CN112341420B - 一种二氢黄酮类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新二氢黄酮类化合物及其提取方法和用途。该化合物的提取方法如下：采用乙醇水溶液提取，浓缩后得浸膏，再用乙酸乙酯萃取后得到萃取膏，萃取膏经过一次正相柱层析分离、一次反相柱层析分离得粗品，粗品再经一次凝胶柱层析纯化得到所述的新二氢黄酮类化合物。药理研究表明，该化合物能有效拮抗哮喘，适合于制备用于预防和治疗哮喘的新药物，具有广阔的应用前景和巨大的潜在价值。

Description

一种二氢黄酮类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药化学技术领域，具体涉及一种二氢黄酮类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
铜钱麻黄为豆科（Leguminosae）宿苞豆属（Shuteria）植物中国宿苞豆S. sinensisHemsl的干燥根，别名宿苞豆、野豌豆、铜钱根，主要分布于云南中部和南部海拔500-2300m的干热河谷。傣药名为“托叶努滕”，傣医理论认为该药味苦、性凉，入土塔，具有清火解毒，祛风止痛的功效，临床治疗“兵哇皇，唉乎火接”（风热感冒，咳嗽咽痛）。该药除做傣药使用外，其他多个少数民族也有药用历史，如彝药名为“野梭努”，彝医认为其能清热解毒，主治感冒、支气管炎、扁桃体炎、急性咽炎等；佤药名为“铜钱根”，佤族草医用其配方使用，治疗气管炎。
铜钱麻黄主要药效成分尚不清晰，并且未见其作用于哮喘的文献报道，相关研究工作亟待加强。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种二氢黄酮类化合物；第二目的在于提供所述的二氢黄酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述的二氢黄酮类化合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的二氢黄酮类化合物是从铜钱麻黄ShuteriasinensisHemsl中分离得到的，命名为3’,4’,7-三羟基-2’-异戊烯基二氢黄酮，分子式为：C20H20O5，其结构式如下：
。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
（1）使用乙醇水溶液对铜钱麻黄药材进行热回流提取，提取液浓缩后得到浸膏；
（2）将步骤（1）得到的浸膏用水稀释后，先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取后的溶液得到萃取浸膏；
（3）将步骤（2）得到的萃取浸膏采用正相硅胶柱进行第一次柱层析分离，洗脱剂为三氯甲烷和丙酮不同比例的混合溶剂，收集富含所述化合物的洗脱液，浓缩后得到含所述化合物的混合物；
（4）将步骤（3）得到的混合物采用反相柱进行第二次层析分离，洗脱剂为甲醇和水不同比例的混合溶剂，收集富含所述化合物的洗脱液，浓缩后得到含所述化合物的粗产物；
（5）将步骤（4）得到的粗产物采用凝胶柱进行纯化，洗脱液为纯甲醇，收集洗脱液得到所述新二氢黄酮类化合物。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的二氢黄酮类化合物在制备治疗哮喘药物中的应用。
本发明的优点：
（1）本发明提供的所述化合物的新用途，即用于哮喘的防治，为哮喘患者带来新的药物选择。
（2）药效实验结果显示，所述化合物能够明显改善卵清蛋白致敏小鼠肺组织的病理变化，抑制血清和肺泡灌洗液中多种炎性因子的生成，说明本发明的所述化合物可用于制备预防或治疗嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘药物。
（3）药效实验结果显示，所述化合物能够明显改善高脂饲料+屋尘螨致敏小鼠肺组织的病理变化，抑制血清和肺泡灌洗液中多种炎性因子的生成，说明本发明的所述化合物可用于制备预防或治疗中性粒细胞浸润为主的哮喘药物。
本发明在研究铜钱麻黄黄酮类成分的过程中，分离并鉴定了一个新的二氢黄酮类化合物，经药效研究表明该化合物具有显著的治疗哮喘的用途。
附图说明
图1为本发明化合物a的化学结构式；
图2为本发明化合物a的制备流程；
图3为本发明化合物a的高分辨质谱；
图4为本发明化合物a的紫外光谱；
图5为本发明化合物a的红外光谱；
图6为本发明化合物a的1H-NMR谱；
图7为本发明化合物a的13C-NMR谱；
图8为本发明化合物a的H-H COSY；
图9为本发明化合物a的HSQC；
图10为本发明化合物a的HMBC；
图11为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺组织病理学影响（HE染色）；
图12为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺组织病理学影响（PAS染色）；
图13为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠血清中总IgE水平的影响；
图14为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠血清中OVA-特异性IgE水平的影响；
图15为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中Eotaxin水平的影响；
图16为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-33水平的影响；
图17为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-25水平的影响；
图18为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中TSLP水平的影响；
图19为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-4水平的影响；
图20为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-5水平的影响；
图21为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-13水平的影响；
图22为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-2水平的影响；
图23为化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-9水平的影响；
图24为化合物a对中性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺组织病理学影响（HE染色）；
图25为化合物a对中性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺组织病理学影响（PAS染色）；
图26为化合物a对中性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-1β水平的影响；
图27为化合物a对中性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-17A水平的影响；
图28为化合物a对中性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-22水平的影响；
图29为化合物a对中性粒细胞浸润为主的哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-8水平的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的二氢黄酮类化合物是从铜钱麻黄ShuteriasinensisHemsl中分离得到的，命名为3’,4’,7-三羟基-2’-异戊烯基二氢黄酮，分子式为：C20H20O5，其结构式如下：
。
本发明所述的二氢黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）使用乙醇水溶液对铜钱麻黄药材进行热回流提取，提取液浓缩后得到浸膏；
（2）将步骤（1）得到的浸膏用水稀释后，先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取后的溶液得到萃取浸膏；
（3）将步骤（2）得到的萃取浸膏采用正相硅胶柱进行第一次柱层析分离，洗脱剂为三氯甲烷和丙酮不同比例的混合溶剂，收集富含所述化合物的洗脱液，浓缩后得到含所述化合物的混合物；
（4）将步骤（3）得到的混合物采用反相柱进行第二次层析分离，洗脱剂为甲醇和水不同比例的混合溶剂，收集富含所述化合物的洗脱液，浓缩后得到含所述化合物的粗产物；
（5）将步骤（4）得到的粗产物采用凝胶柱进行纯化，洗脱液为纯甲醇，收集洗脱液得到所述新二氢黄酮类化合物。
步骤（1）中，所用的乙醇水溶液中乙醇浓度为70~75%，提取2~3次，每次2~3小时。
步骤（3）中，所用的三氯甲烷和丙酮的体积比为10:1-1:1。
步骤（4）中，所用的反相柱为MCI，流动相中水和甲醇的体积比为100:0-0:100。
步骤（5）中，所用的凝胶柱为Sephadex LH-20。
本发明所述的二氢黄酮类化合物的应用为所述的二氢黄酮类化合物在制备治疗哮喘药物中的应用。
所述的哮喘为过敏性哮喘、非变应性哮喘、成年型哮喘、气道持续性狭窄哮喘或肥胖性哮喘。
所述的二氢黄酮类化合物的有效剂量为200~800mg/d。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
化合物a的制备
干燥的铜钱麻黄根（5 kg），粉碎后以10 L 70%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，提取液减压浓缩至无醇味，得乙醇浸膏（1.8 kg）。浸膏用1 L水分散后，以1 L石油醚萃取脱脂1次，再用乙酸乙酯萃取3次，每次2 L，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收得乙酸乙酯浸膏（0.9kg）。
乙酸乙酯浸膏经硅胶柱色谱（三氯甲烷-丙酮系统）梯度洗脱（40:1-2:1），所得各馏分以薄层色谱检识，合并含有化合物a的部分（14 g），经MCI柱色谱层析，甲醇-水（30：70-100：0）梯度洗脱，各馏分以薄层色谱检识，合并只含有化合物a的部分，得化合物a粗品（8.1g），经Sephadex LH-20（甲醇）纯化得化合物a纯品（2.2 g）。
结构鉴定：利用光谱，包括质谱、紫外、红外、核磁共振谱（1H-NMR，13C-NMR，2D-NMR）鉴定其结构。
化合物a为白色无定型粉末，由质谱（见图3）可知分子量为340。
紫外光谱（见图4）中的吸收峰205，276和310 nm，表明该化合物为黄酮。
红外光谱（见图5）显示羰基吸收峰（1668 cm-1），芳环共振峰（1583，1504，1460 cm-1），双键吸收峰（1610 cm-1）。
13C-NMR谱（见图7）显示有20个碳信号，其中δ194.1（C）为黄酮C-4的特征信号，同时，δ78.4（CH）和δ44.6（CH2），以及1H-NMR谱（见图6）中δ 5.51（1H，d，J= 13.6 Hz）、3.05（1H，t，J= 13.6，16.8 Hz）和2.61（1H，d，J = 16.8 Hz），可以判断该成分为二氢黄酮类化合物。
通过偶合常数的计算和H-HCOSY谱（见图8）的观察，可知该二氢黄酮两个苯环上的取代类型为一个AB系统，一个ABX系统，H δ 7.75和H δ 6.52偶合，H δ 6.91和H δ 6.83偶合，取代基均为羟基，此外，位于高场区的H δ 3.47和H δ 5.11偶合，并且H δ 5.11为一个宽单峰，同时，通过不饱和度数据，推测结构中有一个异戊烯基存在。通过HSQC谱（见图9）可知，在芳香环上的H δ ：7.75、6.91、6.73、6.52、6.35分别对应的碳信号为：129.9、118.7、113.6、111.8、103.8；异戊烯基上的H δ ：5.11和3.47分别对应C δ ：124.7和25.5，而二氢黄酮中C-2（δ78.4）的氢信号为δ5.51，C-3（δ 44.6）的氢信号为δ3.05和δ2.61，在高场积分为6的氢信号（δ1.66和δ1.63）为两个CH3信号，对应的碳信号为δ17.9和δ25.9。
在HMBC谱（见图10）上可以看到，H δ 6.91和C-2相关，同时和C δ 128.1、146.4相关，表明C δ 118.7和C δ 113.6在B环上，H δ 6.73和C δ 130.0、144.4相关，B环为AB系统，H δ 3.47分别和C δ 130.0、128.1和124.7相关，表明异戊烯基接在B环的2’位；而A环为ABX系统，其中H δ 7.75和C δ 194.1、165.9相关，H δ 6.52和C δ 114.9、103.8相关，H δ 6.35和C δ 165.9相关，表明羟基取代了7位上的氢。
经过上述解析，推定化合物a为3’,4’,7-三羟基-2’-异戊烯基二氢黄酮，结构如式I。
（I）
上述实施例中分离得到的化合物a波谱数据如下：
分子式为C20H20O5，分子量为340。1H-NMR(MeOD，400 MHz)δ：5.51(1H，d，J= 13.6Hz，H-2)，3.05(1H，t，J = 13.6，16.8 Hz，H-3)，2.61(1H，d，J= 16.8Hz，H-3)，7.75(1H，d，J =8.8 Hz，H-5)，6.52(1H，d，J = 8.8 Hz，H-6)，6.35(1H，d，J = 2.4 Hz，，H-8)，6.73(1H，d，J = 8.4Hz，H-5′)，6.91(1H，d，J = 8.4 Hz，H-6′)，3.47(2H，d，J = 6.8 Hz，H-1′′)，5.11(1H，brs，H-2′′)，1.66(3H，s，H-4′′)，1.66(3H，s，H-5′′)。13C-NMR(MeOD，100 MHz)δ：78.4(C-2)，44.6(C-3)，194.1(C-4)，129.9(C-5)，111.8(C-6)，166.7(C-7)，103.8(C-8)，165.9(C-9)，114.9(C-10)，130.0(C-1′)，128.1(C-2′)，144.4(C-3′)，146.4(C-4′)，113.6(C-5′)，118.7(C-6′)，25.5(C-1′′)，124.7(C-2′′)，131.8(C-3′′)，17.9(C-4′′)，25.9(C-5′′)。
实施例2：化合物a对嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘小鼠的治疗作用
1、试剂：OVA（批号：9006-59-1）和地塞米松（批号：BCBV3214）购于Sigma公司；EotaxinELISA检测试剂盒（批号：2130802231）、IL-4 ELISA检测试剂盒（批号：A20480141）、IL-5 ELISA检测试剂盒（批号：A20580821）、IL-13 ELISA检测试剂盒（批号：A21381132）、IL-25 ELISA检测试剂盒（批号：M181225-007a）、IL-33 ELISA检测试剂盒（批号：A23380314）、TSLP ELISA检测试剂盒（批号：A26580933）、IL-2 ELISA检测试剂盒（批号：A20280153）、IL-9 ELISA检测试剂盒（批号：A20980513）、总IgE ELISA检测试剂盒（批号：A27581115）购于杭州联科生物技术有限公司；OVA-IgE检测试剂盒（批号：0544983）购于艾美捷科技有限公司。
2、仪器：超声雾化器(INQUA NEB plus，德国百瑞公司)；多功能酶标仪（Spectramax plus 384，倍捷科技）；台式高速冷冻离心机（HR/T16M，湖南赫西仪器装备有限公司）；-80℃超低温冰箱（8920，赛默飞世尔）；电子分析天平（AR224CN，奥豪斯仪器有限公司）。
3、实验方法：
[1]实验动物与分组：清洁级雌性BALB/c小鼠30只，体重18-22g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。小鼠适应性喂养一周后，随机分为正常组、模型组、地塞米松组、化合物a高剂量组、化合物a低剂量组，每组6只。
[2]哮喘模型制备与给药：于实验1，8，15天均腹腔注射模型组、地塞米松组、化合物a高剂量组、化合物a低剂量组0.2ml OVA混悬液（含OVA 0.2 mg，氢氧化铝 1mg），正常组以0.2ml生理盐水代替。于实验21-27天，正常对照组和模型组均给予生理盐水0.01ml/g灌胃，地塞米松组给予地塞米松1mg/kg灌胃，化合物a高、低剂量组分别给予化合物a100 mg/kg、50 mg/kg灌胃，1小时后，将小鼠置于雾化激发装置内，除正常组给予生理盐水外其余各组给予2%OVA生理盐水雾化激发，每天一次，每次30分钟。将小鼠呼吸急促，搔鼻抓痒、呛咳烦躁、点头运动等作为哮喘小鼠模型成功的标准。
[3]标本采集
①血清的收集：小鼠腹腔注射1 %的戊巴比妥钠进行麻醉，剂量为0.01 ml/g。75%乙醇消毒，摘眼球取血，室温静置1 h后，800×g，4℃离心10 min，-80℃保存。
②小鼠肺泡灌洗液的收集：小鼠采血完成后，将小鼠固定于泡沫板上，胸腹腔消毒后暴露胸腔，行气管插管术，用动脉夹夹闭右主支气管，并用PBS灌洗左肺2次，每次0.3 ml，反复抽吸3 次，合并2次灌洗液，4℃，800×g离心10 min，-80℃保存。
③肺组织的收集：小鼠肺组织灌洗完后，取下右肺动脉夹，取右肺中叶，经PBS冲洗后放入4%的多聚甲醛中，用脱脂棉球压入液面以下固定48h后用石蜡包埋。
[4]肺组织病理学检测
①肺组织病理学检测（HE染色）：无菌取出肺组织块固定在10%福尔马林中，制作石蜡切片，二甲苯脱蜡，依次用苏木精染液、0.1%-0.3%伊红染色，二甲苯处理后用中性树脂封片。观察小鼠肺组织的病理变化，如炎细胞浸润、管腔狭窄、气道上皮受损等病理变化。
②肺气道杯状细胞的观察（PAS染色）：取肺叶于10%中性福尔马林中固定24h，制作石蜡切片，依次用1%高碘酸钠水溶液氧化、Schiff液染色、苏木精染核、1%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。观察小鼠气道的杯状细胞增生情况。
[5] 相关细胞因子的检测（ELISA法）
于-80℃取出冰冻的肺泡灌洗液及血清，恢复至室温。准备所有的试剂和标准品，按照ELISA试剂盒所示方法配制标准品，分别设置空白孔、标准品孔及样品孔空白孔加入100μl标准品稀释液，标准品孔加入2倍比稀释的标准品溶液，样本孔加入l00ul稀释的样本，每孔再加入50 μl稀释检测抗体，在15分钟内完成加样过程，室温孵育1.5小时，洗涤6次，每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育30分钟，洗涤6次，每孔加入100 μl显色底物，避光，室温孵育5 -30分钟，每孔加入100 μl终止液，30分钟内，于在450 nm波长检测OD值。以OD值为横坐标坐，以标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值确定肺泡灌洗液中eotaxin、IL-4、IL-5、IL-13、IL-25、IL-33、TSLP、IL-2、IL-9及血清中总IgE和OVA-IgE的水平。
[6]统计学处理
采用SPSS 20.0 统计学软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验(方差齐时采用t 检验，方差不齐时采用t' 检验) 。检验结果以P＜0.05为差异有统计学意义。
4、实验结果
Control为正常对照组，Model为模型组，Dex为地塞米松组（1.0 mg/kg），化合物a-H为化合物a高剂量组（100 mg/kg），化合物a-L为化合物a低剂量组（50 mg/kg）。正常组小鼠肺组织结构完整，粘膜上皮完整，气管平滑肌和基底膜无明显增厚，气管周围无杯状细胞增生现象；模型组组小鼠气管、肺泡及肺间质周围有大量炎性细胞浸润，上皮增生，基底膜增厚明显，气管周围有大量杯状细胞增生，并分泌大量粘液。化合物a高低剂量组同模型组相比，炎性细胞浸润及基底膜增厚均得到不同程度缓解（图11），杯状细胞增生明显的减轻（图12），说明化合物a能明显减轻哮喘气道炎症程度，改善气道黏液高分泌。对相关细胞因子水平检测发现，化合物a能明显抑制血清中总IgE（图13）和OVA-特异性IgE（图14）的产生，显著降低哮喘小鼠肺泡灌洗液中Eotaxin（图15）、IL-33（图16）、IL-25（图17）、TSLP（图18）、IL-4（图19）、IL-5（图20）、IL-13（图21）、IL-2（图22）、IL-9（图23），表明化合物a对哮喘有效。其中##表示与正常对照组相比P＜0.01，**表示与模型组相比P＜0.01，*表示与模型组相比P＜0.05。
实施例3 化合物a对中性粒细胞浸润为主的哮喘小鼠的治疗作用
1、试剂：屋尘螨（批号：331422）购于美国GREER实验室；高脂饲料（29%carbohydrate、55% fat、16% protein，批号：MD12032）购于江苏美迪森生物医药有限公司；地塞米松（批号：BCBV3214）购于Sigma公司；IL-1β ELISA检测试剂盒（批号：A201B81053）、IL-17A ELISA检测试剂盒（批号：A21780741）、IL-22 ELISA检测试剂盒（批号：A22280933）购于杭州联科生物技术有限公司；IL-8 ELISA检测试剂盒（批号：M181211-104a）购于欣博盛生物科技有限公司。
2、仪器：超声雾化器(INQUA NEB plus，德国百瑞公司)；多功能酶标仪（Spectramax plus 384，倍捷科技）；台式高速冷冻离心机（HR/T16M，湖南赫西仪器装备有限公司）；-80℃超低温冰箱（8920，赛默飞世尔）；电子分析天平（AR224CN，奥豪斯仪器有限公司）。
3、实验方法：
[1]实验动物与分组：4～5周龄SPF级C57 BL/6小鼠（雄性），体重（20±2）g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。小鼠适应性喂养一周后，随机分为正常组、肥胖组、模型组、地塞米松组、化合物a高、低剂量组，每组6只。
[2]肥胖哮喘动物模型建立和给药剂量
每周测量体重和体长，计算Lee’s指数。选择营养组中，超过普通喂养组Lee’s指数2倍标准差作为致肥成功的标准。将致肥小鼠随机分为5组。
计算方法：LEE'SINDEX=体重(g)^(1/3)/体长（cm）。
高脂饲料喂养105天（15周），第85天、92天腹腔注射25 μg HDM（0.2 ml PBS），第99-105天滴鼻25 μg HDM（0.03 ml PBS），连续7天，滴鼻前1 h，正常组、肥胖组、肥胖哮喘模型组予生理盐水（10 ml/kg），地塞米松组给予地塞米松（1 mg/kg），化合物a高、低剂量组分别给予化合物a 100 mg/kg、50 mg/kg灌胃。于末次给药后24 h（106天）处死动物，获取血清及肺组织进行检测。
[3]标本采集
①血清的收集：小鼠腹腔注射1 %的戊巴比妥钠进行麻醉，剂量为0.01 ml/g。75%乙醇消毒，摘眼球取血，室温静置1 h后，800×g，4℃离心10 min，-80℃保存。
②小鼠肺泡灌洗液的收集：小鼠采血完成后，将小鼠固定于泡沫板上，胸腹腔消毒后暴露胸腔，行气管插管术，用动脉夹夹闭右主支气管，并用PBS灌洗左肺2次，每次0.3 ml，反复抽吸3 次，合并2次灌洗液，4℃，800×g离心10 min，-80℃保存。
③肺组织的收集：小鼠肺组织灌洗完后，取下右肺动脉夹，取右肺中叶，经PBS冲洗后放入4%的多聚甲醛中，用脱脂棉球压入液面以下固定48h后用石蜡包埋。
[4]肺组织病理学检测
①肺组织病理学检测（HE染色）：无菌取出肺组织块固定在10%福尔马林中，制作石蜡切片，二甲苯脱蜡，依次用苏木精染液、0.1%-0.3%伊红染色，二甲苯处理后用中性树脂封片。观察小鼠肺组织的病理变化，如炎细胞浸润、管腔狭窄、气道上皮受损等病理变化。
②肺气道杯状细胞的观察（PAS染色）：取肺叶于10%中性福尔马林中固定24h，制作石蜡切片，依次用1%高碘酸钠水溶液氧化、Schiff液染色、苏木精染核、1%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。观察小鼠气道的杯状细胞增生情况。
[5] 相关细胞因子的检测（ELISA法）
于-80℃取出冰冻的肺泡灌洗液及血清，恢复至室温。准备所有的试剂和标准品，按照ELISA试剂盒所示方法配制标准品，分别设置空白孔、标准品孔及样品孔空白孔加入100μl标准品稀释液，标准品孔加入2倍比稀释的标准品溶液，样本孔加入l00ul稀释的样本，每孔再加入50 μl稀释的检测抗体，在15分钟内完成加样过程，室温孵育1.5小时，洗涤6次，每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育30分钟，洗涤6次，每孔加入100 μl显色底物，避光，室温孵育5 -30分钟，每孔加入100 μl终止液，30分钟内，于在450 nm波长检测OD值。以OD值为横坐标坐，以标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值确定肺泡灌洗液中IL-1β、IL-17A、IL-22、IL-8的水平。
[6]统计学处理
采用SPSS 20.0 统计学软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验（方差齐时采用t 检验，方差不齐时采用t' 检验）。检验结果以P＜0.05为差异有统计学意义。
4、实验结果
C为正常组，F为肥胖组，M为模型组，D为地塞米松组（1.0 mg/kg），化合物a-H为化合物a高剂量组（100 mg/kg），化合物a-L为化合物a低剂量组（50 mg/kg）。正常组小鼠肺组织结构完整，粘膜上皮完整，气管平滑肌和基底膜无明显增厚，气管周围无杯状细胞增生现象；肥胖组小鼠和模型组小鼠气管、肺泡及肺间质周围有大量炎性细胞浸润，上皮增生，基底膜增厚明显，气管周围有大量杯状细胞增生，并分泌大量粘液，模型组小鼠病理改变更为严重。化合物a高、低剂量组同肥胖组和模型组相比，炎性细胞浸润及基底膜增厚均得到不同程度缓解（见图24），杯状细胞增生明显的减轻（见图25），说明化合物a能明显减轻肥胖哮喘小鼠的气道炎症程度，改善气道黏液高分泌。对相关细胞因子水平检测发现，化合物a高、低剂量组能显著降低肥胖哮喘小鼠肺泡灌洗液中IL-1β（图26）、IL-17A（图27）、IL-22（图28）、IL-8（图29）的水平，表明化合物a对肥胖型哮喘有效。其中##表示与正常对照组相比P＜0.01，**表示与模型组相比P＜0.01，*表示与模型组相比P＜0.05。
由此可见，化合物a具有较强的拮抗哮喘的活性，可用于制备防治哮喘的药物。
本发明所述的小鼠哮喘模型实验中，化合物a低剂量为50 mg/kg，高剂量为100mg/kg。换算为人（以成人体重60kg计算）剂量为300-600mg。考虑到人的体重及其他生理病理情况，推荐剂量为200-800 mg/d。
本发明所涉及的实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种二氢黄酮类化合物，其特征在于，所述的二氢黄酮类化合物是从铜钱麻黄ShuteriasinensisHemsl中分离得到的，命名为3’,4’,7-三羟基-2’-异戊烯基二氢黄酮，分子式为：C20H20O5，其结构式如下：
。
2.一种权利要求1所述的二氢黄酮类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）使用乙醇水溶液对铜钱麻黄药材进行热回流提取，提取液浓缩后得到浸膏；
（2）将步骤（1）得到的浸膏用水稀释后，先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取后的溶液得到萃取浸膏；
（3）将步骤（2）得到的萃取浸膏采用正相硅胶柱进行第一次柱层析分离，洗脱剂为三氯甲烷和丙酮不同比例的混合溶剂，收集富含所述化合物的洗脱液，浓缩后得到含所述化合物的混合物；
（4）将步骤（3）得到的混合物采用反相柱进行第二次层析分离，洗脱剂为甲醇和水不同比例的混合溶剂，收集富含所述化合物的洗脱液，浓缩后得到含所述化合物的粗产物；
（5）将步骤（4）得到的粗产物采用凝胶柱进行纯化，洗脱液为纯甲醇，收集洗脱液得到所述二氢黄酮类化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所用的乙醇水溶液中乙醇浓度为70~75%，提取2~3次，每次2~3小时。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所用的三氯甲烷和丙酮的体积比为10:1-1:1。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所用的反相柱为MCI，流动相中水和甲醇的体积比为100:0-0:100。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所用的凝胶柱为SephadexLH-20。
7.一种权利要求1所述的二氢黄酮类化合物的应用，其特征在于，所述的二氢黄酮类化合物在制备治疗过敏性哮喘或肥胖性哮喘药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的二氢黄酮类化合物的有效剂量为200~800mg/d。
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