壳聚糖硫酸酯(CSB)的红外光谱图分析结果：
由图1壳聚糖原料的红外光谱看出，3435cm-1是亚胺基伸缩振动，2917cm-1和2874cm-1分别是-CH3，-CH2的伸缩振动，1659，1597cm-1是酰胺I带，酰胺II带，1379cm-1是-CH2的面外弯曲振动，1076cm-1是醚键(c-o-c)的伸缩振动，此外，897cm-1，930cm-1，750cm-1处吸收弱，说明壳聚糖是以β-1.4糖苷键连结的多聚物，红外光谱结果与文献报导一致(李继珩，1997；王转花，1997；周赤，1996)。
磺酸化产物IR见图2，与图1比较，在3429cm-1，2923cm-1，1629cm-1，1535cm-1，1062cm-1出现了壳聚糖骨架的特征峰，而在1257cm-1，803cm-1，1383cm-1处出现三个峰，分别是Vs(s＝0)，V(s-o-c)和Vas(s＝0)，红外光谱与参考文献图谱一致(A.M.Naggi，1985)，证明反应后在壳聚糖分子上引入了硫酸基团。
(2).壳聚糖硫酸酯(CSB)的13C-NMR光谱分析结果：
从图3看出，在壳聚糖的C6位引入硫酸酯基(-OSO3 -)后，由于硫酸酯基的去屏蔽作用使C6的化学位移由62.85ppm明显向低场漂移至69.3ppm，C3的化学位移由75.3ppm明显向低场漂移至78.1ppm，C2的化学位移由56.7ppm明显向低场漂移至58.2ppm，表明此反应已成功的将硫酸酯基引入到壳聚糖上，在100.45ppm，77.78ppm，75.40ppm，处分别出现C-1，C-4，C-5信号，此三位点化学位移几乎不变。
Claims (3)
1、甲壳低聚糖硫酸酯和/或壳聚糖硫酸酯作为制备降血糖药物中的应用。
2、根据权利要求1所述甲壳低聚糖硫酸酯和/或壳聚糖硫酸酯作为制备降血糖药物中的应用，其特征在于：所述的甲壳低聚糖硫酸酯和/或壳聚糖硫酸酯是以有效量的组分与药用载体和/或赋形剂制成口服液或气雾剂。
3、根据权利要求1所述甲壳低聚糖硫酸酯和/或壳聚糖硫酸酯作为制备降血糖药物中的应用，其特征在于：所述的甲壳低聚糖硫酸酯和/或壳聚糖硫酸酯是以0.5％羧甲基纤维素钠溶液配成所需浓度混悬液。
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