CN117561980B - 一种三角梅试管开花的组培培养基和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物的组织培养及试管开花技术领域，具体涉及一种三角梅试管开花的组培培养基和培养方法。本发明的三角梅试管开花组培培养基包括诱导培养基、生根培养基和花芽培养基；本发明提供的组培培养基，在6‑BA、NAA、PP333共同作用下利于诱导三角梅花芽的形成和开花，获得三角梅试管开花植株。本发明还提供了一种三角梅试管开花的培养方法，最终得到三角梅试管开花植株。本发明的技术方案操作简单、成本低廉，三角梅试管花卉观赏价值高，观赏花期长，可持续两个月以上，可丰富试管花卉新品种。
Description
技术领域
本发明属于植物的组织培养及试管开花技术领域，具体涉及一种三角梅试管开花的组培培养基和培养方法。
背景技术
三角梅（Bougainvillea glabra）又称勒杜鹃、叶子花、九重葛等，为紫茉莉科（Nyctaginaceae）三角梅属（Bougainvillea）的常绿攀援或披散灌木。三角梅是我国一类优良的园林观赏植物，在我国南方地区被广泛用于园林绿化。三角梅因其具有观赏价值高、品种丰富、花量大、花期长、易栽培和应用广泛等特点，一直为我国观赏植物的重要研究对象。
试管花卉又被称为天使花房、微型花卉等，是将组织培养的无菌苗接种于装有各种颜色基质、形态不同且具有观赏价值的瓶子里，以达到可以直接观赏的目的的迷你微型植物。近年来以观叶为主的试管花卉成为市场主流，但品种仅局限于天南星科的一些观叶植物品种等，远远满足不了人们对“新、奇、特”花卉产品的日益需求。因此，发掘特色花卉品种及建立其相配套的试管花卉培养技术具有现实意义。目前国内三角梅试管开花的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种三角梅试管开花的组培培养基和培养方法，应用本发明提供的组培培养基进行三角梅试管培养，能够获得三角梅试管开花植株。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种三角梅试管开花的组培培养基，所述组培培养基包括诱导培养基、生根培养基和花芽培养基；
所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5~2.5mg/L6-BA、0.05~0.15mg/LNAA、30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂；
所述生根培养基以MS培养基或1/2MS培养基为基本培养基，还包括：30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂；
所述花芽培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5~2.5mg/L6-BA、0.1~0.3mg/LNAA、0.5~1mg/LPP333、食用色素0.01g/L、30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂。
优选的，所述诱导培养基的pH值为5.8~6.0；所述生根培养基的pH值为5.8~6.0；所述花芽培养基的pH值为5.8~6.0。
本发明提供了一种三角梅试管开花的培养方法，所述培养方法采用上述技术方案所述组培培养基，培养容器包括试管，包括以下步骤：
将三角梅的嫩枝茎段接种于诱导培养基进行诱导培养，得到带有不定芽的茎段；
将所述带有不定芽的茎段接种于生根培养基进行生根培养，得到三角梅无菌苗；
将所述三角梅无菌苗接种于花芽培养基进行开花培养，得到三角梅试管开花植株。
优选的，所述带有不定芽的茎段中不定芽的长度为2.0~3.0cm。
优选的，所述诱导培养、生根培养和开花培养的温度分别为（25±2）℃。
优选的，所述诱导培养、生根培养和开花培养均在光照条件下进行，所述光照的时间分别为12~16h/d，所述光照的强度分别为1500~2000lx。
优选的，所述诱导培养的时间为7~10d，所述生根培养的时间为40~50d；所述开花培养的时间为90~120d。
优选的，所述接种于诱导培养基前，还包括对三角梅嫩枝茎段依次进行清洗和消毒；
所述清洗包括洗涤剂清洗和流水冲洗，所述洗涤剂清洗时间为5~6min，所述流水冲洗时间为25~35min；
所述消毒的方式包括：先用质量浓度70%~75%乙醇浸泡30~45s，用无菌水冲洗3~4次；再用质量浓度为1%NaClO溶液浸泡8~12min；最后用无菌水冲洗5~6次。
优选的，所述嫩枝茎段中的腋芽数量为1~2个。
优选的，所述三角梅包括'小叶紫'三角梅（Bougainvillea glabra'Sao Paulo'）。
本发明的有益效果：本发明提供了一种三角梅试管开花组培培养基，所述组培培养基包括诱导培养基、生根培养基和花芽培养基；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5~2.5mg/L6-BA、0.05~0.15mg/LNAA、30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂；所述生根培养基以MS培养基或1/2MS培养基为基本培养基，还包括：30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂；所述花芽培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5~2.5mg/L6-BA、0.1~0.3mg/LNAA、0.5~1mg/LPP333、食用色素0.01g/L、30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂。
在本发明提供的组培培养基中，6-BA（6-苄氨基嘌呤）刺激细胞分裂促进三角梅生长和发育，促进芽的形成；NAA（1-萘乙酸）促进三角梅发芽和生长；多效唑（PP333）可以促进花芽的分化；食用色素的作用是着色，使试管三角梅更加美观；6-BA、NAA、PP333共同作用下利于诱导三角梅花芽的形成，获得三角梅试管开花植株。
本发明提供了一种三角梅试管开花的培养方法，通过组织培养技术，进行消毒处理、诱导培养、生根培养、开花培养，最终得到三角梅试管开花植株。本发明的技术方案操作简单、成本低廉，三角梅试管花卉观赏价值高，观赏花期长（可持续两个月以上），还可丰富试管花卉品种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1三角梅嫩枝茎段外植体培养第15d嫩枝茎段不定芽情况；
图2为实施例1三角梅带有不定芽的外植体生根培养第60d分化不定根图；
图3为实施例1三角梅带有不定芽的外植体开花培养第130d诱导花芽图；
图4为实施例1三角梅开花培养第160d三角梅植株试管开花图；
图5为实施例2、3的三角梅植株试管开花图，左侧为实施例3中开花培养第150d三角梅植株试管开花情况，右侧为实施例2中开花培养第120d三角梅植株试管开花情况。
具体实施方式
本发明提供了一种三角梅试管开花的组培培养基，所述组培培养基包括诱导培养基、生根培养基和花芽培养基。
在本发明中，所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5~2.5mg/L6-BA、0.05~0.15mg/LNAA、30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂；更优选以MS培养基为基本培养基，还仅含有：1.5~2.5mg/L6-BA、0.05~0.15mg/LNAA、30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂。在本发明中，所述诱导培养基中6-BA的浓度为1.5~2.5mg/L，优选为2~2.5mg/L，更优选为2.5mg/L。所述诱导培养基中NAA的浓度为0.05~0.15mg/L，优选为0.08~0.12mg/L，更优选为0.1mg/L；所述诱导培养基中琼脂的浓度为7.0~8.0g/L琼脂，优选为7.5~8.0g/L琼脂，更优选8.0g/L琼脂。本发明中6-BA和NAA在适当浓度配比下能够共同促进三角梅的腋芽分化形成不定芽。
在本发明中，所述诱导培养基的pH值优选为5.8~6.0，更优选为5.9。
在本发明中，所述生根培养基以MS培养基或1/2MS培养基为基本培养基，还包括：30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂；更优选以MS培养基或1/2MS培养基为基本培养基，还仅含有：30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂。在本发明中，所述生根培养基中琼脂浓度为7.0~8.0g/L，优选为7.5~8.0g/L琼脂，更优选为8.0g/L琼脂。本发明生根培养基中不添加生长调节剂的作用为壮苗生根。本发明生根培养基中的生根率可达60%。
在本发明中，所述生根培养基的pH值优选为5.8~6.0，更优选为5.9。
在本发明中，所述花芽培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5~2.5mg/L6-BA、0.1~0.3mg/LNAA、0.5~1mg/LPP333、食用色素0.01g/L、30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂；更优选以MS培养基为基本培养基，还仅含有：1.5~2.5mg/L6-BA、0.1~0.3mg/LNAA、0.5~1mg/LPP333、食用色素0.01g/L、30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂。在本发明中，所述花芽培养基中6-BA浓度为1.5~2.5mg/L，优选为1.8~2.2mg/L，更优选为2mg/L。所述花芽培养基中NAA浓度为0.1~0.3mg/L，优选为0.2~0.3mg/L，更优选为0.25~0.3mg/L。所述花芽培养基中PP333浓度为0.5~1mg/L，优选为0.8~1mg/L，更优选为1mg/L。所述花芽培养基中琼脂浓度为7.0~8.0g/L，优选为7.5~8.0g/L，更优选为8.0g/L。本发明中，6-BA能够刺激细胞分裂促进三角梅生长和发育，促进腋芽萌发以及花芽的形成；NAA能够促进三角梅发芽和生长；PP333促进花芽的形成；食用色素的作用是着色，使试管三角梅更加美观；三角梅外植体的花芽诱导率可达23.33%。
在本发明中，所述花芽培养基的pH值优选为5.8~6.0，更优选为5.9。
本发明提供的诱导培养基和花芽培养基中含有6-BA、NAA、多效唑（PP333），在6-BA、NAA、PP333共同作用下利于诱导三角梅的芽形成和开花，获得三角梅试管开花植株。本发明添加PP333、6-BA、NAA的浓度较低，降低生产成本。
本发明之所以选择MS培养基作为基础培养基，是由于MS培养基中含大量和微量元素及维生素、甘氨酸，与其它基本培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高。本发明对所述MS培养基、1/2MS培养基、PP333、6-BA、NAA、食用色素、蔗糖和琼脂的来源没有特殊的限定，采用常规的市售产品即可。本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产萘乙酸（NAA）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、多效唑（PP333），均为分析纯。本发明1/2MS培养基的应用量是MS培养基的一半。
本发明配制诱导培养基时，按照MS基础培养基粉、蔗糖、琼脂和纯水的重量比为4.43:30:（7~8）:1000称取相应组分，灭菌后按照诱导培养基的组成添加灭菌后的1.5~2.5mg/L6-BA和0.05~0.15mg/LNAA；诱导培养基中的蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为7~8g/L。
本发明配制生根培养基时，按照MS基础培养基粉、蔗糖、琼脂和纯水的重量比为4.43:30:（7~8）:1000称取相应组分，之后在121℃下恒温灭菌20min；或者按照1/2MS基础培养基粉、蔗糖、琼脂和纯水的重量比2.215:30:（7~8）:1000称取相应组分，之后在121℃下恒温灭菌20min；生根培养基中的蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为7~8g/L。
本发明配制花芽培养基时，按照MS基础培养基粉、蔗糖、琼脂和纯水的重量比为4.43:30:（7~8）:1000称取相应组分，之后在121℃下恒温灭菌20min，灭菌后按照花芽培养基的组成添加灭菌后的1.5~2.5mg/L6-BA、0.1~0.3mg/LNAA、0.5~1mg/LPP333和0.01g/L食用色素；花芽培养基中的蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为7~8g/L。
本发明还提供了一种三角梅试管开花的培养方法，所述培养方法采用上述技术方案所述的组培培养基，培养容器包括试管，包括以下步骤：
将三角梅的嫩枝茎段接种于诱导培养基进行诱导培养，得到带有不定芽的茎段；
将所述带有不定芽的茎段接种于生根培养基进行生根培养，得到三角梅无菌苗；
将所述三角梅无菌苗接种于花芽培养基进行开花培养，得到三角梅试管开花植株。本发明对所述组培应用的培养容器无特殊限定，采用常规的培养容器即可。在本发明实施例中，所述培养容器优选为试管。
本发明将三角梅嫩枝茎段于诱导培养基进行诱导培养，得到带有不定芽的茎段。本发明以三角梅嫩枝茎段作为外植体进行育苗。本发明以三角梅叶片作为外植体进行组培实验，虽然产生了愈伤组织，但是分化不定芽困难，且过程漫长；还以顶芽和全木质化茎段作为外植体进行组培，但是组培效果没有嫩枝茎段好，三角梅嫩枝茎段作为外植体，和顶芽作为外植体相比，更加成熟稳定，更耐消毒；和木质化茎段作为外植体相比，三角梅嫩枝茎段细胞分裂更活跃，消毒效果更好。
在本发明中，所述三角梅嫩枝茎段优选采集三角梅绿色嫩枝的茎段制备而成。本发明所述嫩枝茎段的制备方法优选包括：去除三角梅绿色嫩枝的多余的枝、叶和刺，只保留茎段和腋芽。本发明所述嫩枝茎段中的腋芽数量优选为1~2个。在本发明实施例中，所述三角梅为'小叶紫'三角梅（Bougainvillea glabra'Sao Paulo'）。
本发明所述三角梅嫩枝茎段接种于诱导培养基之前优选依次进行清洗和消毒；本发明所述清洗优选包括洗涤剂清洗和流水冲洗，本发明对所述清洗方式没有特殊限定。在本发明中，所述洗涤剂优选为洗洁精和洗手液中的一种，更优选为洗洁精。本发明所述洗涤剂清洗时间优选为5~6min，更优选为5.5min。本发明所述流水冲洗时间优选为25~35min；进一步优选为28~32min，更优选为30min。本发明对所述流水冲洗时应用的水没有特殊限定，采用常规的自来水即可。本发明洗涤剂清洗和流水冲洗能够有效清洗三角梅嫩枝茎段嫩枝茎段表面的灰尘。
本发明对所述消毒方式没有特殊限定，优选为体积浓度70%~75%乙醇和质量浓度为1%NaClO溶液，更优选为体积浓度75%乙醇和质量浓度为1%NaClO溶液。本发明所述消毒方式先用75%乙醇优选浸泡30~45s，进一步优选为30~35s，更优选为30s，再优选用无菌水冲洗3~4次；再优选用质量浓度为1%NaClO溶液浸泡8~12min，进一步优选为9~11min，更优选为10min；最后优选用无菌水冲洗5~6次，更优选为冲洗6次。本发明对无菌水没有特殊限定，优选对蒸馏水灭菌后获得；所述75%乙醇和NaClO溶液的用量均优选淹没三角梅嫩枝茎段即可。
本发明所述三角梅嫩枝茎段清洗和消毒之后，本发明优选将暴露于消毒液的外植体的剪口面去除后，再接种于诱导培养基。本发明优选每个诱导培养瓶中接种一个外植体。每个培养瓶接种一个外植体是为了减少污染，为后续外植体生长提供更大空间。本发明以三角梅嫩枝茎段作为外植体进行三角梅试管开花培养，以试管作为培养容器，形成了三角梅试管花卉培养技术体系，弥补了现有技术中三角梅试管花卉的空白，丰富了试管花卉品种。
在本发明中，所述诱导培养的温度优选为（25±2）℃，进一步优选为24~26℃，更优选为25℃。
在本发明中，所述三角梅嫩枝茎段诱导培养优选在光照条件下进行，所述光照的时间优选为12~16h/d，进一步优选为12~14h/d，更优选为12h/d；所述光照的光照强度优选为1500~2000lx，进一步优选为1600~1800lx，更优选为1750lx。在本发明中，所述诱导培养时间优选为7~10d，更优选为8~9d。本发明诱导培养三角梅嫩枝茎段的腋芽分化形成不定芽，不定芽诱导率达到87%。在本发明中，三角梅嫩枝茎段经诱导培养获得带有不定芽的茎段。本发明所述诱导培养至腋芽抽长至2~3cm（即不定芽的长度为2~3cm）时停止。
得到不定芽的长度为2~3cm的茎段后，本发明将所述带有不定芽的茎段接种于生根培养基进行生根培养，得到三角梅无菌苗。本发明所述带有不定芽的茎段中不定芽的长度优选为2~3cm，更优选为2.5cm。本发明不对带有不定芽的茎段进行任何处理，直接将带有不定芽的茎段转接到生根培养基进行生根培养。每个培养瓶接种一个带有不定芽的茎段是为了减少污染，为后续外植体生长提供更大空间。
在本发明中，所述生根培养的温度优选为（25±2）℃，进一步优选为24~26℃，更优选为25℃。本发明所述生根培养优选在光照条件下进行的，所述光照培养的时间优选为12~16h/d，进一步优选为12~13h/d，更优选为12h/d；所述光照培养的光照强度优选为1500~2000lx，进一步优选为1600~1900lx，更优选为1700lx。在本发明中，所述生根培养时间优选为40~50d，更优选为44~46d。
本发明经生根培养得到生根后的三角梅无菌苗，本发明优选将所述生根后的三角梅无菌苗接种于花芽培养基进行开花培养。本发明对所述生根培养至根系数量达到3根以上且长度在3cm左右时停止。
本发明优选对所述生根后的三角梅无菌苗不进行任何处理，直接转接到花芽培养基进行开花培养。每个培养瓶接种一个生根后的三角梅无菌苗是为了减少污染，为后续外植体生长提供更大空间。
在本发明中，所述开花培养的温度优选为（25±2）℃，进一步优选为24~26℃，更优选为25℃。本发明所述开花培养优选在光照条件下进行的，所述光照的时间优选为12~16h/d，进一步优选为12~13h/d，更优选为12h/d；所述光照的强度优选为1500~2000lx，进一步优选为1600~1850lx，更优选为1700lx。本发明所述开花培养的时间优选为90~120d，进一步优选为96~115d，更优选为100~110d。本发明所述开花培养结束后获得三角梅试管开花植株。本发明所述开花培养直至出现花苞为止。本发明所述开花培养的时间为90~120d是出现花苞的时间。
本发明提供的三角梅试管开花的培养方法，通过组织培养技术进行消毒处理、诱导培养、生根培养和开花培养，最终得到三角梅试管开花植株。本发明的技术方案操作简单、成本低廉，三角梅试管花卉观赏价值高，观赏花期长（可持续两个月以上），可丰富试管花卉新品种，为三角梅的试管花卉的规模化栽培奠定技术基础。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例和对比例中的食用色素组成为：复配着色剂柠檬色组成为：柠檬黄69.9%、氯化钠30%、日落黄0.1%；复配着色剂果绿组成为：氯化钠64%、柠檬黄29%、亮蓝7%；复配着色剂胭脂色组成为：胭脂红69%、氯化钠30%、诱惑红1%。柠檬色、果绿和胭脂色混合后应用，混合的质量比无特殊限定。本发明所述食用色素为复配食品添加剂复配着色剂，由上海染料研究所有限公司生产。
实施例1~3和对比例1~3应用的是同一批次采集的‘小叶紫’三角梅母株的绿色嫩枝茎段；长势一致。
实施例1一种三角梅试管开花的培养方法，步骤如下：
1外植体采集与清洗
选择生长健壮、无病虫害的‘小叶紫’三角梅（Bougainvillea glabra'SaoPaulo'）母株，采集绿色嫩枝的茎段，去除多余的枝、叶（刺），修剪成合适的长度，每个茎段保留1~2个腋芽，用洗洁精清洗5min，流水冲洗30min。
2外植体消毒处理
将步骤1所得外植体置于超净工作台上，先使用体积浓度为75%乙醇溶液消毒30s，消毒后用无菌水清洗3次，再使用含质量浓度为1%NaClO溶液消毒10min，消毒后用无菌水清洗6次。
3诱导培养
将步骤2所得消毒后的茎段，用无菌滤纸吸干表面水分，剪去暴露于消毒液的剪口面，再接种于诱导培养基。诱导培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有2.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。诱导培养共接种90瓶，接种后在光暗交替条件下进行诱导培养，诱导培养的光照强度2000lx，光照时间为12h/d；诱导培养的环境温度为（25±2）℃，诱导培养7~10d腋芽开始分化出不定芽，诱导率为94.44%，继续培养至第15d，不定芽情况如图1所示。不定芽长度至2~3cm进行生根培养。
4生根培养
将步骤3分化出不定芽的茎段接种于生根培养基进行生根培养。生根培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。生根培养共接种60瓶，生根培养在光暗交替条件下进行，其环境温度为（25±2）℃，光照强度2000lx，光照时间为12h/d；生根培养时间为40~50d；转接至生根培养基开始计算生根培养时间，生根培养第40~50d时外植体开始分化出现不定根，生根率为68.33%。继续培养至第60d，分化不定根情况如图2所示。生根培养至根系数量达到3根以上，长度在3cm左右结束，获得生根后三角梅无菌苗。
5开花培养
将步骤4获得的生根后的三角梅无菌苗接种于彩色花芽培养基进行开花培养。花芽培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有6-BA2mg/L、NAA0.3mg/L、PP3331mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L和食用色素0.01g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。花芽培养共接种30瓶，开花培养在光暗交替条件下进行，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d；环境温度为（25±2）℃，开花培养时间为90~120d。在植物的枝条靠近顶部的叶腋处生长出的花梗上形成花芽，花芽诱导率为23.33%。转接至花芽培养基开始计算开花培养时间，培养第90~120d开始出现花芽的时间，继续开花培养至第130d，诱导花芽结果见图3，继续开花培养至第160d，花芽开放后，得到三角梅试管开花植株，开花植株的情况见图4。
实施例2一种三角梅试管开花的培养方法，步骤如下：
1外植体采集与清洗
选择生长健壮、无病虫害的‘小叶紫’三角梅（Bougainvillea glabra'SaoPaulo'）母株，采集绿色嫩枝的茎段，去除多余的枝、叶（刺），修剪成合适的长度，每个茎段保留1~2个腋芽，用洗洁精清洗6min，流水冲洗30min。
2外植体消毒处理
将步骤1所得外植体置于超净工作台上，先使用体积浓度为75%乙醇溶液消毒30s，消毒后用无菌水清洗3次，再使用含质量浓度为1%NaClO溶液消毒10min，消毒后用无菌水清洗6次。
3诱导培养
将步骤2所得消毒后的茎段，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，剪去暴露于消毒液的剪口面，再接种于诱导培养基。诱导培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有1.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。诱导培养共接种90瓶，接种后在光暗交替条件下进行诱导培养，光照强度2000lx，光照培养时间为12h/d；诱导培养的环境温度为（25±2）℃，诱导培养7~10d腋芽开始分化出不定芽，诱导率为83.33%。不定芽长度至2~3cm进行生根培养。
4生根培养
将步骤3分化出不定芽的外植体接种于生根培养基进行生根培养。生根培养基组成为：以1/2MS培养基为基本培养基，还仅含有蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。生根培养共接种60瓶，接种后开始进行生根培养，生根培养在光暗交替条件下进行，光照强度2000lx，光照培养时间为12h/d；环境温度为（25±2）℃，转接至生根培养基开始计算生根培养时间，生根培养40~50d时外植体开始分化出不定根，生根率为56.67%。生根培养至根系数量达到3根以上，长度在3cm左右结束。培养结束获得生根后三角梅无菌苗。
5开花培养
将步骤4获得的生根后的三角梅无菌苗接种于彩色花芽培养基进行开花培养。花芽培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有6-BA 1.5mg/L、NAA 0.1mg/L、PP3330.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L和食用色素0.01g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。开花培养共接种30瓶，接种后开始进行开花培养。开花培养在光暗交替条件下进行，光照强度2000lx，光照培养时间为12h/d；环境温度为（25±2）℃，开花培养时间为90~120d。实施例2中开花培养第120d三角梅植株试管开花情况见图5。
在植物的枝条靠近顶部的叶腋处生长出的花梗上形成花芽并开放，得到三角梅试管开花植株，开花培养直至出现花苞，转接至花芽培养基开始计算开花培养时间，培养第90~120d为开始出现花芽的时间，花芽诱导率为6.67%。
实施例3一种三角梅试管开花的培养方法，步骤如下：
1外植体采集与清洗
选择生长健壮、无病虫害的‘小叶紫’三角梅（Bougainvillea glabra'SaoPaulo'）母株，采集绿色嫩枝的茎段，去除多余的枝叶（刺），修剪成合适的长度，每个茎段保留1~2个腋芽，用洗洁精清洗5~6min，流水冲洗30min。
2外植体消毒处理
将步骤1所得外植体置于超净工作台上，先使用体积浓度为75%乙醇溶液消毒30s，消毒后用无菌水清洗3次，再使用含质量浓度为1%NaClO溶液消毒10min，消毒后用无菌水清洗6次。
3诱导培养
将步骤2所得消毒后的茎段，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，剪去暴露于消毒液的剪口面，再接种于诱导培养基。诱导培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有2mg/L6-BA、0.15mg/LNAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。诱导培养共接种90瓶，接种后在光暗交替条件下进行诱导培养，光照强度1500~2000lx，光照培养时间为12h/d；诱导培养的环境温度为（25±2）℃，诱导培养7~10d腋芽开始分化出不定芽，诱导率为86.67%。不定芽长度至2~3cm进行生根培养。
4生根培养
将步骤3分化出不定芽的外植体接种于生根培养基进行生根培养。生根培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。生根培养共接种60瓶，接种后开始进行生根培养，生根培养在光暗交替条件下进行，光照强度2000lx，光照培养时间为12h/d；环境温度为（25±2）℃，转接至生根培养基开始计算生根培养时间，生根培养40~50d时外植体开始出现分化出不定根，生根率为60.00%。培养结束获得生根后的三角梅无菌苗。生根培养至根系数量达到3根以上，长度在3cm左右结束。
5开花培养
将步骤4获得生根后的三角梅无菌苗接种于彩色花芽培养基进行开花培养。花芽培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有6-BA 2.5mg/L、NAA 0.2mg/L、PP3331mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L和食用色素0.01g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。花芽培养共接种30瓶，开花培养在光暗交替条件下进行，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d；环境温度为（25±2）℃，开花培养时间为90~120d。在植物的枝条靠近顶部的叶腋处生长出的花梗上形成花芽并开放，得到三角梅试管开花植株，花芽诱导率为10.00%。实施例3中开花培养第150d三角梅植株试管开花情况见图5。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于：诱导培养基的生长调节剂种类改变，KT替换6-BA；生根培养基添加IBA、NAA激素；花芽诱导培养基去掉PP333。
一种三角梅试管开花的培养方法，步骤如下：
1外植体采集与清洗
选择生长健壮、无病虫害的‘小叶紫’三角梅（Bougainvillea glabra'SaoPaulo'）母株，采集绿色嫩枝的茎段，去除多余的枝、叶（刺），修剪成合适的长度，每个茎段保留1~2个腋芽，用洗洁精清洗5min，流水冲洗30min。
2外植体消毒处理
将步骤1所得外植体置于超净工作台上，先使用体积浓度为75%乙醇溶液消毒30s，消毒后用无菌水清洗3次，再使用含质量浓度为1%NaClO溶液消毒10min，消毒后用无菌水清洗6次。
3诱导培养
将步骤2所得消毒后的茎段，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，剪去暴露于消毒液的剪口面，再接种于诱导培养基。诱导培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有2.5mg/LKT、0.1mg/LNAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的pH值为5.8~6.0。诱导培养共接种90瓶，接种后在光暗交替条件下进行诱导培养，诱导培养的光照强度2000lx，光照时间为12h/d；诱导培养的环境温度为（25±2）℃，诱导培养7~10d腋芽开始分化出不定芽，诱导率为83.33%。不定芽长度至为2~3cm进行生根培养。
4生根培养
将步骤3分化出不定芽的茎段接种于生根培养基进行生根培养。生根培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有1.5mg/LIBA、0.1mg/LNAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。生根培养共接种60瓶，生根培养在光暗交替条件下进行，其环境温度为（25±2）℃，光照强度2000lx，光照时间为12h/d；生根培养60~70d时开始出现不定根，生根率为66.67%。培养结束获得生根后三角梅无菌苗。由于无根苗在添加激素的生根培养上，先产生了愈伤组织，后期再分化出根，与实施例1相比，生根时间更长，且伴随着茎叶过度生长，不利于植株后期花芽诱导。
5开花培养
将步骤4获得的生根后的三角梅无菌苗接种于彩色花芽培养基进行开花培养。花芽培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有6-BA 2mg/L、NAA 0.3mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L和食用色素0.01g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。花芽培养共接种30瓶，开花培养在光暗交替条件下进行，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d；环境温度为（25±2）℃，开花培养时间为90~120d内未发现有花芽形成。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于：诱导培养基、生根培养基和开花培养基的基础培养基种类改变，WPM替换MS。
一种三角梅试管开花的培养方法，步骤如下：
1外植体采集与清洗
选择生长健壮、无病虫害的‘小叶紫’三角梅（Bougainvillea glabra'SaoPaulo'）母株，采集绿色嫩枝的茎段，去除多余的枝、叶（刺），修剪成合适的长度，每个茎段保留1~2个腋芽，用洗洁精清洗5min，流水冲洗30min。
2外植体消毒处理
将步骤1所得外植体置于超净工作台上，先使用体积浓度为75%乙醇溶液消毒30s，消毒后用无菌水清洗3次，再使用含质量浓度为1%NaClO溶液消毒10min，消毒后用无菌水清洗6次。
3诱导培养
将步骤2所得消毒后的茎段，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，剪去暴露于消毒液的剪口面，再接种于诱导培养基。诱导培养基组成为：以WPM培养基为基本培养基，还仅含有2.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。诱导培养共接种90瓶，接种后在光暗交替条件下进行诱导培养，诱导培养的光照强度2000lx，光照时间为12h/d；诱导培养的环境温度为（25±2）℃，诱导培养7~10d外植体腋芽开始分化出不定芽，诱导率为76.67%。不定芽长度至为2~3cm进行生根培养。
4生根培养
将步骤3分化出不定芽的茎段接种于生根培养基进行生根培养。生根培养基组成为：以WPM培养基为基本培养基，还仅含有蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。生根培养共接种60瓶，生根培养在光暗交替条件下进行，其环境温度为（25±2）℃，光照强度2000lx，光照时间为12h/d；生根培养第40~50d外植体开始分化出不定根，生根率为55.00%。培养结束获得生根后三角梅无菌苗。
5开花培养
将步骤4获得的生根后的三角梅无菌苗接种于彩色花芽培养基进行开花培养。花芽培养基组成为：以WPM培养基为基本培养基，还仅含有6-BA 2mg/L、NAA 0.3mg/L、PP3331mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L和食用色素0.01g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。花芽培养共接种30瓶，开花培养在光暗交替条件下进行，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d；环境温度为（25±2）℃，开花培养90~120d在植物的枝条靠近顶部的叶腋处生长出的花梗上开始形成花芽并开放，得到三角梅试管开花植株，花芽诱导率为3.33%。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于：诱导培养基和开花培养基的NAA改为IAA。
一种三角梅试管开花的培养方法，步骤如下：
1外植体采集与清洗
选择生长健壮、无病虫害的‘小叶紫’三角梅（Bougainvillea glabra'SaoPaulo'）母株，采集绿色嫩枝的茎段，去除多余的枝、叶（刺），修剪成合适的长度，每个茎段保留1~2个腋芽，用洗洁精清洗5min，流水冲洗30min。
2外植体消毒处理
将步骤1所得外植体置于超净工作台上，先使用体积浓度为75%乙醇溶液消毒30s，消毒后用无菌水清洗3次，再使用含质量浓度为1%NaClO溶液消毒10min，消毒后用无菌水清洗6次。
3诱导培养
将步骤2所得消毒后的茎段，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，剪去暴露于消毒液的剪口面，再接种于诱导培养基。诱导培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有2.5mg/L6-BA、0.1mg/LIAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。诱导培养共接种90瓶，接种后在光暗交替条件下进行诱导培养，诱导培养的光照强度2000lx，光照时间为12h/d；诱导培养的环境温度为（25±2）℃，诱导培养的时间为7~10d。诱导培养过程中腋芽开始分化出不定芽，诱导率为70.00%。不定芽长度至为2~3cm进行生根培养。
4生根培养
将步骤3分化出不定芽的茎段接种于生根培养基进行生根培养。生根培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。生根培养共接种60瓶，生根培养在光暗交替条件下进行，其环境温度为（25±2）℃，光照强度2000lx，光照时间为12h/d；生根培养时间为40~50d；外植体分化出不定根，生根率为65.00%。培养结束获得生根后三角梅无菌苗。
5开花培养
将步骤4获得的生根后的三角梅无菌苗接种于彩色花芽培养基进行开花培养。花芽培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有6-BA 2mg/L、IAA 0.3mg/L、PP3331mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L和食用色素0.01g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。花芽培养共接种30瓶，开花培养在光暗交替条件下进行，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d；环境温度为（25±2）℃，开花培养时间为90~120d。在观察期内未发现有花芽形成。
对比例4
三角梅顶芽作为外植体的效果数据。
1外植体采集与清洗
选择生长健壮、无病虫害的‘小叶紫’三角梅（Bougainvillea glabra'SaoPaulo'）母株，采集新鲜顶芽，去除多余的枝、叶（刺），修剪成合适的长度，每个茎段保留1~2个腋芽，用洗洁精清洗5min，流水冲洗30min。
2外植体消毒处理
将步骤1所得外植体置于超净工作台上，先使用体积浓度为75%乙醇溶液消毒30s，消毒后用无菌水清洗3次，再使用含质量浓度为1%NaClO溶液消毒6min，消毒后用无菌水清洗6次。
3诱导培养
将步骤2所得消毒后的顶芽，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，剪去暴露于消毒液的剪口面，再接种于诱导培养基。诱导培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有2.5mg/L6-BA、0.1mg/LIAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。诱导培养共接种90瓶，接种后在光暗交替调条件下进行诱导培养，诱导培养的光照强度2000lx，光照时间为12h/d；诱导培养的环境温度为（25±2）℃，诱导培养的时间为7~10天。诱导培养过程中腋芽开始分化出不定芽，诱导率为43.33%。
对比例5
三角梅全木质化茎段作为外植体的效果数据。
1外植体采集与清洗
选择生长健壮、无病虫害的‘小叶紫’三角梅（Bougainvillea glabra'SaoPaulo'）母株，采集全木质化茎段，去除多余的枝、叶（刺），修剪成合适的长度，每个茎段保留1~2个腋芽，用洗洁精清洗5min，流水冲洗30min。
2外植体消毒处理
将步骤1所得外植体置于超净工作台上，先使用体积浓度为75%乙醇溶液消毒1min，消毒后用无菌水清洗3次，再使用含质量浓度为2%NaClO溶液消毒12min，消毒后用无菌水清洗6次。
3诱导培养
将步骤2所得消毒后的全木质化茎段，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，剪去暴露于消毒液的剪口面，再接种于诱导培养基。诱导培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有2.5mg/L6-BA、0.1mg/LIAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，灭菌后的培养基pH值为5.8~6.0。诱导培养共接种90瓶，接种后在光暗交替调条件下进行诱导培养，诱导培养的光照强度2000lx，光照时间为12h/d；诱导培养的环境温度为（25±2）℃，诱导培养的时间为7~10天。诱导培养过程中腋芽开始分化出不定芽，诱导率为26.67%。
对实施例1~3和对比例1~5的诱导培养的诱导率、生根培养的生根率和开花培养的花芽诱导率进行计算，对比例4~5只进行了诱导培养。计算公式如下：如下公式中不定芽的诱导率以诱导培养为10d时进行统计，生根率以生根培养时间为50d时统计，花芽诱导率以开花培养的时间为120d时统计。
不定芽诱导率（%）=分化不定芽的外植体总数/接种的外植体总数×100%；
生根率（%）=生根的外植体总数/接种的外植体总数×100%；
花芽诱导率（%）=分化花芽的植株总数/接种的植株总数×100%。
结果见表1。根据表1可知，实施例1的效果数据最佳，花芽诱导率的达到23.33%，开花期可达到两个月左右，从9月2日开始开花，至目前11月8日仍再开花。本发明诱导培养的时间、生根培养的时间、开花培养的时间为不定芽、根和花芽萌发的时间，继续提高培养时间，可以在一定程度上提高不定芽诱导率、生根率和花芽诱导率。
表1实施例1~3和对比例1~5三角梅嫩枝茎段无菌诱导培养结果
对比例4中，由于顶芽比较幼嫩，消毒过程中往往容易消毒致死，而消毒时间过短又容易导致染菌，与实施例1相比，腋芽诱导率显著低于嫩枝茎段。对比例5中，全木质化茎段往往带菌较多，消毒过程中不容易灭菌干净，而消毒时间过长又容易使得芽点失活，与实施例1相比，腋芽诱导率显著低于嫩枝茎段。
综上所述，本发明以组培作为培养手段，利用本发明的培养方法可以获得的三角梅试管开花植株，建立了三角梅试管开花技术培养体系，为三角梅试管花卉的开发提供技术支撑。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种三角梅试管开花的培养方法，其特征在于，所述培养方法采用组培培养基，培养容器包括试管，由以下步骤组成：
所述组培培养基由诱导培养基、生根培养基和花芽培养基组成；将三角梅的嫩枝茎段接种于诱导培养基进行诱导培养，得到带有不定芽的茎段；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有：1.5~2.5mg/L 6-BA、0.05~0.15mg/L NAA、30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂；
将所述带有不定芽的茎段接种于生根培养基进行生根培养，得到三角梅无菌苗；所述生根培养基以MS培养基或1/2MS培养基为基本培养基，还仅含有：30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂；
将所述三角梅无菌苗接种于花芽培养基进行开花培养，得到三角梅试管开花植株；所述花芽培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有：1.5~2.5mg/L 6-BA、0.1~0.3mg/L NAA、0.5~1mg/L PP333、食用色素0.01g/L、30g/L蔗糖和7.0~8.0g/L琼脂。
2.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述诱导培养基的pH值为5.8~6.0；所述生根培养基的pH值为5.8~6.0；所述花芽培养基的pH值为5.8~6.0。
3.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述带有不定芽的茎段中不定芽的长度为2.0~3.0cm。
4.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述诱导培养、生根培养和开花培养的温度分别为25±2 ℃。
5.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述诱导培养、生根培养和开花培养均在光照条件下进行，所述光照的时间分别为12~16h/d，所述光照的强度分别为1500~2000lx。
6.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述诱导培养的时间为7~10d，所述生根培养的时间为40~50d；所述开花培养的时间为90~120d。
7.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述接种于诱导培养基前，还包括对三角梅嫩枝茎段依次进行清洗和消毒；
所述清洗包括洗涤剂清洗和流水冲洗，所述洗涤剂清洗时间为5~6min，所述流水冲洗时间为25~35min；
所述消毒的方式包括：先用质量浓度70%~75%乙醇浸泡30~45s，用无菌水冲洗3~4次；再用质量浓度为1% NaClO溶液浸泡8~12min；最后用无菌水冲洗5~6次。
8.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述嫩枝茎段中的腋芽数量为1~2个。
9.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，三角梅包括'小叶紫'三角梅（Bougainvillea glabra 'SaoPaulo'）。
10.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有2.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L；或者，所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有2mg/L6-BA、0.15mg/LNAA、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，
所述花芽培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有6-BA 2mg/L、0.3mg/L NAA、1mg/LPP333、蔗糖30g/L、琼脂8g/L和食用色素0.01g/L；或者，所述花芽培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有6-BA 2.5mg/L、NAA 0.2mg/L、PP333 1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L和食用色素0.01g/L。
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