CN117486959A - 磷酸酯衍生物的合成 - Google Patents

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玛尼·布尚·科塔拉
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Abstract

本发明大体上涉及用于制备特定磷酸酯非对映异构体形式的某些抗癌化合物的方法。

Description

磷酸酯衍生物的合成
本申请是申请日为2018年6月14日、题为《磷酸酯衍生物的合成》的中国发明专利申请201880039747.4的分案申请。
技术领域
本发明大体上涉及用于制备特定磷酸酯非对映异构体形式的某些磷酰胺酯前药(ProTide)的新方法。某些磷酰胺酯前药包括可用于治疗癌症的磷酰胺酯前药，例如NUC-3373(5-氟-2'-脱氧尿苷-5'-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰基)磷酸酯)、NUC-7738(3'-脱氧腺苷-5'-O-[苯基(苄氧基-L-丙氨酰基)磷酸酯)和NUC-9701(8-氯腺苷-5'-O-[萘基(苄氧基-L-丙氨酰基)磷酸酯)。
背景技术
磷酰胺酯前药是掩蔽的(masked)核苷的磷酸酯衍生物。它们已被证明是抗病毒药和肿瘤学领域中特别有效的治疗剂。更具体地说，磷酰胺酯前药是单磷酸化核苷的前药。这些化合物似乎避免了许多固有的和获得性的耐药机制，这些机制限制了母体核苷的效用(参见，例如，‘Application of ProTide Technology to Gemcitabine:A SuccessfulApproach to Overcome the Key Cancer Resistance Mechanisms Leads to a NewAgent(NUC-1031)in Clinical Development’；Slusarczyk等人；J.Med.Chem.；2014,57,1531-1542)。
NUC-3373(5-氟-2'-脱氧尿苷-5'-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰基)]磷酸酯)是5FU/FUDR的磷酰胺酯前药改造，是目前是针对结直肠癌的基础治疗。NUC-3373和一系列相关化合物已针对一系列癌症模型显示出体外活性，在许多情况下，特别是对于NUC-3373，其活性非常突出并且远远优于用5-氟尿嘧啶获得的结果。向5-氟尿嘧啶/FUDR分子中添加磷酰胺酯前药氨基磷酸酯部分赋予了将药剂的关键活化形式(FdUMP)递送到肿瘤细胞中的特定优点。非临床研究表明，NUC-3373克服了与5-FU及其口服前药卡培他滨(capecitabine)相关的关键癌细胞耐药机制，产生了高细胞内水平的活性FdUMP代谢物，导致对肿瘤细胞生长的更强抑制。此外，在正式的犬毒理学研究中，NUC-3373比5-FU具有显著更好的耐受性(参见WO2012/117246；McGuigan等人；Phosphoramidate ProTides of the anticanceragent FUDR successfully deliver the preformed bioactive monophosphate incells and confer advantage over the parent nucleoside；J.Med.Chem.；2011,54,7247-7258；和Vande Voorde等人；The cytostatic activity of NUC-3073,aphosphoramidate prodrug of 5-fluoro-2'-deoxyuridine,is independent ofactivation by thymidine kinase and insensitive to degradation byphosphorolytic enzymes；Biochem.Pharmacol.；2011,82,441-452)。
嘌呤核苷的磷酰胺酯前药衍生物(例如8-氯腺苷和3’-脱氧腺苷)和相关化合物也针对一系列实体瘤、白血病和淋巴瘤显示出优异的体外活性(参见WO2016/083830和GB1609602.6)。3’-脱氧腺苷本身不是特别有效的抗癌剂。
通常，所制备的磷酰胺酯前药是两种非对映异构体的混合物，在磷酸酯中心差向异构。例如，NUC-3373的非对映异构体具有以下结构(其中Np是1-萘基)：
WO 2014/076490公开了一种制备核苷前药如吉西他滨-[苯基(苄氧基-L-丙氨酰基)]磷酸酯的方法，通过在催化剂的存在下使吉西他滨或其结构变体与磷酸氯化物的非对映异构体混合物反应，其中所述催化剂包括金属盐，如Cu(OTf)2、CuCl、CuBr、CuI、Cu(OAc)2、CuSO4、Cu(OC(O)CF3)2、Cu(OTf)2、Yb(OTf)3、Fe(OTf)3、La(OTf)3，收率为约45％。
WO2017/098252(PCT/GB2016/053875)中描述了一种合成非对映异构体纯形式的NUC-1031的方法。
本发明某些实施方案的目的是提供一种提供基本上非对映异构体纯形式的NUC-3373、NUC-7738和/或NUC-9701的方法。
本发明某些实施方案的目的是提供一种提供基本上非对映异构体纯形式的NUC-3373、NUC-7738和/或NUC-9701的(Sp)和/或(Rp)-差向异构体的方法，所述方法是可规模化的(scalable)、经济的和/或有效的，例如，比使用HPLC的方法更可规模化、经济和/或有效。因此，本发明某些实施方案的目的是提供一种提供基本上非对映异构体纯形式的(Sp)和/或(Rp)-差向异构体的方法，所述方法适用于大规模生产。
本发明某些实施方案的目的是提供一种简单的方法，即该方法涉及提供基本上非对映异构体纯形式的(Sp)和/或(Rp)-差向异构体的最少数量的工艺步骤和/或试剂。
本发明某些实施方案的另一个目的是提供一种方法，所述方法确保以基本上非对映异构体纯形式提供分离的(Sp)-或(Rp)-差向异构体，同时满足或超过诸如美国FDA之类的组织规定的关于由合成和分离产生的任意痕量杂质的数量和性质的必要标准。
本发明的某些实施方案满足上述目的中的一些或全部。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种制备基本上非对映异构体纯形式的NUC-3373(式Ia)的方法：
所述方法包括步骤a)和任选的步骤b)：
a)在碱(B1)的存在下，使式IIa化合物与式IIIa化合物反应，以提供基本上非对映异构体纯形式的式IVa化合物；其中R1代表吸电子基团，并且a是1至5的整数；其中P1独立地选自氢和保护基团；并且其中式IIa化合物是基本上非对映异构体纯形式：
b)在P1是保护基团的情况下，任选地从式IVa化合物除去保护基团P1，以提供基本上非对映异构体纯形式的NUC-3373。
根据本发明的第二方面，提供了一种制备基本上非对映异构体纯形式的NUC-7738(式Ib)的方法：
所述方法包括步骤a)和任选的步骤b)：
a)在碱(B1)的存在下，使式IIb化合物与式IIIb化合物反应，以提供基本上非对映异构体纯形式的式IVb化合物；其中R1代表吸电子基团，并且a是1至5的整数；其中P2、P3和P4各自独立地选自氢和保护基团；并且其中式IIb化合物是基本上非对映异构体纯形式：
b)在P2、P3和P4中的任意一个或多个是保护基团的情况下，任选地从式IVb化合物除去保护基团P2、P3和P4，以提供基本上非对映异构体纯形式的NUC-7738。
根据本发明的第三方面，提供了一种制备基本上非对映异构体纯形式的NUC-9701(式Ic)的方法：
所述方法包括步骤a)和任选的步骤b)：
a)在碱(B1)的存在下，使式IIa化合物与式IIIc化合物反应，以提供基本上非对映异构体纯形式的式IVc化合物；其中R1代表吸电子基团，并且a是1至5的整数；其中P5、P6、P7和P8各自独立地选自氢和保护基团；并且其中式IIa化合物是基本上非对映异构体纯形式：
b)在P5、P6、P7和P8中的任意一个或多个是保护基团的情况下，任选地从式IVc化合物除去保护基团P5、P6、P7和P8，以提供基本上非对映异构体纯形式的NUC-9701。
R1可选自由以下组成的组：卤素基团(例如选自氟、溴、氯或碘)；三氟甲基、氰基和硝基。a是1到5之间的整数。R1在每次出现时可以是卤素，例如氟。a可以是5。
取代的苯氧基基团的置换选择性地与磷酸酯立体中心的转化一起发生。
通常，前体(式IIa或IIb的化合物)的(Sp)-非对映异构体提供磷酰胺酯前药的(Sp)-非对映异构体，并且前体的(Rp)-非对映异构体提供磷酰胺酯前药的(Rp)-非对映异构体。例外情况是，当在Cahn-Ingold-Prelog规则下，OPh(R1)a离去基团的优先级分配比萘基基团低时(例如，在OPh(R1)a是对硝基苯氧基的情况下)。在这种情况下，前体(式IIa化合物)的(Rp)-非对映异构体提供磷酰胺酯前药的(Sp)-非对映异构体，并且前体的(Sp)-非对映异构体提供磷酰胺酯前药的(Rp)-非对映异构体。在整个说明书中，提供磷酰胺酯前药的(Sp)-异构体的式IIa化合物的异构体被称为X-非对映异构体，并且提供磷酰胺酯前药的(Rp)-异构体的式IIa化合物的异构体被称为Y-非对映异构体。对于化合物IIb，通常情况是：前体(式IIb化合物)的(Sp)-非对映异构体提供磷酰胺酯前药的(Sp)-非对映异构体，并且前体的(Rp)-非对映异构体提供磷酰胺酯前药的(Rp)-非对映异构体。
因此，第一、第二或第三方面的方法可以是制备非对映异构体富集形式的磷酰胺酯前药的(Sp)-非对映异构体的方法，并且式IIa或IIb化合物是非对映异构体富集形式。
第一、第二或第三方面的方法可以是制备非对映异构体富集形式的磷酰胺酯前药的(Rp)-非对映异构体的方法，并且式IIa或IIb化合物是非对映异构体富集形式。
碱(B1)可以是氮碱。氮碱包括N-烷基咪唑(例如N-甲基咪唑(NMI))、咪唑、任选取代的吡啶(例如可力丁(collidine)、吡啶、2,6-二甲基吡啶)和三烷基胺(例如三乙胺和二异丙基乙胺)。或者，碱(B1)可以是有机金属碱或金属氢化物碱(例如NaH)。因此，碱可以是格氏试剂(Grignard reagent)(即烷基卤化镁)。示例性的格氏试剂包括叔丁基镁卤化物，例如tBuMgCl、tBuMgBr。优选地，碱是tBuMgCl。
步骤a)可在溶剂S1中进行。
在本发明的第四方面，提供了一种式IIa化合物的非对映异构体富集方法；所述方法包括：
c)将式IIa化合物的X-非对映异构体或式IIa化合物的XR-和Y-非对映异构体混合物悬浮或溶解于溶剂(S2)中，
d)用碱(B2)处理溶液或悬浮液，以得到基本上非对映异构体富集形式的X-非对映异构体，以及
e)分离式IIa的X-非对映异构体。通常，X-非对映异构体是(S)-非对映异构体，并且Y-非对映异构体是(R)-非对映异构体。
本发明人惊奇地发现，用碱处理式IIa化合物时，它们会异构化，优先形成X-非对映异构体而非Y-非对映异构体。因此，可以将Y-非对映异构体转化为X-非对映异构体，或者可以将Y-非对映异构体和X-非对映异构体的差向异构体混合物转化为X-非对映异构体。这提高了结合了第一或第三方面的方法的制备NUC-3373或NUC-9701的X-非对映异构体的任意合成顺序的净效率，因为这意味着所有式IIa化合物，甚至最初以Y-非对映异构体形成的化合物的一部分均可以被利用。通常，X-非对映异构体是(Sp)-非对映异构体，并且Y-非对映异构体是(Rp)-非对映异构体。
该方法可以包括：
以Y-和X-非对映异构体混合物的形式形成式IIa化合物；并且步骤c)包括将式IIa化合物的Y-和X-非对映异构体混合物悬浮或溶解于溶剂(S2)中。
通常，X-非对映异构体是(Sp)-非对映异构体，并且Y-非对映异构体是(Rp)-非对映异构体。
在第一或第三方面的方法中使用的式IIa化合物可以是根据第四方面的方法形成的X-非对映异构体。通常，X-非对映异构体是(Sp)-非对映异构体，并且Y-非对映异构体是(Rp)-非对映异构体。
本发明第二方面的方法可以包括：
c)将式IIb化合物的Rp-非对映异构体或式IIb化合物的(Rp)-和(Sp)-非对映异构体混合物悬浮或溶解于溶剂(S2)中，
d)用碱(B2)处理溶液或悬浮液，以得到基本上非对映异构体富集形式的(Sp)-非对映异构体，以及
e)分离式IIb的(Sp)-非对映异构体。
因此，本发明第二方面的方法可以包括：
以(Rp)-和(Sp)-非对映异构体混合物的形式形成式IIb化合物；并且步骤c)包括将式IIb化合物的(Rp)-和(Sp)-非对映异构体混合物悬浮或溶解于溶剂(S2)中。
碱(B2)可以选自由以下组成的组：有机胺碱(例如伯胺、仲胺、叔胺、环胺；示例性有机胺碱包括碱包括N-烷基咪唑，[例如N-甲基咪唑(NMI)、咪唑、任选取代的吡啶，(例如可力丁、吡啶、2,6-二甲基吡啶)和三烷基胺(例如三乙胺和二异丙基乙胺)]；或无机碱(例如碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属醇盐、碱金属芳族醚(aryloxide))。优选地，B2是叔胺。因此，B2可以是三烷基胺。最优选地，B2是三乙胺。
溶剂S2可以选自由以下组成的组：酰胺、醚、酯、酮、芳烃、卤代溶剂、腈、亚砜、砜及其混合物。S2可以是有机溶剂。有机溶剂包括但不限于醚(例如四氢呋喃、二噁烷、乙醚、叔丁基甲基醚)；酮(例如丙酮和甲基异丁基酮)；卤代溶剂(如二氯甲烷、氯仿和1,2-二氯乙烷)；烃类(例如环己烷、戊烷、己烷、庚烷)、芳族溶剂(例如苯和甲苯)、酯(例如乙酸乙酯)和酰胺(例如DMF、NMP)；或其混合物。优选地，S2是烃或包含烃的混合物。当S2是混合物时，它可以是包含超过50％(例如超过70％)的烃的混合物。烃可以是己烷。烃可以是庚烷。S2可以是己烷或庚烷与极性有机溶剂(例如醚、酯、醇或卤代溶剂)的混合物。S2可以是己烷或庚烷与极性有机溶剂的混合物，该混合物包含超过50体积％(例如超过70体积％)的己烷或庚烷。S2可以是己烷或庚烷与乙酸乙酯的混合物。S2可以是庚烷与乙酸乙酯的混合物。S2可以是己烷或庚烷与乙酸乙酯的混合物，该混合物包含超过50体积％(例如超过体积70％)的己烷或庚烷。S2可以是庚烷与乙酸乙酯的混合物，该混合物包含超过50体积％(例如超过体积70％)的庚烷。S2可以是己烷或庚烷与甲基叔丁基醚的混合物。S2可以是己烷与甲基叔丁基醚的混合物。S2可以是己烷或庚烷与甲基叔丁基醚的混合物，该混合物包含超过50体积％(例如超过体积70％)的己烷或庚烷。S2可以是己烷与甲基叔丁基醚的混合物，该混合物包含超过50体积％(例如超过体积70％)的己烷。
步骤d)可以涉及将式IIa化合物和碱B2的混合物搅拌24小时或更长时间。步骤d)可以涉及将式IIa化合物和碱B2的混合物搅拌48小时或更长时间。步骤d)可以涉及将式IIa化合物和碱B2的混合物搅拌60小时或更长时间。步骤d)可以涉及将式IIa化合物和碱B2的混合物搅拌72小时或更长时间。步骤d)可以涉及将式IIa化合物和碱B2的混合物搅拌多达100小时。
步骤d)可以涉及在0至60℃的温度下搅拌式IIa化合物和碱B2的混合物。步骤d)可以涉及在20至40℃的温度下搅拌式IIa化合物和碱B2的混合物。
步骤d)可以涉及将式IIb化合物和碱B2的混合物搅拌2小时或更长时间。步骤d)可以涉及将式IIb化合物和碱B2的混合物搅拌6小时或更长时间。步骤d)可以涉及将式IIb化合物和碱B2的混合物搅拌10小时或更长时间。步骤d)可以涉及将式IIb化合物和碱B2的混合物搅拌16小时或更长时间。步骤d)可以涉及将式IIb化合物和碱B2的混合物搅拌多达36小时。
步骤d)可以涉及在0至50℃的温度下搅拌式IIb化合物和碱B2的混合物。步骤d)可以涉及在10至35℃的温度下搅拌式IIb化合物和碱B2的混合物。
在本发明第二方面的某些特定实施方案中，式IIb化合物是选自以下的化合物：
/>
/>
/>
*表示磷上的手性中心
式IIb化合物可以是：
式IIb化合物可以是：
在本发明第一、第三和第四方面的某些特定实施方案中，式IIa化合物是选自以下的化合物：
/>
/>
/>
/>
/>
*表示磷上的手性中心
式IIa化合物可以是化合物12：
式IIa化合物可以是基本上非对映异构体纯形式的(Rp)-化合物12。该化合物可以是基本上非对映异构体纯形式的化合物12的快速洗脱异构体。因此，该化合物可以是化合物12的异构体，当在CDCl3中在202MHz NMR机器上获得NMR光谱时，其在-1.41±0.02具有31PNMR峰，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。该化合物可以是化合物12的异构体，当在Varian Pursuit XRs 5 C18，150x4.6mm上进行分析级HPLC(在35min内用20/80的H2O/MeOH洗脱，1mL/min)时，其保留时间为12.96±0.20分钟，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。
式IIa化合物可以是基本上非对映异构体纯形式的(Sp)-化合物12。该化合物可以是基本上非对映异构体纯形式的化合物12的缓慢洗脱异构体。因此，该化合物可以是化合物12的异构体，当在CDCl3中在202MHz NMR机器上获得NMR光谱时，其在-1.36±0.02具有31PNMR峰，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。该化合物可以是化合物12的异构体，当在Varian Pursuit XRs 5 C18，150x4.6mm上进行分析级HPLC(在35min内用20/80的H2O/MeOH洗脱，1mL/min)时，其保留时间为14.48±0.20分钟，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。
式IIa化合物可以是：
NUC-3373可以是基本上非对映异构体纯形式的NUC-3373的快速洗脱异构体。因此，NUC-3373可以是NUC-3373的异构体，当在CD3OD中在202MHz NMR机器上获得NMR光谱时，其在4.27±0.10具有31P NMR峰，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。NUC-3373可以是NUC-3373的异构体，当在Varian Pursuit XRs 5 C18，150x4.6mm上进行分析级HPLC(在35min内用100/10至0/100的H2O/CH3CN洗脱，1mL/min)时，其保留时间为16.03±0.20分钟，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。
NUC-3373可以是基本上非对映异构体纯形式的NUC-3373的缓慢洗脱异构体。因此，NUC-3373可以是NUC-3373的异构体，当在CD3OD中在202MHz NMR机器上获得NMR光谱时，其在4.62±0.10具有31P NMR峰，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。NUC-3373可以是NUC-3373的异构体，当在Varian Pursuit XRs 5 C18，150x4.6mm上进行分析级HPLC(在35min内用90/10至0/100的H2O/CH3CN洗脱，1mL/min)时，其保留时间为16.61±0.20分钟，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。
NUC-9701可以是基本上非对映异构体纯形式的NUC-9701的快速洗脱异构体。因此，NUC-9701可以是NUC-9701的异构体，当在CD3OD中在202MHz NMR机器上获得NMR光谱时，其在3.93±0.04具有31P NMR峰，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。NUC-9701可以是NUC-9701的异构体，当在Varian Pursuit XRs 5 C18，150x4.6mm上进行分析级HPLC(在30min内用90/10至0/100的H2O/CH3CN洗脱，1mL/min)时，其保留时间为16.43±0.10分钟，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。
NUC-9701可以是基本上非对映异构体纯形式的NUC-9701的缓慢洗脱异构体。因此，NUC-9701可以是NUC-9701的异构体，当在CD3OD中在202MHz NMR机器上获得NMR光谱时，其在3.83±0.04具有31P NMR峰，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。NUC-9701可以是NUC-9701的异构体，当在Varian Pursuit XRs 5 C18，150x4.6mm上进行分析级HPLC(在30min内用100/10至0/100的H2O/CH3CN洗脱，1mL/min)时，其保留时间为16.59±0.10分钟，所述异构体是基本上非对映异构体纯形式的。
式IIa化合物可以根据本发明的第四方面制备。
在本发明的第五方面，提供了式IIa化合物。该化合物可以是式IIa化合物的Sp异构体。该化合物可以是式IIa化合物的Rp异构体。
在本发明的第六方面，提供了基本上非对映异构体纯形式的(Sp)-NUC-3373：
优先异构化以形成式IIa化合物的X-非对映异构体是指NUC-3373的Sp异构体比Rp异构体更容易生产。
在本发明的第七方面，提供了基本上非对映异构体纯形式的(Rp)-NUC-3373：
在本发明的第八方面，提供了基本上非对映异构体纯形式的(Sp)-NUC-7738：
优先异构化以形成式IIb化合物的(S)-非对映异构体是指NUC-7738的Sp异构体比Rp异构体更容易生产。
在本发明的第九方面，提供了基本上非对映异构体纯形式的(Rp)-NUC-7738：
在本发明的第十方面，提供了基本上非对映异构体纯形式的(Sp)-NUC-9701：
优先异构化以形成式IIa化合物的X-非对映异构体是指NUC-9701的Sp异构体比Rp异构体更容易生产。
在本发明的第十一方面，提供了基本上非对映异构体纯形式的(Rp)-NUC-9701：
本发明第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的化合物可以是以上对于本发明的第一、第二和第三方面描述的非对映异构体。
本发明还可以提供一种药物组合物，其包含本发明第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的化合物和药学上可接受的赋形剂。
本发明还可以提供一种治疗癌症(例如实体瘤或白血病)的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的化合物。
本发明第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的化合物可以用于医学用途。本发明第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的化合物可以用于治疗癌症(例如实体瘤或白血病)。
本发明第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的产品可以通过本发明的第一、第二或第三方面获得(或者可以是通过本发明的第一、第二或第三方面获得的)。
羟基基团的保护基团(例如P1、P2、P5或P6)可以独立地选自任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3、任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基、任选取代的-C(O)-芳基、任选取代的-C(O)-OC1-C6-烷基、-C(O)-O-烯丙基、-C(O)-O-CH2-芴基、任选取代的-C(芳基)3、任选取代的-(C1-C3-亚烷基)-芳基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基和-C1-C4-烷基-O-C1-C4-烷基。当两个羟基基团连接到相邻的碳原子上时(例如P5和P6)，可以用任选取代的–C(C1-C4-烷基)2-基团将它们共同保护。
氨基基团的保护基团(例如P3、P4、P7或P8)可以在每次出现时独立地选自-C(O)OC1-C6-烷基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基、-C(O)-O-烯丙基、-C(O)-O-CH2-芴基、任选取代的-CH(芳基)3、任选取代的-(C1-C3-亚烷基)-芳基、任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基、任选取代的-C(O)-芳基、-S(O)2-C1-C6-烷基、任选取代的-S(O)2-芳基和任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3。
许多受保护的式IIIa、IIIb或IIIc起始化合物是本领域已知的和/或可以通过已知方法制备。例如，可以通过用合适的保护基团保护羟基和/或氨基基团从而从母体核苷合成IIIa、IIIb或IIIc起始化合物。通常可以使用常规保护基团方法来添加和除去保护基团，例如，如“Protective Groups in Organic Chemistry,”由J WF McOmie编辑(1973)；“Protective Groups in Organic Synthesis,”第二版，T WGreene(1991)；和“ProtectingGroups”，第三版P.J Koscienski(1995)中所描述的。
通常需要通过以下方法制备式IIIa、IIIb和IIIc化合物：首先用保护基团保护母体核苷的5'-羟基基团，其中所述保护基团与将要用于保护3'和/或2'-羟基和/或氨基基团的保护基团是互不干涉的(orthogonal)(即，该基团可以从5'-羟基基团上除去，而无需同时除去所需的3'-羟基、2'-羟基和/或氨基保护基团)。同时或随后，用所需的保护基团保护3’,2’-羟基和/或氨基，并且可以除去5'-羟基保护基团以产生式IIIa、IIIb或IIIc化合物。可以将某些保护基团同时引入到3'和/或2’-羟基和5'-羟基和任选的氨基基团上，然后从5'羟基基团上选择性地除去，而不从3'和/或2’-羟基和任选的氨基基团上除去。
根据一些实施方案，P1独立地选自任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3、任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基、任选取代的-C(O)-芳基、任选取代的-C(O)-OC1-C6-烷基、-C(O)-O-烯丙基、-C(O)-O-CH2-芴基、任选取代的-C(芳基)3、任选取代的-(C1-C3-亚烷基)-芳基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基和-C1-C4-烷基-O-C1-C4-烷基。
P1可以独立地选自任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3、任选取代的-C(O)-OC1-C6-烷基和任选取代的-C(O)OCH2-芳基、-C(O)-O-烯丙基。优选地，P1选自-C(O)O-tBu、-C(O)O-苄基和-C(O)OCH2-烯丙基。因此，P1可以是-C(O)OCH2-芳基。P1可以是-C(O)O-tBu。
或者，P1可以独立地选自任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基和任选取代的-C(O)-芳基，例如，P1可以独立地选自苄氧基和乙酰基。
在另一个替代方案中，P1可以是任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3。P1可以是-Si(C1-C4-烷基)3。烷基基团可以是未取代的。P1可以是叔丁基二甲基甲硅烷基。
根据一些实施方案，P2独立地选自任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3、任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基、任选取代的-C(O)-芳基、任选取代的-C(O)-OC1-C6-烷基、-C(O)-O-烯丙基、-C(O)-O-CH2-芴基、任选取代的-C(芳基)3、任选取代的-(C1-C3-亚烷基)-芳基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基和-C1-C4-烷基-O-C1-C4-烷基。
P2可以独立地选自任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3、任选取代的-C(O)-OC1-C6-烷基和任选取代的-C(O)OCH2-芳基、-C(O)-O-烯丙基。优选地，P2选自-C(O)O-tBu、-C(O)O-苄基和-C(O)OCH2-烯丙基。因此，P2可以是-C(O)OCH2-芳基。P2可以是-C(O)O-tBu。
或者，P2可以独立地选自任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基和任选取代的-C(O)-芳基，例如，P2可以独立地选自苄氧基和乙酰基。
在另一个替代方案中，P2可以是任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3。P2可以是-Si(C1-C4-烷基)3。烷基基团可以是未取代的。P2可以是叔丁基二甲基甲硅烷基。
P3可以独立地选自-C(O)OC1-C6-烷基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基、-C(O)-O-烯丙基、-C(O)-O-CH2-芴基、任选取代的-CH(芳基)3、任选取代的-(C1-C3-亚烷基)-芳基、任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基、任选取代的-C(O)-芳基、-S(O)2-C1-C6-烷基、任选取代的-S(O)2-芳基和任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3。
P3可以独立地选自-C(O)OC1-C6-烷基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基、-C(O)-O-烯丙基、任选取代的-C(芳基)3和任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3。优选地，P3选自-C(O)O-tBu、-C(O)O-苄基和-C(O)OCH2-烯丙基。因此，P3可以是-C(O)OCH2-芳基。
或者，P3可以独立地选自任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基和任选取代的-C(O)-芳基，例如，P3可以独立地选自苄氧基和乙酰基。
在另一个替代方案中，P3是H。
P4可以独立地选自H、-C(O)OC1-C6-烷基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基、-C(O)-O-烯丙基、-C(O)-O-CH2-芴基、任选取代的-CH(芳基)3、任选取代的-(C1-C3-亚烷基)-芳基、任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基、任选取代的-C(O)-芳基、-S(O)2-C1-C6-烷基、任选取代的-S(O)2-芳基和任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3。
优选地，P4是H。
P3和P4可以各自是H。可能的是：P3和P4各自是H，并且P2是–C(O)O-tBu。可能的是：P3和P4各自是H，并且P2是叔丁基二甲基甲硅烷基。
根据一些实施方案，P5和P6各自独立地选自任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3、任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基、任选取代的-C(O)-芳基、任选取代的-C(O)-OC1-C6-烷基、-C(O)-O-烯丙基、-C(O)-O-CH2-芴基、任选取代的-C(芳基)3、任选取代的-(C1-C3-亚烷基)-芳基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基和-C1-C4-烷基-O-C1-C4-烷基；或者，P5和P6一起形成任选取代的-C(C1-C4-烷基)2-基团。P5和P6可以是相同的。
P5和P6可以各自选自任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3、任选取代的-C(O)-OC1-C6-烷基和任选取代的-C(O)OCH2-芳基、-C(O)-O-烯丙基。优选地，P5和P6各自选自-C(O)O-tBu、-C(O)O-苄基和-C(O)OCH2-烯丙基。因此，P5和P6可以各自是–C(O)OCH2-芳基。因此，P5和P6可以各自是–C(O)O-tBu。
或者，P5和P6可以各自选自任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基和任选取代的-C(O)-芳基，例如，P5和P6可以各自选自苄氧基和乙酰基。
在另一个替代方案中，P5和P6可以各自是任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3。P2可以是-Si(C1-C4-烷基)3。烷基基团可以是未取代的。P5和P6可以各自是叔丁基二甲基甲硅烷基。
然而，优选地，P5和P6一起形成任选取代的-C(C1-C4-烷基)2-基团。P5和P6可以一起形成–C(Me)2-基团。
P7可以独立地选自-C(O)OC1-C6-烷基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基、-C(O)-O-烯丙基、-C(O)-O-CH2-芴基、任选取代的-CH(芳基)3、任选取代的-(C1-C3-亚烷基)-芳基、任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基、任选取代的-C(O)-芳基、-S(O)2-C1-C6-烷基、任选取代的-S(O)2-芳基和任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3。
P7可以独立地选自-C(O)OC1-C6-烷基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基、-C(O)-O-烯丙基、任选取代的-C(芳基)3和任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3。优选地，P7选自-C(O)O-tBu、-C(O)O-苄基和-C(O)OCH2-烯丙基。因此，P7可以是-C(O)OCH2-芳基。
或者，P7可以独立地选自任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基和任选取代的-C(O)-芳基，例如，P7可以独立地选自苄氧基和乙酰基。
在另一个替代方案中，P7是H。
同样，P8可以独立地选自H、-C(O)OC1-C6-烷基、任选取代的-C(O)OCH2-芳基、-C(O)-O-烯丙基、-C(O)-O-CH2-芴基、任选取代的-C(芳基)3、任选取代的-(C1-C3-亚烷基)-芳基、任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基、任选取代的-C(O)-芳基、-S(O)2-C1-C6-烷基、任选取代的-S(O)2-芳基和任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3。
优选地，P8是H。
P7和P8可以各自是H。可能的是：P7和P8是H，并且P5和P6一起形成–C(Me)2-基团。
任选取代的-Si(C1-C6-烷基)3基团可以是-Si(C1-C4-烷基)3基团。该基团(即烷基基团)优选是未取代的。说明性实例包括三乙基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基。
任选取代的-C(O)-C1-C6-烷基基团可以是-C(O)-C1-C6-烷基。该基团(即烷基基团)优选是未取代的。说明性实例包括乙酰基和丙酰基。
任选取代的-C(O)-芳基基团可以是-C(O)-苯基基团。该基团(即苯基基团)优选是未取代的。说明性实例包括苄氧基。
任选取代的-C(O)-OC1-C6-烷基基团可以是-C(O)-OC1-C4-烷基。该基团(即烷基基团)优选是未取代的。说明性实例包括-C(O)-O-甲基和-C(O)-O-乙基。特别优选的实例是C(O)OtBu。
任选取代的-(C1-C3-亚烷基)-芳基基团优选是任选取代的苄基基团。说明性实例包括苄基、苯乙基、4-甲氧基苄基、4-硝基苄基、4-溴苄基、2,3-二甲氧基苄基和2,4-二甲氧基苄基。
任选取代的-C(O)OCH2-芳基基团优选是任选取代的-C(O)O苄基基团。说明性实例包括-C(O)O苄基和-C(O)O-(4-甲氧基苄基)。
任选取代的-C1-C4-烷基-O-C1-C4-烷基基团可以是-C1-C2-烷基-O-C1-C2-烷基基团。该基团(即烷基基团)优选是未取代的。说明性实例包括甲氧基-甲基(MOM)和2-甲氧基-乙氧基-甲基(MEM)。
任选取代的-S(O)2-C1-C6-烷基基团可以是-S(O)2-C1-C4-烷基。该基团(即烷基基团)优选是未取代的。说明性实例包括甲磺酸酯。
任选取代的-S(O)2-芳基基团可以是-S(O)2-苯基基团。说明性实例包括苯基磺酸酯、4-甲基苯基磺酸酯和4-硝基苯基磺酸酯。
任选取代的-C(芳基)3基团基团可以是-C(苯基)3基团。说明性实例包括三苯甲基。
在P2、P3和P4或P5、P6、P7和P8中的两个或多个是保护基团的情况下，脱保护步骤可以包括两个或三个单独的脱保护反应。这是在使用两个或三个不同保护基团并且这两个或三个保护基团不能在相同条件下除去的情况下。
然而，脱保护步骤可以包括除去所有保护基团的单一脱保护反应。因此，P2和P3可以是可以在相同条件下被除去的保护基团。P2和P3可以是相同的。同样，P5和P6可以是可以在相同条件下被除去的保护基团。P5和P6可以是相同的。
在整篇说明书中，“非对映异构体富集形式”和“基本上非对映异构体纯形式”是指非对映异构体纯度大于95％。“非对映异构体富集形式”和“基本上非对映异构体纯形式”可以指非对映异构体纯度大于98％、大于99％或大于99.5％。
任意上述烷基和芳基(例如苯基，包括苄基基团中的苯基基团)基团，在化学上可能的情况下，任选地被1至3个取代基取代，所述取代基在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：氧代、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、SORa、SO3Ra、SO2Ra、SO2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-烯基和C1-C4卤代烷基；其中Ra在每次出现时独立地选自H、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基。
任意上述烷基均可以是未取代的。
任意上述芳基(例如苯基，包括苄基基团中的苯基基团)，在化学上可能的情况下，可以任选地被1至3个取代基取代，所述取代基在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、SORa、SO3Ra、SO2Ra、SO2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-烯基和C1-C4卤代烷基；其中Ra在每次出现时独立地选自H、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基。
任意上述芳基(例如苯基，包括苄基基团中的苯基基团)可以任选地被1至3个取代基取代，所述取代基在每次出现时各自独立地选自由以下组成的组：卤素、硝基、ORa；C1-C4-烷基，C1-C4卤代烷基；其中Ra在每次出现时独立地选自H、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基。
芳基基团酌情具有6-20个碳原子，以满足化合价要求。芳基基团是满足Huckel规则的碳环基团(即，它们含有包含2(2n+1)π电子的碳环体系)。芳基基团可以是任选取代的苯基基团、任选取代的联苯基基团、任选取代的萘基基团或任选取代的蒽基基团。同样，芳基基团可以包括非芳族碳环部分。优选地，芳基基团是任选取代的苯基基团。
烷基基团可以是直链或支链的。因此，例如，C4烷基基团可以是正丁基、异丁基或叔丁基。
第一、第二和第三方面的步骤a)可以在有机溶剂(S1)中进行。有机溶剂包括但不限于醚(例如四氢呋喃、二噁烷、乙醚、甲基叔丁基醚)；酮(例如丙酮和甲基异丁基酮)；卤代溶剂(例如二氯甲烷、氯仿和1,2-二氯乙烷)；和酰胺(例如DMF、NMP)；或其混合物。当步骤a)在格氏试剂的存在下进行时，有机溶剂优选为醚。最优选地，溶剂是四氢呋喃。
当第一方面的步骤a)在氮碱的存在下进行时，有机溶剂最优选是卤代溶剂或酰胺。
反应通常在合适的温度下进行，例如，从约-5℃至约40℃。优选地，反应温度为约25℃至约30℃。可以将反应搅拌约15分钟至约16小时，优选约30分钟至约60分钟。
本发明的方法还可以涉及羟基和氨基保护基团的脱保护。
可以在不纯化步骤a)的产物的情况下进行脱保护步骤(步骤b)。
当保护基团对酸敏感时(例如三苯甲基、C(O)OtBu、MOM、MEM、2,4-二甲氧基苄基、2,3-二甲氧基苄基、-C(Me)2-)，脱保护步骤可以使用合适的酸进行。酸可以是布朗斯台德酸(Bronsted acid)(例如、TFA、磷酸、HCl或甲酸)或路易斯酸(Lewis acid)(例如ZnBr2、CeCl3)。路易斯酸(例如ZnBr2)是不太优选的。同样不太优选HCl。优选地，酸是TFA。
当保护基团对碱敏感时，例如乙酰基、苄氧基，脱保护步骤可以使用合适的碱例如NH3水溶液或NaOH水溶液进行。碱敏感基团可能不太优选。
当保护基团是甲硅烷基基团(例如三乙基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基)时，脱保护步骤可以使用合适的酸(例如TFA)或使用合适的氟源(例如四丁基氟化铵、氟硅酸、HF)进行。
当保护基团是苄基基团或C(O)O苄基基团时，脱保护步骤可以使用H2和合适的催化剂(例如Pd/C)进行。这种保护基团可能不太优选。
当保护基团是4-甲氧基苄基、2,3-二甲氧基苄基、2,4-二甲氧基苄基或C(O)O-(4-甲氧基苄基)时，脱保护步骤可以使用合适的氧化剂(例如间氯过苯甲酸)进行。
当保护基团是-C(O)-O-烯丙基时，脱保护步骤可以使用(PPh3)4Pd进行。
当保护基团是-C(O)-O-CH2-芴基时，脱保护步骤可以使用哌啶进行。
脱保护步骤可以在有机溶剂或其混合物中进行。示例性有机溶剂包括但不限于卤化溶剂(例如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷)；醇(如甲醇、乙醇、异丙醇)和醚(如四氢呋喃、乙醚)。
当脱保护步骤在酸(例如TFA)的存在下进行时，有机溶剂优选是卤代溶剂，例如二氯甲烷。
脱保护反应可以在例如-10℃至约30℃，例如至约10℃的温度范围下进行。进行反应的合适温度为-5℃至5℃。可以将反应搅拌约15分钟至约16小时，优选约1小时至约4小时，更优选约2小时至约3小时。
当使用C1-C4-醇和/或水(例如异丙醇(IPA)和水的混合物)来实现步骤b)时，可以将反应混合物加热，例如，加热至30℃至90℃的温度或60℃至85℃的温度。
当脱保护在酸(例如TFA)的存在下进行时，脱保护后得到的产物的分离通常通过如下操作进行：淬灭在脱保护步骤中使用的过量酸，并用与水不混溶的有机溶剂萃取产物，并通过蒸发有机溶剂回收产物。
用于萃取的与水不混溶的有机溶剂的实例包括酯，如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯等；氯化溶剂，如二氯甲烷、氯仿等；芳烃溶剂，如甲苯、二甲苯等；优选乙酸乙酯。
在某些实施方案中，可能仍然需要纯化从本发明第一方面的方法获得的磷酰胺酯前药。同样，仍然需要纯化从本发明第四方面的方法获得的式IIa化合物。纯化方法是本领域技术人员熟知的，包括色谱法(例如柱色谱法)、重结晶和蒸馏。在其它实施方案中，不需要纯化。
应该理解，可以对本文公开的实施方案进行各种修改。因此，以上描述不应被解释为限制，而仅仅作为优选实施方案的示例。例如，作为执行本发明的最佳模式而实现的上述功能仅用于说明目的。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本领域技术人员可以实现其他安排和方法。此外，本领域技术人员将设想在所附说明书的范围和精神内的其他修改。
在整篇说明书中使用以下缩写：
ACN–乙腈 AIBBr–乙酰氧基异丁酰溴
BOC–碳酸叔丁酯 DCM–二氯甲烷
DMAP–N,N-二甲基-4-氨基吡啶 DMF–N,N-二甲基甲酰胺
eq.–摩尔当量 FUDR–5-氟-2'-脱氧尿苷
IPA–异丙醇 MEM–2-甲氧基乙氧基甲基
MOM–甲氧基甲基 MTBE–甲基叔丁基醚
NMP–N-甲基-2-吡咯烷酮 NP–1-萘基
PTSA–对甲苯磺酸 RT–室温
TBAF–四丁基氟化铵 TBDMS–叔丁基二甲基甲硅烷基
TEA–三乙胺 Tf–三氟甲基磺酸酯
TFA–三氟乙酸 THF–四氢呋喃
V用于表示单位重量(单位：g)的起始材料的体积(单位：mL)。因此，如果起始材料为1g，则10V表示10mL的指定液体。
实施例
本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例仅以说明的方式提供，不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：2-[(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸苄酯5(式IIb化合物的说明性实例)的非对映异构体混合物的制备
在25-35℃下，向搅拌的L-丙氨酸苄酯盐酸盐1(100g)在二氯甲烷(1L)中的混合物中加入二氯磷酸苯酯2(77mL)，并将所得混合物冷却至-70℃至-78℃，加入三乙胺(130.5mL)，并将混合物在相同温度下搅拌1小时。将反应物质温度升至25-35℃并搅拌2小时。反应完成后，将反应物质在低于35℃的温度下真空浓缩，得到残余物。在25-35℃下向所得残余物中加入二异丙醚(2L)，并在相同温度下搅拌30分钟。将反应物质过滤，用二异丙醚(500mL)洗涤，然后将滤液在低于35℃的温度下真空浓缩，得到苯基-(苄氧基-L-丙氨酰基)-氯磷酸酯3。在25-35℃下将得到的化合物溶解于二氯甲烷(1L)中并冷却至-5℃至-10℃。在相同温度下向反应物质中加入五氟苯酚4(85.5g)、三乙胺(65.2mL)并搅拌2小时。反应完成后，将反应物质在低于35℃的温度下真空浓缩，并在25-35℃下加入乙酸乙酯(1L)，并在相同温度下搅拌30分钟。将固体过滤并用乙酸乙酯(1L)洗涤。向滤液中加入水(1L)、10％碳酸钠(2×1L)、盐水(1L)洗涤液，将有机层用无水硫酸钠干燥，在35-45℃下真空浓缩，得到标题化合物5的非对映异构体混合物，为白色半固体。
产量：210g
通过HPLC测定手性纯度(％面积)：33.74：66.26％(RP：SP)
实施例2：2-[(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸苄酯5(式IIb化合物的说明性实例)的Sp-非对映异构体的分离
在25-35℃下，向化合物5的非对映异构体混合物(210g；RP：SP-33.74：66.26％)中加入20％乙酸乙酯的己烷溶液(1.2L)，并搅拌1小时。将固体过滤，用20％乙酸乙酯的己烷溶液(300mL)洗涤，得到化合物5的非对映异构体混合物。
产量：112克
通过HPLC测定手性纯度(％面积)：22.13：77.87％(RP：SP)
将滤液真空浓缩，得到化合物5的非对映异构体混合物(75g；RP：SP-65.43：34.57％)。
在25-35℃下，向式IIb化合物的非对映异构体混合物(112g；RP：SP-22.13：77.87％)中加入20％乙酸乙酯的己烷溶液(1.2升)，并搅拌1小时。将固体过滤，用20％乙酸乙酯的己烷溶液(300ml)洗涤，得到化合物5的基本上纯的Sp-非对映异构体。
产量：80g
通过HPLC测定手性纯度(％面积)：0.20：99.80％(RP：SP)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):7.18-7.41(m,10H),6.91-6.99(d,1H),5.10(s,2H),4.01-4.11(m,1H),1.30-1.32(d,3H)
ESI-MS(m/z):524(M+1)
将滤液真空浓缩，得到化合物5的非对映异构体混合物(28g；RP：SP-80.77：19.23％)。
实施例3：2-[(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸苄酯5S-异构体(式IIb化合物的说明性实例)的富集
/>
在25-35℃下，向搅拌的2-[(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸苄酯5(75g；RP：SP–65.43：34.57％)在20％乙酸乙酯的己烷溶液(1.1L)中的溶液中加入三乙胺(7.5mL)，并在相同温度下搅拌6小时。反应完成后，将反应物质在水(750mL)中淬灭，并用乙酸乙酯(750mL)萃取。将有机层用无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩，得到标题化合物，为固体。
产量：45g
通过HPLC测定手性纯度(％面积)：91.29：8.71％(SP：RP)
在25-30℃下，使上述得到的2-[(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸苄酯5的Rp和Sp-非对映异构体混合物(45g；RP：SP–8.71：91.29％)在20％乙酸乙酯的己烷溶液(1.1L)中浆化，并在相同温度下搅拌1小时。将固体过滤，用20％乙酸乙酯的己烷溶液(225ml)洗涤，得到标题化合物的Sp-非对映异构体，为固体。
产量：19g
通过HPLC测定手性纯度(％面积)：99.92：0.08％(SP：RP)
实施例4：2-[(4-硝基苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸苄酯7(式IIb化合物的说明性实例)的非对映异构体混合物的制备
在25-35℃下，向搅拌的L-丙氨酸苄酯盐酸盐1(50g)在二氯甲烷(500mL)中的混合物中加入二氯磷酸苯酯2(54g)，将所得混合物冷却至-70℃至-78℃，加入三乙胺(65.2mL)并在相同温度下搅拌1小时。将反应物质温度升至25-35℃并搅拌2小时。反应完成后，将反应物质在低于35℃的温度下真空浓缩，得到残余物。在25-35℃下向所得残余物中加入二异丙醚(1L)，并在相同温度下搅拌30分钟。将反应物质过滤，用二异丙醚(250mL)洗涤，然后在低于35℃的温度下真空浓缩滤液，得到苯基-(苄氧基-L-丙氨酰基)-氯磷酸酯3。在25-35℃下将得到的化合物溶解于二氯甲烷(500mL)中并冷却至-5℃至-10℃。在相同温度下向反应物质中加入4-硝基苯酚6(27.5g)、三乙胺(65.2mL)并搅拌2小时。反应完成后，将反应物质在低于35℃的温度下真空浓缩，并在25-35℃下加入乙酸乙酯(500mL)，并在相同温度下搅拌30分钟。将固体过滤，并用乙酸乙酯(500mL)洗涤。向滤液中加入水(500mL)、10％碳酸钠(2×500mL)、盐水(500mL)洗涤液，将有机层用无水硫酸钠干燥，在35-40℃下真空浓缩，得到标题化合物7的非对映异构体混合物，为稠油状液体。
产量：90g
通过HPLC测定手性纯度(％面积)：45.6：54.94％(RP：SP)
通过制备型HPLC将上述得到的2-[(4-硝基苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸苄酯7的非对映异构体混合物(40g；RP：SP-45.6：54.94％)分离成纯的Sp和Rp非对映异构体，并在真空下浓缩纯级分，分别得到Sp和Rp非对映异构体。
产量：Sp-非对映异构体：8g，
1H NMR(300MHz,CDCl3):8.15-8.19(d,2H),7.15-7.37(m,12H),5.12(s,2H),4.02-4.24(m,2H),1.39-1.42(d,3H)
ESI-MS(m/z):479(M+Na)
Rp-非对映异构体：6g，
1H NMR(300MHz,CDCl3):8.08-8.13(d,2H),7.15-7.34(m,12H),5.10(s,2H),4.48-4.56(m,1H),4.11-4.20(m,1H),1.39-1.41(d,3H)
ESI-MS(m/z):457(M+1)+
Sp和Rp-非对映异构体混合物：20g
实施例5—(Sp)-2-[(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸苄酯5(式IIb化合物的说明性实例)的制备
在30℃下，向搅拌的L-丙氨酸苄酯.HCl 1(100g)在1000mL二氯甲烷中的混合物中加入二氯磷酸苯酯2(97.8g)。将混合物冷却至-20℃，并缓慢加入三乙胺(93.8g)，保持温度在-20℃。将反应在-20℃下搅拌1小时，然后温热至10℃(10±5)，再搅拌1.5小时。
在10℃下缓慢加入五氟苯酚4(85.3g)在100mL二氯甲烷中的溶液，然后缓慢加入三甲胺(46.8g)，保持温度在10℃。在氮气氛下，在10℃(10±5)下，向反应物质中缓慢加入46.9g三乙胺。将混合物在10℃下搅拌2小时，然后通过缓慢加入0.5N HCl溶液淬灭，保持温度在10℃。升温至室温后，将混合物分离，将有机相用饱和碳酸氢盐溶液、蒸馏水和盐水洗涤，然后真空浓缩。
在25℃下，将粗混合物悬浮于1500mL的20％乙酸乙酯的正庚烷溶液中。在25℃下加入三乙胺(12.2g)并搅拌混合物。将混合物过滤，将固体溶解于2500mL乙酸乙酯中，将其用水和盐水洗涤，并真空浓缩。将固体悬浮于1200mL的20％乙酸乙酯的正庚烷溶液中，搅拌45-60分钟并过滤。将该物质在真空下干燥，得到所需产物5-(Sp)。收率在40至80％的范围内，并且非对映异构体纯度超过99％。
实施例6：2-[(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-萘-1-氧基-磷酰基氨基]丙酸苄酯12(式IIa化合物的说明性实例)的非对映异构体混合物的制备
在25℃下将α-萘酚8(100g)溶解于DCM(1L)中，并在25℃下加入POCl3 9(1.1当量)，并搅拌10分钟，然后将混合物冷却至-70℃并搅拌10分钟。缓慢加入三乙胺(1.1当量)，将温度保持为低于-70℃，并将混合物在-70℃下搅拌1小时。将混合物温热至25℃并搅拌1小时，然后冷却至-50℃。将L-丙氨酸苄基酯1(HCl盐；1当量)加入到混合物中，将混合物搅拌10分钟，然后在-50℃下在30分钟内加入三乙胺(2.2当量)的DCM(200mL)溶液。将混合物在-50℃下搅拌1小时，然后温热至25℃，并再搅拌1小时。将混合物冷却至-10℃并搅拌10分钟，然后在低于-10℃的温度下将五氟苯酚4的DCM(200mL)溶液缓慢加入到反应物质中。将混合物在-10℃下搅拌10分钟，然后在-10℃下在30分钟内加入三乙胺(1.1当量)。将混合物在-10℃下搅拌1小时，然后将混合物温热至0℃。加入水(1L)，并将混合物在0℃下搅拌30分钟。将混合物温热至25℃并搅拌5-10分钟，然后分离有机层。将水层用DCM(500mL)萃取。将合并的有机层用7％碳酸氢钠溶液(2×1L)洗涤，将有机层用无水硫酸钠干燥，然后真空浓缩。
向粗化合物中加入50％IPA/水(2.4L)，并在25℃下搅拌1小时。将固体化合物过滤，并将湿滤饼用50％IPA/水(500mL)洗涤，然后真空干燥。再次向粗化合物中加入50％IPA/水(2.4L)，并在25℃下搅拌1小时，然后过滤，并再次将湿滤饼用50％IPA/水(500mL)洗涤，然后真空干燥。在25-30℃下将半干燥的化合物用环己烷(10v/w)洗涤1小时，然后将固体化合物用环己烷(2L)洗涤，并在55-60℃下将湿化合物12真空干燥12小时。
结果：
化合物的重量 ：252g
总收率 ：66％
HPLC纯度 ：98.31％(非对映异构体比例为1：1)
31P NMR(202MHz,CDCl3):δP-1.35,-1.41；1H NMR(500MHz,CDCl3):δH8.13–8.10(1H,m,H-Ar),7.90–7.88(1H,m,H-Ar),7.73(1H,表观d,J＝8.5Hz,H-Ar),7.62–7.55(3H,m,H-Ar),7.45–7.41(1H,m,H-Ar),7.36–7.28(5H,m,H-Ar),5.01(1H,表观s,CH2Ph),5.12(1H,q,J＝12.5Hz,CH2Ph),4.38–4.31(1H,m,NHCHCH3),4.17–4.08(1H,m,NHCHCH3),1.49,1.47(3H,2 x d,J＝3.5Hz,NHCHCH3)；MS(ES+)m/z:574(M+Na+,100％),精确质量：C26H19F5NO5P理论551.40实测574.05(M+Na+)；反相HPLC，在35分钟内用20/80的H2O/MeOH洗脱，F＝1mL/min，λ＝254，两个非对映异构体有两个峰，tR＝12.96、14.48min。
化合物12的非对映异构体通过HPLC用Biotage Isolera使用C18 SNAP Ultra(30g)柱，以MeOH/H2O(70％/30％)的混合物作为洗脱剂进行分离，得到：快速洗脱异构体(被认为是Rp非对映异构体)和缓慢洗脱异构体(被认为是Sp非对映异构体)
注意：根据在C18(反相)柱和HPLC分析柱上的保留时间，将异构体命名为快速洗脱(FE)和缓慢洗脱(SE)。
快速洗脱异构体(被认为是Rp非对映异构体)：31P NMR(202MHz,CDCl3):δP–1.41；1HNMR(500MHz,CDCl3):δH 8.02(1H,dd,J＝7.0,2.0Hz,H-Ar),7.79(1H,dd,J＝6.5,3.0Hz,H-Ar),7.64(1H,d,J＝8.5Hz,H-Ar),7.53–7.45(3H,m,H-Ar),7.33(1H,t,J＝8.0Hz,H-Ar),7.28–7.23(5H,m,H-Ar),5.09(s,2H,CH2Ph),4.29–4.21(1H,m,NHCHCH3),4.02–3.97(1H,m,NHCHCH3),1.38(3H,d,J＝7.0Hz,NHCHCH3)；MS(ES+)m/z:MS(ES+)m/z:574(M+Na+,100％),精确质量：C26H19F5NO5P理论551.40实测574.05(M+Na+)；反相HPLC，在35分钟内用20/80的H2O/MeOH洗脱，F＝1mL/min，λ＝254，tR＝12.96。
缓慢洗脱异构体(被认为是Sp非对映异构体)：31P NMR(202MHz,CDCl3):δP–1.36；1HNMR(500MHz,CDCl3):δH 8.14–8.11(1H,m,H-Ar),7.90–7.87(1H,m,H-Ar),7.74(1H,d,J＝8.0Hz,H-Ar),7.60(1H,d,J＝8.0Hz,H-Ar),7.58–7.55(2H,m,H-Ar),7.44(1H,t,J＝8.0Hz,H-Ar),7.34–7.30(5H,m,H-Ar),5.12(2H,q,J＝12.5Hz,CH2Ph),4.35–4.29(1H,m,NHCHCH3),4.04–4.00(1H,m,NHCHCH3),1.48(3H,d,J＝7.0Hz,NHCHCH3)；MS(ES+)m/z:MS(ES+)m/z:574(M+Na+,100％),精确质量：C26H19F5NO5P理论551.40实测574.05(M+Na+)；反相HPLC，在35分钟内用20/80的H2O/MeOH洗脱，F＝1mL/min，λ＝254，tR＝14.48。
实施例7：2-[(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-萘-1-氧基-磷酰基氨基]丙酸苄酯12Sp异构体(式IIb化合物的说明性实例)的Sp-非对映异构体的富集
将化合物12的1：1非对映异构体混合物(25g)溶解于10％MTBE/正己烷(500mL)中，并在25℃下将三乙胺(2.5mL)加入到反应物质中。将混合物在30℃下搅拌80小时。将混合物过滤，并将湿滤饼用10％MTBE/正己烷(75mL)洗涤，然后真空干燥30分钟。向上述粗化合物中加入50％IPA/水(200mL)，并在25-35℃下搅拌1小时，然后过滤。将湿滤饼用50％IPA/水(100mL)洗涤，然后在55-60℃下真空干燥12小时。
结果：
化合物的重量：17g
收率：68％
HPLC纯度：97.66％
缓慢洗脱异构体(被认为是Sp-非对映异构体)：31P NMR(202MHz,CDCl3):δP–1.36；1H NMR(500MHz,CDCl3):δH 8.14–8.11(1H,m,H-Ar),7.90–7.87(1H,m,H-Ar),7.74(1H,d,J＝8.0Hz,H-Ar),7.60(1H,d,J＝8.0Hz,H-Ar),7.58–7.55(2H,m,H-Ar),7.44(1H,t,J＝8.0Hz,H-Ar),7.34–7.30(5H,m,H-Ar),5.12(2H,q,J＝12.5Hz,CH2Ph),4.35–4.29(1H,m,NHCHCH3),4.04–4.00(1H,m,NHCHCH3),1.48(3H,d,J＝7.0Hz,NHCHCH3)；MS(ES+)m/z:MS(ES+)m/z:574(M+Na+,100％),精确质量：C26H19F5NO5P理论551.40实测574.05(M+Na+)；反相HPLC，在35分钟内用20/80的H2O/MeOH洗脱，F＝1mL/min，λ＝254，tR＝14.48。
根据使用化合物12异构体制备的NUC-3373的31P化学位移、1H NMR光谱和HPLC保留时间与文献中已知的其他磷酰胺酯前药的这些特征的比较，已初步确定了上述两种化合物12异构体的立体化学(Rp与Sp)。如上所述，在本发明的方法中，磷酸酯立体中心的立体化学被颠倒，因此式12化合物的(Sp)-非对映异构体将形成NUC-3373的(Sp)-非对映异构体，并且同样地，式12化合物的(R)-非对映异构体将形成NUC-3373的(R)-非对映异构体。立体化学分配由对两种化合物12异构体进行的粉末X射线衍射和差示扫描量热支持，但这本身并不是确定的。
实施例8-NUC-3373的Sp和Rp异构体的形成
可以根据以下方案制备3’-BOC保护的FUDR 16。
然后可以将化合物16与式IIa化合物偶联。
将化合物16(1g)和化合物12的Sp异构体(1.2当量)溶解于THF(10mL)中，并将混合物冷却至0℃。在15分钟内将叔丁基氯化镁(2.5当量，2.0M的THF溶液)加入到混合物中。将混合物温热并在25℃下搅拌4小时。将混合物冷却至10℃，并加入饱和氯化铵溶液(10mL)。向混合物中加入乙酸乙酯(10mL)，并分离有机层。将水层用乙酸乙酯(5mL)萃取。将合并的有机层先后用去离子水(5mL)和20％氯化钠溶液(5mL)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，然后真空浓缩，得到2.16g化合物17(100％粗收率)。
将粗化合物17(1g)溶解于DCM(5mL)中，并冷却至10℃。向混合物中缓慢加入TFA(2mL)，保持温度低于20℃。将混合物加热至30℃，并搅拌6小时。将混合物冷却至10℃，并缓慢加入去离子水(5mL)，保持温度低于20℃。搅拌10分钟后，分离有机层，并用DCM(5mL)萃取水层。将合并的有机层用去离子水(2X 5mL)、7％碳酸氢钠溶液(2X 5mL)和20％氯化钠溶液(5mL)洗涤，然后用无水硫酸钠(1w/w)干燥并真空浓缩。使用硅胶(100-200目)在乙酸乙酯/DCM中用柱色谱法纯化粗化合物。在50％乙酸乙酯/DCM至100％乙酸乙酯中洗脱纯化合物。将合并的纯级分真空浓缩，然后将化合物浆液用环己烷(5mL)洗涤。
结果：
NUC-3373(Sp异构体)的重量：9.3g
总收率 ：70％
HPLC纯度 ：96.86％
1H-NMR(500MHz,MeOD):δH 8.16–8.14(m,1H,H-Ar),7.90–7.80(m,1H,H-Ar),7.72–7.70(m,2H,H-Ar),7.54–7.49(m,3H,H-Ar,H-6),7.43(表观t,1H,J＝8.0Hz,H-Ar),7.35–7.27(m,5H,H-Ar),6.16–6.13(m,1H,H-1’),5.11(AB系统,J＝12.0Hz,2H,OCH2Ph),4.35–4.33(m,2H,2 x H-5’),4.30–4.28(m,1H,H-3’),4.14–4.08(m,H,CHCH3),4.07–4.04(m,1H,H-4’),2.14–2.09(m,1H,H-2’),1.74–1.68(m,1H,H-2’),1.35(d,J＝7.0Hz,3H,CHCH3)；
13C-NMR(125MHz,MeOD):δC 174.92(d,3JC-P＝3.75Hz,C＝O,酯),159.37(d,2JC-F＝25.9Hz,C＝O,碱),150.54(d,4JC-F＝4.0Hz,C＝O,碱),147.99(d,2JC-P＝7.1Hz,C-Ar,萘),141.75(d,1JC-F＝232.1Hz,CF-碱),137.18,136.29(C-Ar),129.59,129.36,128.90,127.91(CH-Ar),127.83(d,3JC-P＝5.4Hz,C-Ar,萘),127.59,126.52,126.50,126.18(CH-Ar),125.54(d,2JC-F＝34.1Hz,CH-碱),122.64(CH-Ar),116.29(d,3JC-P＝2.75Hz,CH-Ar,萘),86.95(C-1’),86.67(d,3JC-P＝8.1Hz,C-4’),72.12(C-3’),68.05(OCH2Ph),67.85(d,2JC-P＝5.3Hz,C-5’),51.96(CHCH3),40.84(C-2’),20.52(d,3JC-P＝7.5Hz,CHCH3).
31P-NMR(202MHz,MeOD):δP 4.62；
19F NMR(470MHz,MeOD):δF-167.19；
(ES+)m/z：实测：(M+Na+)636.1520。C29H29N3O9FNaP理论：(M+),613.15。
反向HPLC(Varian Pursuit XRs 5 C18，150x4.6mm)，在35分钟内用(90/10至0/100的H2O/AcCN)洗脱，tR 16.61min。
NUC-3373的Rp异构体可以通过进行上述方法来获得，但以化合物12的Rp非对映异构体开始：
1H-NMR(500MHz,MeOD):δH 8.17–8.15(m,1H,H-Ar),7.91–7.88(m,1H,H-Ar),7.72–7.69(m,2H,H-Ar),7.56–7.52(m,2H,H-Ar,H-6),7.50–7.48(m,1H,H-Ar),7.39(表观t,J＝8.0Hz,1H,H-Ar),7.35–7.28(m,5H,H-Ar),6.16–6.09(m,1H,H-1’),5.13(s,2H,OCH2Ph),4.35–4.25(m,3H,2 x H-5’,H-3’),4.14–4.08(m,1H,CHCH3),4.05–4.03(m,1H,H-4’),2.15–2.10(m,1H,H-2’),1.74–1.68(m,1H,H-2’),1.36(d,J＝7.0Hz,3H,CHCH3)；
13C-NMR(125MHz,MeOD):δC 174.58(d,3JC-P＝5.0Hz,C＝O,酯),159.38(d,2JC-F＝26.3Hz,C＝O),150.48(C＝O碱),147.80(d,2JC-P＝6.5Hz,C-Ar,萘),141.67(d,1JC-F＝232.5Hz,CF-碱),137.15,136.26(C-Ar),129.62,129.40,129.36,128.96,127.89(CH-Ar),127.84(d,3JC-P＝5.5Hz,C-Ar,萘),127.59,126.57,126.55,126.21(CH-Ar),125.61(d,2JC-F＝34.0Hz,CH-碱),122.62(CH-Ar),116.55(d,3JC-P＝3.75Hz,CH-Ar,萘),86.97(C-1’),86.66(d,3JC-P＝7.5Hz,C-4’),72.01(C-3’),68.07(OCH2Ph),67.84(d,2JC-P＝5.0Hz,C-5’),51.83(CHCH3),40.89(C-2’),20.42(d,3JC-P＝7.5Hz,CHCH3).
31P-NMR(202MHz,MeOD):δP 4.27；
19F NMR(470MHz,MeOD):δF-167.27；
(ES+)m/z：实测：(M+Na+)636.1520。C29H29N3O9FNaP理论：(M+),613.15。
反向HPLC(Varian Pursuit XRs 5 C18，150x4.6mm)，在35分钟内用(90/10至0/100的H2O/MeOH)洗脱，tR 16.03min。
根据31P化学位移、1H NMR光谱和HPLC保留时间与文献中已知的其他磷酰胺酯前药的这些特征的比较，已初步确定了上述两种NUC-3373异构体的立体化学(Rp与Sp)。根据化合物12的异构体形成哪种NUC-3373的异构体，初步确定了化合物12的立体化学。
实施例9NUC-7738的Sp和Rp异构体的形成
可以根据以下方案制备2’-TBDMS保护的3’-脱氧腺苷21。
然后可以使用实施例8中描述的偶联方法条件将化合物21与式IIb化合物偶联。为了形成NUC-7738，可以使用TFA的THF溶液除去TBDMS基团。
/>
腺苷(18)至环氧化物19
将一当量的腺苷(18)溶解于10V乙腈中，并将混合物冷却至15℃。在15℃下缓慢加入3.0摩尔当量的乙酰氧基异丁酰溴。将混合物温热至室温并搅拌8小时。将反应用碳酸氢钠溶液淬灭，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用5％氯化钠溶液洗涤，并将有机层真空浓缩。
将产物溶解于15V甲醇中，并加入1重量当量的碳酸钾，然后搅拌2小时。将混合物真空浓缩，并将产物用水洗涤，然后在60℃下真空干燥，得到2′,3′-脱水腺苷，收率为70-85％。
将1当量的2`,3`-脱水腺苷和1.6当量的咪唑溶解于5V DMF中。将混合物冷却至15℃，并加入0.8当量的TBDMSC1。将混合物在30℃下搅拌1至2小时，然后再加入0.4当量的咪唑和0.4当量的TBDMSC1。将混合物在30℃下再搅拌1至2小时，然后加入水(5V)。将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层依次用7％碳酸氢钠溶液、水和5％氯化钠溶液洗涤，然后真空浓缩。将产物用庚烷洗涤，然后在50℃下真空干燥，得到环氧化物19，收率为75-90％。
环氧化物19至5′-甲硅烷基虫草素21
将一当量的环氧化物19溶解于DMSO(5V)和THF(5V)的混合物中。将混合物冷却至0℃，并用氮气吹扫混合物。在0(±5)℃下在1-2小时的时间内加入1M三乙基硼氢化锂(1当量)的THF溶液。将混合物在0℃下搅拌30分钟，温热至30℃并搅拌2小时，然后在5℃下缓慢加入甲醇(10V)。在5℃下逐滴加入10V 10％氢氧化钠，然后加入10V 10％过氧化氢溶液。将混合物用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层依次用10％焦亚硫酸钠溶液、反应器中的水、7％碳酸氢钠溶液和10％氯化钠溶液洗涤，然后真空浓缩。将产物用庚烷洗涤，然后在50℃下真空干燥，得到2’-甲硅烷基虫草素，收率为70-100％。
将2’-甲硅烷基虫草素、2.5当量的咪唑和0.15当量的DMAP溶解于5V DMF中。将混合物冷却至15℃，然后分批加入2.5当量的TBDMSC1。将反应在30℃下搅拌4小时，然后冷却至15℃。加入10V水，并将混合物用乙酸乙酯萃取。将有机层用7％碳酸氢钠溶液、水和5％氯化钠洗涤，然后真空浓缩。
将混合物溶解于8V中，并加入2V水，然后将混合物冷却至0℃。在0℃下在30℃-60分钟的时间内，将2.5当量的三氟乙酸加入到反应混合物中。将混合物温热至10℃，并在10℃下搅拌4至6小时。加入水，并将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用7％碳酸氢钠溶液、水(两次)和5％氯化钠溶液洗涤，然后真空浓缩。将产物用庚烷洗涤，并真空干燥，得到5’-甲硅烷基虫草素21，收率为40-70％。
5′-甲硅烷基虫草素21至Sp-NUC-7738
将5’-甲硅烷基虫草素21溶解于10V THF中，并冷却至0℃。加入2.0Mt-BuMgCl(2.5当量)，并将混合物搅拌15分钟。将化合物5的Sp异构体(2.5当量)溶解于5V THF中，并在0℃下加入到反应中。将混合物在0℃下搅拌15分钟，然后温热至25℃并再搅拌2小时。将反应淬灭至10％氯化铵溶液(10体积)中，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水和10％盐水溶液洗涤，然后真空浓缩。
将产物溶解于THF(10V)中，然后冷却至0℃。在30分钟的时间内将10VTFA和水(1：1)的混合物加入到反应中，然后将混合物搅拌45分钟，温热至30℃并再搅拌16小时。在0℃下将反应淬灭至7％NaHCO3溶液(90V)中，然后用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水、7％碳酸氢钠溶液和10％盐水溶液洗涤，然后真空浓缩。
产物通过柱色谱法通过使用硅胶(100-200目)纯化，柱子用2-10％MeOH的DCM溶液洗脱，得到Sp-NUC-7738，收率为40％。产物的HPLC纯度为99.50％，并且手性HPLC显示Sp异构体以99.90％存在且Rp异构体以0.10％存在。
可以执行相同的步骤以提供Rp-NUC-7738。
Rp-NUC-7738:
1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 8.26(s,1H,H8),8.22(s,1H,H2),7.37-7.25(m,7H,Ar),7.22-7.12(m,3H,Ar),6.01(d,J＝1.5Hz,1H,H1’),5.12(AB q,JAB＝12.0Hz,ΔδAB＝0.04,2H,CH2Ph),4.74-4.70(m,1H,H2’),4.69-4.62(m,1H,H4’),4.44-4.38(m,1H,H5’),4.28-4.21(m,1H,H5’),3.99-3.90(m,1H,CHCH3 L-Ala),2.35-2.27(m,1H,H3’),2.09-2.02(m,1H,H3’),1.29(d,J＝7.0Hz,3H,CHCH3L-Ala).
31P NMR(202MHz,CD3OD)δP 3.91.
MS(ES+)m/z实测569.2[M+H+],591.2[M+Na+],1159.4[2M+Na+]C26H29N6O7P理论m/z568.2[M]。
HPLC反相HPLC(Varian Pursuit XRs 5 C18，150x4.6mm)，在30分钟内用H2O/CH3CN从90/10到0/100洗脱，F：1mL/min，λ＝200nm，显示一个峰tR 14.02min。
Sp-NUC-7738:
1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 8.24(s,1H,H8),8.22(s,1H,H2),7.36-7.26(m,7H,Ar),7.22-7.13(m,3H,Ar),6.01(d,J＝1.5Hz,1H,H1’),5.08(AB q,JAB＝12.0Hz,ΔδAB＝0.01,2H,CH2Ph),4.70-4.67(m,1H,H2’),4.66-4.60(m,1H,H4’),4.41-4.35(m,1H,H5’),4.26-4.19(m,1H,H5’),4.02-3.94(m,1H,CHCH3 L-Ala),2.36-2.27(m,1H,H3’),2.08-2.01(m,1H,H3’),1.34-1.30(m,3H,CHCH3 L-Ala).
31P NMR(202MHz,CD3OD)δP 3.73.MS(ES+)m/z实测569.2[M+H+],591.2[M+Na+],1159.4[2M+Na+]C26H29N6O7P理论m/z 568.2[M]。
HPLC反相HPLC(Varian Pursuit XRs 5 C18，150x4.6mm)，在30分钟内用H2O/CH3CN从90/10到0/100洗脱，F：1mL/min，λ＝200nm，显示一个峰tR 14.26min。
已通过常规X射线晶体学分析证实了上述两种NUC-7738异构体的立体化学(Rp与Sp)。
实施例10-NUC-9701的形成
可以根据以下方案(也在WO2017/207989中描述)制备8-氯-腺苷24的二甲基缩醛25。
然后可以使用实施例8中描述的偶联方法条件将化合物25与式IIa化合物偶联。为了形成NUC-9701，可以在0℃下使用1：1的TFA：水5小时除去二甲基缩醛。
将化合物25(30g；1当量)和所需的化合物12的异构体(58.08g；1.2当量)溶解于300ml(10V)的THF中。将混合物冷却至0℃，然后缓慢加入叔丁基氯化镁(76.8ml的2.0M的THF溶液；1.75当量)，将温度保持在0℃，并将混合物搅拌4小时。向反应混合物中加入300mL(10V)的10％氯化铵溶液，保持温度低于15℃。将混合物用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用7％碳酸氢钠溶液(两次)、水(两次)和20％氯化钠洗涤，然后用无水硫酸钠干燥并过滤。真空除去乙酸乙酯。
向所得产物中加入600ml(20V)的60％甲酸的水溶液，并在25℃下将反应搅拌65-70小时，然后缓慢加入乙酸乙酯(600mL；20V)。加入600ml(20V)的20％氯化钠溶液，并分离各层。将水层用乙酸乙酯萃取，然后将600ml(20V)10％氨溶液滴加到合并的有机层中，并分离各层。将有机层用水(3次)和20％氯化钠溶液洗涤，用30g(1w/w)的无水硫酸钠干燥，过滤，然后真空浓缩。粗产物通过柱色谱法纯化，得到20-45g NUC-9701。
Sp-NUC-9701:
1H-NMR(500MHz；MeOD-d4):δH 8.07(1H,d J＝8.5Hz,H-萘),8.05(1H,s,2-H),7.87(1H,d J＝8.5Hz,H-萘),7.67(1H,d J＝8.5Hz,H-萘)7.54-7.48(2H,m,H-萘),7.41-7.30(1H,m,H-萘),7.36-7.33(1H,m,H-萘),7.26-7.22(5H,m,-CH2Ph),6.03(1H,d J＝5.0Hz,H-1’),5.33(1H,t J＝5.0Hz,H-2’),5.01,4.98(AB,JAB＝12.3Hz,CH2Ph),4.65(1H t J＝5.5Hz,H-3’),4.49-4.45(1H,m,Ha-5’),4.41-4.36(1H,m,Hb-5’),4.22-4.20(1H,m,H-4’),3.94-3.90(1H,m,-CHCH3),1.17(1H,d J＝7.0Hz,CH3).
31P NMR(202MHz,MeOD-d4):δP 3.93(1P,s).
反相HPLC，在30min内用90/10至0/100的H2O/CH3CN洗脱，1mL/min，λ＝254nm，在tR＝16.43min显示一个峰
Rp-NUC-9701:
1H-NMR(500MHz；MeOD-d4):δH 8.10(1H,s,H-2),8.08(1H,d J＝8.5Hz,H-萘),7.87(1H,d J＝8.5Hz,H-萘),7.67(1H,d J＝8.5Hz,H-萘),7.53-7.50(1H,m,H-萘),7.48-7.44(1H,m,H-萘),7.40-7.38(1H,m,H-萘),7.33-7.27(6H,m,H-萘和-CH2Ph),6.02(1H,d J＝5.0Hz,H-1’),5.28(1H,t J＝5.0Hz,H-2’),5.04,5.02(AB,JAB＝12.2Hz,CH2Ph),4.63(1H tJ＝5.5Hz,H-3’),4.48-4.46(1H,m,Ha-5’),4.38-4.35(1H,m,Hb-5’),4.23-4.20(1H,m,H-4’),4.05-4.01(1H,m,-CHCH3),1.17(1H,d J＝7.0Hz,CH3).
31P NMR(202MHz,MeOD-d4):δP 3.83(1P,s).
反相HPLC，在30min内用90/10至0/100的H2O/CH3CN洗脱，1mL/min，λ＝254nm，在tR＝16.59min显示一个峰
根据31P化学位移、1H NMR光谱和HPLC保留时间与文献中已知的其他磷酰胺酯前药的这些特征进行比较，已初步确定了上述两种NUC-9701异构体的立体化学(Rp与Sp)。

Claims (17)

1.基本上非对映异构体纯形式的NUC-7738的制备方法：
所述方法包括步骤a)和当P2、P3和P4的任何一个或多个为保护基因时的步骤b)：
a)在碱(B1)的存在下，使式IIb化合物与式IIIb化合物反应，以提供基本上非对映异构体纯形式的式IVb化合物；其中R1代表吸电子基团，并且a是1至5的整数；其中P2、P3和P4各自独立地选自氢和保护基团；并且其中式IIb化合物是基本上非对映异构体纯形式：
b)从式IVb化合物除去保护基团P2、P3和P4，以提供基本上非对映异构体纯形式的NUC-7738。
2.根据权利要求1所述的方法，其中P2是叔丁基二甲基甲硅烷基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中P3和P4各自是H。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中B1是格氏试剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中B1是tBuMgCl。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤a)在醚溶剂中进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤a)在THF中进行。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中式IIb化合物是基本上非对映异构体纯形式，并且所述方法是制备基本上非对映异构体纯形式的NUC-7738的(Sp)-非对映异构体的方法。
9.根据权利要求8所述的方法；所述方法包括：
c)将式IIb化合物的R-非对映异构体或式IIb化合物的(Rp)-非对映异构体和(Sp)-非对映异构体的混合物悬浮或溶解于溶剂(S2)中，
d)用碱(B2)处理溶液或悬浮液，以得到基本上非对映异构体富集形式的(Sp)-非对映异构体，以及
e)分离式IIb的(Sp)-非对映异构体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中B2是叔胺。
11.根据权利要求10所述的方法，其中B2是三乙胺。
12.根据权利要求9所述的方法，其中S2是烃或包含烃的混合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中S2是己烷或庚烷与极性有机溶剂的混合物，所述混合物包含超过50体积％的己烷或庚烷。
14.根据权利要求13所述的方法，其中S2是庚烷或己烷与乙酸乙酯的混合物，所述混合物包含超过50体积％的庚烷或己烷。
15.根据权利要求9项所述的方法，其中步骤d)包括将式IIb化合物和碱B2的混合物搅拌6小时或更长时间。
16.根据权利要求9所述的方法，其中步骤d)包括在0至50℃的温度下搅拌式IIb化合物和碱B2的混合物。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述式IIb化合物是：
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