CN117964588A - 一种异土木香内酯的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种异土木香内酯的制备方法，包括土木香药材粉碎、提取、大孔树脂洗脱、硝酸银‑硅胶柱层析分离等步骤；本发明制备的异土木香内酯对结肠癌和中枢神经癌有强烈的抑制作用；本发明应用大孔树脂和硝酸银‑硅胶柱技术的优势，设备材料成本低，工艺流程清晰，处理量大，操作简便，产品色度好、得率和含量高，适合于异土木香内酯的工业化制备。
Description
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种异土木香内酯的制备方法。
背景技术
土木香(Inula Radix)药材是菊科旋覆花属植物土木香Inula helenium L.的干燥根，辛、苦、温，具有健脾和胃、行气止痛的功效，为2010版《中国药典》收载。土木香药材中含有较多的倍半萜内酯类成分，该类成分具有较好的抗肿瘤活性以及抗炎活性而日渐被关注(1.王良言，土木香乙醇提取物的镇痛作用，国外医药，植物药分册，2004,19(6)：262.小西天二，土木香中抑制肿瘤细胞增殖的成分，国外医学中医中药分册，2003,25(3):174)。从土木香中分离得到的倍半萜内酯类成分包括土木香内酯、异土木香内酯、木香烃内酯、二氢木香烃内酯、凤毛菊内酯等，其中土木香内酯和异土木香内酯的含量较高。
据报道，异土木香内酯对人脑神经胶质瘤细胞、人肝癌细胞、人和色素瘤细胞和人乳腺癌脑转移肿瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用。
CN101624387A、CN102160863A均公开了一种异土木香内酯的提纯制备方法，其以土木香为原料，用90％-99％的乙醇冷浸提取，滤液减压浓缩得浸膏；将浸膏悬浮在饱和的盐水中，在60～90℃条件下，用石油醚萃取3次，合并石油醚萃取液，并用无水Na2SO4脱水后减压浓缩至近干，分别得石油醚提取物；采用硅胶柱色谱进行分离，石油醚－乙酸乙酯溶剂系统进行梯度洗脱，依次用乙酸乙酯、甲醇冲柱至洗脱完全，洗脱液按体积接收，每份500mL，减压浓缩各流份将相同流份，进行合并；在8-19流份得化合物异土木香内酯。该提纯制备方法步骤繁琐，收率低，纯度仅87.6％。
CN102558120A公开了一种同时制备土木香内酯和异土木香内酯的方法，包括将溶剂系统置于分液漏斗中分层，取上相为固定相，下相为流动相，取土木香提取物溶解于下相中，将固定相用泵灌满分离柱，连接柱首端与进样阀，调节流动相流速和主机转速，收集分离物。该制备方法采用的工艺设备复杂，成本高，不适于工业化生产。
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的是提供一种异土木香内酯的制备方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种异土木香内酯的制备方法，包括以下步骤：
1)、土木香药材粉碎后，用溶剂连续回流提取，合并提取液并浓缩成浸膏；
2)、步骤1)中得到的浸膏加水热溶后上大孔树脂柱，依次用纯化水、50％乙醇和95％乙醇进行洗脱，回收95％乙醇部分，浓缩至浸膏后用浸膏质量1-3倍的硅胶拌样，优选用浸膏质量2倍的硅胶拌样；
3)、步骤2)中的拌样上硝酸银-硅胶柱，依次用不同的洗脱溶剂洗脱，薄层监测后，合并含异土木香内酯部分的流出液，浓缩至干，即得异土木香内酯；所述硝酸银-硅胶柱中硝酸银的质量百分比为0.5％-2％，优选为1.2％。
其中，步骤1)中的溶剂是纯化水、乙醇、甲醇中的一种或其中任意几种的任意比例的混合溶媒，每次溶剂量为土木香药材重量的3～15倍量，优选为6倍量，提取温度为30～80℃，优选为60℃。
其中，步骤1)中的溶剂是乙醇，提取次数为1～3次，优选为2次；提取时间为1～4小时，优选为2小时。
其中，步骤1)中加水溶解所需的量为浸膏重量的2～8倍量。
其中，步骤2)中所述的大孔树脂型号为D101、AB-8、ADS-7、XAD-2和D296中的一种。
其中，步骤3)中所述的硝酸银-硅胶其粒度为60-400目。
其中，步骤3)中所述的洗脱体系依次分别为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、环己烷丙酮、乙醇、甲醇中的一种或其中任意几种的任意比例的混合溶媒。
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：
①发明提供了一种全新的异土木香内酯的提取分离方法。
②本发明所述的制备方法，充分应用了大孔树脂和硝酸银-硅胶柱技术的优势，设备和材料成本低，工艺流程清晰，处理量大，操作简便，产品色度好、得率和含量高，适合于工业化大生产。
③本发明所制备的异土木香内酯，可以加入药学上可以接受的载体制成片剂、胶囊剂或注射液，用于医药和保健领域，使得中药土木香得到更加高效及广泛地应用。
本发明还意外地发现异土木香内酯对结肠癌细胞和中枢神经癌细胞有强烈的抑制作用，因此本发明还提供异土木香内酯在制备治疗结肠癌和中枢神经癌疾病药物中的一种新用途。
本发明异土木香内酯的HPLC分析方法如下：
流动相A：乙腈60％；
流动相B：0.03％ H3PO4水溶液40％；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
样品浓度：0.5mg/ml，甲醇溶解；
进样体积：5μL。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的异土木香内酯的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡按照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
土木香药材2kg经粉碎后，用药材重量6倍量的95％乙醇连续回流提取两次，提取温度65℃，提取2小时，合并提取液并浓缩至浸膏状，加入浸膏重量4倍量的水热溶，上D101型号大孔树脂柱，依次用纯化水、50％乙醇和95％乙醇进行洗脱，回收95％乙醇部分，浓缩至浸膏后用浸膏质量2倍的硅胶拌样，上硝酸银-硅胶柱，粒度为200目，硝酸银的质量百分比为2％；依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯:乙醇(V:V＝10:1)、乙酸乙酯:乙醇(V:V＝4:1)的洗脱体系洗脱，薄层监测后，合并含异土木香内酯部分的流出液，浓缩至干，即得异土木香内酯18.3g，经检测异土木香内酯质量含量为99.4％。
实施例2
土木香药材2kg经粉碎后，用药材重量3倍量的95％乙醇连续回流提取两次，提取温度50℃，提取2小时，合并提取液并浓缩至浸膏状，加入浸膏重量8倍量的水热溶，上AB-8型号大孔树脂柱，依次用纯化水、50％乙醇和95％乙醇进行洗脱，回收95％乙醇部分，浓缩至浸膏后用浸膏质量2倍的硅胶拌样，上硝酸银-硅胶柱，粒度为200目，硝酸银的质量百分比为2％；依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯:丙酮(V:V＝12:1)、乙酸乙酯:丙酮(V:V＝5:1)的洗脱体系洗脱，薄层监测后，合并含异土木香内酯部分的流出液，浓缩至干，即得异土木香内酯18.9g，经检测异土木香内酯质量含量为99.0％。
实施例3
土木香药材2kg经粉碎后，用药材重量8倍量的甲醇连续回流提取两次，提取温度60℃，提取4小时，合并提取液并浓缩至浸膏状，加入浸膏重量2倍量的水热溶，上XAD-2型号大孔树脂柱，依次用纯化水、50％乙醇和95％乙醇进行洗脱，回收95％乙醇部分，浓缩至浸膏后用浸膏质量3倍的硅胶拌样，上硝酸银-硅胶柱，粒度为400目，硝酸银的质量百分比为3％；依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯:乙醇(V:V＝10:1)、乙酸乙酯:乙醇(V:V＝4:1)的洗脱体系洗脱，薄层监测后，合并含异土木香内酯部分的流出液，浓缩至干，即得异土木香内酯18.6g，经检测异土木香内酯质量含量为99.3％。
实施例4
土木香药材2kg经粉碎后，用药材重量15倍量的纯化水连续回流提取3次，提取温度80℃，提取1小时，合并提取液并浓缩至浸膏状，加入浸膏重量2倍量的水热溶，上ADS-7型号大孔树脂柱，依次用纯化水、50％乙醇和95％乙醇进行洗脱，回收95％乙醇部分，浓缩至浸膏后用浸膏质量2倍的硅胶拌样，上硝酸银-硅胶柱，粒度为100目，硝酸银的质量百分比为1％；依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯:乙醇(V:V＝10:1)、乙酸乙酯:乙醇(V:V＝4:1)的洗脱体系洗脱，薄层监测后，合并含异土木香内酯部分的流出液，浓缩至干，即得土木香皂18.8g，经检测异土木香内酯质量含量为98.5％。
实施例5
土木香药材2kg经粉碎后，用药材重量3倍量的甲醇连续回流提取3次，提取温度30℃，提取4小时，合并提取液并浓缩至浸膏状，加入浸膏重量6倍量的水热溶，上D296型号大孔树脂柱，依次用纯化水、50％乙醇和95％乙醇进行洗脱，回收95％乙醇部分，浓缩至浸膏后用浸膏质量3倍的硅胶拌样，上硝酸银-硅胶柱，粒度为300目，依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯:乙醇(V:V＝10:1)、乙酸乙酯:乙醇(V:V＝4:1)的洗脱体系洗脱，薄层监测后，合并含异土木香内酯部分的流出液，浓缩至干，即得异土木香内酯17.4g，经检测异土木香内酯质量含量为99.3％。
抗结肠癌、中枢神经癌症生物测试例：
本发明制得的异土木香内酯体外抗肿瘤活性实验用GI50值(50％细胞生长抑制所需要的浓度)来评定：将肿瘤细胞培养在10％小牛血清的RPMI1640培养基中，内含适量青、链霉素和谷氨酰胺，在5％CO2，37℃条件下培养。试验前将细胞按一定密度接种于96孔培养基中，24h后换用含不同浓度受试药物(用PBS配置成1μg/mL工作液，使用时按所需浓度用培养基稀释并加入细胞)的新鲜培养基，继续培养48h。终止培养，每孔加入50uL预冷50％三氯乙酸(TCA，终浓度为10％)，静置5分钟后移放于4℃环境1h。蒸馏水洗涤5次，空气干燥，加入100μL SRB染液(用1％醋酸配制成0.4％溶液)，染色处理细胞10min，用1％醋酸溶液洗涤细胞4次，除去未结合染料，空气干燥。最后加入150uL 10mmol/L非缓冲Tris溶液溶解结合染料，充分混匀后，经酶标仪在490nm波长下测定并计算GI50。
以本发明实施例1制得的异土木香内酯为检测样品，测得异土木香内酯对结肠癌细胞的GI50为1.6×10-7mol/L，即0.16μM；对中枢神经癌细胞的GI50为1.1×10-7mol/L，即0.11μM；均显示出强烈的抑制活性。
Claims (10)
1.一种异土木香内酯的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：
1)、土木香药材粉碎后，用溶剂连续回流提取，合并提取液并浓缩成浸膏；
2)、步骤1)中得到的浸膏加水热溶后上大孔树脂柱，依次用纯化水、50％乙醇和95％乙醇进行洗脱，回收95％乙醇部分，浓缩至浸膏后硅胶拌样；
3)、步骤2)中的拌样上硝酸银-硅胶柱，依次用不同的洗脱溶剂洗脱，薄层监测后，合并含异土木香内酯部分的流出液，浓缩至干，即得异土木香内酯；所述硝酸银-硅胶柱中硝酸银的质量百分比为0.5％-2％。
2.根据权利要求1所述的一种异土木香内酯的制备方法，其特征在于，
步骤1)中的溶剂是纯化水、乙醇、甲醇中的一种或其中任意几种的任意比例的混合溶媒，每次溶剂量为土木香药材重量的3～15倍量，提取温度为30～80℃。
3.根据权利要求1所述的一种异土木香内酯的制备方法，其特征在于，
步骤1)中的溶剂是纯化水、乙醇、甲醇中的一种或其中任意几种的任意比例的混合溶媒，每次溶剂量为土木香药材重量的6倍量，提取温度为60℃。
4.根据权利要求2所述的一种异土木香内酯的制备方法，其特征在于，
步骤1)中的溶剂是乙醇，提取次数为1～3次，提取时间为1～4小时。
5.根据权利要求4所述的一种异土木香内酯的制备方法，其特征在于，
步骤1)中提取次数为2次，提取时间为2小时。
6.根据权利要求1所述的一种异土木香内酯的制备方法，其特征在于，
步骤1)中加水溶解所需的量为浸膏重量的2～8倍量。
7.根据权利要求1所述的一种异土木香内酯的制备方法，其特征在于，
步骤2)中所述的大孔树脂型号为D101、AB-8、ADS-7、XAD-2和D296中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种异土木香内酯的制备方法，其特征在于，
步骤2)中所述的硅胶拌样，采用1-3倍浸膏质量的硅胶进行拌样。
9.根据权利要求1所述的一种异土木香内酯的制备方法，其特征在于，
步骤3)中所述的洗脱体系依次分别为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、环己烷、丙酮、乙醇、甲醇中的一种或其中任意几种的任意比例的混合溶媒。
10.权利要求1-9制备的异土木香内酯在制备治疗结肠癌和中枢神经癌疾病药物中的应用。
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