CN117535383A - 一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用 - Google Patents

一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117535383A
CN117535383A CN202311521442.6A CN202311521442A CN117535383A CN 117535383 A CN117535383 A CN 117535383A CN 202311521442 A CN202311521442 A CN 202311521442A CN 117535383 A CN117535383 A CN 117535383A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
sequence
reaction
nucleic acid
detection method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311521442.6A
Other languages
English (en)
Inventor
刘国珍
陶书蕊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chinese University of Hong Kong Shenzhen
Original Assignee
Chinese University of Hong Kong Shenzhen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chinese University of Hong Kong Shenzhen filed Critical Chinese University of Hong Kong Shenzhen
Priority to CN202311521442.6A priority Critical patent/CN117535383A/zh
Publication of CN117535383A publication Critical patent/CN117535383A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法，包括以下步骤：S1.设计并合成探针1、探针2、探针3以及环状RCA模板；S2.连接反应：配制连接反应体系，所述连接反应体系包括所述探针1、探针2、连接酶和待测样品核酸；S3.恒温扩增反应：向所述S2连接反应产物中加入反应液，所述反应液包括所述环状RCA模板、所述探针3、聚合酶、切刻酶；S4.在S3恒温扩增反应产物中加入核酸染料，得到混合物，之后分别利用荧光或者纸基芯片检测产物，判断待测样品核酸中是否存在目标基因。本发明提供的检测方法将切刻酶与滚环扩增技术相结合，具有较高的灵敏度和特异性；结合具有加热功能和纸基芯片成像功能3D便携式设备，本发明适用于POCT的诊断场景，能够对低浓度的致癌mRNA水平进行准确检测。

Description

一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用。
背景技术
核酸是普遍存在于各种生物(包括细菌、病毒等)中的遗传信息载体，不同的生物其具有相应的特异性核酸序列，因此，通过核酸的检测，能够获知生物的存在以及数量的相关信息，因此应用广泛。而核酸检测主要依赖于核酸扩增技术这一分子生物学领域的常用技术，其中，聚合酶链反应(PCR)是目前使用最为广泛的DNA扩增技术，然而其存在一些局限：(1)由于其通常包括变性、退火等步骤，因此在应用上依赖于大型仪器，如高质量的热循环仪，因此难以在基层推广应用；(2)检测周期长，步骤繁琐，包括样本处理、核酸提取、扩增和分析等多个步骤，耗时长，同时需要熟练的技术人员进行操作；(3)常引起非特异性扩增。
自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的核酸恒温扩增技术，滚环扩增技术(RCA)是其中最典型的之一，它借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式的复制方式，可在恒温下发生扩增。如今已经发展出第一代线性滚环扩增(LRCA)技术和第二代超分支滚环扩增(HRCA)技术。
人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一种DNA病毒，与人宫颈癌的发生、发展密切相关。根据基因组特定区段的序列差异，HPV被分为不同的型，其中HPV16型和HPV18型最为常见。体外快速检测HPV16/HPV18型核酸，对宫颈癌的早期筛查意义重大。然而上述的聚合酶链反应(PCR)方法，由于步骤繁琐，对温度要求高，有对大型仪器的依赖性，测试成本高，不适用于欠发达地区，极大限制了这种检测方法广泛使用。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明提供一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用，旨在解决上述的技术问题。
本发明提供一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法，包括以下步骤：
S1.设计并合成探针1、探针2、探针3以及环状RCA模板，其中：
所述环状RCA模板包括多个重复序列，由多个所述重复序列首尾串联而成；
所述探针1包括目标基因前端识别序列以及与所述探针3的序列结合的序列；
所述探针2包括目标基因后端识别序列、切刻酶的识别位点序列以及与所述环状RCA模板的重复序列相同的序列；
所述探针3为与所述探针1序列结合的序列；
S2.连接反应：配制连接反应体系，所述连接反应体系包括所述探针1、探针2、连接酶和待测样品核酸；
S3.恒温扩增反应：向所述S2连接反应产物中加入反应液，所述反应液包括所述环状RCA模板、所述探针3、聚合酶、切刻酶；
S4.在S3恒温扩增反应产物中加入核酸染料，得到混合物，之后检测产物，判断待测样品核酸中是否存在目标基因。
进一步的，所述环状RCA模板由5个所述重复序列首尾串联而成。
进一步的，所述环状RCA模板的序列为GGTTATTATTGGTTATTATTGGTTATTATTGGTTATTATTGGTTATTATT(SEQ ID NO.1)。
进一步的，所述S4中检测产物采用酶标仪或纸基芯片。
进一步的，所述S4中检测产物采用所述酶标仪时，具体操作为在激发波长为495nM、发射波长为537nM时读取荧光读数，所述核酸染料为SYBR Gold混合物，所述SYBRGold混合物包括0.6μL的100×SYBR Gold和9.4μL的ddH2O；
进一步的，所述S4中检测产物采用所述纸基芯片时，具体操作为将混合物添加至采用纸基芯片的圆形上样区，10分钟后读数，所述核酸染料为SYBR Green I混合物，所述SYBR Green I混合物包括3μL的100×SYBR Green I、3μL的1％Tween 20和4μL的ddH2O。
进一步的，所述连接酶为T4连接酶，所述连接反应体系的组份及配比为：以单管反应体系10μL计，1×T4 buffer、终浓度均为50nM的探针1和探针2、2.5U的T4连接酶、1μL的浓度为100aM-100nM的待测样品核酸，所述1×T4buffer包括50mM的Tris-HCl、10mM的MgCl2、1mM的ATP、1mM的二硫苏糖醇和5％(w/v)聚乙二醇8000，所述1x T4 buffer的pH为7.6，所述连接反应的反应条件为室温，反应时间为10分钟。
进一步的，所述聚合酶为Phi29 DNA聚合酶，所述切刻酶为Nb.BbvCI，所述反应液的组份及配比为：以单管反应体系10μL计，1μL的10×Phi29缓冲液、10mM的dNTPs、80nM纯化的环状RCA模板、6U的Phi29 DNA聚合酶和4U的Nb.BbvCI，所述10×Phi29缓冲液的组份及配比为：50mM的Tris-HCl、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4和4mM DTT，所述10×Phi29缓冲液的pH为7.5，所述恒温扩增反应的反应条件为37℃，反应时间为45分钟。
本发明还提供一种HPV的检测方法，采用如上述的检测方法，所述目标基因为HPV16 E7 mRNA中的序列，所述目标基因的序列为GTGCTTTGTACGCA CAACCGAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAA TGGGCTC(SEQ ID NO.2)，所述探针1的序列为GACTCTACTACATACTACT ACATACTACTACATACTACTACA(SEQ ID NO.3)，所述探针2的序列为GGTTATTATTGGTTATTATTGGTCCTCAGCGCAAGTGT(SEQ ID NO.4)，所述探针3的序列为TGTAGTAGTATGTAGTAGTATGTAG(SEQ ID NO.5)。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明提供的检测方法将切刻酶与滚环扩增技术相结合，具有较高的灵敏度和特异性，具有良好的性能，能够对低浓度的致癌mRNA水平进行准确检测；
2、本发明提供的检测方法反应条件温和，大部分反应条件为37℃，反应时间短，因此检测速度快，可以在短时间内准确检测出目标基因的存在；
3、本发明提供的检测方法操作简单，设备需求低，无需操作大型设备，所需的设备体积小、便携，整个反应可以在该设备中进行，可以方便地在不同地点进行使用，无需送往实验室分析，可以直接在临床现场使用，不仅提供了及时的结果，还减少了样本处理和运输的时间和成本，能够更好地满足欠发达地区的检测需求；
4、本发明提供的检测方法成本低，传统的检测方法往往需要昂贵的设备和耗材，使得检测成本居高不下，而本发明的检测方法采用了更简化的设备和读数方式(纸基芯片)，从而降低了整体的检测成本；
5、本发明能在体外快速检测HPV，不仅操作简单易行，适用于大量样本的筛查，且适宜在实验条件有限的平台实施，能更好地满足欠发达地区宫颈癌筛查项目的检测需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明检测方法的示意图；
图2为本发明检测方法的原理图；
图3为纸基芯片用于读数的原理图；
图4为便携式检测平台的3d结构图；
图5为扩增产物的琼脂糖电泳图；
图6为目标序列在0-100nM之间不同浓度下的荧光强度；
图7为本发明检测方法的检测极限；
图8为目标序列在0-100nM之间不同浓度下的纸基芯片图片；
图9为目标序列在0-100nM之间不同浓度下的纸基芯片读数。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
本发明实施例提供一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法，包括以下步骤：
S1.针对目标基因分别设计并合成探针1、探针2、探针3以及环状RCA模板，其中：
所述环状RCA模板包括多个重复序列，由多个所述重复序列首尾串联而成；
所述探针1包括目标基因前端识别序列以及与所述探针3的序列结合的序列；
所述探针2包括目标基因后端识别序列、切刻酶的识别位点序列以及与所述环状RCA模板的重复序列相同的序列；
所述探针3为与所述探针1序列结合的序列；
S2.连接反应：配制连接反应体系，所述连接反应体系包括所述探针1、探针2、连接酶和待测样品核酸；
S3.恒温扩增反应：向所述S2连接反应产物中加入反应液，所述反应液包括所述环状RCA模板、所述探针3、聚合酶、切刻酶；
S4.在S3恒温扩增反应产物中加入核酸染料，得到混合物，之后检测产物，判断待测样品核酸中是否存在目标基因。
其中，切刻酶为一种限制性内切酶，其可识别双链DNA的特定序列，在识别位点或其上下游位置，并在其中一条DNA链水解磷酸二酯键，产生3’羟基末端和5’磷酸末端，主要包括Nt.BstNBI、Nb.BsmI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI等。滚环扩增技术是1998年建立的通过借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式的复制方式而建立的一种可在恒温下发生的核酸扩增技术，当有环形DNA模板、引物、dNTP以及聚合酶时，通过DNA聚合酶的作用，以环形DNA为模板进行复制，引物被延伸并最后形成了一条与环形DNA模板互补的具有重复序列的线状DNA单链，该技术具有快速、灵敏、特异的特点。
本发明的原理(见图1和图2)具体包括：
第一步：在待测样品核酸中存在目标基因时，探针1和探针2与目标基因正确杂交，并在连接酶作用下发生S2的连接反应而将两者连接得到连接产物；
第二步：加入反应液，探针3与连接产物中的探针1的部分序列结合，并在聚合酶的作用下沿着连接产物的链延伸，形成双链连接产物；
第三步：切刻酶识别并切割双链连接产物中的切割酶的识别位点序列，并在聚合酶的作用下从切割位点再次延伸，同时在聚合酶的链位移活性，切割后得到的短单链(包含与环状RCA模板的重复序列相同的序列)在聚合酶的链位移活性下将被排除和释放，形成游离的短单链；
第四步：短单链作为环状RCA模板的引物，启动环状RCA模板的滚环扩增，产生具有多个重复序列的扩增产物；
第五步：探针2由于一部分序列为与环状RCA模板的重复序列相同的序列，因此与环状RCA模板的扩增产物部分结合，在聚合酶的链消化作用下，探针2中与环状RCA模板的扩增产物不配对的序列在聚合酶的链消化作用下被切割掉，再在聚合酶的作用下，以环状RCA模板的扩增产物为模板，进行分支扩增。其中，由于环状RCA模板的扩增产物具有多个重复序列，每个重复序列均可与探针2的部分序列结合，因此可同时启动分支扩增，这样，一部分分支扩增链会被前端相连的分支扩增链挤占位置而与环状RCA模板分离，分离的分支扩增链可与第三步释放的短单链结合，短单链作为引物，启动分离的分支扩增链的扩增，使其扩增为双链。
根据以上原理可知，本发明将切刻酶和滚环扩增进行结合，其不同于现有技术中的方法：1)本发明在恒温扩增反应之前还进行了连接反应，在待测样品核酸中含有目标基因时，探针1与目标基因的前端结合，探针2与目标基因的后端结合，连接酶将探针1和探针2连接，在待测样品核酸中不含有目标基因时，则探针1和探针2不会与其结合，连接酶也无法发挥作用，因此利用连接酶/探针1和探针2和所设计的核酸序列的特异性识别作用，能够对目标序列和非目标序列进行区分；
2)本发明的环状RCA模板为由多个所述重复序列首尾串联而成的序列，其与目标基因无关，即不受目标基因的影响，因此通用性高，并且环状RCA模板经过MFold软件的设计，由于其自身包含多个重复序列的结构，因此其不会在空间上形成二级结构，即发生缠绕，能够保证以环状RCA模板为模板进行的滚环扩增的产物在空间上为呈延伸状的线性结构，从而保证后续分支扩增的充分进行；
3)本发明的切刻酶的识别位点包含在探针2的序列中，在待测样品核酸中含有目标基因时，如上所述，探针1和探针2与目标基因结合，之后连接酶连接形成连接产物，之后在恒温扩增反应中，探针3与连接产物中的探针1的部分序列结合，启动扩增，得到双链连接产物，每个扩增的双链连接产物中其中一链包含切刻酶的识别位点，切刻酶可进行切割，若待测样本核酸中不含有目标基因，则探针1和探针2呈分离状态，在恒温扩增反应中，探针3直接与探针1结合，启动扩增，得到的扩增产物中不包含切刻酶的识别位点，因此，切刻酶的切割依赖于连接反应；
4)利用切刻酶的切割和聚合酶的链位移活性能够释放出很多短单链，该短单链作为环状RCA模板的引物，启动环状RCA模板的滚环扩增，而切刻酶具有高度的序列特异性，因此切刻酶和滚环扩增结合可保证反应体系的高特异性；
5)在恒温扩增反应后，本发明加入核酸染料，核酸染料(如SYBR Green I)与纤维素之间的结合弱于核酸染料与DNA(尤其是双链DNA)之间的结合，因此，核酸染料可以通过扩增产物有效地洗脱到测试区域，并且DNA的洗脱能力与其浓度相关，因此可以通过简单读取核酸染料在纸基芯片中的迁移距离对扩增产物进行定量分析。
具体的，所述环状RCA模板由5个所述重复序列首尾串联而成，所述环状RCA模板通过Mfold软件设计。
具体的，所述环状RCA模板的序列为GGTTATTATTGGTTATTATTGGTTATTATTGGTTATTATTGGTTATTATT(SEQ ID NO.1)。
具体的，所述S4中检测产物采用酶标仪或纸基芯片，通过肉眼观察纸基芯片的荧光长度，快速判读目标序列的存在与否，使用纸基芯片能够摆脱对于传统仪器的依赖。
具体的，所述S4中检测产物采用酶标仪时，具体操作为在激发波长为495nM、发射波长为537nM时读取荧光读数，所述核酸染料为SYBR Gold混合物，所述SYBR Gold混合物包括0.6μL的100×SYBR Gold和9.4μL的ddH2O。
具体的，所述S4中检测产物采用纸基芯片时，具体操作为将混合物添加至采用纸基芯片的圆形上样区，10分钟后读数，所述核酸染料为SYBR Green I混合物，所述SYBRGreen I混合物包括3μL的100×SYBR Green I、3μL的1％Tween 20和4μL的ddH2O。
具体的，所述连接酶为T4连接酶，所述连接反应体系的组份及配比为：以单管反应体系10μL计，1×T4 buffer、终浓度为50nM的探针1和探针2、2.5U的T4连接酶、1μL的浓度为100aM-100nM的待测样品核酸，所述1×T4 buffer包括50mM的Tris-HCl、10mM的MgCl2、1mM的ATP、1mM的二硫苏糖醇和5％(w/v)聚乙二醇8000，所述1x T4 buffer的pH为7.6，所述连接反应的反应条件为室温下持续10分钟。
具体的，所述聚合酶为Phi29 DNA聚合酶，所述切刻酶为Nb.BbvCI，所述反应液的组份及配比为：以单管反应体系10μL计，1μL的10×Phi29缓冲液、10mM的dNTPs、80nM纯化的环状RCA模板、6U的Phi29 DNA聚合酶和4U的Nb.BbvCI，所述10×Phi29缓冲液的组份及配比为：50mM的Tris-HCl、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4和4mM DTT，所述10×Phi29缓冲液的pH为7.5，所述恒温扩增反应的反应条件为在37℃下进行45分钟。
本发明实施例还提供一种HPV的检测方法，采用如上述的检测方法，所述目标基因为HPV16 E7 mRNA中的序列，所述目标基因的序列为GTGCTTTGT ACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATT GTAATGGGCTC(SEQ ID NO.2)，所述探针1的序列为GACTCTACTACAT ACTACTACATACTACTACATACTACTACA(SEQ ID NO.3)，所述探针2的序列为GGTTATTATTGGTTATTATTGGTCCTCAGCGCAAGTGT(SEQ ID NO.4)，所述探针3的序列为TGTAGTAGTATGTAGTAGTATGTAG(SEQ ID NO.5)。
本发明实施例如上述的检测方法在检测HPV中的应用。
本发明实施例还提供一种纸基芯片，见图3，所述纸基芯片均采用色谱法纸层析滤纸(Whatman滤纸No.1)制造，纸基芯片上的图案由打印机(XEROX ColorQube打印机)打印上去，打印好后放在热板上加热，温度为120℃，加热时间为3分钟，纸基芯片上的图案包含一个圆形上样区(直径为7毫米)和一个带有1毫米刻度的直线测试区域(宽度×高度＝2.5毫米×30毫米)，纸基芯片的整体尺寸为43毫米×12毫米。
本发明实施例还提供一种使用纸基芯片读数的方法，该方法包括如下步骤：将核酸染料加至扩增产物中得到混合物，将混合物添加至如上述的纸基芯片的圆形上样区。
具体的，所述核酸染料为SYBR Green I混合物，所述SYBR Green I混合物包括3μL的100×SYBR Green I、3μL的1％Tween 20和4μL的ddH2O。
本发明还提供一种便携式检测设备，如图4，所述便携式检测设备具有加热和纸基芯片的成像功能，包括加热模块和纸基芯片的读数模块。
具体的，所述便携式检测设备还包括滤波片、蓝光激发光源以及用于纸基芯片的纸基芯片平台，所述加热模块为具有加热功能的加热试管架。
具体的，所述便携式检测设备还包括3D打印柱体、可充电电池以及主板。
本发明的检测方法可在该便携式检测设备中进行，该设备体积小、便携，可以方便地在不同地点进行使用，无需送往实验室分析，不仅提供了及时的结果，还减少了样本处理和运输的时间和成本，能够更好地满足欠发达地区的检测需求。
以下结合具体实施例说明：
本实施例中所使用的化学试剂若无特殊说明，均为普通市售分析纯。本实施例中T4 DNA连接酶和核酸染料SYBR Gold购自赛默飞世尔，Phi29DNA聚合酶购自新海基因，相关序列合成于上海生工生物，用于制备纸基芯片的滤纸购自默克公司，型号为Whatmanfilter paper No.1，核酸染料SYBR Green I购自阿拉丁。
实施例1
本实施提供了一种检测HPV16 E7 mRNA的方法，包括以下步骤：
(1)设计探针和环状RCA模板，序列见下表：
表1序列信息
(2)检测：
2.1.将从生工生物工程(上海)股份有限公司合成的目标序列干粉加入50μL灭菌去离子水，使用Nanodrop测量浓度，梯度稀释配制成待测DNA溶液。
2.2.取2.1中制备的待测DNA溶液，按表2配制连接反应体系，置于室温反应10分钟。
表2连接反应体系
试剂 浓度 体积
超纯水 / 补至10μL
目标序列 / 1μL
5×T4缓冲液 5× 2μL
探针1 500nM 1μL
探针2 500nM 1μL
T4连接酶 5U/μL 0.5μL
注：1x T4 buffer的配方为：50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM ATP，1mMdithiothreitol，5％(w/v)polyethylene glycol 8000，pH 7.6
(3)恒温扩增反应：步骤(2)反应结束后，将所得的10μL产物直接加入反应液中，置于37℃反应45分钟。所述反应液(恒温扩增反应体系)的组份及配比如表3所示：
表23反应液的组份及配比
注：10×Phi29缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mMDTT，pH 7.5。
(4)读数：
有两种读数方式可以选择：
4.1.添加10μL的SYBR Gold混合物(包含0.6μL的100×SYBR Gold和9.4μL的ddH2O)，置于酶标仪下获取荧光读数(激发波长为495nM，发射波长为537nM)；
4.2.添加10μL的SYBR Green I混合物(包含3μL的100×SYBR Green I，3μL的1％Tween 20和4μL的ddH2O)，将混合液添加到纸基芯片的圆形上样区，十分钟后读数。
电泳验证：
将实施例1中步骤(3)后得到的扩增产物进行电泳分析，电泳条件：1％琼脂糖电泳，核酸染料：SYBR Green I，结果见图5所示，泳道1，DNA marker；泳道2，目标序列存在时的扩增产物；泳道3，目标序列不存在时的扩增产物。
从图中可看出，在有目标序列存在的情况下，有大量DNA扩增产物在胶孔中，所产生的产物片段远远大于14000bp，符合典型的RCA产物特性；在目标序列不存在的情况下也有少量产物在胶孔中，但产物远远少于目标序列存在的情况，反映T4连接酶的非特异性连接。从电泳结果可知，本发明的检测方法能够检测出是否存在目标序列。
线性分析：
目的序列的浓度稀释至100aM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM，按实施例1操作，其中步骤(4)选择使用酶标仪，所得到的荧光信号如图6和图7所示，显示该反应体系的灵敏度可以达到1fM，这说明本发明的检测方法灵敏度较高。
目的序列的浓度稀释至10fM、100fM、1pM、10pM、100pM，按实施例1操作(使用便携设备)，其中步骤(4)选择使用纸基芯片，所得到的荧光长度如图8和图9所示，显示该反应体系的灵敏度可以达到10fM，这说明本发明的检测方法灵敏度较高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.设计并合成探针1、探针2、探针3以及环状RCA模板，其中：
所述环状RCA模板包括多个重复序列，由多个所述重复序列首尾串联而成；
所述探针1包括目标基因前端识别序列以及与所述探针3的序列结合的序列；
所述探针2包括目标基因后端识别序列、切刻酶的识别位点序列以及与所述环状RCA模板的重复序列相同的序列；
所述探针3为与所述探针1序列结合的序列；
S2.连接反应：配制连接反应体系，所述连接反应体系包括所述探针1、探针2、连接酶和待测样品核酸；
S3.恒温扩增反应：向所述S2连接反应产物中加入反应液，所述反应液包括所述环状RCA模板、所述探针3、聚合酶、切刻酶；
S4.在S3恒温扩增反应产物中加入核酸染料，得到混合物，之后检测产物，判断待测样品核酸中是否存在目标基因。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述环状RCA模板由5个所述重复序列首尾串联而成。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述环状RCA模板的序列为SEQ IDNO.1。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述S4中检测产物采用酶标仪或纸基芯片。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述S4中检测产物采用所述酶标仪时，具体操作为在激发波长为495nM、发射波长为537nM时读取荧光读数，所述核酸染料为SYBRGold混合物，所述SYBR Gold混合物包括0.6μL的100×SYBR Gold和9.4μL的ddH2O。
6.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述S4中检测产物采用所述纸基芯片时，具体操作为将混合物添加至采用纸基芯片的圆形上样区，10分钟后读数，所述核酸染料为SYBR Green I混合物，所述SYBR Green I混合物包括3μL的100×SYBR Green I、3μL的1％Tween 20和4μL的ddH2O。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述连接酶为T4连接酶，所述连接反应体系的组份及配比为：以单管反应体系10μL计，1×T4 buffer、终浓度均为50nM的探针1和探针2、2.5U的T4连接酶、1μL的浓度为100aM-100nM的待测样品核酸，所述1×T4 buffer包括50mM的Tris-HCl、10mM的MgCl2、1mM的ATP、1mM的二硫苏糖醇和5％(w/v)聚乙二醇8000，所述1x T4 buffer的pH为7.6，所述连接反应的反应条件为室温，反应时间为10分钟。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述聚合酶为Phi29 DNA聚合酶，所述切刻酶为Nb.BbvCI，所述反应液的组份及配比为：以单管反应体系10μL计，1μL的10×Phi29缓冲液、10mM的dNTPs、80nM纯化的环状RCA模板、6U的Phi29 DNA聚合酶和4U的Nb.BbvCI，所述10×Phi29缓冲液的组份及配比为：50mM的Tris-HCl、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4和4mMDTT，所述10×Phi29缓冲液的pH为7.5，所述恒温扩增反应的反应条件为37℃，反应时间为45分钟。
9.一种HPV的检测方法，其特征在于，采用如权利要求1-7任一项所述的检测方法，所述目标基因为HPV16 E7 mRNA中的序列，所述目标基因的序列为SEQ ID NO.2，所述探针1的序列为SEQ ID NO.3，所述探针2的序列为SEQ ID NO.4，所述探针3的序列为SEQ ID NO.5。
CN202311521442.6A 2023-11-15 2023-11-15 一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用 Pending CN117535383A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311521442.6A CN117535383A (zh) 2023-11-15 2023-11-15 一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311521442.6A CN117535383A (zh) 2023-11-15 2023-11-15 一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117535383A true CN117535383A (zh) 2024-02-09

Family

ID=89789388

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311521442.6A Pending CN117535383A (zh) 2023-11-15 2023-11-15 一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117535383A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yin et al. CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives
US9920380B2 (en) Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
JP5951755B2 (ja) 定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ｑＮＰＡ）法および定量的ヌクレアーゼプロテクション配列決定（ｑＮＰＳ）法の改善
WO2011001496A1 (ja) 検体解析方法およびそれに用いるアッセイキット
WO2022077687A1 (zh) 一种新型crispr核酸检测方法及应用
JP2006201062A (ja) 核酸の検出あるいは定量方法
JP2012509078A (ja) 二本鎖核酸特異色素を用いる固体表面でのリアルタイムマルチプレックスｐｃｒ検出
CN113186341B (zh) CRISPR介导的一步式恒温扩增检测SARS-CoV-2的方法
CN109439735A (zh) 一种脱碱基核酸内切酶1的荧光检测探针、试剂盒及应用
CN106755593A (zh) 一种hpv分型检测的核酸组合及其应用和试剂盒
Lu et al. Rapid and highly specific detection of communicable pathogens using one-pot loop probe-mediated isothermal amplification (oLAMP)
CN108026591B (zh) 诊断方法和组合物
Lei et al. Non-canonical CRISPR/Cas12a-based technology: A novel horizon for biosensing in nucleic acid detection
CN107083437B (zh) 一种利用固有荧光核苷酸超灵敏同时检测多种dna糖基化酶的方法
CN112359143A (zh) 一种基于y型探针组的等温指数扩增方法及其应用
CN113186257A (zh) 一种基于液态芯片技术的pcr扩增后恒温杂交方法
CN114410793B (zh) 一种无标记荧光检测fen1活性的方法
CN117867166A (zh) 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组及其应用
CN116656788A (zh) 一种分子扩增方法及核酸检测方法
CN117535383A (zh) 一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用
CN116083575A (zh) 用于检测宫颈癌的试剂盒及其应用
Du et al. A simple rapid detection method of DNA based on ligation-mediated real-time fluorescence PCR
US20040214176A1 (en) Multiplexed DNA assays using structure-specific endonucleases
JP2011004733A (ja) 複数検体中の標的核酸を検出するマイクロアレイ
Zhang et al. A high-throughput DNA analysis method based on isothermal amplification on a suspension microarray for detecting mpox virus and viruses with comparable symptoms

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination