CN117838829A - 一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,采用当归、黄精及海参为原材料,通过提取复配组合过程,制备改善机体疲乏的中药组合物,组方中的黄精味甘,性平,无毒,入肺、脾、肾经,既顾先天之本肾,又顾后天之本脾胃味甘,主补中益气,除分湿,安五脏,久服轻身、延年、不饥,可用于脾胃气虚、体倦乏力、肺虚燥咳、精血不足、腰膝酸软;当归味甘、辛、苦,性温,入肝经、心经、脾经,具有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效;组方同时增加了海参,强调了海参成分有助于“补肾益精,除湿壮阳,养血润燥”的功能,突出了组方协同增效的创新性特点;本发明在药效实验中证实了组方具有改善炎症关联性疲劳的功效,且在一定的配比范围内均具有显著药效,为人群的机体亚健康的预防及改善提供支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物。
背景技术
机体疲劳是一种复杂的生理和病理现象,它既标志着机体原有工作能力的暂时下降,又可能是机体发展到疾病状态的先兆,涉及生理与病理两个方面。生理性疲劳是机体发生剧烈体力劳动后引起的肌肉疲劳,体内代谢产物过量堆积而发出的保护信号,可以通过休息或生活方式的改变得到缓解,是中枢神经系统和外周肌肉组织相互作用的结果。病理性疲劳主要指疾病伴随发生的疲劳以及疲劳相关性疾病。与生理性疲劳相比,病理性疲劳不会随着休息而改善,它更强烈,持续时间更长,对个体的功能活动和生活质量造成更严重的损害,通常与慢性疲劳综合症等同,中医称之为疲劳病或虚损。患有疲劳病的病人除了机体疲乏外,还伴有记忆力下降和注意力难以集中,咽喉肿痛、淋巴结肿大,无原因的关节及肌肉酸痛,睡眠障碍,运动后体力长时间难以恢复等症状。疲劳病的诱发原因是复杂的,可由长期超负荷工作或短期内重度疲劳引起,通常还与身体虚弱、感染、免疫力低下、慢炎性疾病或者恶性病的发生发展关联。目前有较多研究表明炎症与疲劳密切相关,在动物模型研究中,注射或诱导促炎细胞因子会导致运动活动减少以及食物和水摄入量减少、社交退缩、快感缺乏和认知改变(可能是疲劳的行为表现);在临床实验研究中,内毒素给药后疲劳增加,这与促炎细胞因子循环浓度的升高有关;在观察性研究中,炎症标志物的亚临床水平前瞻性地预测了健康个体的疲劳发展,此外,阻断促炎细胞因子TNF-α的药物可减轻炎症性疾病患者的疲劳。以上研究显示炎症在诱发疲劳中起着很大的作用,这为炎症作为疲劳的潜在机制提供了强有力的生物学依据。
调研数据显示,随着我国人口老龄化的发展,易疲劳人群数量激增,特别是上班族及青少年学生人群,随着工作与学习压力的增加,群体中表现为易机体疲劳状态的人愈来愈多。我国成年人中随着年龄增长,健康状况会随之下降,40岁到55岁人群越来越忧虑过劳死的问题。临床上应对疲劳综合征的治疗及预防药物非常有限,常用药为抗抑郁药,多属于处方药及管制类的精神药物。目前市场上迫切需要一些能够有效改善机体长期疲劳状态的抗疲劳产品。抗疲劳保健品与中药的研发是一个重要的方向,与当前国家及社会各层面对中医药支持与推动的大背景前提下,抗疲劳产品的作用特点及研究深度仍有待于提高,需继续研究疲劳的关联因素及复杂生物学机制。目前针对未成年人群(学生)的养生类保健品强调一个“增补”,重视青少年产生疲劳的深层次因素及过度用脑和精神压力问题。产品集中在“健脑益智”和“强身健体”两类,主要提高青少年记忆力、改善注意力等智力问题,以及增强青少年身体质素。而对于改善学生群体由于心理、精神压力过重、感染及慢病而产生的疲劳综合症产品存在空隙。针对这一现状,在中医虚损病的辨证论治理论指导下,利用中药经典名方理论的组方策略,结合补益中药的化学成分研究及现代药理学研究成果,采用药食两用中药当归、黄精及海参为主要原材料,通过提取复配组合过程,研制开发一款可显著改善炎症关联性疲劳的中药组合物产品,可为现代相应人群的机体亚健康的预防及改善提供支持。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处,提供一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物。
为了实现本发明的目的,我们将采用如下所述的技术方案加以实施:
一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,其特征在于,所述的中药组合物的组分包括按照质量比1~10:1~10:1~10配置的黄精、当归和海参肽,由黄精、当归和海参肽均匀混合而成的组合物,通过减轻肝脏和脾脏水肿,缓解肾脏萎缩和提高胸腺免疫能力来改善机体疲劳;通过减少体内代谢物堆积,增强肝脏和骨骼肌的糖原储存,增加供能,改善机体疲劳;通过抑制NF-κB p65的磷酸化调控炎症因子分泌,改善机体疲劳。
作为本发明的优选方案,所述黄精为黄精提取物,产物得率为投料饮片的10-20%,总多糖以葡萄糖计不低于60%。
作为本发明的优选方案,所述的当归为当归提取物,产物得率为投料饮片的10-20%,阿魏酸含量不低于0.05%。
作为本发明的优选方案,所述的海参肽是以小分子活性肽为主要成分,抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗疲劳、免疫调节等多种功效共存的蛋白质水解物。
作为本发明的优选方案,所述的活性肽中的低聚肽含量不低于80%以及海参硫酸化岩藻聚糖含量不低于5%。
作为本发明的优选方案,所述的中药组合物的优选组分为按照质量比3:3:4配置的黄精、当归和海参肽。
作为本发明的优选方案,所述黄精为黄精提取物,总多糖以葡萄糖计不低于60%。
作为本发明的优选方案,所述的当归为当归提取物,阿魏酸含量不低于0.05%。
组方中黄精味甘,性平,无毒,入肺、脾、肾经。既顾先天之本肾,又顾后天之本脾胃味甘,为补益脾阴之良品,主补中益气,除分湿,安五脏,久服轻身、延年、不饥,可用于脾胃气虚、体倦乏力、肺虚燥咳、精血不足、腰膝酸软等症。组方中当归味甘、辛、苦,性温,入肝经、心经、脾经,具有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效,历代中医家称赞当归为补血活血之圣药。组方同时增加了中药海参成分,强调了海参成分有助于“补肾益精,除湿壮阳,养血润燥”的功能,突出了组方协同增效的创新性特点。
有益效果
1、黄精当归海参肽组方能增强机体运动能力,改善机体疲劳。
2、黄精当归海参肽组方减轻肝脏和脾脏水肿,缓解肾脏萎缩,提高胸腺免疫能力来改善机体疲劳。
3、黄精当归海参肽组方可通过减少体内代谢物堆积,增强肝脏和骨骼肌的糖原储存,增加供能,改善机体疲劳。
4、黄精当归海参肽组方通过抑制炎症因子分泌发挥改善机体疲劳作用。
5、黄精当归海参肽组方发挥抗炎作用机制可能是其抑制了LPS诱导的NF-κB p65磷酸化。
6、与黄精当归基础方相比,海参肽的加入,使黄精当归海参肽组方在提高小鼠爬杆和负重游泳能力、增加肝糖原和肌糖原储存、抑制炎症因子IL-6分泌等方面有显著提升作用,提示黄精当归海参肽组方比中药黄精、当归基础方具有更优的改善机体疲劳的作用。
附图说明
图1为组方改善炎症关联性疲劳作用的实验进程安排图;
图2为组方改善炎症关联性疲劳实验中小鼠体重变化;
其中,NC:空白组,MC:模型组,PA:待试药1组,AS:待试药2组,APS:待试药3组;
图3为组方改善炎症关联性疲劳实验中小鼠脏器指数;
其中,A:胸腺指数,B:脾脏指数,C:肝脏指数,D:肾脏指数;NC:空白组,MC:模型组,PA:待试药1组,AS:待试药2组,APS:待试药3组;
图4为组方改善炎症关联性疲劳实验中小鼠行为学指标;
其中,A:爬杆时间,B:电击次数,C:游泳力竭时间;NC:空白组,MC:模型组,PA:待试药1组,AS:待试药2组,APS:待试药3组;
图5为组方改善炎症关联性疲劳实验中小鼠血浆中疲劳因子水平;
其中,A:尿素氮含量,B:乳酸含量,C:肝糖原,D:肌糖原;NC:空白组,MC:模型组,PA:待试药1组,AS:待试药2组,APS:待试药3组;
图6为组方改善炎症关联性疲劳实验中小鼠肝脏组织病理切片;
其中,A:空白组,B:模型组,C:待试药1组,D:待试药2组,E:待试药3组,F:肝脏组织病理评分,注:黑色箭头代表炎症细胞浸润;
图7为组方改善炎症关联性疲劳实验中小鼠肌肉组织病理切片;
其中,A:空白组,B:模型组,C:待试药1组,D:待试药2组,E:待试药3组,F:肌肉组织病理评分,注:黑色箭头代表炎症细胞浸润;黄色箭头代表肌肉撕裂;
图8为组方改善炎症关联性疲劳实验中小鼠血浆中炎症因子含量;
其中,A:TNF-α,B:IL-6;NC:空白组,MC:模型组,PA:待试药1组,AS:待试药2组,APS:待试药3组;
图9为组方改善炎症关联性疲劳实验中小鼠脾脏中NF-κB p-p65蛋白的表达水平;
其中,A:脾脏中NF-κB p-p65的代表性蛋白质印记,B:归一化为β-actin条带的NF-κB p-p65蛋白条带的相对强度;NC:空白组,MC:模型组,PA:待试药1组,AS:待试药2组,APS:待试药3组;
图10为不同组方配比改善炎症关联性疲劳实验中小鼠行为学指标;
其中,A:爬杆时间,B:电击次数,C:游泳力竭时间;MC:模型组,PC:阳性组,APS-1:待试药4组,APS-2:待试药5组,APS-3:待试药6组;
图11为不同组方配比改善炎症关联性疲劳实验中小鼠血浆中疲劳因子水平;
其中,A:尿素氮含量,B:乳酸含量,C:肝糖原,D:肌糖原;NC:空白组,MC:模型组,PC:阳性组,APS-1:待试药4组,APS-2:待试药5组,APS-3:待试药6组。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步地说明。
作为本发明的实施例,一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,其特征在于,所述的中药组合物的组分包括按照质量比1~10:1~10:1~10配置的黄精、当归和海参肽,由黄精、当归和海参肽均匀混合而成的组合物,通过减轻肝脏和脾脏水肿,缓解肾脏萎缩和提高胸腺免疫能力来改善机体疲劳;通过减少体内代谢物堆积,增强肝脏和骨骼肌的糖原储存,增加供能,改善机体疲劳;通过抑制NF-κB p65的磷酸化调控炎症因子分泌,改善机体疲劳。
作为本发明的实施例,所述黄精为黄精提取物,产物得率为投料饮片的10-20%,总多糖以葡萄糖计不低于60%。
作为本发明的实施例,所述的当归为当归提取物,产物得率为投料饮片的10-20%,阿魏酸含量不低于0.05%。
作为本发明的实施例,所述的海参肽是以小分子活性肽为主要成分,抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗疲劳、免疫调节等多种功效共存的蛋白质水解物。
作为本发明的实施例,所述的活性肽中的低聚肽含量不低于80%以及海参硫酸化岩藻聚糖含量不低于5%
作为本发明的实施例,所述的中药组合物的优选组分为按照质量比3:3:4配置的黄精、当归和海参肽。
作为本发明的实施例,所述黄精为黄精提取物,总多糖以葡萄糖计不低于60%。
作为本发明的实施例,所述的当归为当归提取物,阿魏酸含量不低于0.05%。
作为本发明的药效试1:黄精当归海参肽组方改善炎症关联性疲劳的药效实验
LPS是革兰氏阴性细菌内毒素,是一种经典的炎症诱发疲劳模型,亦可模拟慢性疲劳综合症(CFS)发病特征,是研究病理性疲劳最常用的动物模型。本实验采用LPS诱导的炎症疲劳小鼠为模型,以评价黄精当归海参肽组方的合理性、有效性及验证组方改善炎症关联性疲劳功效是否优于基础方(黄精当归组方),通过测定脏器指数、疲劳因子、炎症因子、观察病理组织切片评价受试物的药效作用,通过测定血浆中尿素氮(BUN)、乳酸(LD)、TNF-α、IL-6和肝糖原、肌糖原水平以及检测NF-кB相关蛋白的表达来探讨组方中药可能的改善炎症关联性疲劳生物学机制。
1仪器与材料
1.1仪器
实验所需的主要仪器设备如下表1所示。
表1仪器设备
1.2试药和试剂
实验所需的主要试药和试剂如下表2所示。
表2试药和试剂
3实验方法
3.1受试样品的准备
3.1.1黄精当归合提物
称取相同重量的黄精饮片和当归饮片,粗破碎后加水煎煮提取两次,首次提取加8倍药材重量的水,煮沸提取1小时,过滤收集滤液,向药渣加入6倍药材量的水煎煮1小时,过滤收集滤液,合并两次提取滤液,6000rpm离心20分钟,上清液浓缩干燥,可得黄精当归合提物,粉碎后备用。产物得率约为投料饮片的10-20%,总多糖以葡萄糖计不低于60%,阿魏酸含量不低于0.05%。
3.1.2海参肽粉
海参肽粉购于南京狄尔格生物科技有限公司,产品使用了中国烟台及大连海域养殖的冰鲜拟刺鲜海参为原料,通过现代生物酶解技术、冷冻干燥等工艺精制而成,制备过程最大程度的保留海参活性物质。产品是以小分子活性肽为主要成分,多种功效共存的蛋白质水解物,低聚肽含量不低于80%,可检出海参硫酸化岩藻聚糖成分。
3.1.3黄精当归海参肽组合物
称量3.1.1制备的黄精当归合提物粉末与3.1.2购买的海参肽粉末,按比混合均匀制得(黄精,当归,海参的质量比为1:1:1)。
3.2动物分组及给药量确定
ICR小鼠,雄性,18~22g,南京中医药大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(沪)2022-0004。本次实验共安排有5组小鼠,分别包括空白组(NC),模型组(MC)及三组受试组,每组8~10只,饲养环境温度为23~25℃,湿度40~60%,明暗交替周期为12h。动物适应性喂养1周后,开始正式实验。
三组受试组小鼠在试验期间分别灌胃给予黄精当归合提物(PA),海参肽粉(AS),及黄精当归海参肽组合物(APS),给药剂量参照黄精当归在一种知名的复方制剂(九转黄精丹)的人推荐用量确定。确定黄精当归合提物服用量应为2g/人/天(相当于服用黄精10g/d、当归10g/d,不超出《中国药典》2020版规定的黄精饮片用量为9~15g/d、当归饮片用量为6~12g/d的规定),小鼠剂量约为人推荐用量的10倍,小鼠服用黄精当归合提物服用量为300mg/kg/d。同时参照已有涉及海参肽抗疲劳功能实验的文献报道,海参肽能够展现明显抗疲劳功能的动物剂量约为150mg/kg/d。据此,黄精当归海参肽组合物剂量确定为450mg/kg/d。综上,实验动物分组及给药剂量如下表3所示。各组均按10mL/kg的体积灌胃,1次/1d,连续灌胃21天,每天灌胃前称重,记录小鼠的精神状态。
表3动物分组及给药剂量
3.3实验进度安排
本实验给药周期为3周,MC组、PA组、AS组、APS组于给药第14、17、20d的后3h腹腔注射LPS(4mg/kg,10mL/kg)制造LPS诱导的疲劳小鼠模型,NC组腹腔注射等量0.9%生理盐水,造模周期为1周,最后一次造模后禁食12h。在第15天给药1h后进行爬杆实验;在第18天给药1h后进行跑步机实验;在最后一次给药1h后进行负重游泳实验,休息30min后取小鼠脏器、血清进行生化指标测定。实验进程安排见图1。
3.4组方改善炎症关联性疲劳作用的实验研究
3.4.1体重及脏器指数
各实验组小鼠每天给药前测量小鼠体重并记录,计算每组小鼠每周平均体重;每天给予每笼小鼠100g食物,第二天称量食物剩余量,计算并记录每组每日平均摄食量;负重游泳实验后取小鼠胸腺、脾脏、肝脏、肾脏及左后肢小腿内侧骨骼肌,冷生理盐水漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,计算脏器系数。
3.4.2爬杆实验
爬杆实验(Pole climbing test,PCT)是利用小鼠在垂直方向自身重力衡量小鼠前肢握力能力的实验方法。将玻璃棒一端夹在铁架台上,玻璃棒离桌面40cm高,将小鼠置于玻璃棒上,小鼠肌肉处于紧张状态,直至疲劳从棒上跌落,小鼠跌落后迅速放回杆上,跌落3次视为力竭。于给药后第15天进行爬杆实验,从抓住玻璃棒到落下的时间为小鼠1次爬杆时间,以3次爬杆时间的总和为该小鼠的力竭爬杆时间。
力竭爬杆时间(s)=第一次爬杆时间+第二次爬杆时间+第三次爬杆时间
3.4.3跑步机实验
跑步机实验(Treadmill fatigue test,TFT)是一种判断小鼠跑步耐力强弱的常用方法之一。第18天,给药30min后,将小鼠置于跑步机上,先放置好动物,对小鼠进行训练,使其了解逃离带电区域后,将初始速度设为15m/min,加速时间20s,持续时间180s;一级速度20m/min,加速时间20s,持续时间80s,刺激电流为0.1mA,记录5min内小鼠被电击的次数。
3.4.4游泳力竭实验
游泳力竭实验(Swimming exhaustion test,SET)是目前最常用的衡量小鼠运动能力的实验方法之一。第21天,将小鼠单独放置在游泳池中(水温,25±1℃;深度,30cm),确保它们只能用脚触底支撑,在每只小鼠尾巴的根部附着铅(重量的7%)。当小鼠未能在10秒内返回水面时,判定为小鼠此时游泳力竭,记录小鼠从游泳开始至力竭的时间为游泳时间。
3.4.5与疲劳有关的生化指标测定
3.4.5.1尿素氮(BUN)含量测定
取给药21天后游泳力竭的小鼠,将老鼠从水中取出,用纸巾擦干,然后放回笼子休息30min后眼球采血,将其放置在含有肝素钠的离心管中,静置1h,14000r/min离心15min,吸取血浆转移至EP管中。按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作,检测小鼠BUN含量。
C标准:标准品浓度,10mmol/L(280.1mg/L);
N:样本测试前稀释倍数。
3.4.5.2乳酸(LD)含量测定
取3.4.5.1中的血浆,按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作,检测小鼠LD含量。
C标准:标准品浓度,3mmol/L;
N:样本测试前稀释倍数。
3.4.5.3肝糖原和肌糖原含量测定
取给药21天后游泳力竭的小鼠肝脏和肌肉各80mg,按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作,检测小鼠肝糖原和肌糖原含量。
m标准:标准管含糖量,0.01mg;
N:样本测试前稀释倍数,肝脏为100、肌肉为20。
3.4.6肝脏和肌肉病理组织切片观察
取小鼠肝脏和左小腿肌,将其分别在4%多聚甲醛溶液中固定48h后按照常规脱水、包埋、切片后,进行苏木素-伊红(HE)染色,病理切片在光学显微镜下放大200倍视野,随机取3个区域观察病理状态,按照表4和表5分别对肝脏和肌肉损伤进行定量分析。
表4肝脏组织切片病理评分标准
表5肌肉组织切片病理评分标准
3.5组方改善炎症关联性疲劳作用机制的实验研究
3.5.1与炎症有关的生化指标测定
3.5.1.1血浆中TNF-α含量测定
取3.4.5.1中的血浆,按南京翼飞雪生物科技有限公司Elisa试剂盒说明书操作,检测小鼠血浆中TNF-α含量。
3.5.1.2血浆中IL-6含量测定
取3.4.5.1中的血浆,按南京翼飞雪生物科技有限公司Elisa试剂盒说明书操作,检测小鼠血浆中IL-6含量。
3.5.2 Western Blot检测NF-кB相关蛋白的表达
取小鼠脾脏组织,RIPA裂解液抽提蛋白,采用BCA法对蛋白进行定量并以RIPA调整蛋白浓度,使样品最终浓度为1mg/mL,沸水浴5min变性。根据目的蛋白的分子量,配制12%分离胶,浓缩胶浓度为5%;以10μg/孔进行上样;电泳条件:浓缩胶恒压90V,约20min;分离胶恒压160V,通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间;最后分别经转膜、封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、胶片曝光并定影,曝光后的胶片直接扫描,软件Image J转变图片格式JPEG为Tif,Total Lab Quant V11.5(Newcastle uPon Tyne,UK)读取条带的积分光密度(IOD)值。
4实验结果
4.1黄精当归海参肽组方改善炎症关联性疲劳的作用
4.1.1对小鼠体重及脏器指数的影响
如图2所示,在预给药的前两周,各组小鼠的平均体重呈逐渐递增的趋势,与NC组无显著性差异,说明药物对小鼠生长无抑制作用。在第14、17、20天造模后1天,除NC组外,其余各造模组小鼠体重均显著性降低、饮食显著减少,出现行动迟缓、不同程度的腹泻、眼角分泌物增多、不自主颤抖等症状,提示LPS诱导的炎症关联性疲劳小鼠模型造模成功。
如图3(A)所示,与NC组相比,MC组小鼠胸腺指数显著性降低(p<0.05),可能是LPS注射后使小鼠免疫受到抑制,而APS给药组可在一定程度上恢复小鼠免疫功能(p<0.05)。如图3(B)和(C)所示,与NC组相比,MC组小鼠肝脏和脾脏指数显著增加(p<0.05),可能是LPS注射后引起肝脏和脾脏水肿,而APS给药组可显著减轻肝脏和脾脏水肿的现象(p<0.05)。肾脏承担着滤过代谢废物并排出体外及重吸收各种营养物质的重要使命,与NC组相比,MC组小鼠肾脏出现萎缩(p<0.05),APS给药组有减轻肾脏萎缩的趋势,但无显著性差异,见图3(D)。
4.1.2对小鼠爬杆、跑步、游泳能力的影响
如图4所示,MC组小鼠爬杆、跑步、游泳能力相比于NC组明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05),而APS给药组能显著增加小鼠爬杆与负重游泳的时间,降低跑步电击次数(p<0.05)。与PA组相比,APS组爬杆和游泳时间极显著地增加(p<0.05)。以上结果表明,黄精当归海参肽组方可以提高小鼠运动耐力,且与黄精当归基础方相比,海参肽的加入使黄精当归海参肽组方在提高爬杆和负重游泳时间方面效果更显著。
4.1.3对小鼠血浆中疲劳因子的影响
如图5所示,与NC组相比,MC组小鼠体内有害代谢物尿素氮、乳酸显著增加(p<0.05),肝糖元、肌糖原储存显著减少(p<0.05)。APS给药组能显著减少尿素氮、乳酸的积累(p<0.05),同时显著提高肝糖原、肌糖原的储存(p<0.05),增加供能,从而改善机体疲劳。与PA组相比,APS组能显著提高肝糖原(p<0.05)和肌糖原(p<0.05)储存,提示APS组方在增加供能方面具有更优的作用。
4.1.4对小鼠肝脏和肌肉的影响
如图6(A-E)所示,NC组显示肝组织结构完整,无炎症细胞浸润;MC组显示肝组织损害严重,门管区有大量炎症细胞渗出、充血;PA组和AS组显示肝组织部分损害,部分区域有炎症细胞浸润;APS组显示肝组织结构相对完整,几乎看不到炎症细胞浸润情况。
由图6(F)和表6可以看出,MC组小鼠肝组织经LPS注射后炎症细胞浸润程度明显加重,相比于NC组差异具有统计学意义(p<0.05);PA组与APS组小鼠的肝组织炎症细胞浸润程度均小于MC组(p<0.05);与PA组相比,APS组小鼠肝组织炎症细胞浸润程度显著降低(p<0.05),提示海参肽的加入使APS抑制炎症效果更显著。
表6小鼠肝脏组织切片及病理评分(x±s,n=9)
如图7(A-E)所示,NC组显示肌肉组织排列整齐,表面光滑无撕裂,有少量炎症细胞浸润;MC组显示肌肉组织出现严重损伤,视野下的组织均显现出肌肉撕裂,且有大量炎症细胞浸润于组织;PA组和AS组显示肌肉组织撕裂情况有所改善,但仍有半数肌肉呈现撕裂状态,且有部分炎症细胞浸润;APS组显示肌肉组织结构相对完整,几乎看不到肌肉撕裂,炎症细胞浸润情况也明显改善。
由图7(F)和表7可以看出,MC组小鼠肌肉组织经LPS注射、爬杆、跑步及游泳力竭实验后,肌肉组织出现严重撕裂且有明显的炎症细胞浸润,相比于NC组差异具有统计学意义(p<0.05);PA组与APS组小鼠的肌肉组织撕裂与炎症细胞浸润程度均小于MC组(p<0.05);与PA组相比,APS组小鼠肌肉组织撕裂与炎症细胞浸润程度显著降低(p<0.05),提示海参肽的加入使APS抑制炎症与改善肌肉组织损伤效果更显著。
表7小鼠肌肉组织切片及病理评分(x±s,n=9)
4.2黄精当归海参肽组方改善炎症关联性疲劳的作用机制
4.2.1对小鼠血浆中炎症因子的影响
如图8所示,MC组小鼠血浆中炎症因子(TNF-α、IL-6)含量相比于NC组明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05),表明经LPS注射后诱导小鼠体内产生大量炎症因子,提示造模成功;PA组和APS组小鼠血浆中的炎症因子含量相比于MC组明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05),表明PA、APS组方可以通过调控细胞因子分泌,激活免疫细胞活性,调节免疫系统平衡,降低LPS诱导的小鼠炎症水平,从而缓解炎症引起的机体疲劳;与PA组相比,APS组更能显著降低IL-6的分泌(p<0.05),提示APS组方在抑制炎症分泌、改善机体疲劳作用更优。
4.2.2对小鼠脾脏中NF-кB信号通路蛋白的影响
NF-κB是一种核转录因子,通过经典和替代途径增加炎症因子的水平。一旦NF-κB通过磷酸化被激活,就会诱导大量炎性细胞因子的产生,如TNF-α、IL-1β、IL-6等,对炎症反应和组织损伤产生协同作用。如图9所示,MC组小鼠脾脏中NF-κB p-p65的蛋白表达水平相比于NC组显著上调,差异具有统计学意义(p<0.05),表明LPS诱导后会显著提高NF-κB p65的磷酸化,从而刺激产生更多的炎症因子,使机体炎症水平上升;APS治疗后可显著降低NF-κBp-p65的表达(p<0.05),以上结果表明,APS可能通过阻断NF-κB p65的磷酸化发挥其抗炎作用。
5讨论
LPS是革兰氏阴性细菌内毒素,是一种经典的炎症诱发疲劳模型,亦可模拟感染CFS发病,是研究病理性疲劳最常用的动物模型。本章对APS组方改善LPS致小鼠炎症关联性疲劳进行药效学研究,发现经4mg/kg LPS腹腔注射造模后,小鼠出现明显的疲劳行为,体重均显著性降低、饮食显著减少、行动迟缓、不同程度的腹泻、眼角分泌物增多、不自主颤抖,爬杆、跑步、游泳能力下降,血浆中有害代谢物堆积、炎症因子水平极具升高,证明LPS诱导的炎症关联性疲劳模型建立成功。
APS组方对LPS致小鼠炎症关联性疲劳的药效作用表现在以下几个方面:相比于MC组,小鼠爬杆、跑步、游泳能力显著提高,有害代谢物(BUN、LD)含量显著下降,肝糖原和肌糖原储存增加;肝脏和肌肉组织病理切片及病理评分显示,肝脏和肌肉中仅有少量的炎症细胞浸润,肌肉组织损伤结构得到明显修复;小鼠血浆中炎症因子(TNF-α、IL-6)水平明显降低,脾脏中NF-κB p65的磷酸化水平也明显降低,提示APS组方可能通过抑制NF-κB p65的磷酸化调控炎症细胞因子分泌,降低炎症关联性疲劳小鼠的炎症水平,从而达到通过抗炎改善机体疲劳的效果;此外,与PA组相比,海参肽的加入,使APS组方在提高小鼠爬杆和负重游泳能力、增加肝糖原和肌糖原储存、抑制炎症因子IL-6分泌等方面有显著提升作用,提示黄精当归海参肽组方比中药PA基础方具有更优的改善机体疲劳的作用。在上述药效指标方面,APS组与MC组、APS组与PA组相比,差异均具有统计学意义(p<0.05)。
本研究通过动物实验证明,APS组方具有改善炎症关联性疲劳的药效作用,此外,与黄精当归基础方相比,创新性地加入海参肽使黄精当归海参肽组方具备更优的改善炎症关联性疲劳药效作用。因此,本发明成功筛选出了改善炎症关联性疲劳效果更优的APS组方。
作为本发明的药效试验2:组方配比对改善炎症关联性疲劳作用的药效实验
实施例1对APS组方改善炎症关联性疲劳的合理性与有效性进行了探讨,结果证明APS组方可以通过抗炎改善机体疲劳,且与基础方相比,APS组方具有更优的改善机体疲劳的作用,验证了组方的合理性与有效性。本实施例将研究不同配比的APS组方改善炎症关联性疲劳的药效作用,采用LPS诱导的炎症关联性疲劳小鼠为模型,通过爬杆、跑步和游泳力竭等行为学研究和尿素氮、乳酸、肝糖原和肌糖原等疲劳相关生化指标的测定来评价不同配比的APS组方改善炎症关联性疲劳的药效作用,进而扩大本实施例的保护范围。
1仪器与材料
1.1仪器
实验所需的主要仪器设备如下表8所示。
表8仪器设备
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1.2试药和试剂
实验所需的主要试药和试剂如下表9所示。
表9试药和试剂
3实验方法
3.1受试样品准备
3.1.1黄精提取物
称取黄精药材饮片100g,分别加8、6倍量的水溶液,水煎煮提取2次,每次1h,合并滤液,6000rpm离心20分钟,上清液浓缩干燥,可得黄精提取物,粉碎后备用。产物得率约为投料饮片的10-20%,总多糖以葡萄糖计不低于60%。
3.1.2当归提取物
称取当归药材饮片各100g,加8、6倍量的水溶液,水煎煮提取2次,每次1h,合并两次提取滤液,6000rpm离心20分钟,上清液浓缩干燥,可得当归提取物,粉碎后备用。产物得率约为投料饮片的10-20%,阿魏酸含量不低于0.05%。
3.1.3海参肽
海参肽粉购于南京狄尔格生物科技有限公司,产品使用了中国烟台及大连海域养殖的冰鲜拟刺鲜海参为原料,通过现代生物酶解技术、冷冻干燥等工艺精制而成,制备过程最大程度的保留海参活性物质。产品是以小分子活性肽为主要成分,多种功效共存的蛋白质水解物,低聚肽含量不低于80%,可检出海参硫酸化岩藻聚糖成分。
3.1.4黄精当归海参肽组合物
按比例称取上述制备的黄精、当归提取物粉与购买的海参肽粉末,混合均匀制成不同比例的黄精当归海参肽组合物。组合物配比一:黄精提取物30份,当归提取物30份,海参肽粉40份(该配比经得率换算后相当于黄精:当归:海参=3:3:4);组合物配比二:黄精提取物50份,当归提取物30份,海参肽粉20份(该配比经得率换算后相当于黄精:当归:海参=5:3:2);组合物配比三:黄精提取物30份,当归提取物50份,海参肽粉20份(该配比经得率换算后相当于黄精:当归:海参=3:5:2)。
3.2动物分组及给药剂量
ICR小鼠,雄性,18~22g,南京中医药大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(沪)2022-0004。本次实验共安排6组实验动物,分别包括空白组(NC),模型组(MC),阳性药物组(PC)及三组受试组,每组8~10只,饲养环境温度为23~25℃,湿度40~60%,明暗交替周期为12h。动物适应性喂养1周后进行正式实验。
实验过程中,空白组及模型组给与10ml/kg/d的纯净水,阳性药物组给与10ml/kg/d的复方高山红景天口服液。三组受试组给与不同配比的黄精当归海参肽组合物,组合物1组(APS-1)为黄精:当归:海参肽为=3:3:4,组合物2组(APS-2)为黄精:当归:海参肽为=5:3:2;组合物3组(APS-3)为黄精:当归:海参肽为=3:5:2。上述受试物溶解于适量纯净水中,配置成合适浓度的灌胃药物,按照小鼠10ml/kg/d的体积灌胃小鼠,连续灌胃21天。实验动物分组及给药总剂量如下表10所示。
表10动物分组及给药剂量
3.3实验进度安排
本实验给药周期为3周,MC组、PC组、APS-1组、APS-2组和APS-3组于给药第14、17、20d的后3h腹腔注射LPS(4mg/kg,10mL/kg)制造LPS诱导的疲劳小鼠模型,NC组腹腔注射等量0.9%生理盐水,造模周期为1周,最后一次造模后禁食12h。在第15天给药1h后进行爬杆实验;在第18天给药1h后进行跑步机实验;在最后一次给药1h后进行负重游泳实验,休息30min后取小鼠脏器、血清进行生化指标测定。实验进程安排见图1。
3.4不同组方配比改善炎症关联性疲劳作用的实验研究
3.4.1爬杆实验
爬杆实验(Pole climbing test,PCT)是利用小鼠在垂直方向自身重力衡量小鼠前肢握力能力的实验方法。将玻璃棒一端夹在铁架台上,玻璃棒离桌面40cm高,将小鼠置于玻璃棒上,小鼠肌肉处于紧张状态,直至疲劳从棒上跌落,小鼠跌落后迅速放回杆上,跌落3次视为力竭。于给药后第15天进行爬杆实验,从抓住玻璃棒到落下的时间为小鼠1次爬杆时间,以3次爬杆时间的总和为该小鼠的力竭爬杆时间。
力竭爬杆时间(s)=第一次爬杆时间+第二次爬杆时间+第三次爬杆时间
3.4.2跑步机实验
跑步机实验(Treadmill fatigue test,TFT)是一种判断小鼠跑步耐力强弱的常用方法之一。第18天,给药30min后,将小鼠置于跑步机上,先放置好动物,对小鼠进行训练,使其了解逃离带电区域后,将初始速度设为15m/min,加速时间20s,持续时间180s;一级速度20m/min,加速时间20s,持续时间80s,刺激电流为0.1mA,记录5min内小鼠被电击的次数。
3.4.3游泳力竭实验
游泳力竭实验(Swimming exhaustion test,SET)是目前最常用的衡量小鼠运动能力的实验方法之一。第21天,将小鼠单独放置在游泳池中(水温,25±1℃;深度,30cm),确保它们只能用脚触底支撑,在每只小鼠尾巴的根部附着铅(重量的7%)。当小鼠未能在10秒内返回水面时,判定为小鼠此时游泳力竭,记录小鼠从游泳开始至力竭的时间为游泳时间。
3.4.4与疲劳有关的生化指标测定
3.4.4.1尿素氮(BUN)含量测定
取给药21天后游泳力竭的小鼠,将老鼠从水中取出,用纸巾擦干,然后放回笼子休息30min后眼球采血,将其放置在含有肝素钠的离心管中,静置1h,14000r/min离心15min,吸取血浆转移至EP管中。按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作,检测小鼠BUN含量。
C标准:标准品浓度,10mmol/L(280.1mg/L);
N:样本测试前稀释倍数。
3.4.4.2乳酸(LD)含量测定
取3.4.4.1中的血浆,按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作,检测小鼠LD含量。
C标准:标准品浓度,3mmol/L;
N:样本测试前稀释倍数。
3.4.4.3肝糖原和肌糖原含量测定
取给药21天后游泳力竭的小鼠肝脏和肌肉各80mg,按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作,检测小鼠肝糖原和肌糖原含量。
m标准:标准管含糖量,0.01mg;
N:样本测试前稀释倍数,肝脏为100、肌肉为20。
3.5统计学分析
本研究中所有数据均显示为平均数±标准差,并且包含至少三个独立重复组;使用GraphPad Prism 8.0.2软件对数据进行两两t检验,以P<0.05认为差异具有统计学意义。
4实验结果
4.1不同配比的黄精当归海参肽组方改善炎症关联性疲劳的作用
4.1.1对小鼠爬杆、跑步、游泳能力的影响
如图10所示,与NC组相比,MC组、PC组、APS-1组、APS-2组和APS-3组小鼠爬杆和力竭游泳时间均显著降低(p<0.05),跑步被电击次数显著下降(p<0.05),提示LPS诱导的炎症关联性疲劳模型小鼠造模成功。与MC组相比,PC组、APS-1组、APS-2组和APS-3组均能显著提高小鼠爬杆和游泳力竭时间,降低跑步被电击次数,差异具有统计学意义(p<0.05)。此外,不同配比的APS组与PC组小鼠爬杆、跑步和游泳力竭能力均无显著性差异(p>0.05),提示不同配比的中药APS组方均可以提高炎症关联性疲劳小鼠的运动耐力,具有良好的抗疲劳效果,其中APS-1组抗疲劳效果最佳。
4.1.2对小鼠血浆中疲劳因子的影响
如图11所示,与NC组相比,MC组小鼠体内有害代谢物尿素氮、乳酸显著增加(p<0.05),肝糖元、肌糖原储存显著减少(p<0.05),提示炎症关联性疲劳小鼠造模成功。与MC组相比,PC组、APS-1组、APS-2组和APS-3组均能减少代谢物尿素氮和乳酸的积累,同时提高肝脏和肌肉中糖原的储存,差异具有统计学意义(p<0.05),各组既降低了体内有害代谢物的堆积又增加了供能,从而达到改善机体疲劳作用。此外,不同配比的APS组与PC组降低代谢物积累和增加糖原含量无显著性差异(p<0.05),且APS-1组表现出较好的抗疲劳趋势。
5讨论
对不同配比的APS组方改善炎症关联性疲劳的作用进行药效学研究,发现经LPS造模后,小鼠出现明显的疲劳行为,如运动能力下降、血浆中有害代谢物堆积、肝糖原和肌糖原储存降低,证明LPS诱导的炎症关联性疲劳模型建立成功。
不同配比的APS组方对改善炎症关联性疲劳小鼠均有显著的药效作用,主要表现在以下几个方面:相比于MC组,不同配比的APS组小鼠爬杆、跑步、游泳能力显著提高,有害代谢物(BUN、LD)含量显著下降,肝糖原和肌糖原储存增加,提示APS组方可能通过清除有害代谢物的积累与增加糖原的储存达到改善炎症关联性疲劳的作用,且黄精、当归、海参肽在一定的配比范围内均有效。
通过动物实验证明,APS组方具有改善炎症关联性疲劳的药效作用,此外,本组方与市售的复方高山红景天口服液的抗疲劳效果相当,且配比为APS-1的组方(黄精:当归:海参肽=3:3:4)抗疲劳效果更明显,改善炎症关联性疲劳优势更突出。本发明研究证明黄精、当归、海参肽按一定配比组合均能起到显著的抗疲劳效果,扩大了本实施例的保护范围。
上面结合实施例/附图对本发明的技术方案作了详细说明,但是本发明并不限于上述技术方案,对于本技术领域的普通技术人员来说,在获知本发明中记载内容后,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对其作出若干同等变换和替代,这些同等变换和替代也应视为属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,其特征在于,所述的中药组合物的组分包括按照质量比1~10:1~10:1~10配置的黄精、当归和海参肽,由黄精、当归和海参肽均匀混合而成的组合物,通过减轻肝脏和脾脏水肿,缓解肾脏萎缩和提高胸腺免疫能力来改善机体疲劳;通过减少体内代谢物堆积,增强肝脏和骨骼肌的糖原储存,增加供能,改善机体疲劳;通过抑制NF-κB p65的磷酸化调控炎症因子分泌,改善机体疲劳。
2.根据权利要求1所述的一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,其特征在于,所述黄精为黄精提取物,产物得率为投料饮片的10-20%,总多糖以葡萄糖计不低于60%。
3.根据权利要求1所述的一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,其特征在于,所述的当归为当归提取物,产物得率为投料饮片的10-20%,阿魏酸含量不低于0.05%。
4.根据权利要求1所述的一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,其特征在于,所述的海参肽是以小分子活性肽为主要成分,抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗疲劳、免疫调节多种功效共存的蛋白质水解物。
5.根据权利要求4所述的一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,其特征在于,所述的活性肽中的低聚肽含量不低于80%以及海参硫酸化岩藻聚糖含量不低于5%。
6.根据权利要求1所述的一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,其特征在于,所述的中药组合物的优选组分为按照质量比3:3:4配置的黄精、当归和海参肽。
7.根据权利要求6所述的一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,其特征在于,所述黄精为黄精提取物,总多糖以葡萄糖计不低于60%。
8.根据权利要求6所述的一种改善炎症关联性疲劳的中药组合物,其特征在于,所述的当归为当归提取物,阿魏酸含量不低于0.05%。
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