CN117701576A - 基于甲基化修饰的泛癌标记物khdrbs2基因 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了甲基化泛癌标志物KHDRBS2基因（选择性剪接的RNA结合蛋白2，KH domain containing,RNA binding,signal transduction associated 2），属于疾病诊断标记物领域。本发明提供了甲基化肿瘤标志物KHDRBS2在制备肿瘤诊断试剂中的应用。本发明所述肿瘤标志物KHDRBS2，在大部分肿瘤类型中甲基化程度明显高于正常健康人群，对应的正常组织中均低甲基化，具有非常高的敏感性与特异性，同时，检测所述KHDRBS2的引物可用于制备肿瘤诊断试剂盒，可以用于基于血浆/尿液样本的多种肿瘤的早期筛查和诊断，基于研究成果符合临床实际，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊断标记物领域，更具体地，本发明涉及基于多重检测靶标甲基化修饰的泛癌肿瘤标记物KHDRBS2及其应用，更具体地，涉及一种用于检测靶标DNA的甲基化的方法，其包括：构建寡核苷酸，其包含能够与多个肿瘤特异性的高甲基化的CG岛靶标DNA互补结合的靶标特异性引物，并且通过探针检测是否存在扩增产物。
背景技术
癌症已经成为威胁人类生命健康的头号杀手。尤其有很多的癌症患者确诊时，已经是癌症中晚期，这给治疗带来了很大的难度，甚至很多癌症患者已经失去了理想治疗时机。众所周知，早发现早治疗对与癌症患者的预后非常重要。这就显示出了早期肿瘤筛查的重要性。如果可以有效提高癌症的早期筛查，癌症患者的五年生存率将可以得到大幅度的提高。
传统早筛手段有诸多局限性，且多数癌种尚无有效的早筛查手段，依从性普遍较低。传统早筛手段主要包括内镜、影像学检测(CT、MRI等)、组织活检等，普遍存在一定的局限性。其中内镜筛查虽然能够较早期发现消化道癌，但属于侵入性筛查，检查过程痛苦，对病人体质要求较高，不包括在常规体检项目中，且中国内镜医师相对匮乏，医疗资源紧张，导致筛查渗透率较低；影像学手段通常具有辐射性，对早期癌症的识别力较低；组织活检取样困难，肿瘤异质性容易造成取样不完全，不利于诊断分型又容易导致并发症，同时假阳性率和假阴性率也较高。多数癌种尚无有效的早筛手段，根据美国国家肿瘤中心(NCI)指南，目前仅有乳腺癌、宫颈癌和结直肠癌有推荐的筛查手段，其中乳腺癌早筛使用的钼靶技术仍具有辐射、产生疼痛感等缺陷。其他多数癌种没有推荐适合筛查的检测手段。
为了实现肿瘤的筛查与早期诊断，肿瘤特异性DNA甲基化，肿瘤基因突变，肿瘤基因融合，外泌体等各种技术不断在研发中，在临床上越来越多的证据表明，DNA甲基化以其血液中的稳定性、肿瘤特异性、组织特异性与靶点集中性成为了肿瘤筛查与早期诊断的主流分子诊断技术。ctDNA的甲基化是重要的表观学修饰之一，可以在不改变基因序列的情况下，改变遗传表现，从而控制基因的表达。基因甲基化发生在癌症之前，是癌症发生的重要机制，相当于调控基因表达的“开关”，其稳定性和一致性较好，是癌症早筛的理想手段。从信号丰富度和信号强度的角度来看：
(1)ctDNA片段化的信号丰富度很强但由于信号强度低，检测难度大；
(2)ctDNA点突变信号强度比较高，但是信号丰富度较低，通常早期患者携带的与肿瘤相关的突变约为60个左右(包括驱动突变和“过客”突变在内)，而每个个体有约31.6亿个DNA碱基对可供突变，这些低频突变的准确识别对测序技术的敏感性要求非常高，难度极大；
(3)ctDNA甲基化信号丰富度和信号强度均较高，是较为理想的检测标志物。
DNA甲基化几乎出现在所有癌症的癌前病变及癌症早期阶段，是癌症早筛的理想标志物。在人类基因组的2800万个CpG双核苷酸位点上，60-80％的胞嘧啶残基被甲基化修饰，成为癌症早筛中普遍而丰富的信号来源，而且DNA甲基化经常发生在肿瘤的形成过程中，肿瘤初期通常会发生抑癌基因甲基化水平升高或者原癌基因甲基化降低的现象，因此甲基化模式的改变是癌症早筛的理想指标。
ctDNA甲基化作为癌症早筛检测标志物具有多重优势，是国内外早筛企业采用的主流检测指标。美国癌症早筛龙头Grail在CCGA-1子研究中将cfDNA突变、拷贝数变异(CNV)和cfDNA甲基化三种标志物进行对比，结果发现cfDNA甲基化在信号丰度、组织溯源等层面显著优于其他检测指标，其中靶向甲基化测序的LoD(检测下限)接近0.1％，能够有效捕捉来自肿瘤的信号。
KHDRBS2为抑癌基因，是一种参与选择性剪接调控的RNA结合蛋白，在多种肿瘤组织尤其是头颈部和脑部和细胞中检测到其基因启动子异常高甲基化。
在本发明人的前期研究中，找到了基于甲基化修饰的泛癌肿瘤标记物KHDRBS2，但是，仍然有必要找到更多的新型肿瘤标志物，从而为肿瘤的诊断提供更多的途径。
发明内容
本公开文本的一个目的是提供一种泛癌肿瘤标记物KHDRBS2及其应用。
在本发明的第一方面，提供用作肿瘤标记物的多核苷酸，包括：(a)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)(a)的多核苷酸的片段，且其中存在至少2个修饰的CpG位点(如3～27个)；和/或(c)(a)或(b)的多核苷酸或片段的互补核酸；该互补的核酸例如为SEQID NO:3所示核苷酸序列的多核苷酸。
在另一优选例中，(b)中，所述用作肿瘤标记物的多核苷酸的片段中存在：SEQ IDNO:3中第185-193位序列(对应于第27～29号CpG位点)；SEQ ID NO:3中第131-193位序列(对应于第27～36号CpG位点)；SEQ ID NO:1中第199～207位序列(对应于第27～29号CpG位点)；或SEQ ID NO:1中第199～261位序列(对应于第27～36号CpG位点)。
在本发明的第二方面，提供一种经处理的多核苷酸，其由前一方面所述的多核苷酸转变而来，对应于前述第一方面的序列，其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变，非修饰的胞嘧啶转为T。
在一个优选例中，其由对应于前述第一方面的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理转变而来。在另一优选例中，所述的多核苷酸包括：(d)核苷酸序列如SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4所示的多核苷酸；(e)上述(d)的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个修饰的CpG位点(如3～27个)。
在本发明的第三方面，提供前述第一方面或第二方面所述的多核苷酸的用途，用于制备肿瘤的检测试剂或试剂盒。
在一个优选例中，所述肿瘤包括(但不限于)：肺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫内膜癌，甲状腺癌，肠癌，胰腺癌等。
在另一优选例中，所述临床的样本包括但不限于：血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、宫颈刮片或刷片样本。
在本发明的第四方面，提供一种体外检测样品的甲基化谱式的方法，包括：(1)提供样品，纯化分离核酸；(2)核酸转化处理；(3)检测(2)的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是前述第一方面所述的多核苷酸或由其转变而来的前述第二方面所述的多核苷酸。
在一个优选例中，步骤(3)中，分析的方法包括：实时荧光PCR法、数字PCR法、高通量测序法、三代测序法、飞行时间质谱、或它们的组合以及SEQ ID NO:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。并且，其它其他甲基化检测方法及未来新开发的甲基化检测方法也可被应用于本发明中。
在另一优选例中，步骤(2)包括：对(1)的产物进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(1)所述的核酸；(2)分析经(1)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。
在另一优选例中，所述的甲基化谱式异常是指该肿瘤样本的多核苷酸序列中CpG中的C的甲基化程度与正常样本的多核苷酸中的CpG中的C的甲基化程度的甲基化程度存在着显著性差异，一般地，肿瘤样本中抑癌基因的启动子区域存在高度甲基化，导致抑癌基因低表达，而与之对照，正常样本中抑癌基因的启动子区域甲基化程度很低。
在本发明的第五方面，提供一种制备试剂的方法，所述试剂用于肿瘤筛查、早期诊断以及复发监控，所述方法包括：提供前述第一方面或第二方面所述的多核苷酸，以所述多核苷酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂；其中，所述的靶序列中存在至少2个(如4～26个)修饰的CpG位点；较佳地，所述的检测试剂包括(但不限于)：引物，探针。
在本发明的第六方面，提供一种试剂或试剂组合，可以其特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是前述第一方面或第二方面任一所述的多核苷酸的全长或片段，其中存在至少2个(如4～26个)修饰的CpG位点。
在一个优选例中，所述的试剂或组合的试剂针对包含所述靶序列的基因序列(基于所述基因序列而设计)，所述的基因序列包括基因Panel或基因群组。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括：引物，探针。
在另一优选例中，所述的引物为：SEQ ID NO:5和6所示的引物；SEQ ID NO:8和9所示的引物；SEQ ID NO:11和12所示的引物，SEQ ID NO:14和15所示的引物。
在本发明的第七方面，提供前述第六方面所述的试剂或组合的试剂的用途，用于制备检测肿瘤的试剂盒。
在本发明的第八方面，提供一种用于肿瘤诊断、分型或预后的试剂盒，包括利用前述第一方面或第二方面所示序列设计的引物对以及包含该序列的基因Panel或基因群组，通过DNA甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。
在本发明的第九方面，提供一种检测试剂盒，其包括：容器，以及位于容器中的前面所述的试剂或试剂组合；较佳地，每一种试剂位于一个独立的容器中。
在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：DNA快速转化硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐混合物及纯化试剂，PCR扩增试剂和/或使用说明书(标明检测操作步骤和结果判定标准)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人经过大规模的基于表观遗传学技术的肿瘤标记物的研究筛选，揭示了一种通用型的DNA甲基化肿瘤标志物KHDRBS2。KHDRBS2基因启动子区域在正常的组织中处于低甲基化状态，在肿瘤组织中KHDRBS2则呈现异常甲基化状态，可作为临床肿瘤的早期诊断、筛查、复发监控和疗效评估的标志物。
如本文所用，“样品”或“样本”包括从临床上得或分离的体液(如血浆)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。例如，所示的样本包括但不限于：血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、脑脊液样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。
如本文所用，“异常甲基化”是指在一个基因序列中CpG的甲基化程度在肿瘤组织和正常组织中存在显著差异，例如，肿瘤样本的甲基化程度显著高于正常样本的甲基化程度，或者，肿瘤样本的甲基化程度显著低于正常样本的甲基化程度。一般来说，肿瘤样本的抑癌基因的启动子区域甲基化程度较高，而正常样本的对应区域甲基化程度较低。例如，以特异实时荧光PCR(QMSP)分析手段而言，以甲基化特异性引物所进行的PCR反应可获得阳性的PCR结果或者与内控基因的ct值差值较小即可认为该受试的DNA(基因)区处于高甲基化状态。，以实时定量甲基化特异性PCR而言，高甲基化状态的判定可根据其对照样品的甲基化状态的相对值分析统计学差异。
为了寻找对于诊断人类肿瘤有用的靶标，本发明人经过大规模筛选和研究，确定了KHDRBS2这一靶标。KHDRBS2基因序列区域的甲基化状态在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存在显著的差异，只要检测到KHDRBS2基因序列区域存在异常高甲基化状态，即可判定该受检者属于肿瘤高危人群。并且，KHDRBS2呈现的这种在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存的显著差异广谱地存在于多种类型的肿瘤中。
在此基础上，本发明提供了用作肿瘤标记物的分离的多核苷酸，其具有SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，在肿瘤细胞内，该多核苷酸序列中多处5’-CpG-3’的碱基C位置上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。
针对本发明提供的一个或多个CpG进行检测均是可以的，因此本发明也包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个甲基化CpG位点。所述的至少一个可以为2～15个。上述的多核苷酸或片段也可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。
作为一些优选方式，所述的多核苷酸的片段例如是包含SEQ ID NO:1中序列或SEQID NO:1中的片段，上述片段的反义链也是可用的。这些片段是本发明的较佳实施方式的举例，本领域技术人员应理解，根据本发明提供的信息，也可以选择其它的片段。
此外，包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或序列片段的基因Panel或基因群组也被包含在本发明中。针对所述的基因Panel或基因群组，也可以通过DNA甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。
上述的多核苷酸可以作为基因组中人们分析甲基化状态的关键区域，通过各种本领域已知的技术来分析它们的甲基化状态。任何可用于分析甲基化状态的技术均可被应用于本发明中。
上述的多核苷酸在经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，其中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。
因此，本发明还提供了上述多核苷酸(包括其互补链(反义链))经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸，包括：SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸。这些多核苷酸也可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。
本发明也包含上述多核苷酸或其反义链经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个甲基化CpG位点。所述的至少一个例如2～21个。应理解，在本发明提供了正义链的CpG编号后，反义链中各个CpG位点相应于正义链的编号是根据本发明所提供的内容易于获得的。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结果判定标准，以便于本领域技术人员应用。
下面结合具体实施例
实施例1、标记物的筛选及序列确定
针对人基因组序列，本发明人进行了深入的筛选，获得一种肿瘤标记物KHDRBS2，其序列如下SEQ ID NO:1(chr1:4715430:4715637，Human/hg19)
TCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCGATCTCGGTTCCCTGCAAGCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGAACTACAGGCGCCCGCCACCATGCCCAGCTAACTTTTCGCATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCGTGTTAACCAGGATGGTCTCAATCTCCTGACTTCGTGATCCACCCACCCCGGCCTCCCAAAGTTCTGGGATTGCAGGCATGAGCCACCGGGCCCGGCTGGTACAGACCTTTCTTAAGCCCAGATAGCATTCCTGGCATTCCTATGGCAGGATTTTATGAACCTATATTCATATGACACTTCCCCCAGAGCCAGCTTTTTAAAAATTTTACTAAATGAAGTTCAAAGTGCTTCTGCTTTTTGCAATCAATAATGCCTAAGTAACTCACAAAAAATAGATTATTAATATCTATGACTTCAAAGGGTCCATAACTTATCACAAGCAAAAATTAAGG
SEQ ID NO:2是SEQ ID NO:1的反义互补链
CCTTAATTTTTGCTTGTGATAAGTTATGGACCCTTTGAAGTCATAGATATTAATAATCTATTTTTTGTGAGTTACTTAGGCATTATTGATTGCAAAAAGCAGAAGCACTTTGAACTTCATTTAGTAAAATTTTTAAAAAGCTGGCTCTGGGGGAAGTGTATATGAATATAGGTTCATAAAATCCTGCCATAGGAATGCCAGGAATGCTATCTGGGCTTAAGAAAGGTCTGTACCAGCCGGGCCCGGTGGCTCATGCCTGCAATCCCAGAACTTTGGGAGGCCGGGGTGGGTGGATCACGAAGTCAGGAGATTGAGACCATCCTGGTTAACACGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAATGCGAAAAGTTAGCTGGGCATGGTGGCGGGCGCCTGTAGTTCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGGGAACCGAGATCGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGA
技术方案
为了实现上述目的，本公开文本提供了一种用于检测甲基化DNA的方法，其包括以下步骤：用于检测甲基化DNA的方法，其包括：(a)样本纯化与快速转化：用转化非甲基化DNA位点以使其区分于甲基化DNA位点的至少一种CpG岛异常区域的含靶标DNA的样品；(b)引物设计，其包含被设计为能够与用该试剂处理的靶标DNA互补结合的靶标特异性序列qpcr引物；(c)PCR扩增，使用步骤(a)中用该试剂处理的靶标DNA作为模板，并使用步骤(b)中构建的引物，扩增靶标DNA；(d)探针检测,通过能够与步骤(c)中扩增的靶标DNA序列的荧光探针检测并放大该靶标DNA的甲基化，提高血浆和尿液等样本中稀有模板DNA扩增的灵敏度。
表1、各种肿瘤类型癌组织样本以及正常组织样本的甲基化值比较：
表2、针对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2核酸区域不同类型样本荧光PCR扩增引物对和探针：
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、DNA纯化、PCR扩增等所需的各种试剂。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结果判定标准，以便于本领域技术人员应用。
实施例2、头颈鳞癌正常样本的显著性差异比较
1.本发明人从临床获取16例头颈正常组织样本作为对照组，同时获取13例头颈鳞癌组织样本作为实验组。
2.组织DNA提取
按照苏州易迈吉生物的组织DNA提取试剂盒操作，提取的组织DNA用nanodrop测定浓度，用电泳检测基因组DNA的完整性，浓度大于50ng/uL且有明显保存于-20度待用。
3.样本DNA的亚硫酸盐快速转化
按照苏州易迈吉生物的DNA甲基化试剂盒(FastEasy DNA Methylation Kit)操作说明的方法进行亚硫酸盐转化。
4.转化的DNA样本进行焦磷酸测序，本发明人比较了对照组与实验组的样本中，KHDRBS2甲基化水平。
结果如表1所示，在头颈鳞癌临床样本中，本发明的肿瘤标志物KHDRBS2在实验组中甲基化显著高于正常组织，在头颈鳞癌样本中甲基化水平约为0.420。而在头颈正常样本中甲基化水平约为0.130，统计学差异显著。
实施例3、乳腺癌及乳腺正常样本的显著性差异比较
1.本发明人从临床获取7例乳腺正常样本样本作为对照组，同时获取3例乳腺癌组织样本作为实验组。
2.组织DNA提取
按照苏州易迈吉生物的组织DNA提取试剂盒操作，提取的组织DNA用nanodrop测定浓度，用电泳检测基因组DNA的完整性，浓度大于50ng/uL且有明显保存于-20度待用。
3.样本DNA的亚硫酸盐快速转化
按照苏州易迈吉生物的DNA甲基化试剂盒(FastEasy DNA Methylation Kit)操作说明的方法进行亚硫酸盐转化。
4.转化的DNA样本进行焦磷酸测序，本发明人比较了对照组与实验组的样本中，KHDRBS2甲基化水平。
结果如表1所示，在乳腺癌临床样本中，本发明的肿瘤标志物KHDRBS2在实验组中甲基化值显著高于正常组织，在乳腺癌样本中甲基化水平约为0.272。而在乳腺正常样本中甲基化水平约为0.113，统计学差异较为显著。
实施例4、脑胶质瘤及脑胶质正常样本的显著性差异比较
1.本发明人从临床获取3例脑胶质正常组织样本作为对照组，同时获取3例脑胶质瘤组织样本作为实验组。
2.组织DNA提取
按照苏州易迈吉生物的组织DNA提取试剂盒操作，提取的组织DNA用nanodrop测定浓度，用电泳检测基因组DNA的完整性，浓度大于50ng/uL且有明显保存于-20度待用。
3.样本DNA的亚硫酸盐快速转化
按照苏州易迈吉生物的DNA甲基化试剂盒(FastEasy DNA Methylation Kit)操作说明的方法进行亚硫酸盐转化。
4.转化的DNA样本进行焦磷酸测序，本发明人比较了对照组与实验组的样本中，KHDRBS2甲基化水平。
结果如表1所示，在脑胶质瘤临床样本中，本发明的肿瘤标志物KHDRBS2在实验组中甲基化值显著高于正常组织，在卵巢癌样本中甲基化水平约为0.340。而在卵巢正常样本中甲基化水平约为0.060，统计学差异非常显著。
实施例5、神经母细胞瘤及神经母细胞正常样本的显著性差异比较
1.本发明人从临床获取5例神经母细胞瘤正常组织样本作为对照组，同时获取2例神经母细胞瘤组织样本作为实验组。
2.组织DNA提取
按照苏州易迈吉生物的组织DNA提取试剂盒操作，提取的组织DNA用nanodrop测定浓度，用电泳检测基因组DNA的完整性，浓度大于50ng/uL且有明显保存于-20度待用。
3.样本DNA的亚硫酸盐快速转化
按照苏州易迈吉生物的DNA甲基化试剂盒(FastEasy DNA Methylation Kit)操作说明的方法进行亚硫酸盐转化。
4.转化的DNA样本进行焦磷酸测序，本发明人比较了对照组与实验组的样本中，KHDRBS2甲基化水平。
结果如表1所示，在神经母细胞瘤临床样本中，本发明的肿瘤标志物KHDRBS2在实验组中甲基化值显著高于正常组织，在神经母细胞瘤样本中甲基化水平约为0.104。而在神经母细胞正常样本中甲基化水平约为0.047，统计学差异非常显著。
实施例6、使用衍生自细胞系的甲基化DNA确定检测限
本实施例为采用实施例1所述高灵敏度MMDEC多重甲基化检测技术和常规QMSP对甲基化化DNA检测线的比较。
1.样本准本
1.1阴性细胞系准备：293T细胞株
1.2阳性细胞系准备：jurkat细胞株
2.细胞DNA提取
取10^7-10^9细胞，按照苏州易迈吉生物细胞DNA提取试剂盒操作，提取的细胞DNA用nanodrop和琼脂糖电泳进行质控，浓度大于50ng/uL且有明显电泳条带的为合格样本，保存于-20度待用。
3.样本DNA的亚硫酸盐快速转化
按照苏州易迈吉生物的DNA甲基化试剂盒(FastEasy DNAMethylation Kit)操作说明的方法进行亚硫酸盐转化。具体如下：
3.1在PCR管中加入50ul提取的样本DNA(或阴、阳对照品)和100ul亚硫酸盐转化液(现配现用)，混匀后盖紧盖子，步骤有修改。
3.2在PCR仪器上进行反应。反应条件为95度15分钟，65度60分钟，然后降温至室温。
3.3在核酸纯化柱上加入600ul结合液，再将反应后溶液加入纯化柱中，盖紧盖子混匀，12000rpm离心30秒，弃废液。
3.4加入500ul洗涤液，12000rpm离心30秒，弃废液。
3.5加入200ul脱硫试剂，室温静置20分钟。12000rpm离心30秒，弃废液。
3.6加入500ul洗涤液，12000rpm离心30秒，弃废液。重复本步骤一次。
3.7将纯化柱转移至1.5ml EP管中，向纯化柱膜中央加入15ul洗脱液，静置2分钟。
3.8 12000rpm离心30秒，弃纯化柱，转化后DNA样本收集于1.5ml EP管中待用。
4.样本DNA检测
(1)表3、引物设计：
(2)表4、配制如下PCR反应体系：
| 组分名称 | 体积 |
| ddH2O | 补足总体积至40μL |
| QMSP引物mix | 2μL(10μM) |
| 探针 | 0.5μL(10μM) |
| 25mM MgCl2 | 1μL |
| 5U/uL PCR酶 | 0.2μL |
| UNG酶 | 0.2μL |
| 10xPCR buffer | 2.5μL |
| DNA模板 | 5-10μL |
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，68℃退火10s，62℃退火15s，45个循环，并收集荧光。
结果证实，2种引物探针组合方法在50-200pg DNA中检测率为100％，但在5-20pg中检测率有差异，引物探针组合1效果最好。
表5、不同引物探针组合检测率的比较：
实施例7、本实施例为采用实施例6所述高灵敏度引物探针组合1方案检测头颈鳞癌并与病理结果做对照。
1.样本的收集
1.1阴性样本的收集：取年龄在25～40间，无头颈鳞癌家族史、无头颈炎性疾病史的良性人群17例血清/血浆样本。
1.2干扰样本收集：取年龄在25～35间，有颈部软组织损伤、颈椎综合征等疾病的人群22例血清/血浆样本。
1.3胃癌患者样本的收集：取临床上经细胞学鉴定为头颈鳞癌患者的血清/血浆样本26例。
2.血清/血浆游离DNA提取
取2mL血清/血浆中，按照苏州易迈吉生物的磁珠法游离DNA提取试剂盒操作，提取的游离DNA用荧光PCR进行质控，ct值小于28的为合格样本，保存于-20度待用。
3.样本DNA的亚硫酸盐快速转化
按照苏州易迈吉生物的DNA甲基化试剂盒(FastEasy DNA Methylation Kit)操作说明的方法进行亚硫酸盐转化。具体如下：
3.1在PCR管中加入50ul提取的样本DNA(或阴、阳对照品)和100ul亚硫酸盐转化液(现配现用)，混匀后盖紧盖子，步骤有修改。
3.2在PCR仪器上进行反应。反应条件为95度15分钟，65度60分钟，然后降温至室温。
3.3在核酸纯化柱上加入600ul结合液，再将反应后溶液加入纯化柱中，盖紧盖子混匀，12000rpm离心30秒，弃废液。
3.4加入500ul洗涤液，12000rpm离心30秒，弃废液。
3.5加入200ul脱硫试剂，室温静置20分钟。12000rpm离心30秒，弃废液。
3.6加入500ul洗涤液，12000rpm离心30秒，弃废液。重复本步骤一次。
3.7将纯化柱转移至1.5ml EP管中，向纯化柱膜中央加入15ul洗脱液，静置2分钟。
3.8 12000rpm离心30秒，弃纯化柱，转化后DNA样本收集于1.5ml EP管中待用。
4.样本DNA检测
4.1 QMSP技术，优选地，选择引物探针组合3
(1)表6、引物设计：
(2)表7、配制如下PCR反应体系：
| 组分名称 | 体积 |
| ddH2O | 补足总体积至40μL |
| QMSP引物mix | 2μL(10μM) |
| 探针 | 0.5μL(10μM) |
| 25mM MgCl2 | 1μL |
| 5U/uL PCR酶 | 0.2μL |
| UNG酶 | 0.2μL |
| 10xPCR buffer | 2.5μL |
| DNA模板 | 5-10μL |
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，68℃退火10s，62℃退火15s，45个循环，并收集荧光。
5.表8、临床样本的检测结果统计：
根据上述实施例2～7的结果，KHDRBS2在头颈部癌症、脑神经肿瘤、消化道以及女性内分泌系统肿瘤样本以及相应的非癌样本中甲基化水平差异非常显著，可见其具有多种肿瘤的广谱适用性。
如上所述，根据本公开文本的用于检测肿瘤尤其是消化道中路的血液甲基化DNA的方法及核酸序列，引物试剂盒。此外，该方法的优点在于，可以用于血浆/尿液等肿瘤含量低的液体样本，适合于肿瘤早筛，复发监控等临床应用。
尽管已经参考具体特征对本公开文本进行了详细描述，但是对于本领域技术人员来说清楚的是，该描述仅针对优选实施方案并不限制本公开文本的范围。因此，本公开文本的实质范围将由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.分离的多核苷酸，其特征在于，
包括：
（a）SEQ ID NO:1/ SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸；
（b）（a）的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个修饰的CpG位点；和/或
（c）与上述（a）或（b）的多核苷酸或片段互补的核酸。
2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，其特征在于，
所述修饰包括5-甲基化修饰。
3.权利要求1任一所述的多核苷酸的用途，其特征在于，
用于制备肿瘤的检测试剂或试剂盒。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
所述肿瘤的样本包括：血液样本、尿液样本、组织及细胞活检样本。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
其特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是权利要求1任一所述的多核苷酸的全长或片段，其中存在至少1个修饰的CpG位点。
6.如权利要求3所述的试剂或组合的试剂，其特征在于，
所述的试剂或组合的试剂针对包含所述靶序列的基因序列，所述的基因序列包括基因Panel或基因群组。
7.权利要求1～6任一所述的试剂或组合的试剂的用途，用于制备检测肿瘤的试剂盒；较佳地，所述肿瘤包括但不限于：肺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫内膜癌，甲状腺癌，肠癌，胰腺癌等。
8.一种体外检测样品的甲基化谱式的方法，其特征在于，
包括：
从样本中提取核酸；
核酸的转化以及纯化；
3）检测2）的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况；
步骤2）包括：
对1）的产物进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰，较佳地，利用重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、氢醌、硫氰酸盐、二亚硫酸盐及其组合中的一种或多种组合物处理步骤1）所述的核酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，
步骤3）中，分析的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合以及SEQ IDNO:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。
10.如权利要求8所述，
检测试剂盒可以检测到1%以下的甲基化异常，可以用于粪便样本、尿液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本等常规样本的检测。
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Applications Claiming Priority (1)
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