CN117503947B - 一种用于修复和保护sh-sy5y细胞损伤的药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学、药物制剂技术领域，特别涉及一种用于修复和保护SH‑SY5Y细胞损伤的药物及其制备方法。该药物中尤其是含有甘草酸‑小檗碱‑细叶远志皂苷共聚物，为本发明首次制备得到，所述药物对Aβ1‑40诱导的SH‑SY5Y细胞损伤具有优异的治疗效果。

Description

一种用于修复和保护SH-SY5Y细胞损伤的药物及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物化学、药物制剂技术领域，特别涉及一种用于修复和保护SH-SY5Y细胞损伤的药物及其制备方法。
背景技术
老年性痴呆包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）以及二者同时存在的混合型痴呆，由于AD发病占老年性痴呆的70%，在老年人中较普遍，是多因素引发的神经系统退行性病变，病程缓慢、不可逆，多智能损害。临床以学习记忆和认知能力低下为常见症状，日常生活能力渐退，严重制约病人的生活与社交，降低生活质量，同时给其家庭及社会带来严重负担。故积极寻找有效的治疗和预防措施已成为医药领域研究的重点。
目前广泛应用治疗AD的传统治疗药物包括脑血管扩张药物、中枢神经系统功能改善药物、抗氧化药物、抗炎症药物等，但多价格昂贵，副作用大，且有一定依赖性。西药多针对单病因、单靶点进行治疗，但是老年性痴呆是老年机体特别是脑组织内多种因素失调所致，AD的防治并非单靶点、单药物成分就可解决，需结合其发病机制采用多成分、多靶点、多途径的综合疗法。近些年，中药多靶点、多途径的综合治疗方式在多种疾病的预防和治疗中逐渐崭露头角，相信在不久的将来中药将为该类疾病的预防和治疗发挥重要作用。
AD是老年人中常见病，多发病，发病机制错综复杂，病因牵涉众多病理机制，是典型的“多因异质性病变”，现已发展为严重危及老年人身体健康的重大疾病之一。研究表明，β淀粉样蛋白（Aβ）可使机体发生氧化应激反应，致使钙离子内流，线粒体受损，使神经细胞代谢异常，相关凋亡蛋白和因子被激活，发生细胞凋亡，这可能是AD病人学习和记忆能力低下的主要诱因。同时，可通过引发脑内炎症反应、神经纤维缠结（NFT）和免疫损伤等多种途径间接使神经细胞发生凋亡，从而展现整体神经功能障碍及行为学变化。近些年，对AD的中医药探究实验颇多，中医药对AD的防治也有显著疗效。我国具有广泛的中药资源，由于中药在防治AD等疾病方面具有独特的优势，探讨中药活性成分治疗AD的作用机制引起越来越多研究学者的关注。因此防止Aβ产生和沉积是有效防治AD的途径，研发抑制Aβ形成和聚集的新药势在必行。
Aβ可通过多途径激发脑组织细胞的氧化应激状态，包括产生大量活性氧，降低多种抗氧化酶的活性，诱发多种氧化应激产物。有研究表明，氧自由基能够促进Aβ产生，被激活的Aβ又可加剧氧化应激反应，加重神经细胞的损伤，同时氧化应激和炎症又紧密相连，引发后续恶性级联反应，包括神经元数量降低、形态改变，能量代谢异常，线粒体产能障碍，蛋白功能失常，基因调控紊乱继而导致细胞凋亡的发生，最终出现机体衰老和认知障碍等疾病。
目前，AD 药物研发已经陷入了瓶颈，虽然一直有新的药物推出，但结果不甚理想。因中药具有多靶点、多机制的作用特点，可作为AD药物研发的一个主攻方向。另外更深入地从病理、病生角度探究 AD的发病机制，也能为药物研发提供更多思路。
本发明提供了一种全新的药物，尤其制备一种全新的甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物，经检索，尚未见公开报道。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种用于修复和保护SH-SY5Y细胞损伤的药物及其制备方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种用于修复和保护SH-SY5Y细胞损伤的药物，
其有效成分组成包括：冰片β-CD包合物15重量份、淫羊藿苷25重量份、甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物200重量份。
优选的，药物剂型为胶囊，辅料为硬脂酸镁。
本发明还提供了一种用于修复和保护SH-SY5Y细胞损伤的AD药物的制备方法，包括以下步骤：
（1）称取β-CD制成饱和水溶液，冷却至40℃，磁力搅拌器搅拌的条件下缓缓加入冰片乙醇溶液，继续搅拌2h后，置于4℃冰箱中过夜，第二天将包合物抽滤，滤饼用水和乙酸乙酯各洗涤3次，每次30mL，抽干，真空干燥器干燥，即得冰片β-CD包合物；
（2）称取甘草酸、细叶远志皂苷溶解于乙醇中，加入氢氧化钾溶液调整溶液pH值为8.0-8.5，控制温度60℃，搅拌24小时，得游离甘草酸及细叶远志皂苷溶液；
（3）称取小檗碱溶解于乙醇中，加入磷酸溶液调整pH值为6.0-6.5，控制温度60℃，搅拌30min得小檗碱溶液；
（4）将步骤（2）制得的游离甘草酸及细叶远志皂苷溶液缓慢加入步骤（3）制得的小檗碱溶液中，控制温度80℃，搅拌48小时；
（5）将步骤（4）制得的混合溶液置于透析袋内，采用超纯水透析48h以除去非反应的甘草酸、细叶远志皂苷、小檗碱以及氢氧化钾、磷酸，每2h换一次超纯水，得到甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷溶液；
（6）将步骤（5）制得制得的甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷溶液离心，离心后，收集沉淀，超纯水洗涤，真空冷冻干燥，得到甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物；
（7）淫称取羊藿苷25mg与将步骤（1）冰片β-CD包合物15mg、步骤（6）甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物200mg，混和，研匀，即得。
进一步的，步骤（1）中β-CD的质量为12g，冰片乙醇为5mL 40%；步骤（2）中甘草酸80mg、细叶远志皂苷100mg；步骤（3）中小檗碱55mg。
与现有技术相比，本发明的有益之处为：本发明提供了一种用于修复和保护SH-SY5Y细胞损伤的药物，尤其是含有甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物，为本发明首次制备得到，所述药物对Aβ1-40诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有优异的治疗效果。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明冰片-环糊精包合物薄层鉴别图；样品1：冰片对照品溶液；样品2：β-CD包合物乙醇溶液；样品3：β-CD包合物乙酸乙酯溶液；
图2为本发明不同浓度药物对细胞存活率的影响；（±s，n=6，与对照组相比，*P<0.05）；
图3为不同时间、不同浓度药物对细胞增殖的影响；
图4为醒脑益智组分对Aβ1-40致SH-SY5Y细胞损伤的形态学影响（×200）；
图5为不同浓度药物对细胞内BDNF含量的影响；（±s，n=6，与对照组比，△P<0.05；与损伤组相比，*P<0.05）；
图6为不同浓度药物对细胞内AchE含量的影响；（±s，n=6，与对照组比，△P<0.05；与损伤组相比， *P<0.05）；
图7为药物对损伤细胞内NeuN蛋白表达的作用；
图8为不同浓度药物对损伤细胞内SOD、MDA活性的影响；其中，图A为不同浓度药物对损伤细胞内SOD活性的影响，图B为不同浓度药物对损伤细胞内MDA活性的影响，（±s，n=6，与对照组比，△△P<0.01，△P<0.05；与损伤组比，**P<0.01， *P<0.05）；
图9为不同浓度药物对损伤细胞内TNF-α、IL-1β含量的影响；其中，图A为不同浓度药物对损伤细胞内TNF-α含量的影响，图B为不同浓度药物对损伤细胞内IL-1β含量的影响（±s，n=6，与对照组比，△△P<0.01，△P<0.05；与损伤组比，**P<0.01，*P<0.05）；
图10为流式细胞术测定损伤细胞中总ROS的活性，其中A阴性对照组，B空白对照，C损伤组，D石杉碱甲组（Aβ1-40损伤），E-G醒脑益智组分中药高、中、低剂量组（Aβ1-40损伤），H-K为醒脑益智组分中药高、中、低剂量组（未损伤）；
图11为不同药物对损伤细胞中的IL-1β蛋白含量的影响作用；
图12为药物对Aβ1-40致使SH-SY5Y细胞损伤Bax、Bcl-2凋亡蛋白含量的影响；
图13为药物对Bax/Bcl-2比值的影响；（±s，n=3，与损伤组相比，**P<0.01）。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于修复和保护SH-SY5Y细胞损伤的药物。
所述药物有效成分配方包括：冰片β-CD包合物15重量份、淫羊藿苷25重量份、甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物200重量份。
所述药物对Aβ1-40诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用。
实施例1 冰片与β-环糊精投料比的考察。
按天然冰片与β-环糊精比例1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12称量天然冰片和β-环糊精的量，先将β-环糊精制成饱和水溶液，然后在磁力搅拌器的缓慢搅拌下滴入天然冰片的乙醇溶液，在40℃恒温下搅拌2h，在4℃冰箱中放置24h，抽滤，抽滤物用水和乙酸乙酯各洗涤3次后放入真空干燥器内干燥，即得。从结果可见，随着投料比的增加，天然冰片的包合率和收得率也增加，但当投料比大于1:6时，比率略有下降，因此确定天然冰片和β-环糊精的比例水平为1:4，1:6，1:8，结果见表1。
表1 投料比考察结果
实施例2 冰片与β-环糊精包合温度的考察。
天然冰片和β-环糊精的比例为1:6时，分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃搅拌包合2h，在4℃冰箱中放置24h，抽滤，抽滤物用水和乙酸乙酯各洗涤3次后放入真空干燥器内干燥，即得。从结果可见，随着包合温度的增加，天然冰片的包合率和收得率也增加，但当温度大于50℃时，比率略有下降，因此确定天然冰片和β-环糊精的包合温度水平为40℃，50℃，60℃，结果见表2。
表2 包合温度考察结果
实施例3 冰片与β-环糊精包合时间的考察。
天然冰片和β-环糊精的比例为1:6时，于40℃用磁力搅拌器分别搅拌0.5、1、1.5、2、2.5、3h，在4℃冰箱中放置24h，抽滤，抽滤物用水和乙酸乙酯各洗涤3次后放入真空干燥器内干燥，即得。从结果可见，随着包合时间的增加，天然冰片的包合率和收得率也增加，但当时间大于1.5h时，比率略有下降，因此确定天然冰片和β-环糊精的包合时间水平为1h，1.5h，2h，结果见表3。
表3 包合时间考察结果
实施例4 冰片与β-环糊精包合正交试验优选。
因素水平表
选择投料比（A）、包合温度（B）和包合时间（C）三个因素建立因素水平表。根据单因素考察结果，每个因素选取三个水平，见表4。
表4 正交试验因素水平表
正交设计及结果分析：
表5 正交试验设计表
包合率直观分析与方差分析：
表6 直观分析
分析极差R值，发现RA>RC>RB，即在所选取的影响天然冰片包合的三个因素中其中投料比A为主要因素，而包合时间C则为次要因素。其包合工艺条件的最佳组合为A2C2B1，即投料比为1:6，包合时间为1.5h，包合温度为40℃。
表7方差分析
注：F的临界值为19.000，*为具有显著性意义。
从方差分析可知，投料比对天然冰片的β-环糊精包合具有显著性影响。
收得率直观分析与方差分析：
表8 直观分析
分析极差R值，发现RA>RC>RB，即在所选取的影响天然冰片包合的三个因素中其中投料比A为主要因素，而包合时间C则为次要因素。其包合工艺条件的最佳组合为A2C3B1，即投料比为1:6，包合时间为2h，包合温度为40℃。
表9 方差分析
注：F的临界值为19.000，*为具有显著性意义。
从方差分析可知，投料比对天然冰片的β-环糊精包合具有显著性影响。
结论
收得率中C2和C3相差不大，综合考虑包合率和收得率，确定最佳水平为A2C3B1，即投料比为1:6，包合时间为2h，包合温度为40℃。
实施例5 冰片-β环糊精包合物质量检测。
称取冰片-β环糊精包合物0.2g，置具塞试管中，加入10mL乙酸乙酯，超声10min，离心，取上清液，即得包合物乙酸乙酯溶液；精密称取冰片-环糊精包合物0.2g，置具塞试管中，加入10mL无水乙醇，超声10min，离心，取上清液，即得包合物乙醇溶液；天然冰片10mg，置5mL容量瓶中，加乙醇至刻度，作为对照品溶液。吸取包合物乙酸乙酯溶液、包合物乙醇溶液和对照品溶液各2µL，点于同一块硅胶G薄层板上，展开剂为正己烷-乙酸乙酯(17:3)，展开后晾干，以1%香草醛-浓硫酸为显色剂，于105℃烘约10分钟。结果见图1，样品1为冰片对照品溶液，样品2为β-CD包合物乙醇溶液，样品3为β-CD包合物乙酸乙酯溶液；3个样品薄层色谱法-TLC展开后，β-CD包合物乙醇溶液与冰片对照品溶液相应位置显相同颜色斑点（图1中黑点），β-CD包合物乙酸乙酯溶液无斑点，说明冰片已形成稳定的包合物。
实施例6 甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷聚合物的配比筛选。
选取重量比4:5.5:10、6:5.5:10、8 :5.5:10、8:5.5:7.5或8:5.5:5的甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷，分五组参照以下方法制备不同的甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷聚合物，并测定不同甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷的水合粒径和多分散性指数作为评估该聚合物均匀性和稳定性的指标，见表10。
制备方法：
（1）称取甘草酸、细叶远志皂苷，溶解于100ml乙醇中，加入氢氧化钾溶液调整溶液pH值为8.0-8.5，控制温度60℃，搅拌24小时，得游离甘草酸及细叶远志皂苷溶液；
（2）称取小檗碱，溶解于100ml乙醇中，加入磷酸溶液调整pH值为6.0-6.5，控制温度60℃，搅拌30min得小檗碱溶液；
（3）将步骤（1）制得的游离甘草酸及细叶远志皂苷溶液缓慢加入步骤（2）制得的小檗碱溶液中，控制温度80℃，搅拌48小时；
（4）将步骤（3）制得的混合溶液置于透析袋内（（MWCO=3.0 kDa）），采用超纯水透析48h以除去非反应的甘草酸、细叶远志皂苷、小檗碱以及氢氧化钾、磷酸，每2h换一次超纯水，得到甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷溶液；
（5）将步骤（4）制得的甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷溶液离心，离心后，收集沉淀，超纯水洗涤，真空冷冻干燥，得到甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物。
表10 不同重量比甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷合成聚合物的平均粒径和PDI数值表
表10结果表明，甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷的重量比影响了甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷聚合物的平均水合粒径和多分散性指数（polydispersity，PDI）。根据计算机辅助药物设计水合粒径范围在350-500nm范围内时甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物形成，PDI等于或小于0.3表示聚合物均匀分布，稳定。与其它比例相比，重量比为8:5.5:10时制备的甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷聚合物的平均水合粒径最在350-500nm范围，为430.8±18.5nm，且粒径分布较窄，其PDI为0.29±0.06。因此，选择甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷1.5:1的重量比为8:5.5:10作为制备甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷聚合物的最佳配比。
实施例7 甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷聚合物的制备。
（1）称取甘草酸80mg、细叶远志皂苷100mg，溶解于100ml乙醇中，加入氢氧化钾溶液调整溶液pH值为8.0-8.5，控制温度60℃，搅拌24小时，得游离甘草酸及细叶远志皂苷溶液；
（2）称取小檗碱55mg，溶解于100ml乙醇中，加入磷酸溶液调整pH值为6.0-6.5，控制温度60℃，搅拌30min得小檗碱溶液；
（3）将步骤（1）制得的游离甘草酸及细叶远志皂苷溶液缓慢加入步骤（2）制得的小檗碱溶液中，控制温度80℃，搅拌48小时；
（4）将步骤（3）制得的混合溶液置于透析袋内（（MWCO=3.0 kDa）），采用超纯水透析48h以除去非反应的甘草酸、细叶远志皂苷、小檗碱以及氢氧化钾、磷酸，每2h换一次超纯水，得到甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷溶液；
（5）将步骤（4）制得的甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷溶液离心，离心后，收集沉淀，超纯水洗涤，真空冷冻干燥，得到甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物。
实施例8 具有SH-SY5Y细胞损伤保护作用的药物的制备。
其制备方法为：
（1）称取12g β-CD加入三角瓶中制成饱和水溶液，冷却至40℃，磁力搅拌器搅拌的条件下缓缓加入5mL40%冰片乙醇溶液，继续搅拌2h后，置于4℃冰箱中过夜，第二天将包合物抽滤，滤饼用水和乙酸乙酯各洗涤3次，每次30mL，抽干，真空干燥器干燥，即得冰片β-CD包合物；
（2）称取甘草酸80mg、细叶远志皂苷100mg溶解于100ml乙醇中，加入氢氧化钾溶液调整溶液pH值为8.0-8.5，控制温度60℃，搅拌24小时，得游离甘草酸及细叶远志皂苷溶液；
（3）称取小檗碱55mg溶解于100ml乙醇中，加入磷酸溶液调整pH值为6.0-6.5，控制温度60℃，搅拌30min得小檗碱溶液；
（4）将步骤（2）制得的游离甘草酸及细叶远志皂苷溶液缓慢加入步骤（3）制得的小檗碱溶液中，控制温度80℃，搅拌48小时；
（5）将步骤（4）制得的混合溶液置于透析袋内，采用超纯水透析48h以除去非反应的甘草酸、细叶远志皂苷、小檗碱以及氢氧化钾、磷酸，每2h换一次超纯水，得到甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷溶液；
（6）将步骤（5）制得的甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷溶液离心，离心后，收集沉淀，超纯水洗涤，真空冷冻干燥，得到甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物；
（7）淫称取淫羊藿苷25mg与将步骤（1）制得的冰片β-CD包合物15mg、步骤（6）制得的甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物200mg，混和，研匀，即得具有SH-SY5Y细胞损伤保护作用的药物，命名为醒脑益智组分。
实施例9 药物胶囊制剂制备。
（1）休止角的测定：按实施例8方法制备具有SH-SY5Y细胞损伤保护作用的药物作为原料药粉，分别加入微粉硅胶、微晶纤维素、硬脂酸镁，采用固定漏斗法测定休止角。取3只25mL漏斗串联并固定铁架台上，最下面一只漏斗出口使其距纸面2cm(H)，将药粉沿最上面的漏斗的漏斗壁倒入，直到坐标纸上形成的药粉圆锥体尖端接触到漏斗为止，由坐标纸测出圆锥体底部的半径(r)，计算休止角tgα=H/r，平行操作三次，具体结果见表11。
表11 验证试验结果
试验结果显示，原料药粉的休止角已小于工业生产要求的40°，表明药粉达到了很好的流动性，其他辅料对其休止角的影响不大。
（2）吸湿率的测定：将饱和的氯化钠溶液置于真空干燥器的底部，然后将真空干燥器放入恒温干燥箱中，控制温度25℃，放置24h以上，使得干燥器内的相对湿度达到75%±1%，称量瓶恒重，在其底部放入不同配方的样品，使其厚度达到2mm左右，精密称定，打开称量瓶盖放入相对湿度75%±1%的干燥器中，分别于0、4、8、12、24h取出称定重量，计算吸湿率，结果见表12。
表12 吸湿率试验结果
试验结果表明，原料药的吸湿性已满足生产的需要，根据文献并结合实际情况，防止粉末与金属材料的黏附，确定加入0.5%的硬脂酸镁，防止药粉的吸附。
（3）胶囊制备：将淫羊藿苷、冰片β-CD包合物、甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物、硬脂酸镁使用等量递增法研磨混合，过80目筛，装填胶囊，制成1000粒。
实施例10 醒脑益智组分中药对SH-SY5Y细胞增殖的影响。
（1）对SH-SY5Y细胞增殖的作用
本部分研究了醒脑益智组分不同浓度以及不同作用时间对SH-SY5Y细胞增殖的影响，通过MTT法检测细胞存活情况。结果发现，药物在一定浓度范围内时可对SH-SY5Y细胞表现出增殖的作用，70、35、17.5µg×mL-1药物对细胞的增殖具有促进作用，但同正常对照组比较差异不显著，280、140µg×mL-1药物对细胞的存活力显示较弱的抑制作用，差异较为明显（P<0.05），8.8µg×mL-1药物对细胞活力也表现出较弱抑制作用，差异不明显。结果见图2。
（2）不同作用时间下药物对SH-SY5Y细胞毒的实验结果
实验结果表明，在药物浓度一定的情况下，伴随药物对细胞作用时间的不断增长，细胞活力稍有增加，当超过24h后细胞的活力变化不大。故药物的作用时间选择24h。结果见图3。
醒脑益智组分在不同浓度、不同作用时间下对SH-SY5Y细胞增殖的影响结果显示，不同浓度的药物（280、140、70、35、17.5、8.8µg×mL-1）对细胞表现出不同的作用效果，当药物浓度较高时（280、140µg×mL-1）可对细胞显示出较强的抑制作用，即细胞毒性；随着药物浓度的降低，药物在一定范围内（70、35、17.5µg×mL-1）对细胞增殖呈现促进作用，并存在一定的剂量依赖性，当浓度过低时（8.8µg×mL-1）对细胞的增殖表现出较弱作用；当药物浓度不变时，伴随药物作用时间的不断增长，细胞活力总体呈增长趋势，呈现出时间依赖性，当加药24h后细胞活力基本保持不变。综上结果，实验确定醒脑益智组分的最大浓度为140µg×mL-1，在此剂量下按2倍比稀释，故选用70、35、17.5µg×mL-1药物浓度，作用时间为24h进行后续实验。
实施例11 对Aβ1-40（β-淀粉样蛋白）致SH-SY5Y细胞损伤的修复作用研究。
（1）药物对Aβ1-40致SH-SY5Y细胞损伤的形态学影响
显微镜下观察，SH-SY5Y细胞分化后突起长度明显增加，各神经元细胞突起之间互相连接，交错联系。与对照组相比，损伤组细胞突起缩短较显著，部分突起呈折断样，神经元核固缩，胞体变小且变形，且总体积回缩，连接消失，神经元细胞的数量也显著下降。各给药组细胞突起有所增长，细胞数量增加，在加入不同浓度药物后，细胞数量虽有所降低，但较模型组仍有增加趋势，细胞突起也有所改善，其中石杉碱甲组及药物高剂量即70µg×mL-1时细胞数量及突起长度均较35、17.5µg×mL-1中、低两组改善明显。见图4。
（2）药物对Aβ1-40致SH-SY5Y损伤细胞活力的影响
实验结果显示，同对照组比较，Aβ1-40损伤组的细胞活力明显下降，差异较为明显（P<0.05）；各单独给药组同对照组相比，具有明显的促增殖作用；与损伤组相比，药物各剂量组均能显著改善Aβ1-40对细胞活力的影响作用，提高细胞存活率，并呈一定量效关系，其中石杉碱甲及药物高、中剂量组细胞存活率较模型组提高显著，差异具有统计学意义（P<0.05）；低剂量的存活率同模型组相比略微提高，但差异不明显。
（3）药物对Aβ1-40致SH-SY5Y损伤细胞LDH（乳酸脱氢酶）释放的影响
LDH释放检测数据表明，同对照组相比，Aβ1-40损伤组的LDH漏出显著上升，表明细胞损伤严重，表现出清晰的细胞毒作用，且具有显著性差异（P<0.01）；各单药组同对照组相比，LDH漏出有所降低，表明各组单药能促进细胞增殖，对细胞的毒性较低；与损伤组比较，不同剂量的药物作用后，各组LDH释放量与损伤组相比均下降，其中以石杉碱甲及高剂量对细胞LDH的渗漏降低效果显著（P<0.05），中、低剂量的药物效果不明显，没有明显差异性。
（4）药物对损伤细胞中BDNF含量的影响
与对照组相比，Aβ1-40损伤组BDNF（脑源性神经营养因子）含量明显减少，存在明显差异性（P<0.05）；各单独给药组同对照组细胞相比，BDNF含量没有显著增加；与损伤组相比，各加药组BDNF含量升高，其中以石杉碱甲和70µg×mL-1作用较为显著（P<0.05），35、17.5µg×mL-1作用稍有提高，但不显著，各剂量作用呈现一定的剂量依赖性。结果表明该药物能改善Aβ1-40致SH-SY5Y损伤细胞中的BDNF含量，但对正常细胞没有显著影响。结果见图5。
（5）药物对损伤细胞中AchE（乙酞胆碱酯酶）含量的影响
同对照组比较，Aβ1-40损伤组AchE含量明显升高，存在显著差异性（P<0.05）；不同单药组同对照组细胞比较，AchE含量略有增加，但不显著；与损伤组相比，各加药组AchE含量降低，其中以阳性药及70µg×mL-1作用较为显著（P<0.05），35、17.5µg×mL-1作用稍有降低，但不显著。结果表明该药物能改善Aβ1-40致使SH-SY5Y细胞损伤中的AchE含量，但对正常对照组细胞没有影响。结果见表13，图6。
表13 醒脑益智组分对Aβ1-40致SH-SY5Y细胞损伤中AchE含量影响（±s，n=6）
注：与对照组相比，△P<0.05；与损伤组相比，*P<0.05。
（6）药物对损伤细胞中NeuN蛋白表达情况
Western blot实验表明，同对照组比较，Aβ损伤组细胞NeuN蛋白的表达明显减少，各单药组同对照组细胞比较，NeuN表达量稍有增加，说明药物单独作用能够促进神经元核蛋白的生成；与损伤组相比，各加药组NeuN表达增加较明显，表明药物对NeuN的生成具有促进作用。结果见图7。
综上，本部分实验采用Aβ1-40诱导SH-SY5Y细胞损伤，模拟AD发病时由于Aβ过度沉积造成的神经元细胞损伤，以观察醒脑益智组分中药对该细胞损伤的改善作用。对细胞活力的检测采用MTT法和细胞毒性—LDH释放检测，二者都是针对活细胞进行，可间接反映活细胞的数量，采用Elisa法对细胞内BDNF及AchE的表达量进行测定，Western blot法观察细胞内BDNF及NeuN的表达，结果表明，醒脑益智组分中药对Aβ过度沉积造成的神经元SH-SY5Y细胞损伤能够起到相关的改善作用，且该作用呈现一定的剂量依赖性，提示该保护作用可能与改善神经细胞内神经营养因子及神经递质的含量，促进神经细胞的生长和分化有关。
实施例12 对Aβ1-40致SH-SY5Y细胞氧化应激与炎症作用研究。
（1）药物对损伤细胞中总SOD（超氧化物歧化酶）活力及MDA（丙二醛）含量的影响
同对照组比较，Aβ1-40损伤细胞中的SOD活力明显下降，MDA含量增加，差异具极有显著性（P<0.01）；同损伤细胞相比，石杉碱甲及药物高剂量中的SOD活力升高、MDA含量下降，二者均具有极显著性（P<0.01），中剂量的SOD活性也明显升高，MDA含量明显降低，效果均优于损伤细胞，各差异较为显著（P<0.05），低剂量组的SOD活性略有增加，MDA含量有所下降，但效果不如高、中剂量药物，差异不显著；各单药组能使正常细胞的SOD活力增加，减少MDA含量，但差异不明显。结果表明该药物能改善SH-SY5Y损伤细胞中SOD的活力，减少MDA的生成，加快机体对自由基的清除能力，抑制脂质过氧化物的生成。结果见表14，图8。
表14 醒脑益智组分中药对Aβ1-40致SH-SY5Y细胞损伤中SOD活性和MDA含量影响（±s，n=6）
注：与对照组相比，△△P<0.01；与损伤组相比，**P<0.01，*P<0.05。
（2）药物对损伤细胞中TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、IL-1β(白介素1β)含量的影响
同对照组比较，Aβ1-40损伤组TNF-α及IL-1β含量均显著增加，差异极明显（P<0.01）；各单药组与对照组细胞相比，TNF-α及IL-1β的含量稍有增加，各组没有明显差异；与损伤组相比，各加药组TNF-α含量降低，其中以阳性药及药物70、35µg×mL-1作用较为显著（P<0.05），各加药组IL-1β含量降低，以阳性药及药物70µg×mL-1作用较为显著（P<0.05），中、低剂量组虽有改善，但效果不明显。结果表明该药物能改善Aβ1-40致SH-SY5Y损伤细胞中的相关炎症因子的含量，但对正常细胞作用不明显。结果见表15，图9。
表15 醒脑益智组分中药对Aβ1-40致SH-SY5Y细胞损伤IL-1β含量影响，（±s，n=6）
注：与对照组相比，△△P<0.01，△P<0.05；与损伤组相比，**P<0.01，*P<0.05。
（3）药物对损伤细胞中总ROS（活性氧）活性作用
从图10上可看出，同空白对照比较，阴性组细胞在M2区出现阳性群，并出现偏移，呈现一定的荧光强度，说明正常细胞加入探针后可被探针染上颜色；与空白对照组相比，Aβ1-40损伤组M2区平均荧光强度（MFI）增强，经统计学分析具有一定的差异性（P<0.05）；与损伤组相比，各加药组M2区MFI降低，其中以石杉碱甲及高剂量70µg×mL-1作用较显著（P<0.05），中、低剂量作用不明显；各单药组与空白对照组细胞相比，M2区MFI略有降低，说明药物能够降低正常细胞中ROS的表达，呈现出一定的抗氧化作用。结果见表16。
表16 醒脑益智组分中药对Aβ1-40致SH-SY5Y细胞损伤中总ROS活性的影响，（±s，n=3）
注：与空白对照组相比，△P<0.05；与损伤组相比，*P<0.05 。
（4）药物对损伤细胞中IL-1β蛋白表达的影响
Western blot实验表明，同对照组比较，Aβ1-40损伤组细胞中的IL-1β含量明显增多，不同单药组同对照组细胞比较，IL-1β表达量变化不大；与损伤细胞相比，各加药组IL-1β含量显著降低，以70µg×mL-1和石杉碱甲作用效果较好，表明药物对Aβ1-40致细胞损伤产生的IL-1β具有一定抑制作用。结果见图11。
实施例13 对Aβ1-40致使SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用研究。
（1）荧光显微镜下对损伤细胞的凋亡形态的观测
药物作用24h之后，采用Hoechst染色的方法对SH-SY5Y损伤细胞进行染色观测，荧光显微镜下发现，对照组细胞核发出的亮蓝色荧光在细胞核中分布较为均匀，且染色数量较少，Aβ1-40进行损伤后，视野中发亮蓝色荧光的细胞核数目急剧上升，说明细胞膜损伤严重，细胞出现坏死；给以不同剂量（70、35、17.5µg×mL-1）的醒脑益智组分后，所发亮蓝色荧光的细胞核数量有所减少，其中以高剂量（70µg×mL-1）组较为明显，表明药物对SH-SY5Y细胞受损有不同程度的改善效果。
（2）药物对Aβ1-40致使SH-SY5Y细胞损伤相关凋亡蛋白含量的影响
Western blot结果表明，与对照组比，Aβ1-40损伤组细胞Bax、Bcl-2蛋白含量明显增加，不同剂量药物干预后，细胞中促凋亡蛋白Bax的表达量较损伤组下降，抗凋亡基因Bcl-2也有所表达，但与损伤组比，变化不明显。结果见图12。
（3）药物对Aβ1-40致SH-SY5Y细胞损伤Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响
本实验所得Ct值由软件测得，依照power(2-ΔΔCt)法推算不同组别Bax、Bcl-2 mRNA的相对表达。实验结果如下：同对照组比，Aβ1-40组Bax mRNA相对表达明显提高，具有极明显差异（P<0.01）；与损伤组比，不同浓度药物组的Bax mRNA相对表达显著减少，以高、中浓度组减少显著，具有明显差异（P<0.05），低剂量组虽有所降低，但差异不理想。从Bcl-2 mRNA的相对表达来看，损伤组同对照组比较，表达量明显降低，具有极明显的差别（P<0.01）；同损伤细胞比较，各剂量组Bcl-2 mRNA的表达有所增加，以高、中浓度的药物较为明显（P<0.05）。结果显示，醒脑益智组分中药能显著降低促凋亡基因Bax mRNA的含量，增加抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的含量，从而对Aβ1-40诱导的细胞凋亡起到不同程度的抑制效果。结果见表17，图13。
表17 SH-SY5Y细胞中凋亡基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达情况（±s，n=3）
注：与对照组相比，△△P<0.01，△P<0.05；与损伤组相比，**P<0.01，*P<0.05。
本研究结果表明，给予不同剂量的醒脑益智组分后，各给药组能明显提高Aβ1-40诱导的SH-SY5Y细胞活力，减少细胞的凋亡率，同时还发现该药物可减缓Caspase-3，Caspase-9的活力，抑制Bax蛋白的含量，提高Bcl-2的含量，并能够显著上调SH-SY5Y损伤细胞内Bax基因的表达，下调Bcl-2基因的表达，减轻由Aβ1-40诱导SH-SY5Y细胞损伤引发的凋亡而发挥细胞保护作用。结果提示，醒脑益智组分改善Aβ1-40诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用机理不仅与改善神经细胞相关因子如BDNF、AchE含量，减少相关炎症因子TNF-α、IL-1β含量及总ROS活性强弱等有关，还能通过调节神经元细胞相关凋亡蛋白基因的表达来抑制以线粒体途径进行细胞凋亡通路的激活，从而达到细胞保护的目的，体现中药多靶点，多途径，多层次的整体治疗特点。

Claims (2)

1.一种用于修复和保护SH-SY5Y细胞损伤的药物，其特征在于，其有效成分组成包括：冰片β-CD包合物、淫羊藿苷、甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物；其中，冰片β-CD包合物15重量份、淫羊藿苷25重量份、甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物200重量份；
所述药物的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取β-CD 12g制成饱和水溶液，冷却至40℃，磁力搅拌器搅拌的条件下缓缓加入冰片乙醇溶液，继续搅拌2h后，置于4℃冰箱中过夜，第二天将包合物抽滤，滤饼用水和乙酸乙酯各洗涤3次，每次30mL，抽干，真空干燥器干燥，即得冰片β-CD包合物；其中，冰片乙醇为5mL 40％；
(2)称取甘草酸80mg、细叶远志皂苷100mg溶解于乙醇中，加入氢氧化钾溶液调整溶液pH值为8.0-8.5，控制温度60℃，搅拌24小时，得游离甘草酸及细叶远志皂苷溶液；
(3)称取小檗碱55mg溶解于乙醇中，加入磷酸溶液调整pH值为6.0-6.5，控制温度60℃，搅拌30min得小檗碱溶液；
(4)将步骤(2)制得的游离甘草酸及细叶远志皂苷溶液缓慢加入步骤(3)制得的小檗碱溶液中，控制温度80℃，搅拌48小时；
(5)将步骤(4)制得的混合溶液置于透析袋内，采用超纯水透析48h以除去非反应的甘草酸、细叶远志皂苷、小檗碱以及氢氧化钾、磷酸，每2h换一次超纯水，得到甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷溶液；
(6)将步骤(5)制得的甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷溶液离心，离心后，收集沉淀，超纯水洗涤，真空冷冻干燥，得到甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物；
(7)称取淫羊藿苷25mg与步骤(1)冰片β-CD包合物15mg、步骤(6)甘草酸-小檗碱-细叶远志皂苷共聚物200mg，混和，研匀，即得。
2.根据权利要求1所述的一种用于修复和保护SH-SY5Y细胞损伤的药物，其特征在于，药物剂型为胶囊，辅料为硬脂酸镁。
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