CN117405792B - 一种泊沙康唑中基因毒性杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种泊沙康唑中基因毒性杂质的检测方法。该方法包括采用高效液相色谱‑质谱联用方法对泊沙康唑中的三种杂质进行检测,色谱条件包括:色谱柱的柱温为25‑45℃,优选为30‑40℃;流速为0.5‑1.0ml/min,优选为0.7‑0.9ml/min;流动相由流动相A和流动相B组成,流动相A为浓度0.1%的甲酸水溶液;流动相B为乙腈;和洗脱方式采用流动相梯度洗脱,初始时流动相A与流动相B的体积比为(75:25)~(85:15);三种杂质分别为4‑二甲氨基吡啶、POS‑SMB‑02(2‑((2S,3S)‑2‑(苄氧基)戊烷‑3‑基)肼甲酸叔丁酯)和POS‑SMB‑05(1‑((2S,3S)‑2‑(苄氧基)戊烷‑3‑基)‑N‑(4‑(4‑(4‑羟基苯基)哌嗪‑1‑基)苯基)肼甲酰胺)。本发明提供的方法具有良好的专属性、准确度、精密度和耐用性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域,具体地,本发明涉及泊沙康唑的基因毒性杂质的检测方法。
背景技术
泊沙康唑(posaconazole),其化学名为:4-[4-[4-[4-[[(3R,5R)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基]-2-[(2S,3S)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮,分子式:C37H42F2N8O4,相对分子质量:700.77。泊沙康唑是由伊曲康唑衍生而得到,为2006年在FDA上市的第二代三唑类抗真菌药物。商品名为NOXAFIL。药理作用同唑类药物,但与伊曲康唑相比,其抑制固醇C14脱甲基作用更强,尤其对曲霉。用于预防侵袭性曲霉菌和念珠菌感染;治疗口咽念珠菌病,包括伊曲康唑和/或氟康唑难治性口咽念珠菌病。
基因毒性杂质(genotoxic impurity)是指能直接或间接损害DNA,导致基因突变或具有致癌倾向的物质。其特点是在浓度很低时即可造成人体遗传物质的损伤,具有致突变性和致癌性,在用药过程中严重威胁到人类的健康。
《评估和控制药物中DNA反应性(致突变)杂质以限制潜在的致癌风险(ICH M7)》指出,致突变物质(基因毒性杂质)如果是市售化学品、合成中间体中的杂质,或者是合成副产物,申请人应使用基于风险的推理来确定在哪些步骤应该对此类潜在杂质进行危害性评估,如果确认了合成过程中需要对这些杂质和副产物进行致突变性评估的步骤,则需要进行风险评估讨论。
泊沙康唑的工艺中可能存在的致突变杂质,按照警示结构种类划分包括四类。本发明涉及其中的两类,第一类包含芳胺类的警示结构,包括4-二甲氨基吡啶(DMAP);第二类包含肼类的警示结构,包括POS-SMB-02(2-((2S,3S)-2-(苄氧基)戊烷-3-基)肼甲酸叔丁酯)和POS-SMB-05(1-((2S,3S)-2-(苄氧基)戊烷-3-基)-N-(4-(4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基)苯基)肼甲酰胺)。能从源头控制原料药中这些高毒性杂质的含量,减轻了后续工艺对这些杂质清除能力的压力。下表中列出了上述记载的可能存在的致突变杂质。
泊沙康唑工艺中可能存在的致突变杂质
通过文献调研,尚未发现国内外有相关检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种专属性、准确度、精密度和耐用性良好的一种泊沙康唑中基因毒性杂质的检测方法。
本发明提供了一种泊沙康唑中基因毒性杂质的检测方法,该方法包括:采用高效液相色谱-质谱联用方法对所述泊沙康唑中的三种杂质进行检测,其中,色谱条件包括:
色谱柱的柱温为25-45℃;流速为0.5-1.0ml/min;
流动相由流动相A和流动相B组成,所述流动相A为浓度0.1%的甲酸水溶液;流动相B为乙腈;
洗脱方式采用流动相梯度洗脱,初始时所述流动相A与所述流动相B的体积比为(75:25)~(85:15);
其中,所述三种杂质分别为4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-02(2-((2S,3S)-2-(苄氧基)戊烷-3-基)肼甲酸叔丁酯)和POS-SMB-05(1-((2S,3S)-2-(苄氧基)戊烷-3-基)-N-(4-(4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基)苯基)肼甲酰胺)。
根据本发明提供的检测方法,其中,所述梯度洗脱的程序为:
0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(75:25)~(85:15);
1.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(75:25)~(85:15);
4.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(25:75)~(15:85);
6.5min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(25:75)~(15:85);
7.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(75:25)~(85:15);
10.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(75:25)~(85:15)。
根据本发明提供的检测方法,其中,在优选情况下,色谱柱的柱温为30-40℃;流速为0.7-0.9ml/min。
根据本发明提供的检测方法,其中,在优选情况下,初始时所述流动相A与所述流动相B的体积比为80:20。
根据本发明提供的检测方法,其中,在优选情况下,所述梯度洗脱的程序为:
0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为80:20;
1.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为80:20;
4.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为20:80;
6.5min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为20:80;
7.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为80:20;
10.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为80:20。
根据本发明提供的检测方法,其中,
4-二甲氨基吡啶的结构式为:
POS-SMB-02(2-((2S,3S)-2-(苄氧基)戊烷-3-基)肼甲酸叔丁酯)的结构式为:
POS-SMB-05(1-((2S,3S)-2-(苄氧基)戊烷-3-基)-N-(4-(4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基)苯基)肼甲酰胺)的结构式为
根据本发明提供的检测方法,其中,色谱条件还包括:
供试样品浓度为1.0~8.0mg/ml,供试样品的进样量为5~20μl。
根据本发明提供的检测方法,其中,在优选情况下,供试样品浓度为2.0~6.0mg/ml,供试样品的进样量为5~15μl。
根据本发明提供的检测方法,其中,质谱的检测条件包括:
扫描离子模式为多反应离子扫描,正离子模式;离子源类型为电喷雾离子源;毛细管电压为3000V;脱溶剂温度为450℃;脱溶剂气流量为1000L/hr;锥孔气流量为50L/hr;离子源温度为150℃。
根据本发明提供的检测方法,其中,所述高效液相色谱的色谱条件还包括:色谱柱采用WatersHSS T3 2.5μm,3.0×150mm Column XP;色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶颗粒;填充剂的粒径为2.5μm。
通过采用本发明提供的泊沙康唑中基因毒性杂质的检测方法,对4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05和POS-SMB-02的检测受柱温、流速和流动相比例变化的影响较小,具有良好的专属性,并且准确度、精密度和耐用性良好。
附图说明
图1是POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶检测系统适应性图谱1;
图2是POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶检测系统适应性图谱2;
图3是POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶检测系统适应性图谱3;
图4是POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶检测系统适应性图谱4;
图5的a-c是对于POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶以及空白样品改变检测条件-流动相A-B(75:25)的图谱;
图6的a-c是对于POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶以及空白样品改变检测条件-流动相A-B(85:15)的图谱;
图7的a-c是对于POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶以及空白样品改变检测条件-流速0.7ml/min的图谱;
图8的a-c是对于POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶以及空白样品改变检测条件-流速0.9ml/min的图谱;改变检测条件-流速0.9ml/min实验结果
图9的a-c是对于POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶以及空白样品改变检测条件-柱温30℃的图谱;
图10的a-c是对于POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶以及空白样品改变检测条件-柱温40℃的图谱;
图11的a-c示出了在与实施例1中相同的实验条件下的实验结果。
具体实施方式
下面将结合附图,对本申请的技术方案进行详细地描述,显然,所描述的实施例是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
本申请的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施,且“第一”、“第二”等所区分的对象通常为一类,并不限定对象的个数,例如第一对象可以是一个,也可以是多个。此外,说明书以及权利要求中“和/或”表示所连接对象的至少其中之一,字符“/”,一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
实施例1
根据本发明提供的泊沙康唑的基因毒性杂质的检测方法,其中的基因毒性杂质POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶(DMAP)按照液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)和质谱法(中国药典2020年版四部通则0431)来测定。具体方法如下:
检测中使用的POS-SMB-02为下表3中列出的批号为POP-20131231-03,由深圳市华信医药科技有限公司制造的产品;POS-SMB-05为下表3中列出的批号为RS-POS-14010501-F1,由博瑞生物医药(苏州)股份有限公司制造的产品;4-二甲氨基吡啶为下表3中列出的批号为L2103502,由阿拉丁制造的产品。
样品溶液的准备
<空白试剂>:乙腈
<标准贮备液>
取POS-SMB-02对照品适量,精密称定,加乙腈制成每1ml中约含POS-SMB-02 1mg的溶液,摇匀,作为POS-SMB-01标准贮备液。
取POS-SMB-05对照品适量,精密称定,加乙腈制成每1ml中约含POS-SMB-05 1mg的溶液,摇匀,作为POS-SMB-05标准贮备液。
取4-二甲氨基吡啶对照品适量,精密称定,加乙腈制成每1ml中约含4-二甲氨基吡啶1mg的溶液,摇匀,作为4-二甲氨基吡啶标准贮备液。
<对照品溶液>
精密量取POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶各标准贮备液适量,加乙腈制成每1ml中约含POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶各0.01μg的溶液,摇匀,作为对照品溶液。
<供试品溶液>
取本品约20mg,精密称定,置5ml量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
仪器和用具
所使用的实验仪器见表1,所使用的实验器具见表2。
表1:实验仪器
仪器 | 型号 | 编号 | 是否检定校准 |
高效液相色谱-质谱联用仪 | TQ-S micro | RY-LCMSMS-002 | 是 |
电子天平 | AP225WD | RY-TP-001 | 是 |
电子天平 | AP225WD | RY-TP-002 | 是 |
表2:实验器具
名称 | 规格 | 校验情况 |
容量瓶 | 5ml、10ml、20ml | 已校 |
刻度管 | 0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml | 已校 |
试药与试剂
所使用的实验试药和试剂见表3。
表3:实验试药和试剂
试剂 | 批号 | 纯度/级别 | 厂家 |
4-二甲氨基吡啶 | K2025119 | 99.227% | 阿拉丁 |
POS-SMB-05 | POS-SMB-020140105-01 | 99.59% | 博瑞生物医药(苏州)股份有限公司 |
POS-SMB-02 | HX-202011 | 96.27% | 深圳华信医药科技有限公司 |
乙腈 | 215625 | LC/MS | fisher |
水 | 20221010R | 蒸馏水 | 屈臣氏 |
甲酸 | J2113582 | 99% | 阿拉丁 |
泊沙康唑原料药 | 22031001 | / | 自制 |
泊沙康唑原料药 | 22032901 | / | 自制 |
泊沙康唑原料药 | 22041101 | / | 自制 |
POS-SMB-02 | POP-20131231-03 | 96.27% | 深圳市华信医药科技有限公司 |
POS-SMB-05 | RS-POS-14010501-F1 | 99.59% | 博瑞生物医药(苏州)股份有限公司 |
4-二甲氨基吡啶 | L2103502 | 99% | 阿拉丁 |
色谱和质谱的参数
下表4中列出了色谱和质谱的参数表4:色谱和质谱的参数
测定方法
分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各10μl,进样,记录色谱图,且重复进样6针。
检测限度:供试品中的POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶含量均不得超过2.5ppm。
计算公式
其中,
A供—供试品的峰面积;
A对—对照品的峰面积;
C对—对照品溶液浓度;单位:μg/ml
m—供试品取样量,单位:mg;
V—供试品定容体积,单位:ml。
测定结果
<方法学验证结果>
表5:方法学验证结果汇总表
附图1-4为POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶检测系统适应性图谱1~4。其中图1中分别示出了4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02的对照品溶液以及其供试品溶液的保留时间、峰面积和峰高度,其中POS-SMB-05供试品溶液和POS-SMB-02供试品溶液的保留时间、峰面积和峰高度未检出;图2中以图谱的形式展现了图1中示出的4-二甲氨基吡啶的空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液的检测图谱,结合图1表明,空白溶剂、供试品溶液不干扰4-二甲氨基吡啶的检测,且供试品溶液中4-二甲氨基吡啶有检出;图3中以图谱的形式展现了图1中示出的POS-SMB-05的空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液的检测图谱,结合图1表明,空白溶剂、供试品溶液不干扰POS-SMB-05的检测,且供试品溶液中未检出;图4中以图谱的形式展现了图1中示出的POS-SMB-02的空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液的检测图谱,结合图1表明,空白溶剂、供试品溶液不干扰POS-SMB-02的检测,且供试品溶液未检出。
<各杂质的检测结果>
表6:4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02检测结果
从以上可以看出,采用本发明提供的泊沙康唑的基因毒性杂质的检测方法,具有良好的专属性,并且准确度、精密度和耐用性良好。此外,本发明的检测方法的检测限度为2.5ppm;系统适用性符合要求;4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05和POS-SMB-02在特定的浓度范围内的峰面积与浓度呈现良好的线性关系;关于溶液稳定性,4-二甲氨基吡啶在12小时内稳定性良好,POS-SMB-05与POS-SMB-02的对照溶液与供试品加标溶液在1小时内稳定性良好。
实施例2
改变色谱条件的耐用性的测试
色谱条件的具体改变内容见表7。
表7:色谱条件耐用性范围
<溶液的配制>
检测中使用的POS-SMB-02为上表3中列出的批号为HX-202011,由深圳市华信医药科技有限公司制造的产品;POS-SMB-05为上表3中列出的批号为POS-SMB-020140105-01,由博瑞生物医药(苏州)股份有限公司制造的产品;4-二甲氨基吡啶为上表3中列出的批号为K2025119,由阿拉丁制造的产品。
空白溶剂:乙腈。
对照品贮备液1:精密量取POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶各标准贮备液适量,加乙腈稀释制成每1ml中约含4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02各0.1μg的溶液,摇匀,作为对照品贮备液1。
100%加标供试溶液:取本品约20mg,精密称定,置5ml量瓶中,加0.5ml对照品贮备液1,混匀,加乙腈稀释至刻度,摇匀,即得。
对照品溶液1:精密量取POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶各标准贮备液适量,加乙腈稀释制成每1ml中约含4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02各0.01μg的溶液,摇匀,作为对照品溶液1。
对照品溶液2:与对照品溶液1同法配制。精密量取POS-SMB-02、POS-SMB-05、4-二甲氨基吡啶各标准贮备液适量,加乙腈稀释制成每1ml中约含4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02各0.01μg的溶液,摇匀,作为对照品溶液2。
<测试方法>
操作步骤:分别精密量取各条件下的耐用性溶液10μl,在实施例1所述的仪器参数条件下,按照表8-10所示,单一改变一个参数条件进行进样,记录谱图。
<测试结果>
测试的图谱见图5-图11。
其中图5的a-c示出了改变检测条件-流动相A-B(75:25)实验结果。其中,图5的a中示出4-二甲氨基吡啶的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图5的b中示出POS-SMB-05的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图5的c中示出POS-SMB-02的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱。结合下表8-10的数据统计,供试品溶液中4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02检出结果与正常条件检出结果无明显差异。表明改变检测条件-流动相A-B(75:25)对检测结果影响较小,方法耐用;
图6的a-c示出了改变检测条件-流动相A-B(85:15)实验结果。其中,图6的a中示出4-二甲氨基吡啶的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图6的b中示出POS-SMB-05的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图6的c中示出POS-SMB-02的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱。结合下表8-10的数据统计,供试品溶液中4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02检出结果与正常条件检出结果无明显差异。表明改变检测条件-流动相A-B(85:15)对检测结果影响较小,方法耐用;
图7的a-c示出了改变检测条件-流速0.7ml/min实验结果。其中,图7的a中示出4-二甲氨基吡啶的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图7的b中示出POS-SMB-05的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图7的c中示出POS-SMB-02的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱。结合下表8-10的数据统计,供试品溶液中4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02检出结果与正常条件检出结果无明显差异。表明改变检测条件-流速0.7ml/min对检测结果影响较小,方法耐用;
图8的a-c示出了改变检测条件-流速0.9ml/min实验结果。其中,图8的a中示出4-二甲氨基吡啶的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图8的b中示出POS-SMB-05的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图8的c中示出POS-SMB-02的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱。结合下表8-10的数据统计,供试品溶液中4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02检出结果与正常条件检出结果无明显差异。表明改变检测条件-流速0.9ml/min对检测结果影响较小,方法耐用;
图9的a-c示出了改变检测条件-柱温30℃实验结果。其中,图9的a中示出4-二甲氨基吡啶的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图9的b中示出POS-SMB-05的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图9的c中示出POS-SMB-02的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱。结合下表8-10的数据统计,供试品溶液中4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02检出结果与正常条件检出结果无明显差异。表明改变检测条件-柱温30℃对检测结果影响较小,方法耐用;
图10的a-c示出了改变检测条件-柱温40℃实验结果,结合下表8-10的数据统计。其中,图10的a中示出4-二甲氨基吡啶的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图10的b中示出POS-SMB-05的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图10的c中示出POS-SMB-02的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱。供试品溶液中4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02检出结果与正常条件检出结果无明显差异。表明改变检测条件-柱温40℃对检测结果影响较小,方法耐用;
图11的a-c示出了在与实施例1中相同的实验条件下的实验结果。其中,图11的a中示出4-二甲氨基吡啶的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图11的b中示出POS-SMB-05的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱;图11的c中示出POS-SMB-02的空白溶剂、对照品溶液1、对照品溶液2和100%加标供试溶液的检测图谱。
对于各杂质4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05和POS-SMB-02改变检测条件的实验结果统计见表8-10。
表8:改变检测条件实验结果统计(4-二甲氨基吡啶)
表9:改变检测条件实验结果统计(POS-SMB-05)
表10:改变检测条件实验结果(POS-SMB-02)
结论:从以上表8-10与图5-11结合起来可以得出,与图11中a、b、c的与实施例1相同的色谱条件得到的检测图谱相比,改变各色谱条件,即,分别更改柱温箱温度±5℃,更改流速±0.1ml/min,更改流动相比例±5%,其中4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05和POS-SMB-02保留时间均有变动,但供试品中杂质保留时间和峰面积与对照品溶液保留时间和峰面积的变化一致;说明本发明的方法检测4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05和POS-SMB-02受柱温、流速和流动相比例变化影响较小,该方法耐用性良好。且各条件下空白溶剂、供试品溶液均不干扰本品中4-二甲氨基吡啶、POS-SMB-05、POS-SMB-02的检测。
Claims (8)
1.一种泊沙康唑中基因毒性杂质的检测方法,其特征在于,该方法包括:采用高效液相色谱-质谱联用方法对所述泊沙康唑中的三种杂质进行检测,其中,色谱条件包括:
色谱柱的柱温为25-45℃;流速为0.5-1.0 ml/min;色谱柱采用Waters XSelect® HSST3 2.5μm,3.0×150mm Column XP;色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶颗粒;填充剂的粒径为2.5μm;
流动相由流动相A和流动相B组成,所述流动相A为浓度0.1%的甲酸水溶液;流动相B为乙腈;和
洗脱方式采用流动相梯度洗脱,初始时所述流动相A与所述流动相B的体积比为(75:25)~(85:15);所述梯度洗脱的程序为:
0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(75:25)~(85:15);
1.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(75:25)~(85:15);
4.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(25:75)~(15:85);
6.5min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(25:75)~(15:85);
7.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(75:25)~(85:15);
10.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为(75:25)~(85:15);
其中,所述三种杂质分别为4-二甲氨基吡啶、2-((2S,3S)-2-(苄氧基)戊烷-3-基)肼甲酸叔丁酯和1-((2S,3S)-2-(苄氧基)戊烷-3-基)-N-(4-(4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基)苯基)肼甲酰胺。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其中,色谱柱的柱温为30-40℃;流速为0.7-0.9ml/min。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其中,初始时所述流动相A与所述流动相B的体积比为80:20。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其中,所述梯度洗脱的程序为:
0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为80:20;
1.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为80:20;
4.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为20:80;
6.5min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为20:80;
7.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为80:20;
10.0min,所述流动相A与所述流动相B的体积比为80:20。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其中,
4-二甲氨基吡啶的结构式为:;2-((2S,3S)-2-(苄氧基)戊烷-3-基)肼甲酸叔丁酯的结构式为:/>;1-((2S,3S)-2-(苄氧基)戊烷-3-基)-N-(4-(4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基)苯基)肼甲酰胺的结构式为/>。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法,其中,色谱条件还包括:
供试样品浓度为1.0~8.0mg/ml,供试样品的进样量为5~20μl。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其中,供试样品浓度为2.0~6.0mg/ml,供试样品的进样量为5~15μl。
8.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法,其中,质谱的检测条件包括:
扫描离子模式为多反应离子扫描,正离子模式;离子源类型为电喷雾离子源;毛细管电压为3000V;脱溶剂温度为450℃;脱溶剂气流量为1000L/hr;锥孔气流量为50 L/hr;离子源温度为150℃。
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