CN118043335A - 肽的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明以提供一种从含有乳清蛋白的材料有效制造特定肽的方法为发明课题。具体地，本发明以提供一种GTWY(甘氨酸‑苏氨酸‑色氨酸‑酪氨酸)含量高、且WY(色氨酸‑酪氨酸)含量低，风味良好的材料以及使用该材料的食品为发明课题。在本技术方案中发现，当使用源自蜂蜜曲霉菌的蛋白酶水解乳清蛋白时，通过将反应溶液的pH值维持在碱性侧并在相对短的时间内进行酶促反应，不仅可以从乳清蛋白中提取蛋白质GTWY还可以抑制蛋白酶引起的GTWY分解，从而制造出GTWY含量高、风味好的食材。

Description

肽的制造方法
技术领域
本发明涉及一种制造肽组合物的方法，所述肽组合物的制造方法是通过使用蛋白水解酶分解含有乳清蛋白的材料来制造肽组合物的方法。具体而言，本发明涉及有效地制造具有良好风味的特定肽组合物的方法、特定肽组合物以及使用该特定肽组合物的食品。
背景技术
衰老和压力引起的大脑功能下降会导致记忆力减退、抑郁、失眠、痴呆等，显着降低生活质量(QOL)。在压力大、人口超老龄化的日本，抑郁症、痴呆症等精神疾病患者的增加已成为社会问题，除了开发疾病治疗方法之外，从考虑疾病预防的观点出发，人们正在积极实施从每日的饮食食物中摄取维持和改善大脑功能的物质的探索。
迄今为止，对于预期对维持和改善大脑功能有作用的食品成分，据报道有DHA、EPA、茶氨酸、儿茶素、银杏叶黄酮苷等，近年来还出现了来自乳蛋白的肽衍生品相关报道。据报道，在来自乳蛋白的肽中，甘氨酸-苏氨酸-色氨酸-酪氨酸(下文有时称为GTWY肽，或简称GTWY)具有增强记忆学习能力和认知功能的作用，在以健康中老年人为对象的人体临床试验中，确认了维持和改善记忆的效果(非专利文献1)。因此，开发这种肽含量高的材料和食品，有望为中老年人生活质量的改善做出巨大贡献。
非专利文献2和专利文献1中报道了由乳蛋白产生的GTWY。GTWY序列包含在乳清蛋白之一的β-乳球蛋白中，是由奶酪和酸奶等发酵乳制品中的蛋白质分解产生的，但其含量极少，在通常饮食中不能期待其摄入量。也有报道利用市售通用蛋白酶水解乳清蛋白材料获得GTWY，然而，一般市售的通用蛋白酶不具有严格的切割特异性，且具有副活性，难以大量产生和积累特定肽。事实上，通过乳清蛋白的水解可以产生一定量的GTWY肽，但产生后，预计会进一步分解为色氨酸-酪氨酸(下文有时称为WY肽或简称WY)等。
另外，作为浓缩特定肽的方法，可以考虑使用反渗透膜或超滤膜来获得特定肽的方法(专利文献2和3)，或者吸附在柱树脂上进行洗脱的方法(专利文献4)等，但都需要在工业制造方面进行高昂的设备投资。
如上所述，仍然没有已知的无需特殊摸处理或分离处理的情况下，有效地制造出低成本且高GTWY含量的材料的方法。
另外，众所周知，蛋白质水解得到的肽类物质比原始蛋白质具有更强的苦味和涩味，因此添加到食品中时需要抑制异味。事实上，据报道，含有一定量的GTWY材料的饮料表现出苦味和涩味(专利文献1)。这样，当将该材料用于食品中时，还期望改善该材料的风味。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2017/086303说明书
专利文献2：日本特开第2003-92996号公报
专利文献3：日本特开第平6-7188号公报
专利文献4：日本特表第3108518号公报
非专利文献1：《神经科学前沿》，2019，13，399
非专利文献2：衰老的神经生物学，2018，72，23-31
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供一种有效地制造源自乳清蛋白的特定肽的方法。具体而言，本发明的目的是提供GTWY含量高且WY含量低，并且风味良好的材料以及使用该材料的食品。
用于解决问题的方案
为了达成上述目的，本发明的发明人等进行了反复的锐意研究，结果发现，在用蛋白酶水解含有乳清蛋白的材料时，通过将反应液的pH值维持在碱性侧，并进行较短时间的酶促反应，从而不仅能够促进从乳清蛋白中切出GTWY等的特定肽，还能抑制蛋白酶对GTWY的分解，从而能够制造出GTWY含量高且风味好的材料。即，本发明涉及能够有效地制造GTWY等特定肽的特定肽组合物的制造方法。特别地，本发明涉及提供含有高GTWY含量且WY含量低，并且风味良好的材料以及使用该材料的食品。具体而言，本发明具有以下结构。
<1>一种肽组合物的制造方法，通过使蛋白酶作用于含有乳清蛋白的材料来制造肽组合物的方法，其特征在于，使所述蛋白酶产生作用的反应开始时的反应液的pH值为大于7.0。
<2>根据<1>的肽组合物的制造方法，其中反应时间为5分钟以上且小于5小时。
<3>根据<1>或<2>的肽组合物的制造方法，其中乳清蛋白是β-乳球蛋白。
<4>根据<1>至<3>中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中所述蛋白酶源自蜂蜜曲霉。
<5>根据<1>至<4>中任一项所述的用于制备肽组合物的方法，其中所述肽组合物含有GTWY(甘氨酸-苏氨酸-色氨酸-酪氨酸)组合物。
<6>根据<1>至<5>中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，所述肽组合物为含有GTWY的组合物，其平均分子量为500以上，且GTWY相对于WY的摩尔比为2.0以上。
<7>一种肽组合物的制造方法，其特征在于，使蛋白酶作用于含有乳清蛋白的材料来制造肽组合物，其特征在于，将蛋白酶作用的反应液的pH值维持在6.6以上。
<8>根据<7>的肽组合物的制造方法，其中反应时间为5分钟以上且小于5小时。
<9>根据<7>或<8>所述的肽组合物的制造方法，其中，乳清蛋白为β-乳球蛋白。
<10>根据<7>～<9>中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，蛋白酶来自蜂蜜曲霉。
<11>根据<7>～<10>中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，肽组合物是含有GTWY的组合物。
<12>根据<7>～<11>中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，肽组合物为含有GTWY的组合物，其平均分子量为500以上，GTWY相对于WY的摩尔比为2.0以上。
<13>一种抑制GTWY分解的方法，其特征在于，通过使来源于蜂蜜曲霉的蛋白酶作用于含有乳清蛋白的材料来制造含有GTWY的组合物的方法中抑制GTWY分解的方法，其特征在于，将所述蛋白酶产生作用的反应开始时的反应液的pH值设为大于7.0。
<14>一种肽组合物，其特征在于，该肽组合物源自于乳清蛋白，其平均分子量为500以上。
<15>根据<14>所述的肽组合物，其中，所述肽组合物是含有GTWY的组合物，且GTWY相对于WY的摩尔比为2.0以上。
<16>一种食品饮料，其含有<15>所述的肽组合物，该食品饮料中的GTWY相对于WY的摩尔比为2.0以上。
发明效果
本发明的制造方法能够在使用蛋白酶水解含乳清蛋白的材料时仅通过调节pH值来提高特定肽的含量。因此，能够选择性且高效地制造例如GTWY等的肽。
附图说明
图1是示出以β-乳球蛋白为基质进行蛋白酶处理时的各水准的GTWY量的时间变化的图。
图2是示出以β-乳球蛋白为基质进行蛋白酶处理时的各水准的pH值的时间变化的图。
具体实施方式
本发明的制造方法是，通过控制在使用蛋白酶水解含有乳清蛋白的材料时的酶反应期间的pH值条件，来提高乳清蛋白衍生的特定肽的产量，并且能够抑制特定肽的分解。因此，根据该制造方法，能够提供风味良好且特定肽含量高的材料。
其中，特别地，本发明的制造方法可以通过控制当使用源自蜂蜜蜂蜜曲霉的蛋白酶水解含有GTWY序列的蛋白质材料时的酶反应的pH值条件来提高从乳清蛋白获得的GTWY的产量，并且能够抑制GTWY的分解。因此，根据该制造方法，能够提供风味良好且GTWY含量高的材料。下面对本发明进行详细说明。
(含有乳清蛋白的材料)
作为本发明的材料，使用含有乳清蛋白的材料，其中，优选使用含有GTWY序列的蛋白质材料。所谓含有GTWY序列的蛋白质材料，是指蛋白质结构的一部分含有由甘氨酸-苏氨酸-色氨酸-酪氨酸组成的氨基酸序列的肽(GTWY)的蛋白质，典型地例为含有β-乳球蛋白的材料。含有GTWY序列的蛋白质材料中还包含蛋白质降解产物。含有β-乳球蛋白的材料的例子包括牛奶、乳制品、乳清、乳清粉、浓缩乳清蛋白(WPC)和分离乳清蛋白(WPI)等。本发明进行蛋白质水解反应时，对材料的浓度没有特别限制，但是考虑到通常的制造步骤，蛋白质的量优选为约0.01％至50％(w/w)，更优选为约0.1％至20％(w/w)。
(蛋白酶)
在本发明中，用于水解含乳清蛋白材料的蛋白酶优选是源自蜂蜜曲霉的蛋白酶。作为来自蜂蜜曲霉菌的蛋白酶，已知有例如蛋白酶P“AMANO”3SD(天野酶)、蛋白酶(来自Aspergillus melleus的蛋白酶(SIGMA公司))、Sumizyme MP(新日本化学工业公司)和其他市售酶。对酶的添加量没有特别限制。考虑到合适的反应时间和制造成本，反应液中的酶浓度优选为约0.001％～10％，更优选为0.01％～5％，甚至更优选为0.01％～2％。
(酶反应)
本案发明人经过讨论发现，当酶反应的pH值为中性至碱性时，能够有效地生成GTWY肽等特定肽，并能够抑制其分解。一般来说，众所周知，当蛋白质被蛋白酶水解时，由于产生的肽的影响，pH值迅速下降。当水解百分之几或更多的蛋白质溶液来制造材料时，在通常的酶反应测试中使用约0.01～0.2M左右的缓冲液时很难维持pH值。因此，需要以保持反应过程中的pH值为中性至碱性的方式进行酶反应。
反应开始时的pH值优选大于pH值7.0，更优选pH值7.5以上。就理想范围而言，其应大于pH值7.0且为10.0以下，更优选pH值7.5以上且为9.5以下。
另外，反应期间的pH值应保持在6.6以上，更优选6.7以上，进一步优选7.0以上。理想的范围优选为pH值6.6以上且10.0以下，更优选pH值为6.7以上且9.5以下，并且还更优选7.0以上且9.0以下。
至于调节反应中pH值的方法，可以在开始反应前使用NaOH、KOH、(NH4)CO3等将酶反应开始时的pH值调节至中性至碱性。也可以在反应过程中间歇地添加碱性溶液使pH值恢复为碱性，或者可以使用碱性溶液作为中和剂来将pH值维持在固定水准并进行反应。
酶反应时间可根据目标特异性肽的量设定，一般为约5分钟至5小时左右。其中，当特定肽为GTWY时，理想的时间是GTWY的产生量大且GTWY不发生分解的时间，例如10分钟至4小时，更优选15分钟至3小时。另外，只要特定肽生成后不发生明显分解，可以延长酶反应时间，改变温度等条件，或者添加其他酶进行反应。
反应温度为约10℃至75℃，更优选为30℃至65℃。反应期间可以不进行搅拌，可以以约10rpm至500rpm进行搅拌，或者可以在将液体输送通过管道的同时进行反应。反应后，可以通过加热使酶失活，也可以通过超滤膜处理除去酶，还可以在将反应液粉碎或加工成食品的步骤中使酶失活。
(肽成分)
通过使用本发明的制造方法，能够从含有β-乳球蛋白等乳清蛋白的材料中高效地回收特定的肽。例如，如果特定肽是GTWY，则可以从材料中含有的含有GTWY序列的肽中回收15～90％的GTWY。另外，根据本发明的制造方法，由于能够抑制GTWY的分解，因此能够抑制作为其分解物的WY的生成，并且能够提高GTWY相对于WY的摩尔比(以下有时称为例如GTWY/WY的摩尔比、GTWY/WY摩尔比等)。本发明的含有GTWY的组合物的GTWY/WY摩尔比为约2以上，优选为3以上，更优选为4以上。当GTWY/WY的摩尔比小于2时，即生成的GTWY的1/3以上被分解，这不是获得GTWY的有效方法。
另外，本发明的肽组合物的平均分子量优选为500以上，更优选为700以上。一般来说，众所周知，蛋白质会被蛋白酶分解，产生具有苦味、鲜味等味道的肽和氨基酸。分子量小于500的氨基酸、二肽、三肽越多，味道就越差。
通过使用本发明的制造方法，能够抑制乳清蛋白的过度分解，并且能够制造GTWY等特定的肽。因此，能够获得风味良好且平均分子量为500以上的肽组合物。
当肽组合物为含有GTWY的组合物时，优选GTWY/WY摩尔比为2以上且平均分子量为500以上，更优选GTWY/WY摩尔比为3以上平均分子量为500以上。更优选GTWY/WY摩尔比为4以上且平均分子量为700以上。
对于使用本发明的含有GTWY的组合物的原材料、食品和饮料、药品等，可以通过测量其中所含有的GTWY的量和WY的量并求出其比率来进行检测。
本发明的肽组合物可以直接使用。另外，可以通过透析膜、离子交换树脂等对组合物进行脱盐，或者可以通过冷冻干燥、喷雾干燥等对组合物进行干燥和粉末化并使用。
另外，本发明的肽组合物可以混合到食品和饮料中使用。当掺混到食品和饮料中时，可以直接掺混本发明的肽组合物。另外，可以将肽组合物通过透析膜、离子交换树脂等脱盐，或者通过冷冻干燥、喷雾干燥等干燥、粉末化而掺混使用。
掺入本发明的肽组合物的食品和饮料的实例包括软饮料、乳饮料、发酵乳、奶酪、奶油、脱脂奶粉、果汁、果冻、面包、冰淇淋、面条、香肠和婴幼儿配方奶粉、婴儿食品等。
另外，本发明的肽组合物还可以用作药物和功能性食品。在这种情况下，本发明的肽组合物可以加工成片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、锭剂、舌下制剂或液体等口服制剂来使用。
[实施例]
以下示出本发明的实施方式和制造例，对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限于此。
[实施例1]酶反应中的pH值对β-乳球蛋白生产GTWY的影响
1.实验方法
以β-乳球蛋白为基质，考察了酶反应初始pH值(反应开始时的pH值)对GTWY产量的影响。将β-乳球蛋白(SIGMA)以达到8％(w/w)的方式溶解在20mM的缓冲液中，并将pH值调节至6.6、6.9、7.1、7.5和7.8。加热至50℃后，添加0.05％(w/v)的蛋白酶P“AMANO”3SD并开始反应，在反应30分钟后和1小时后分别收集样品并测量反应溶液的pH值和GTWY含量。GTWY的测定遵循阿野(Ano)等人的方法(非专利文献2)，使用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)进行定量。
2.检测结果
反应溶液中GTWY量随时间的变化如图1所示，pH值随时间的变化如图2所示。
当初始pH值为6.6至7.1水准时，GTWY在反应开始后30分钟达到峰值，然后下降，并且证实GTWY是同时生成和分解的。另外，反应开始30分钟后，pH值急剧下降，变为约pH值6.0～6.5。
另一方面，当初始pH值处于7.5至7.8水准时，在反应开始后30分钟GTWY的量较高，并且在反应开始1小时后GTWY的量维持不变。虽然反应开始后30分钟反应中的pH值下降，但保持在pH值6.6以上。
由以上结果可以确认，通过将含有蛋白酶的酶反应液的pH值维持在6.6以上，能够促进GTWY的生成，并且能够抑制GTWY的分解。
[实施例2]酶反应初始pH值对WPC给与GTWY生成的影响
1.实验方法
以WPC为基质，考察了酶反应初始pH值对GTWY产量的影响。将市售WPC溶解在加热至50℃的离子交换水中，使其达到13％(w/w)，并使用NaOH将pH值调节至6.5～9.0。添加蛋白酶P“AMANO”3SD至0.1％(w/v)并开始反应。反应开始1小时后收集样品并测量反应溶液的pH值和GTWY含量。
2.检测结果
反应后的GTWY量和pH值如表1所示。当初始pH值为6.5，7.0的水准时，反应后GTWY量较低，分别为79.8和148.8μg/ml，反应后pH值降至6.26～6.53。
另一方面，当初始pH值在7.7～9.0水准时，GTWY的量较高，为236.8～471.7μg/ml，反应后的pH值也维持在6.6以上，为6.73～7.02。
由以上结果确认，通过将蛋白酶的酶反应开始时的pH值设定为大于7.0的碱性侧，可以将酶反应期间的pH值维持在较高水准，并且能够提高GTWY的产量。
[表格1]
水准 初始pH 反应后pH 反应后的GTWY量(μg/mL)
① 6.5 6.26 79.8
② 7.0 6.53 148.8
③ 7.7 6.73 236.8
④ 8.0 6.80 251.5
⑤ 9.0 7.02 471.7
[实施例3]酶反应中的pH值对GTWY分解的影响
1.实验方法
以GTWY为基质，考察了酶反应过程中pH值条件对蛋白酶分解GTWY的影响。在pH值为6.4～8.9配制的20mM磷酸盐缓冲液中添加化学合成的GTWY使其成为0.2mg/ml，并添加0.01％蛋白酶P“AMANO”3SD，在50℃下进行反应持续2个小时。当使用GTWY作为基质时，没有发生由于蛋白质分解而导致的pH值下降，并且确认了反应前后pH值没有变化。采用高效液相色谱法(HPLC)测定反应后剩余的GTWY及其分解产物WY的量。
2.检测结果
反应开始时的GTWY量、反应后的GTWY量和WY量以及GTWY的分解率的测定结果((反应开始时的GTWY量-反应后的GTWY量)/反应开始时的GTWY量)如表2所示。
在反应pH值为6.4的条件下，反应2小时内约50％的GTWY分解，并产生81.3μM的分解产物WY。
另外，在反应pH值为7.4的条件下，反应2小时内约40％的GTWY分解，并产生57.3μM的分解产物WY。
另一方面，在pH值为8.1～8.9的条件下，GTWY的分解被抑制到约9～23％，并且WY的产生量也较低(8.3～37.5μM)。由以上结果可知，通过将蛋白酶的酶反应液的pH值维持在碱性侧，能够抑制GTWY的分解。
[表2]
[实施例4]通过pH值被恒定的酶处理来制造GTWY高含量材料的实验生产
1.实验方法
使用WPC作为含有GTWY序列的蛋白质材料，尝试在将酶反应时的pH值恒定保持在碱性侧的条件下制造含有GTWY的组合物。
将市售WPC溶解在离子交换水中至16％(w/w)，加热至50℃，并用NaOH(WPC溶液)将pH值调节至7.5。向上述WPC溶液中添加蛋白酶P“AMANO”3SD至0.1％(w/v)，并开始反应。使用小型发酵罐(总容量2L微生物培养系统BMJ-02NC；ABLE公司)，在50℃下进行反应5小时，并且同时添加中和剂(NaOH)使得pH值维持在7.5。反应开始后1小时和5小时采集样品，并测量反应溶液中的GTWY的量。
2.检测结果
反应液中GTWY的量在1小时后为701.6μg/ml，在5小时后为851.6μg/ml。冻干后GTWY含量分别为4.4mg/g和5.3mg/g。因此，获得了具有高GTWY含量的组合物。
[实施例5]GTWY高含量材料的试制
1.实验方法
(1)本发明的测试方法
使用WPC作为含有GTWY序列的蛋白质材料，将酶反应开始时的pH值调至碱性侧，来试制造高含量的GTWY材料。试制造分两个水准(级别)进行(表3)。将市售WPC溶解在离子交换水中至16％(w/w)，加热至50℃，并使用NaOH将pH值调节至8.5。在水准1中添加蛋白酶P“AMANO”3SD为0.06％(w/v)，在水准2中添加蛋白酶P“AMANO”3SD为0.1％(w/v)，并在水准1中48℃下进行2小时的酶反应，在水准2中50℃下进行30分钟的酶反应。90℃下加热20分钟灭活酶后，冷冻干燥，得到GTWY高含量材料1和2。
(2)比较例
作为比较对象，参照专利文献1的方法，使用现有的制造方法制造GTWY材料。将市售WPC材料溶解在离子交换水中至10％(w/w)，加热至50℃，并使用NaOH(WPC溶液)将pH值调节至7.0。在上述WPC溶液中，添加蛋白酶P“AMANO”3SD至0.2％(w/v)，并在50℃下进行酶反应5小时。然后，将反应溶液在90℃下加热20分钟以使酶失活。将反应溶液冷冻干燥，利用现有的制造方法得到含有GTWY的物质(比较例中含有GTWY的物质)。
2.检测结果
各材料中的GTWY含量、WY含量、GTWY/WY摩尔比、平均分子量如表3所示。GTWY/WY的摩尔比是以GTWY的分子量为525.54、WY的分子量为367.41而计算出的。
本发明的GTWY高含量材料中GTWY含量在水准1中为5.1mg/g，在水准2中为3.4mg/g，均保持非常高的含量，材料中的WY含量在水准1中为0.2mg/g，在水准2中为0.1mg/g，均为较低。因此，GTWY/WY的摩尔比均在水准1中为17.0，在水准2中为23.5，均显示出较高的值。另外，GTWY高含量材料的平均分子量在水准1级中为786Da，在水准2中为1024Da。
比较例的GTWY材料中GTWY含量为0.8mg/g，WY含量为0.3mg/g，GTWY/WY摩尔比为1.9。该材料的平均分子量为309Da。酶反应开始后30分钟pH值为6.2，5小时后pH值为6.0。因此，可以认为GTWY是在酶反应过程中发生分解。
由上述结果可以看出，通过采用本发明的技术，在短时间内能够提供GTWY含量、GTWY/WY的摩尔比以及平均分子量较高的材料。
[表3]
[实施例6]GTWY高含量材料感官评价测试
1.实验方法
将实施例5制备的GTWY高含量材料2与现有制备方法制备的GTWY材料(对比例)的苦味进行比较。让10名品尝者将20mg材料粉末放在舌头上品尝，并根据以下标准所示的4分法评价苦味。
<苦味评价结果基准>
3分；强苦味
2分；感觉苦味
1分；轻微的苦味
0分；完全没有苦味
2.检测结果
比较10位品尝者的平均分，可以确认比较例的GTWY材料的平均分为2.4，苦味较强。相比之下，本发明的GTWY高含量材料的平均分为1.4，确认苦味降低。
[表4]
[实施例7]含有GTWY高含量物质的牛奶的感官评价试验
1.实验方法
对含有实施例5制备的GTWY高含量材料的奶进行感官评价。在市售牛奶中添加0.67％的GTWY高含量材料(GTWY含量为2.3mg/100g)而制成。作为比较对象，在实施例5的比较例中制备的GTWY材料添加到奶样品(GTWY含量：1.1mg/100g)中至1.45％，并制备不含GTWY材料的牛奶。让10名品尝者品尝3个样品，并按照如下所示的4分法评价苦味和美味。
<苦味评价结果基准>
3分；强苦味
2分；感觉苦味
1分；轻微的苦味
0分；完全没有苦味
<美味评价结果基准>
3分；美味
2分；有点美味
1分；有点不好吃
0分；不好吃
2.检测结果
比较了10位品尝者的平均分，其结果，含有比较例中制备的GTWY材料的样品不仅苦，而且味道评价较低。另一方面，添加GTWY高含量材料2的样品几乎没有苦味，并且与未添加GTWY材料的样品相比，味道评价存在轻微差异。由此确认，通过使用GTWY高含量材料，能够在不损害产品风味的情况下以高浓度摄取GTWY。
[表5]
[实施例8]当使用源自密封曲霉的不同的酶时，酶反应的初始pH值对WPC给与GTWY产生的影响
1.实验方法
为了研究可用于该专利技术的酶，使用了与实施例1中使用的蛋白酶P“AMANO”3SD不同的来自蜂蜜曲霉的蛋白酶(SIGMA公司)，来研究酶反应初始pH值对GTWY生产的影响。
将市售WPC溶解在加热至50℃的离子交换水中，以达到13％(w/w)，用NaOH调节pH值至6.5～9.0。添加0.1％(w/v)来自蜂蜜曲霉(SIGMA公司)的蛋白酶，并开始反应。反应开始2小时后(反应后)采集样品，测定反应液的pH值和GTWY含量。
2.检测结果
初始pH值以及反应后的GTWY量和pH值见表6。与使用蛋白酶P“AMANO”3SD的情况同样地，确认初始pH值越偏碱性，GTWY的生成量越增加。因此，在本发明中，证实来自蜂蜜曲霉菌的蛋白酶可以不受物种限制而广泛使用。
[表6]
水准 初始pH 反应后pH 反应后的GTWY量(μg/mL)
① 6.5 6.2 429
② 7.5 6.75 652
③ 9 7.01 945
[实施例9]含有GTWY的胶囊的制备
将10g实施例5中制备的GTWY高含量材料2、乳糖33.5g、可溶性淀粉56.0g、硬脂酸镁0.5g混合后，按常规方法制粒，装入胶囊中，制备了本发明的含有GTWY的胶囊。
[实施例10]含有GTWY的饮料的制备
将10g实施例5中制备的GTWY高含量材料2溶解在690g去离子水中，加热至40℃，并使用高速分散机(ULTRA-TURRAX T-25；IKA JAPAN Co.，Ltd.制造)以9，500rpm搅拌混合20分钟。加入麦芽糖醇100g、酸味剂2g、还原麦芽糖20g、香料2g、去离子水176g后，装入100ml玻璃瓶中，95℃灭菌15秒后密封，调节制得含有本发明的GTWY的饮料10瓶(每瓶100ml)。
[实施例11]含有GTWY的乳饮料的制备
将100g实施例5中制备的GTWY高含量材料2和9.9kg牛奶混合，加热至40℃，并使用TK乳化机(TK ROBO MICS；由Tokushu Chemical Industry Co.制造)以6，000rpm搅拌混合10分钟。130℃加热灭菌2秒后，冷却至10℃以下，制得含有本发明的GTWY的乳饮料10kg。
[实施例12]含有GTWY的发酵乳的制备
将100g实施例5中制备的GTWY高含量材料2、1600g脱脂奶粉、300g葡萄糖和7700g去离子水混合，在95℃下保持2小时而加热灭菌。冷却至37℃，接种300g乳酸菌(Lb.casei)，搅拌混匀，在37℃培养箱中发酵至pH值4.0。pH值达到4.0后，冷却至10℃以下，即制得含有本发明的GTWY的发酵乳10kg。
[实施例13]含有GTWY的干酪的制备
将9.5kg高达干酪、9.5kg切达干酪、100g实施例5制备的GTWY高含量材料2、200g柠檬酸钠、700g去离子水混合，并在85℃下乳化。乳化后，将奶酪装入纸箱中，并在5℃下冷却2天，制得含有本发明的GTWY的奶酪20kg。
[实施例14]含有GTWY的鲜奶油的制备
将4.5kg氢化菜籽油、40g卵磷脂、10g脂肪酸单甘油酯和10g脂肪酸山梨糖酯混合制备油相。然后，将100g实施例5制备的GTWY高含量材料2、脱脂奶粉308g、酪蛋白酸钠10g、脂肪酸蔗糖酯20g、磷酸盐10g、三仙胶5g、4.987kg去离子水混合以制备水相。将水相加热至65℃，边搅拌边逐渐少量地添加加热至70℃的油相，使用TK乳化机(TK ROBO MICS；由Tokushu Chemical Industry Co.，Ltd.制造)以6，000rpm搅拌混合10分钟。用均质机将该混合物均质化，制得含有本发明的GTWY的鲜奶油10kg。
[实施例15]含有GTWY的布丁的制备
将2000g蜂蜜、100g实施例5制备的GTWY高含量材料2、770g脱脂奶粉、300g马斯卡彭奶酪、700g液体麦芽糖、500g白砂糖、250g鲜奶油、200g稀奶油，400克加糖蛋黄液、40克明胶、15克香兰粉、120克刺槐豆胶和4605克去离子水混合，制成布丁混合物。使用TK乳化机(TK ROBO MICS；由Tokushu Chemical Industry Co.，Ltd.制造)将该布丁混合物在6，000rpm下搅拌混合10分钟，加热至60℃并溶解，然后以100g分别填充到容器中并冷却，制得含有本发明的GTWY的布丁100块。
[实施例16]含有GTWY的奶粉的制备
将1kg实施例5制备的GTWY高含量物料2、8.3kg脱脂奶粉、90kg去离子水混合，加热至40℃后，使用TK乳化机(TK ROBO MICS；由Tokushu Chemical Industry Co.，Ltd.制造)以6，000rpm混合10分钟。将该溶液喷雾干燥，制得含有本发明的GTWY的奶粉约10kg。
[实施例17]含有GTWY的清凉饮料的试制
通过在清凉饮料的制造过程中进行酶处理，试制了含有GTWY的清凉饮料。将16g市售WPC溶解在84g蒸馏水中，加热至50℃，并用NaOH调节pH值至8.5。添加蛋白酶P“AMANO”3SD以达到0.1％(w/v)，并在50℃下进行酶反应30分钟。在其他容器中，先将10g脱脂奶粉、100g砂糖、5g柠檬酸、2.5g柠檬酸三钠、5g果胶溶解在778ml蒸馏水中，与酶处理过的WPC溶液混合，然后在90℃下加热灭菌20分钟，装入100ml塑料瓶中。
[工业适用性]
根据本发明的制造方法，仅通过调节用蛋白酶水解含乳清蛋白材料时的pH值，就能够提高特定肽的含量并且能够选择性地浓缩肽。此外，由于它不需要昂贵的设备，因此可以很容易地引入工厂。而且，由于酶反应时间短，生产效率高，在生产流水线上也可以连续生产。
此外，由于本发明的含有GTWY的组合物能够抑制过度的蛋白质分解并有效地生成GTWY，所以具有平均分子量为500以上且风味良好的优点。因此，即使添加到食品和饮料中，也能增加肽含量，而不会对食品和饮料的原有风味产生不利影响，具有很高的利用价值。

Claims (16)

1.一种肽组合物的制造方法，通过使蛋白酶作用于含有乳清蛋白的材料来制造肽组合物的方法，其特征在于，使所述蛋白酶产生作用的反应开始时的反应液的pH值为大于7.0。
2.根据权利要求1所述的肽组合物的制造方法，其中，
反应时间为5分钟以上且小于5小时。
3.根据权利要求1或者2所述的肽组合物的制造方法，其中，
所述乳清蛋白为β-乳球蛋白。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，
所述蛋白酶来源于蜂蜜曲霉。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，
所述肽组合物是含有GTWY的组合物。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，
所述肽组合物为含有GTWY的组合物，其平均分子量为500以上，且所述GTWY相对于WY的摩尔比为2.0以上。
7.一种肽组合物的制造方法，通过使蛋白酶作用于含有乳清蛋白的材料来制造肽组合物的方法，其特征在于，将所述蛋白酶作用的反应液的pH值维持在6.6以上。
8.根据权利要求7所述的肽组合物的制造方法，其中，
反应时间为5分钟以上且小于5小时。
9.根据权利要求7或8所述的肽组合物的制造方法，其中，
所述乳清蛋白为β-乳球蛋白。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，
所述蛋白酶来源于蜂蜜曲霉。
11.根据权利要求7～10中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，
所述肽组合物是含有GTWY的组合物。
12.根据权利要求7～11中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，
所述肽组合物为含有GTWY的组合物，其平均分子量为500以上，且所述GTWY相对于WY的摩尔比为2.0以上。
13.一种抑制GTWY分解的方法，其特征在于，通过使来源于蜂蜜曲霉的蛋白酶作用于含有乳清蛋白的材料来制造含有GTWY的组合物的方法中抑制GTWY分解的方法，其特征在于，将所述蛋白酶产生作用的反应开始时的反应液的pH值设为大于7.0。
14.一种肽组合物，其特征在于，该肽组合物源自于乳清蛋白，其平均分子量为500以上。
15.根据权利要求14所述的肽组合物，其中，
所述肽组合物为含有GTWY的组合物，并且所述GTWY相对于WY的摩尔比为2.0以上。
16.一种食品饮料，其特征在于，其含有权利要求15所述的肽组合物，所述食品饮料中的所述GTWY相对于WY的摩尔比为2.0以上。
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