CN1285340C - 多糖硫酸酯氨基酸盐类药物和制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类多糖硫酸酯氨基酸盐类药物及其制备方法，该药物是由多糖硫酸酯聚阴离子载体与氨基酸成盐形成的复合物，其中多糖硫酸酯占该复合物的重量比为10%-95%，氨基酸占5%-90%。该类药物的制备方法，其步骤为：(1)多糖的提取；(2)多糖硫酸酯的制备；(3)多糖硫酸酯氨基酸盐的制备。该药物由于将多糖硫酸酯与氨基酸复合成盐，有助于去除多糖硫酸酯制备过程中产生的金属离子，并融合了它们的免疫调节活性和治疗慢性肾炎和肾衰竭的药理活性，从而产生正向协同作用，使多糖硫酸酯氨基酸盐对肾病患者肾功能的保护作用强于多糖硫酸酯和天然氨基酸的独自药效。此类药物水溶性好，疗效显著且低毒无副作用，是治疗慢性肾炎和肾衰竭疾病的良好药物。

Description

多糖硫酸酯氨基酸盐类药物和制备方法及其应用
一、技术领域
本发明涉及生化制药技术领域，尤其是涉及多糖硫酸酯氨基酸盐药物和制备方法及其在制备治疗慢性肾炎和肾衰竭疾病药物中的应用。
二、背景技术
肾衰竭是由各种原因引起的肾实质损害所导致的水、电解质紊乱，酸碱平衡失调及涉及多个器官功能紊乱的综合征，治疗较为困难，且医疗费昂贵。据有关资料统计，我国约有肾脏病人3000万，慢性肾衰发生率约为总人口的万分之五，其中死于尿毒症者每年就有数万人。近几十年来，血液净化技术的问世和不断改进以及营养治疗、抗生素等技术的发展，使肾衰病人的成活率有了突破性的提高，但在合并严重感染、多脏器功能障碍及衰竭时，死亡率仍高至50-75％以上，因此探索如何发展治疗肾脏疾病的新疗法和新药物仍是当前面临的严峻挑战。
天然多糖是构成生命基础的四大类物质之一，迄今为止，有300多种多糖的免疫调节作用已为人们所发现。基于对肾脏疾病机理的认识，人们发现用糖胺聚糖及其衍生物治疗慢性肾脏疾病有显著效果(Shestakova et al.Terapevticheskii Arkhiv.1997，69(6)：34-37；Skrha et al.Diabetes Research and Clinical Practice.1997，38(1)：25-31)。如：Akima等以酸性粘多糖和具有抗凝血活性的葡聚糖硫酸酯用作治疗间质肾炎、肾小球肾炎和狼疮肾炎(日本专利：08-301771；美国专利：5981509)；Egidio等以粘多糖来源的2-氨基葡萄糖醛酸-2-脱氧葡聚糖硫酸酯治疗糖尿病肾病，降低尿白蛋白效果尤佳(日本专利：06-091713)；徐祖洪等公开了一种褐藻多糖硫酸酯新的制备方法和作为治疗肾衰疾病药品中的应用(中国专利：95112292.4、98120283.7)；毕爱芳等申请了用褐藻多糖硫酸酯作为治疗肾小球疾病的药品专利(中国专利：98110201.8)。本发明人研究发现真菌来源多糖经硫酸酯化修饰后具有显著的降血肌酐、血尿素氮和尿蛋白等治疗慢性肾炎和肾衰竭的功能(中国专利，申请号：200410013931.1)。
氨基酸对肾功能的保护是多方面的，虽然机理上尚存在许多争议。L-鸟氨酸、L-精氨酸是尿素循环中重要的代谢中间物，促进血氨转变成尿素。L-精氨酸是NO的前体物质，NO是舒血管因子，可以显著改善肾脏微循环，提高肾小球滤过率，保护肾脏组织减轻缺血、缺氧的损伤。尿素循环中L-鸟氨酸接受2个氨基转化为L-精氨酸。很久以前人们已发现L-鸟氨酸和L-精氨酸有保护人体减轻铵盐的毒性作用，并尝试用L-鸟氨酸、L-精氨酸治疗高血氨病人(Birnbaum et al.Arch Biochem Biophys.1956，64(2)：319；342；Harper et al.Proc Soc ExpBiol Med.1956，92(3)：560；Fahey et al.Am J Med.1957，23(6)：860；Michel et al.Presse Med.1971，79(19)：867)。Schramm认为在大鼠缺血性急性肾功能衰竭中，L-精氨酸能改善其肾功能，其主要机制可能和来源于L-精氨酸的NO有关(Schramm et al.Ren Fail，1994，16(5)：555)。Reckelhoff等实验表明L-精氨酸能防止与老龄有关的肾小球损伤和GFR的减少(Reckelhoffetal.Am J Physiol，1997，272(6 Pt 2)：R1768)。McGivan实验表明，L-鸟氨酸被L-鸟氨酸转氨酶分解的速度和L-鸟氨酸进入线粒体参与尿素循环的速度几乎是一样的(McGivan et al.Biochemistry Journal 162：147-156(1977))，补充L-鸟氨酸有助于加速尿素循环。
甘氨酸能够保护多种细胞，减轻由缺氧、过氧化和多种毒物造成的损伤。甘氨酸对于缺氧诱导的肾近曲小管损伤是一种非常有效的保护因子。大剂量的甘氨酸对顺铂引起的肾毒性能产生明显的保护和修复作用(Liet al.JPharm Pharmacol，1995，47(3)：223)。Schneider发现甘氨酸抑制环孢菌素A诱导的大鼠肾小球滤过率的下降，阻止血肌酐、尿素氮和碱性磷酸酶的升高，改善近曲小管的膨胀和坏死以及吞噬细胞的浸润(美国专利：6096785)。
其它氨基酸如L-丙氨酸能对体外的兔近曲小管的缺氧性损伤起保护作用，L-丝氨酸也有类似的保护作用。L-赖氨酸能保护溶血引起的肾功能减退，主要是因为带有正电荷的L-赖氨酸能抑制对血红蛋白的重吸收(秦杰．国外医学泌尿系统分册，2003，23(4)：374)。
肾衰病人由于限制蛋白饮食，体内必须/半必须氨基酸血浓度很低，正常的、必要的蛋白质合成受阻，氮代谢平衡被打破。因此以一个合理的比例给肾衰病人补充一定量的必须氨基酸，既是满足营养支持和平衡的需要，又有保护病变肾脏的功能。早些时候的发明给氨氮排泄障碍的病人补充一定量的包括L-精氨酸、L-组氨酸在内的必须/半必须氨基酸以纠正体内蛋白质的缺乏(美国专利：2457820；3764703)。后来的发明将去氨氮的必须/半必须氨基酸的α-酮酸、α-羟基酸类似物和无法获得这些类似物的必须/半必须氨基酸混合补充给病人，即补充了必要的氨基酸，又促进了氨氮转换，减轻肾脏尿素排泄的负担(美国专利：4100160；4100161；4100293；4228099)。但这些专利产品均存在口感差、反胃以及某些氨基酸或α-酮酸、α-羟基酸类似物溶解度低的缺点。Walser将L-精氨酸和L-鸟氨酸与人体必须的支链氨基酸(L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸)的α-酮酸类似物组合形成复合盐用于治疗以高血氨为特征的肝病、肾衰和脑病，产品口感得到改善(美国专利：4320146)。国内谢立平等发明了含有8种L-氨基酸的复合制剂具有明显的对抗顺铂和缺血导致的急性肾功能障碍作用(中国专利：1439364A)。
三、发明内容
1、发明目的
本发明的目的在于提供一类多糖硫酸酯氨基酸盐复合药物和制备方法及其在治疗慢性肾炎和肾衰竭制药领域中的应用。将多糖硫酸酯与氨基酸复合的目的在于融合它们各自的免疫调节活性和治疗慢性肾炎、肾衰竭的药理活性，从而产生正向协同作用，使多糖硫酸酯氨基酸盐对肾病患者肾功能的保护作用强于多糖硫酸酯和天然氨基酸的独自药效。
2、技术方案
一类多糖硫酸酯氨基酸盐药物，其特征在于它是由多糖硫酸酯聚阴离子载体与氨基酸成盐形成的复合物，其组分重量百分比为多糖硫酸酯占该复合物10％-95％，氨基酸占该复合物5％-90％。
上述的多糖硫酸酯包括天然多糖硫酸酯和人工半合成多糖硫酸酯。硫酸根占多糖硫酸酯的重量百分比为2％-60％。
上述多糖硫酸酯中的多糖为微生物多糖。其微生物多糖为真菌多糖，包括茯苓多糖、猪苓多糖和裂褶菌多糖。
上述成盐氨基酸为L-鸟氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。
多糖硫酸酯氨基酸盐药物加入相应的辅料可制备成片剂、丸剂、胶囊剂和针剂。
一类多糖硫酸酯氨基酸盐药物的制备方法，其特征在于多糖硫酸酯和氨基酸的结合是在溶液中以分子离子的形式化学合成的制备方法，其化学合成制备方法步骤如下：
(1)微生物多糖的提取采用酶解和碱提相结合的方法，提取物经脱色、透析和真空浓缩后，乙醇沉淀、真空干燥；
(2)多糖硫酸酯的制备采用氯磺酸-吡啶法。反应产物经碱中和、脱色、透析和真空浓缩后，乙醇沉淀、真空干燥；
(3)多糖硫酸酯氨基酸盐的制备步骤为：
a.多糖硫酸酯碱金属或碱土金属盐配成5％-20％溶液，缓慢搅拌加入氢型酸性树脂，离子交换去除多糖硫酸酯碱金属或碱土金属盐中的金属离子，反应过程中监测溶液pH值，当pH至0.5-2时过滤分离出树脂；
b.将氨基酸配成1％-70％的溶液；
c.向酸性树脂处理好的多糖硫酸酯溶液中缓慢搅拌加入氨基酸溶液，成盐反应过程中监测溶液pH值，当pH至3-8时停止加入氨基酸溶液；
d.活性碳脱色，真空浓缩和干燥，机械粉碎，即得多糖硫酸酯氨基酸盐药物。
上述药物的制备方法，在步骤(2)中所述的多糖硫酸酯，其分子量在0.2万-80.0万之间，优选0.5万-30.0万；
上述药物的制备方法，在步骤(3)中b和c所述的氨基酸，包括一种和/或多种，多糖硫酸酯和一种氨基酸形成多糖硫酸酯单氨基酸盐，多糖硫酸酯和多种氨基酸形成多糖硫酸酯混合氨基酸盐。
一类多糖硫酸酯氨基酸盐药物在制备治疗慢性肾炎和肾衰竭疾病药物中的应用。该药物经药效学试验结果表明，多糖硫酸酯氨基酸盐进入体内后，在血液和组织液中以多糖硫酸酯和氨基酸游离的形式存在，各自发挥它们的肾功能保护和免疫调节作用，从而产生正向协同作用，使多糖硫酸酯氨基酸盐对肾病患者肾功能的保护作用强于多糖硫酸酯和天然氨基酸的独自药效。
经动物实验表明，多糖硫酸酯氨基酸盐使肾衰动物肾脏系数显著下降；明显提高肾衰动物的终尿量、尿肌酐的排放量，提高血清总蛋白、白蛋白水平，使其接近正常水平；降低血清肌酐、血清尿素氮水平，减少尿蛋白的排放。病理切片显示，和模型对照组相比，实验组动物的肾泌尿功能组织的萎缩、肾小体数量的减少、肾小球体积的增大、肾小球囊腔的扩大、细胞间质的增生等现象得到明显改善，肿胀、变性、坏死的近曲小管数量减少，远曲小管扩张程度明显减轻，肾组织内的棕黑色结晶沉积显著减少。
3、有益效果
本发明与现有技术相比，有以下优点：
(1)本产品生产工艺简单，工艺条件温和，对设备无特殊要求；产品原材料来源丰富，动物多糖来源于大型哺乳动物和海洋动物，植物多糖取自天然中药宝库和海洋资源，真菌多糖原材料——食用菌在我国的年产量占世界总产量的60％以上，2002年产量为876万吨。生产过程无固体废料，溶剂可回收套用。因此本发明产品成本低廉，适应低收入肾脏病患者药物治疗的需求。
(2)本产品制备采用树脂离子交换技术去除多糖硫酸酯碱金属或碱土金属盐中的金属离子，消除以往多糖硫酸酯产品中金属离子对肾脏病人造成的不利影响。
(3)本产品水溶性好，易于药物在体内吸收，有利于制备成各种药物剂型。
(4)将多糖硫酸酯与氨基酸复合成盐融合了它们的免疫调节活性和治疗慢性肾炎和肾衰竭的药理活性，并产生正向协同作用，多糖硫酸酯氨基酸盐对肾功能的保护作用强于多糖硫酸酯或天然氨基酸独自药效。
通过上述药效实验结果证明多糖硫酸酯氨基酸盐治疗慢性肾炎和肾衰竭疾病的疗效是显著的，茯苓多糖硫酸酯氨基酸盐对肾功能的保护作用强于茯苓多糖硫酸酯。急性毒理实验的结果也表明本发明药物的毒副作用小。
四、具体实施方案
结合以下实施例进一步说明多糖硫酸酯氨基酸盐药物、制备方法及对慢性肾炎和肾衰竭疾病的治疗作用。
实施例1  多糖硫酸酯氨基酸盐类药物的组成
(一)茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐：L-精氨酸占成品重量百分比为38.4％，茯苓多糖硫酸酯占61.6％。其中茯苓多糖硫酸酯分子量分布范围为0.6万-20.0万，硫酸根含量为48.6％。
(二)海藻多糖硫酸酯混合氨基酸盐：海藻多糖硫酸酯占产品重量的百分比为47.6％，混合氨基酸为52.4％。其中海藻多糖硫酸酯硫酸根含量为45.0％，分子量分布范围为0.5万-15.0万；混合氨基酸中，L-鸟氨酸占海藻多糖硫酸酯混合氨基酸盐的重量比为23.8％，L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸各占9.5％。
(三)硫酸软骨素混合氨基酸盐：硫酸软骨素占产品的重量百分比为57.4％，混合氨基酸占42.6％。其中硫酸软骨素硫酸根含量为23％，分子量分布范围为0.5万-3.0万；混合氨基酸中，L-赖氨酸、L-鸟氨酸和甘氨酸分别占硫酸软骨素混合氨基酸盐的重量比分别为17.8％、16.0％和8.9％。
实施例2茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐的化学合成制备，其制备步骤如下：
1、茯苓多糖的提取
(1)100g茯苓干粉置于5倍量的1mol/LNaOH稀碱溶液中室温下浸泡4小时；
(2)抽滤分离出粘稠的液体，残渣用3倍量碱液再提取一次，合并两次的提取液；
(3)提取液以10％的醋酸液中和至pH6，加入3倍量的95％乙醇，于4℃放置过夜，离心分离出沉淀，流水透析两天；
(4)依次用蒸馏水、无水乙醇洗涤后，真空干燥，得63.7g白色粉末。
2、茯苓多糖硫酸酯的制备
(1)1000ml平底烧瓶中加入吡啶240ml，冷却至4℃并搅拌，用分液漏斗慢慢滴加氯磺酸40ml，制备磺化试剂；
(2)向磺化试剂中加入12g茯苓多糖，于75-80℃下剧烈搅拌反应1小时；
(3)4NNaOH调pH6，减压蒸馏去除水和吡啶，一直到蒸干为止；
(4)反应瓶中加500ml热水溶解，流水透析1天，收集溶液用活性碳脱色；
(5)3倍量的95％乙醇沉淀茯苓多糖硫酸酯，无水乙醇洗涤，真空干燥，得浅黄色粉末38.5g；
(6)改良的BaSO4浊度法检测所得产品硫酸根含量，结果为48.6％；硝酸银法检测NaCl含量小于0.15％；
(7)经醋酸纤维素薄膜电泳，甲苯胺蓝染色，以已知分子量范围的肝素、硫酸软骨素、透明质酸为对照品，检测到所得产品分子量分布范围为0.6万-20.0万。
3、茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐的化学合成制备步骤为：
(1)100g茯苓多糖硫酸酯溶于蒸馏水成10％溶液，缓慢搅拌加入JK008氢型强酸树脂，离子交换反应过程中检测溶液pH值，当pH至1.3时停止树脂的加入；
(2)过滤分离出树脂，少量蒸馏水洗涤树脂2次，洗涤液合并入酸化的茯苓多糖硫酸酯溶液中；
(3)用市售的50g L-精氨酸配成10％的溶液；
(4)向酸性茯苓多糖硫酸酯溶液中缓慢搅拌加入L-精氨酸溶液，成盐反应过程中监测溶液pH值，当pH至7时停止加入L-精氨酸溶液，L-精氨酸实际用量为43g；
(5)活性碳脱色、浓缩、干燥后得浅黄色粉末，重112g；
(6)L-精氨酸占成品重量百分比为38.4％，茯苓多糖硫酸酯占61.6％。
实施例3茯苓多糖硫酸酯鸟氨酸盐的化学合成制备
1、茯苓多糖和茯苓多糖硫酸酯的制备过程同实施例2；
2、100g茯苓多糖硫酸酯去钠离子的酸化过程同实施例2；
3、将50g市售L-鸟氨酸配成20％的溶液；
4、向酸性茯苓多糖硫酸酯溶液中缓慢搅拌加入L-鸟氨酸溶液，成盐反应过程中监测溶液pH值，当pH至6.5时停止加入L-鸟氨酸溶液，L-鸟氨酸实际用量为44g；
5、活性碳脱色、浓缩、干燥后得浅黄色粉末，重124g；
6、L-鸟氨酸占成品重量百分比为35.5％，茯苓多糖硫酸酯占64.5％。
实施例4  海藻多糖硫酸酯混合氨基酸盐的物理方法制备，其制备步骤如下：
1、海藻多糖硫酸酯的制备
(1)1000ml平底烧瓶中加入吡啶200ml，冷却至4℃并搅拌，用分液漏斗慢慢滴加氯磺酸30ml，制备磺化试剂；
(2)向磺化试剂中加入12g市售海藻酸钠，于80-90℃下剧烈搅拌反应1.5小时；
(3)4N NaOH调pH6，减压蒸馏去除水和吡啶，一直到蒸干为止；
(4)反应瓶中加500ml热水溶解，流水透析1天，收集溶液用活性碳脱色；
(5)3倍量的95％乙醇沉淀海藻多糖硫酸酯，无水乙醇洗涤，真空干燥，得浅黄色粉末30.7g；
(6)改良的BaSO4浊度法检测所得产品硫酸根含量，结果为45.0％；
(7)经醋酸纤维素薄膜电泳，甲苯胺蓝染色，以已知分子量范围的肝素、硫酸软骨素、透明质酸为对照品，检测到所得产品分子量分布范围为0.5万-15.0万。
2、海藻多糖硫酸酯混合氨基酸盐的物理方法制备
(1)干燥的海藻多糖硫酸酯粉碎成粉末，称取100g；
(2)分别称取市售L-鸟氨酸50g，L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸各20g，机械混匀成混合L-氨基酸粉末；
(3)海藻多糖硫酸酯和混合L-氨基酸粉末混匀即为目的产品，海藻多糖硫酸酯占产品重量的百分比为47.6％，混合氨基酸为52.4％，其中L-鸟氨酸23.8％，L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸分别为9.5％。
实施例5  硫酸软骨素鸟氨酸、赖氨酸、甘氨酸混合氨基酸盐的化学合成制备
1、市售硫酸软骨素通过BaS2O4浊度法测出硫酸根含量为23％，醋酸纤维素薄膜电泳法测得产品分子量分布范围为0.5万-3.0万；
2、100g市售硫酸软骨素酸化过程同实施例3；
3、30g市售L-赖氨酸、27g市售L-鸟氨酸和15g市售甘氨酸以1∶0.9∶0.5的比例配成25％等摩尔的混合氨基酸溶液；
4、向酸化的硫酸软骨素溶液中缓慢搅拌加入氨基酸混合溶液，至溶液pH6.8时停止。实际消耗L-赖氨酸26.3g，L-鸟氨酸23.7g，甘氨酸13.2g；
5、活性碳脱色、浓缩、干燥后得白色粉末，重148g；
6、硫酸软骨素占产品的重量百分比为57.4％，混合氨基酸占42.6％。
实施例6  茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐急性毒性实验
1、实验动物  昆明种小白鼠，体重20±2g；
2、实验样品配制  取茯苓多糖硫酸酯及其L-精氨酸盐、L-鸟氨酸盐各6g完全溶解于40ml生理盐水中，制成浓度为150mg/ml的溶液；
3、毒性实验  每种样品取小白鼠20只，雌雄各半，每只小白鼠按体重计算一次性灌胃给药0.04ml/g，相当于6000mg/kg，观察10天。茯苓多糖硫酸酯及其L-精氨酸盐、L-鸟氨酸盐各自给药后动物均健康生存，经解剖观察肝、肾等脏器未发现异常。因此多糖硫酸酯及其L-精氨酸盐、L-鸟氨酸盐各自对小白鼠口服的最大耐受量在6000mg/kg以上，属于低毒类物质(标准是LD50＞5000mg/kg)。
实施例7  茯苓多糖硫酸酯氨基酸盐类药物治疗肾衰竭的药效学实验
1、腺嘌呤肾衰动物模型  SD雄性大鼠适应1周后，按体重随机分为5组，每组14只，每天给予腺嘌呤250mg/kg体重，灌胃给药，每天1次，连续21天。腺嘌呤配成25mg/ml的混悬液，灌胃容量10ml/kg鼠重。另有10只大鼠为正常对照组，不给予腺嘌呤。
2、动物分组  正常对照组，给于等量蒸馏水；模型对照组，给于等量蒸馏水；地塞米松组，0.1mg/kg；茯苓多糖硫酸酯组，500mg/kg；茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐组，800mg/kg；茯苓多糖硫酸酯鸟氨酸盐组，800mg/kg。所有组均灌胃给药。
3、采样检测  造模开始第5天给予药物治疗，每天1次，连续30天。所有动物造模之日称体重，以后一周称1次，共称5次。治疗结束时，代谢笼单喂收取12小时尿，期间禁食禁水，量取尿量，测尿总蛋白；蒸馏水稀释10倍，测定尿肌酐；眼眶静脉采血，离心取血清，测定肌肝，尿素氮，总蛋白和白蛋白。治疗结束眼眶采血后，脱颈椎处死大鼠，剖腹取出肾脏，称重后，置于10％甲醛溶液固定，HE染色，光镜观察。内容包括肾小球、近曲小管、肾髓质、肾间质结缔组织及血管，每只动物计数肾皮质被膜下4个视野的肾小球数(×100)，并计算其均值。
4、结果
4.1 一般情况观察  正常对照组大鼠被毛光泽，紧密贴身，活动敏捷，食量较多，饮水适量，体重逐步增加，大便呈颗粒状，尾色淡红。造模各组大鼠，1周后出现多饮多尿，食量减少，被毛干枯蓬松少光泽，活动减少，精神不振。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐各组与模型组和地塞米松组相比，大鼠活动较多，饮水、尿量多，体重减轻较少，灌胃时挣扎有力。地塞米松组较模型组体重下降快，活动、食量少。各组体重增重情况见表1。
               表1  茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐对腺嘌呤致肾衰大鼠体重增重的影响
  组别   第一周(g)   第二周(g)   第三周(g)   第四周(g)   第五周(g)
  正常对照组模型对照组地塞米松组茯苓多糖硫酸酯茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐组茯苓多糖硫酸酯鸟氨酸盐组   268.73±16.32268.62±18.64277.33±14.59272.82±17.24274.50±14.74274.38±16.02   274.80±15.64260.10±17.96267.04±15.95261.81±19.26268.73±16.58260.38±20.73   291.95±15.91269.45±15.86△△246.33±12.40△△**270.96±19.12△273.55±16.79△273.38±26.28   309.13±15.73278.57±19.45△△238.33±21.23△△*282.54±20.33△295.64±18.45*295.69±25.83   329.60±14.25288.40±22.76△△250.55±21.20△△*306.16±20.53*311.00±17.41**315.77±27.25*
与模型对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比，△P＜0.05，△△P＜0.01
4.2死亡情况  造模1周后有动物死亡，多数发生在造模后2-4周内。正常对照组无大鼠死亡，模型组有4只死亡(4/14)，地塞米松组有5只死亡(5/14)，茯苓多糖硫酸酯组有2只死亡(2/14)，茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐组有3只死亡(3/14)，茯苓多糖硫酸酯鸟氨酸盐组有1只死亡(1/14)。
4.3对大鼠肾脏系数的影响  茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐对腺嘌呤致肾衰大鼠肾脏系数的影响见表2。
                     表2  茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐对腺嘌呤致肾衰大鼠肾脏系数的影响
  组别   体重(g)   双肾重(g)   肾系数(g/100g)
  正常对照组模型对照组地塞米松组茯苓多糖硫酸酯茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐组茯苓多糖硫酸酯鸟氨酸盐组   329.60±14.25288.40±22.76△△250.55±21.20△△*306.16±20.53*311.00±17.41**315.77±27.25*   2.19±0.199.64±2.78△△8.16±1.51△△**7.93±1.64△△*9.25±1.33△△8.19±1.94△△   0.67±0.053.37±1.06△△3.24±0.58△△2.58±0.47△△*2.98±0.42△△2.58±0.50△△*
与模型对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比，△P＜0.05，△△P＜0.01
造模后大鼠肾脏重量显著增加。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐治疗后，肾脏系数较模型对照组有明显下降，茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐效果优于地塞米松。
4.4对血液肌酐、尿素氮、总蛋白和白蛋白的影响 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐对腺嘌呤致肾衰大鼠肾功能的影响见表3。
                     表3  茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐对腺嘌呤致肾衰大鼠肾功能的影响
  组别   Scr(μmol/L)   Bun(mmol/L)   TP(g/L)   ALB(g/L)
  正常对照组模型对照组地塞米松组茯苓多糖硫酸酯茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐组茯苓多糖硫酸酯鸟氨酸盐组   41.50±7.14178.40±23.14△△135.22±14.75△△**132.42±18.73△△**129.64±22.77**△△113.08±26.41△△**   8.77±1.6135.18±4.05△△31.24±5.81△△29.66±5.13△△*26.62±6.68△△*21.89±4.88△△**   88.69±5.6275.13±4.34△△76.46±4.49△△85.17±5.62**86.09±5.54**85.02±6.59**   38.49±3.0228.69±3.12△△31.44±3.53△△34.59±2.92*38.74±2.56**36.79±3.11**
与模型对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比，△P＜0.05，△△P＜0.01
动物造模后，模型对照组与正常对照组相比，血清肌酐(Scr)、尿素氮(Bun)有极为显著的升高(P＜0.001)，而总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)则表现为明显的降低(P＜0.01)。经茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐治疗后，血清Scr和Bun水平有明显的降低，其中血肌酐下降更为显著。茯苓多糖硫酸酯氨基酸盐降血肌酐和血尿素氮的能力强于茯苓多糖硫酸酯，茯苓多糖硫酸酯鸟氨酸盐强于茯苓多糖精氨酸盐。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐各组明显升高血清总蛋白和白蛋白，和正常对照组差别已不显著，且升高的幅度大于地塞米松。
4.5对尿量、尿肌酐和尿蛋白的影响影响结果见表4。
                 表4  茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐对腺嘌呤致肾衰大鼠尿量、尿肌酐和尿蛋白的影响
  组别   尿量(ml)   尿肌酐(μmol/L)   尿蛋白(mg/L)
  正常对照组模型对照组地塞米松组茯苓多糖硫酸酯茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐组茯苓多糖硫酸酯鸟氨酸盐组   6.02±1.7213.08±2.72△△14.53±2.61△△16.73±3.83△△*21.48±3.94△△**18.50±3.08△△**   3103.00±746.981178.20±388.68△△1730.00±336.64△△*1847.72±352.81△△**2079.09±408.64△△**1992.31±495.10△△**   970.00±294.582080.00±500.67△△1244.44±335.82**1162.92±431.54**1136.36±385.42**1253.85±411.53**
与模型对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比，△P＜0.05，△△P＜0.01
动物造模后，尿量大量增多(P＜0.01)，实验后期，模型组和地塞米松组尿量开始减少，而茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐各组继续维持高尿量状态。造模各组经尿排泄的肌酐显著减少，尿蛋白的排出显著增加，模型对照组与正常对照组相比，差异极为显著(P＜0.01)。经茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐治疗后，尿肌酐排出显著增多，尿蛋白排出则明显减少，尿蛋白和正常对照组相比没有差异。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐效果优于地塞米松，茯苓多糖硫酸酯氨基酸盐优于茯苓多糖硫酸酯。
4.6肾脏的病理学检查  病理切片显示，和模型对照组相比，各治疗组动物肾泌尿功能组织的萎缩、肾小体数量的减少、肾小球体积的增大、肾小球囊腔的扩大、细胞间质的增生等现象得到明显改善，肿胀、变性、坏死的近曲小管数量减少，远曲小管扩张程度明显减轻，肾组织内的棕黑色结晶沉积显著减少。总体按肾脏病变程度排序：模型对照组＞地塞米松组＞茯苓多糖硫酸酯组＞茯苓多糖硫酸酯氨基酸盐组＞正常对照组。正常对照组每视野肾小球平均为17.8个，模型对照组每视野肾小球平均为6.5个，地塞米松组每视野肾小球平均为6.9个，茯苓多糖硫酸酯组每视野肾小球平均为10.6个，茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐组每视野肾小球平均为13.6个，茯苓多糖硫酸酯鸟氨酸盐组每视野肾小球平均为12.7个。
总之，茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐对腺嘌呤致肾衰大鼠有很好的肾功能保护作用，茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸盐的保护作用强于地塞米松，且无地塞米松显著降低实验动物体重的副作用，茯苓多糖硫酸酯氨基酸盐的保护作用强于茯苓多糖硫酸酯。
实施例8  多糖硫酸酯氨基酸盐类药物的试用实例：
1、李××，女，60岁，干部。高血压，高血糖，慢性肾炎。血肌酐1100，血尿素氮28，没有做血透。服用茯苓多糖硫酸酯精氨酸盐，每天二次，每次服用2000mg，持续服药一个月。服药后疗效明显，起效迅速，体质增强，食欲增加，睡眠质量提高，精神好转，血肌酐和血尿素氮下降速度快，不反弹。血肌酐下降到850，血尿素氮下降到22。
2、蔡××，男，36岁，企业经理，遗传性高血压。后肺部感染诱发急性肾衰，血肌酐1700，血尿素氮38，后即进行肾透析，每周2次。透析一年后服用茯苓多糖硫酸酯鸟氨酸盐，开始每天4000mg分二次服用，持续三个月。服药后疗效明显，食欲增加，精神好转，血肌酐和血尿素氮下降速度快。血透前检查血肌酐下降到1200，血尿素氮下降到25。
3、江××，女，52岁，公司职员。糖尿病肾衰早期，呕吐，恶心。血肌酐1000，血尿素氮25，没有做血透。服用海藻多糖硫酸酯混合氨基酸盐，每天二次，每次服用2000mg，持续服药一个月。服药后疗效明显，起效迅速，血肌酐下降到600，血尿素氮下降到18，恶心症状消失。
4、周××，男，46岁，出租车司机。患尿毒症，口腔有严重的氨臭味，皮肤骚痒，恶心，头晕，血肌酐1500，血尿素氮35，每周血透2次。服用硫酸软骨素混合氨基酸盐，每天二次，每次服用2500mg，持续服药一个月。服药后疗效明显，血透减少为每周一次，血肌酐下降到950，血尿素氮下降到26，皮肤骚痒、头晕症状减轻。

Claims (7)

1、一类用于治疗慢性肾炎和肾衰竭疾病的多糖硫酸酯氨基酸盐药物，其特征在于它是由多糖硫酸酯聚阴离子载体与氨基酸成盐形成的复合物，其组分重量百分比为多糖硫酸酯占该复合物10％-95％，氨基酸占该复合物5％-90％；所述多糖硫酸酯中的多糖为微生物多糖。
2、根据权利要求1所述的药物，其特征在于上述的多糖硫酸酯包括天然多糖硫酸酯和人工半合成多糖硫酸酯，硫酸根占多糖硫酸酯的重量百分比为2％-60％。
3、根据权利要求1所述的药物，其特征在于所述的微生物多糖为真菌多糖，包括茯苓多糖、猪苓多糖和裂褶菌多糖。
4、根据权利要求1所述的药物，其特征在于成盐氨基酸为L-鸟氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。
5、一类用于治疗慢性肾炎和肾衰竭疾病的多糖硫酸酯氨基酸盐药物的制备方法，其特征在于多糖硫酸酯和氨基酸的结合在溶液中以分子离子的形式化学合成的，其合成步骤如下：
(1)微生物多糖的提取采用酶解和碱提相结合的方法，提取物经脱色、透析和真空浓缩后，乙醇沉淀、真空干燥；
(2)多糖硫酸酯的制备采用氯磺酸-吡啶法，反应产物经碱中和、脱色、透析和真空浓缩后，乙醇沉淀、真空干燥；
(3)多糖硫酸酯氨基酸盐制备的步骤为：
a.多糖硫酸酯碱金属或碱土金属盐配成5％-20％溶液，缓慢搅拌加入氢型酸性树脂，离子交换去除多糖硫酸酯碱金属或碱土金属盐中的金属离子，反应过程中监测溶液pH值，当pH至0.5-2时过滤分离出树脂；
b.将氨基酸配成1％-70％的溶液；
c.向酸性树脂处理好的多糖硫酸酯溶液中缓慢搅拌加入氨基酸溶液，成盐反应过程中监测溶液pH值，当pH至3-8时停止加入氨基酸溶液；
d.活性碳脱色，真空浓缩和干燥，机械粉碎，即得多糖硫酸酯氨基酸盐药物。
6、根据权利要求5所述药物的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的多糖硫酸酯，其分子量为0.2万-80.0万。
7、根据权利要求5所述药物的制备方法，其特征在于步骤(3)中b和c所述的氨基酸，包括一种和/或多种，多糖硫酸酯和一种氨基酸形成多糖硫酸酯单氨基酸盐，多糖硫酸酯和多种氨基酸形成多糖硫酸酯混合氨基酸盐。
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