CN117430649B - 根皮苷衍生物及其制备方法和在变叶海棠质量标志物中的应用 - Google Patents

根皮苷衍生物及其制备方法和在变叶海棠质量标志物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及根皮苷衍生物及其制备方法和在变叶海棠质量标志物中的应用，属于药材质量检测领域。本发明将发现的根皮苷衍生物用于控制变叶海棠的质量，能分辨不同生长期的药材，使得变叶海棠的质量更可控，且容易分离纯化根皮苷衍生物等质量标志物。本发明还提供了一种新的根皮苷衍生物的制备方法，以及一种变叶海棠药材的质量检测方法和鉴别变叶海棠药材的生长期的方法，为变叶海棠的质量标准提供了新的选择。

Description

根皮苷衍生物及其制备方法和在变叶海棠质量标志物中的 应用
技术领域
本发明涉及根皮苷衍生物及其制备方法和在变叶海棠质量标志物中的应用，属于药材质量检测领域。
背景技术
蔷薇科植物变叶海棠Malus toringoides (Rehd)Hughes.的干燥叶及叶芽作为藏族习用药材“俄色”被收载于《四川省藏药材标准2014年版》，是仅生长于海拔2500m至3500m雪域高原地区的独特树种。经考证在民间有用其叶制作饮品使用的习惯，藏医传统用法为：取“俄色”适量，和酥油同煮口服，因其味酸，性温，具有消解培根的功效，因此具有缓解“京尼萨库”症状和降低人体脂肪的功效，用于降血糖、降血脂、治疗消化不良、高血压等。
目前对于变叶海棠质量标准研究较少，主要是以其中的根皮素、根皮苷作为质量标志物，如夏冬梅，藏药“俄色叶”的质量标准研究，成都中医药大学，硕士论文，2014年，变叶海棠和花叶海棠均以高剂量(2g/kg)最佳,而根皮素以中剂量(10mg/kg)最佳,根皮苷以低剂量(5mg/kg)最佳。根据药材的有效剂量,确定俄色叶的每日给药量为3.3-13.2g,这与本草中记载基本相符,根皮素和根皮苷为俄色叶的有效成分。 申请号：CN201910351532.2，发明名称：俄色果中枸杞酸的提取方法和检测方法 ，公开了一种俄色果提取物，俄色果中枸杞酸的制备方法和检测方法。实验结果证明，该发明成功从俄色果中分离出了枸杞酸，其在俄色果中属于首次发现，因此，枸杞酸可用于俄色果的鉴别和质量控制。申请号:CN202310223755.7 ，发明名称：一种俄色果配方颗粒的薄层色谱检测方法，公开了一种俄色果配方颗粒的薄层色谱检测方法，它包括如下步骤：a、供试品溶液的制备；b、对照品溶液的制备；c、薄层层析测定：取供试品溶液和对照品溶液，分别点于同一硅胶G板上，用乙酸丁酯：甲酸：水展开，干燥后用溴甲酚绿溶液浸板，加热至斑点清晰，冷却，再置于碘蒸气中熏至斑点显色清晰，检视。该发明通过特定的薄层色谱条件，使俄色果配方颗粒中的特征成分L-苹果酸被有效分离，专属性很好，检测限较低。
由于变叶海棠叶及叶芽可长年采摘，研究发现药材质量不稳定。目前的检测指标还不能满足质量控制的需求。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种新的根皮苷衍生物，本发明还提供了利用该根皮苷衍生物用于控制变叶海棠的质量的方法。
本发明提供了一种根皮苷衍生物，具有式（1）或式（3）结构式：
式（1）：、
式（3）：。
本发明还提供了所述的根皮苷衍生物在用于蔷薇科植物变叶海棠Malustoringoides (Rehd)Hughes.的干燥叶的质量标志物中的应用。
本发明还提供了一种所述的根皮苷衍生物的提取分离方法，它是以蔷薇科植物变叶海棠Malus toringoides (Rehd)Hughes.的干燥叶为原料，经提取、分离、纯化制备而成。
它包括如下步骤：
a 、取蔷薇科植物变叶海棠Malus toringoides (Rehd)Hughes.的干燥叶，粉碎成粗粉；
b、加入90%甲醇浸提2次，每次24h，合并提取液，50℃减压浓缩，加水稀释1倍，用等体积的乙酸乙酯萃取三次；
c、合并乙酸乙酯相50℃浓缩至小体积，加60-80目硅胶拌样，50℃恒温鼓风干燥后硅胶柱层析分离；
d、经二氯甲烷-甲醇（30：1-1：1）梯度洗脱，在薄层色谱参考下合并洗脱液，其中二氯甲烷：甲醇（10:1～5：1）段经高压液相反复制备得到化合物1、化合物3。
其中，a步骤所述的干燥叶来源于产地四川省甘孜州炉霍县，9月份采集。
本发明还提供了一种变叶海棠药材的质量检测方法，它是采用LC-MS方法检测变叶海棠药材中的化合物，化合物包括所述的根皮苷衍生物、化合物2，化合物2的结构如式（2）所示：
。
具体地，所述的LC-MS的色谱条件为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 2.1×100mm×1.8um （LC-147）；流动相：A-乙腈、B-0.1%甲酸溶液；洗脱条件为：
时间（min） 0 10 16 22 28 30 32 36 36.5 40
A% 15 22 22 30 30 34 90 90 22 22
流速：0.3mL/min，波长：286nm，柱温：35℃，进样量：0.2μL，离子源：ESI，喷雾电压：4 kV，鞘气温度：350 ℃，鞘气流速：11L/min，干燥气流速：8L/min，干燥气温度：300℃，扫描模式：全扫描，扫描范围：m/z 100 ～1500，碰撞电压：100V，碰撞能量梯度：10，20，40 eV。
本发明还提供了一种鉴别变叶海棠药材的生长期的方法，它包括如下步骤：
a、采用所述质量检测方法检测待检药材；
b、检测结果分析：
若UPLC含有2个特征峰，为9月份采集的药材；所述的2个特征峰的相对保留时间为：所述的2个特征峰的相对保留时间分别为：26.6min、28min，相对保留时间在±10%范围内波动。
本发明将发现的根皮苷衍生物用于控制变叶海棠的质量，能分辨不同生长期的药材，使得变叶海棠的质量更可控，且容易分离纯化根皮苷衍生物等质量标志物，本发明还提供了一种新的根皮苷衍生物的制备方法，为变叶海棠的质量标准提供了新的选择。
附图说明
图1 3批样品总离子流图；
图2 样品286nm紫外色谱图；
图3 提取分离纯流程图；
图4化合物1质谱图（正模式）；
图5化合物1质谱图（负模式）；
图6化合物1氢谱图（1H-NMR(400M Hz，DMSO-d6)）；
图7化合物1碳谱图（13C-NMR(100M Hz，DMSO-d6)）；
图8化合物2质谱图（正模式）；
图9化合物2质谱图（负模式）；
图10化合物2氢谱图（1H-NMR(400M Hz，DMSO-d6)）；
图11化合物2碳谱图（13C-NMR(100M Hz，DMSO-d6)）；
图12化合物3质谱图（正模式）；
图13化合物3质谱图（负模式）；
图14化合物3氢谱图（1H-NMR(400M Hz，DMSO-d6)）；
图15化合物3碳谱图（13C-NMR(100M Hz，DMSO-d6)）。
实施方式
实施例1 本发明根皮苷衍生物的分离方法
采集了生长期为5月份及9月份的变叶海棠叶片各三批，通过UPLC分析发现9月份采集的叶片中含有2个特征峰。对此进行分离鉴定，鉴定出3个化合物，分别为 6''-O-（4-羟基反式肉桂酰）根皮苷（1）、6''-O-阿魏酰根皮苷（2）、6''-O-（4-羟基顺式肉桂酰）根皮苷（3），其中化合物1、3为新化合物，化合物2为该属植物中首次发现。上述3个化合物可用于不同生长期的俄色药材鉴别。
不同生长周期叶片LC-MS分析
1.1样品处理
取变叶海棠药材置于具塞锥形瓶中，精密加入40%乙醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷至室温，称定重量，以40%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。
1.2色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 2.1×100mm×1.8um （LC-147）
流动相：A-乙腈 B-0.1%甲酸溶液
时间（min） 0 10 16 22 28 30 32 36 36.5 40
A% 15 22 22 30 30 34 90 90 22 22
流速：0.3mL/min、波长：286nm、柱温：35℃、进样量：0.2μL、离子源：ESI、喷雾电压：4 kV、鞘气温度：350 ℃、鞘气流速：11L/min、干燥气流速：8L/min、干燥气温度：300℃、扫描模式：全扫描、扫描范围：m/z 100 ～1 500、碰撞电压：100V、碰撞能量梯度：10，20，40 eV。
1.3数据处理
将采集得到的原始数据导入Qualitative Analysis 10.0软件，通过其向导设置及方法模板，建立未知化合物鉴定流程，对原始数据进行峰提取。将3个样品峰面积百分比1%以上的共有峰、以及各自的特有峰进行提取，共提取到11个目标峰。将这11个峰通过提取得到的分子离子色谱峰、同位素峰拟合出可能的分子式，以及二级碎片检测图与PCDL一级、二级数据库进行匹配，过滤质量偏差低于5ppm的结果后，再与数据库中的化合物信息比对，进行化合物的分析鉴定。
同时，通过安捷伦在线数据库Molecular Structure Correlator进行匹配获得最终结果。
1.4结果：
如图1，图2所示，峰11、12只在9月份采集的变叶海棠叶片样品中可见。后续对此二峰对应的化合物进行分离鉴定。
2.特征化合物的分离及鉴定
2.1提取分离
取俄色叶药材30kg粉碎成粗粉，用90%甲醇浸提2次，每次24h，合并提取液，50℃减压浓缩至约40L，加水稀释1倍，用等体积的乙酸乙酯萃取三次。合并乙酸乙酯相50℃浓缩至小体积，加60-80目硅胶拌样，50℃恒温鼓风干燥后硅胶柱层析分离。经二氯甲烷-甲醇（30：1-1：1）梯度洗脱，在薄层色谱参考下合并洗脱液，其中二氯甲烷：甲醇（10:1～5：1）段经高压液相反复制备得到化合物1、化合物2、化合物3。流程图见图3。
2.2鉴定
化合物1：
类白色固体，HRESI-MS m/z 581.1681[M-H]- ，583.1818[M+H]+ （计算值：C30H30O12, 582.17）。通过1H NMR、13C NMR与文献鉴定化合物6"-O-feruloylphlorizin的结构相似，仅阿魏酸苯环上信号存在差异，根据质谱和核磁数据分析，6"位的基团为4-羟基反式肉桂酰基，1H NMR和13C NMR数据归属情况见表1与表2。结构如图4-图7所示，此结构通过文献调研及SCIFinder数据库查找，未找到与其结构相同的化合物，命名为: 6''-O-（4-羟基反式肉桂酰）根皮苷。
表1 1H-NMR：
表213C-NMR
化合物2：
类白色固体，HRESI-MS m/z 613.1883[M+H]+（计算值：C31H32O13, 612.18）。通过1HNMR、13C NMR与文献（Wei Wen-Wen, Wu Ping, You Xiao-Yin et al; Dihydrochalconesfrom the leaves of Lithocarpus litseifolius [J]. Journal of Asian NaturalProducts Research, 2020, 1—6）鉴定化合物6"-O-feruloylphlorizin的结构一致，1HNMR和13C NMR数据归属情况见表3与4。结构如图8-图11所示，命名为: 6''-O-阿魏酰根皮苷。
表31H-NMR
表413C-NMR：
化合物3:
类白色固体，HRESI-MS m/z 581.1685[M-H]- ，583.1820[M+H]+ （计算值：C30H30O12, 582.17）。本化合物与6''-O-（4-羟基反式肉桂酰）根皮苷的质谱信息一致，碳谱差异为4-羟基肉桂酰基信号差异，根据双键顺反式耦合常数区别，确认6''位所连接基团为4-羟基顺式肉桂酰基，1H NMR、13C NMR数据归属情况见表5与6，结构如图12-图15所示。此结构通过文献调研及SCIFinder数据库查找，未找到与其结构相同的化合物，命名为: 6''-O-（4-羟基顺式肉桂酰）根皮苷。
表51H-NMR：
表613C-NMR：
本发明将发现的根皮苷衍生物用于控制变叶海棠的质量，能分辨不同生长期的药材，使得变叶海棠的质量更可控，且容易分离纯化根皮苷衍生物等质量标志物，为提升变叶海棠的质量标准提供了新的选择。

Claims (5)

1.根皮苷衍生物，其特征在于：具有式（1）或式（3）结构式：
式（1）:、式（3）：。
2.权利要求1所述的根皮苷衍生物在用于蔷薇科植物变叶海棠Malus toringoidesRehd Hughes.的干燥叶的质量标志物中的应用。
3.一种变叶海棠药材的质量检测方法，其特征在于：它是采用LC-MS方法检测变叶海棠药材中的化合物，化合物包括权利要求1所述的根皮苷衍生物、化合物2，化合物2的结构如式（2）所示：。
4.根据权利要求3所述的变叶海棠药材的质量检测方法，其特征在于：所述的LC-MS的色谱条件为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 2.1×100mm×1.8um LC-147 ；
洗脱条件：流动相：A-乙腈，B-0.1%甲酸溶液；梯度洗脱：0-10min流动相A从15%增加至22%；保持6min；16-22min流动相A增加到30%，保持6min；28-30min流动相A增加到34%；30-32min，流动相A增加到90%，保持4min；36-36.5min流动相A降低到22%，保持3.6min；流速：0.3mL/min，波长：286nm，柱温：35℃，进样量：0.2μL，离子源：ESI，喷雾电压：4 kV，鞘气温度：350 ℃，鞘气流速：11L/min，干燥气流速：8L/min，干燥气温度：300℃，扫描模式：全扫描，扫描范围：m/z 100 ～1500，碰撞电压：100V，碰撞能量梯度：10，20，40 eV。
5.一种鉴别变叶海棠药材的生长期的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、采用权利要求3或4所述质量检测方法检测待检药材；
b、检测结果分析：
若UPLC含有2个特征峰，为9月份采集的药材；所述的2个特征峰的相对保留时间分别为：26.6min、28min，相对保留时间在±10%范围内波动。
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