CN1174023C - 一种聚酰胺-胺树型高分子及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚酰胺-胺树型高分子，它们是下列以间苯三甲酸为核的三向型聚酰胺-胺树型高分子：1.5代树型高分子(G1.5)、2.0代树型高分子(G2.0)、2.5代树型高分子(G2.5)、3.0代树型高分子(G3.0)、……、8.0代树型高分子(G8.0)。上述半代聚酰胺-胺树型高分子通过整代树型高分子与丙烯酸甲酯在甲醇钠的催化作用下进行Michael加成反应制备；上述整代聚酰胺-胺树型高分子通过半代树型高分子与乙二胺经酰胺化反应制得。本发明的聚酰胺-胺树型高分子具有生物可降解、高效低毒的优点。可用作基因转移载体，及生物可降解药物控制释放载体。

Description

种聚酰胺-胺树型高分子及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种聚酰胺-胺树型高分子及其制备方法和用途。

背景技术

树型高分子是一类新型高分子，具有确定结构，高分枝度，单分散性，外形为球形，分子表面可以带有大量功能基及高密度电荷，可与DNA分子通过静电作用结合成复合物，再通过胞饮作用进入细胞(Jonathan.D.Eichman，et al，PSTT，2000，3(7)，232-245)。其另一个吸引人的特性就是可以与小分子形成主-客体(host-guest)复合结构，树型分子的内腔中可以容纳小分子。这样就可以通过分子设计来控制分子大小和表面结构，从而研究树型分子与基因、药物结合的机理，开发树型分子基因转移载体、树型分子药物载体(Renxi Zhuo，Bo Du，et al，Journal of Controlled Release，1999，57，249-257)。树型分子还可用于纳米催化、微反应载体、簇状大分子模拟、磁共振成像造影剂、化学传感器、信息媒介物质、免疫诊断等方面(a：K.Inoue，Progress in Polymer Science，2000，25(4)，453-571；b：F.Vgtle，S.Gestermann，et al，Progress in Polymer Science，2000，25(7)，987-1041)。问题是，现有的树型高分子有的生物可降解性较差，有的毒性较高而限制其应用。

发明内容

本发明就是针对上述问题提供一种聚酰胺-胺树型高分子，这种高分子高效低毒且具有较好的生物可降解性。发明者以间苯三甲酸为核，通过酯化反应，制备了半代树状物G0.5，然后通过Michael加成和酰胺化的重复反应过程，合成出不同代数的聚酰胺-胺树型高分子。

本发明提供的技术方案是：一种聚酰胺-胺树型高分子，它们是下列以间苯三甲酸为核的三向型聚酰胺-胺树型高分子：1.5代树型高分子(G1.5)、2.0代树型高分子(G2.0)、2.5代树型高分子(G2.5)、3.0代树型高分子(G3.0)、……、8.0代树型高分子(G8.0)；其中，1.5代树型高分子的结构式

2.0代树型高分子(G2.0)的结构式

2.5代树型高分子(G2.5)的结构式

依次类推可得出后续各半代及各整代树型高分子结构式，直到8.0代树型高分子结构式，即用-CH₂CH₂COOCH₃替代整代树型高分子分枝末端-NH₂上的-H即为后续半代树型高分子，用-NHCH₂CH₂NH₂替代半代树型高分子分枝末端上的-OCH₃即为后续整代树型高分子。

上述聚酰胺-胺树型高分子的制备方法，将0.5代(G0.5)树型分子间苯三甲酸三甲酯与过量乙二胺经酰胺化反应制得1.0代(G1.0)树型高分子；1.5代(G1.5)树型高分子由1.0代树型高分子与过量的丙烯酸甲酯在甲醇钠的催化作用下进行Michael加成反应制备；2.0代(G2.0)树型高分子由1.5代树型高分子与过量乙二胺经酰胺化反应制得；……；7.5代(G7.5)树型高分子由7.0代(G7.0)树型高分子与过量的丙烯酸甲酯在甲醇钠的催化作用下进行Michael加成反应制备；8.0代(G8.0)树型高分子由7.5代树型高分子与过量乙二胺经酰胺化反应制得。

上述整代的酰胺化反应与半代的Michael加成反应均在0～50℃、氮气保护下进行。

上述酰胺化反应与Michael加成反应均在甲醇中进行。

在上述整代的酰胺化反应中，乙二胺用量为半代树型高分子反应物外围酯基摩尔数的50-100倍，以阻止乙二胺分子与第二个酯基反应生成分子内或分子间的桥联结构。

在上述半代的Michael加成反应中，丙烯酸甲酯的用量为整代树型高分子反应物分枝末端-NH₂上的-H摩尔数的1.1～1.5倍(或为整代树型高分子反应物外围氨基摩尔数的2.2～3.0倍)。

在进行上述半代的Michael加成反应之前，先将整代树型高分子反应物用10ml无水甲醇、100ml无水甲苯(无水甲醇∶无水甲苯＝1∶10，v/v)浸泡，再在30℃、真空度为1mmHg下减压蒸干以除去反应物中的乙二胺。因在酰胺化反应制备整代树型高分子时均使用过量的乙二胺，除去乙二胺是确保树型分子规整度的一个重要保证。残留在树型分子里的乙二胺在随后的合成中将成为新的引发核，参与反应的丙烯酸甲酯会与这些乙二胺发生反应生成不同核的树型分子。这些树型分子由于反应进度和反应比例不同，因而所得到的分子形态也会各异，导致合成的树型分子的分子量分布加宽，破坏产物的规整性。

在上述整代的酰胺化反应中将半代树型高分子反应物缓缓滴加到乙二胺中，以保证在任何时刻乙二胺都大量过量，避免分子内或分子间的桥联结构。

上述聚酰胺-胺树型高分子可用作基因转移载体，及生物可降解药物控制释放载体。

本发明的聚酰胺-胺树型高分子是以间苯三甲酸为核的三向型聚酰胺-胺树型高分子，具有生物可降解、高效低毒的优点。合成的各代树型分子可用作基因转染载体进行基因转染实验，通过改变树型分子浓度、代数及树型分子与DNA形成复合物的电荷比来改变基因转染效率及细胞毒性，并可对树型分子载体进行化学修饰，从而增强载体靶向性，降低细胞毒性，提高转染效率。选择间苯三甲酸为核是为了能在低代树型分子时保持平面Y形结构，达到模拟病毒的目的。

附图说明

图1为本发明第四代(G4.0)聚酰胺-胺树型高分子结构式；

图2为本发明第八代(G8.0)产物的形态分析的扫描电镜图；

图3为本发明第四、五、六、七、八代聚酰胺-胺树型高分子的细胞毒性实验结果，所用细胞为HeLa细胞。

具体实施方式

为了得到以间苯三甲酸为核的聚酰胺-胺树型高分子，发明者设计了对间苯三甲酸进行酯化反应，然后进行Michael加成和酰胺化的重复反应的技术路线，合成路线如下：

间苯三甲酸三甲酯由间苯三甲酸和甲醇经酯化反应制备，其熔点与文献(Reynold C.Fuson，C.H.Mc Keever，J.A.C.S.，1940，60，2090)报道相符。

G1.0产物由G0.5产物与大量过量乙二胺经酰胺化反应制备。(Raif Wrl and HubertKster，Tetrahedron，1999，55，2951)

G1.5产物由G1.0产物与少量过量的丙烯酸甲酯在甲醇钠的催化作用下，在甲醇溶液中进行Michael加成反应制备。

上述半代产物与大量过量乙二胺经酰胺化反应得到整代产物，而整代产物与少量过量的丙烯酸甲酯经Michael加成反应得到半代产物，如此重复得到G0.5到G8.0等16个不同代数的聚酰胺—胺树型高分子。

上述制备方法所用的有机溶剂最好为甲醇。所用的乙二胺用CaH2经过回流后蒸出，丙烯酸甲酯为重蒸过试剂，甲醇经镁屑回流后蒸出，甲苯经钠丝回流后蒸出。

上述G4.0(其结构式见图1)-G8.0产物的体外细胞毒性实验是参照文献(N.Malik，etal，Journal of Controlled Release，2000，65，133-148)进行。

本发明从间苯三甲酸出发，设计并合成了以间苯三甲酸为核的三向型聚酰胺—胺树型高分子。化合物的结构经红外光谱(FT-IR)(见表一)，质子核磁共振谱(¹H NMR)(见表二)，元素分析(EA)确认(见表三)。各代产物的重均分子量、数均分子量和多分散指数由凝胶色谱(GPC)测定，洗脱溶剂为0.1M磷酸二氢钾缓冲溶液(见表四)。各代产物的形态分析及粒径分布由扫描电镜实验得到(见图2)。合成的各代树型分子可用作基因转染载体进行基因转染实验，通过改变树型分子浓度、代数及树型分子与DNA形成复合物的电荷比来改变基因转染效率及细胞毒性，并可对树型分子载体进行化学修饰，从而增强载体靶向性，降低细胞毒性，提高转染效率。

表一：红外结果

Generation                               IR

G0.5             V_C＝O1731cm^-1；V_C-O-C1274cm^-1，1249cm^-1

G1.0             V_NH23414cm^-1；V_C＝O1655cm^-1

G1.5             V_NH3291cm^-1；V_C＝O1667cm^-1，1733cm^-1；V_C-O-C1203cm^-1，1262cm^-1

G2.0             V_NH3283cm^-1；V_C＝O1652cm^-1

G2.5             V_NH3306cm^-1；V_C＝O1658cm^-1，1737cm^-1；V_C-O-C1261cm^-1

G3.0             V_NH23402cm^-1；V_NH3307cm^-1；V_C＝O1652cm^-1

G3.5             V_NH3368cm^-1；V_C＝O1646cm^-1，1734cm^-1；V_C-O-C1267cm^-1

G4.0             V_NH3291cm^-1；V_C＝O1657cm^-1

G4.5             V_NH3291cm^-1；V_C＝O1658cm^-1，1738cm^-1；V_C-O-C1260cm^-1

G5.0             V_NH23400cm^-1；V_NH3281cm^-1；V_C＝O1646cm^-1

G5.5             V_NH3304cm^-1；V_C＝O1646cm^-1，1734cm^-1；V_C-O-C1260cm^-1

G6.0             V_NH3282cm^-1；V_C＝O1644cm^-1

G6.5             V_NH3307cm^-1；V_C＝O1647cm^-1，1734cm^-1；V_C-O-C1260cm^-1

G7.0             V_NN3301cm^-1；V_C＝O1645cm^-1

G7.5             V_NH3307cm^-1；V_C＝O1658cm^-1，1733cm^-1；V_C-O-C1261cm^-1

G8.0             V_NH3275cm^-1；V_C＝O1638cm^-1

表二：核磁结果(ppm，整代产物溶剂为DMSO-d₆，半代产物溶剂为CDCl₃)

Generation  H_Ar              -CON HCH₂-        -CONHC H ₂-         -OCH₃        其余-CH₂-

0.5         8.8(s，3H)                            3.9(s，9H)

1.0         8.4(s，3H)        8.6(t，3H)          3.3(t，6H)                         2.7(t，6H)

1.5         8.4(s，3H)        7.4(t，3H)          2.9(m，6H)          3.6(s，18H)    2.3-2.8(m，30H)

2.0         8.4(s，3H)        7.9-8.6(t，9H)，    3.0-3.4(t，18H)                    2.2-3.0(m，42H)

2.5         8.5(s，3H)        7.0-7.9(t，9H)      3.1-3.5(m，18H)     3.7(s，36H)    2.4-2.9(m，90H)

3.0         8.4(s，3H)        7.9-8.8(t，21H)     3.1-3.4(t，42H)                    2.2-3.0(m，114H)

3.5         8.4(s，3H)        7.1-8.2(m，21H)     3.2-3.5(m，42H)     3.7(s，72H)    2.1-2.9(m，210H)

4.0         8.4(s，3H)        7.9(m，45H)         3.0-3.3(t，90H)                    2.2-2.7(m，258H)

4.5         8.5(s，3H)        7.1-7.8(m，45H)     3.3-3.5(m，90H)     3.7(s，144H)   2.2-2.9(m，450H)

5.0         8.4(s，3H)        7.9(m，93H)         3.0-3.2(t，186H)                   2.2-2.8(m，546H)

5.5                           7.2(m，93H)         3.3-3.5(m，186H)    3.7(s，288H)   2.3-2.8(m，930H)

6.0                           7.9-8.2(m，172H)    3.0-3.2(m，344H)                   2.2-2.7(m，1163H)

6.5                           7.2-7.4(m，175H)    3.2-3.5(m，366H)    3.7(s，576H)   2.3-2.8(m，2017H)

7.0                           7.8-8.6(m，381H)    3.0-3.4(m，762H)                   2.2-2.9(m，2027H)

7.5                           7.2-7.8(m，371H)    3.2-3.5(m，762H)    3.7(S，1152H)  2.3-2.8(m，4089H)

8.0                           7.6-8.2(m，765H)    3.0-3.2(m，1530H)                  2.2-2.7(m，4590H)

注：随着代数增高，苯环上的氢在谱图上的峰越来越小，最后消失。

表三：元素分析结果

                         N％         N％         C％         C％         H％         H％

Generation  M_w

                         (Calc.)     (Found)     (Calc.)     (Found)     (Calc.)    (Found)

0.5         252.24       0           0           57.14       58.37       4.80       5.57

1.0         336.45       24.98       21.99       53.54       52.17       7.20       9.77

1.5         853.05       9.85        10.76       54.91       57.82       7.10       13.17

2.0         1021.47      24.69       22.93       52.91       53.46       8.31       14.52

2.5         2054.67      12.27       12.47       54.36       62.61       7.67       7.30

3.0         2391.51      24.60       24.37       52.73       52.88       8.62       18.94

3.5         4457.91      13.20       12.46       54.15       54.90       7.88       5.07

4.0         5131.59      24.57       20.95       52.66       49.25       8.74       6.55

4.5         9264.39      13.61       13.88       54.06       54.15       7.98       12.68

5.0         10611.75     24.56       22.38       52.63       52.17       8.79       16.23

5.5         18877.35     13.80       13.95       54.01       54.98       8.03       13.65

6.0         21572.07     24.55       23.38       52.61       52.82       8.82       13.70

6.5         38103.27     13.90       14.39       53.99       54.22       8.05       15.00

7.0         43492.71     24.55       23.89       52.60       49.94       8.83       14.02

7.5         76555.11     13.95       13.63       53.98       53.39       8.06       13.15

8.0         87333.99     24.54       23.73       52.60       53.15       8.84       13.99

注：H％(Found)偏高是因为样品极易吸潮。

表四：GPC结果(洗脱溶剂为0.1M磷酸二氢钾缓冲溶液)

          G1.0      G2.0       G3.0       G4.0      G5.0      G6.0      G7.0      G8.0

M_n       800       1970       3164       5081      8774      11012     11655     12051

M_w       804       2015       3318       5694      9101      11635     13374     15441

d         1.005     1.023      1.049      1.121     1.037     1.057     1.148     1.281

          G1.5      G2.5       G3.5       G4.5      G5.5      G6.5      G7.5

M_n       664       1285       2504       5270      8289      11541     16600

M_w       672       1344       2711       5607      8527      11905     19260

d         1.013     1.046      1.083      1.064     1.029     1.031     1.160

以下结合具体实例对本发明的技术方案作进一步的说明：

实施例一、间苯三甲酸三甲酯G0.5的制备：将2.8克用水重结晶过的间苯三甲酸晶体(熔点376℃)，加入26ml无水甲醇，0.5ml浓H₂SO₄，回流2小时，蒸出其中2/3甲醇。蒸出的甲醇用无水K₂CO₃干燥。干燥后的甲醇又注回反应瓶，回流2小时。如此反复三次。当反应混合物冷却时，有大量白色晶体出现。过滤出的晶体溶于30ml乙醚中，过滤，滤液注入到30ml水中，再用105ml乙醚萃取。乙醚溶液合并，用100毫升10％KHCO₃溶液彻底洗涤2次，再用水洗涤2次，分出的乙醚层用无水MgSO₄干燥。干燥后的乙醚溶液过滤，滤液减压抽干乙醚，得到的白色针状晶体用无水甲醇重结晶。得2.4克白色针状晶体即为间苯三甲酸三甲酯(G0.5)。熔点144-145℃，产率71.4％。

实施例二、上述G1.0的制备：稍加热将1.4克G0.5溶于70ml无水甲醇中，置于滴液漏斗中，在冰浴、氮气保护、电磁搅拌下，缓缓滴入75ml无水乙二胺中，室温下避光搅拌72小时。水泵30℃下减压蒸去甲醇及少量乙二胺，然后在30℃、真空度为1mmHg下减压蒸去过量乙胺。得到的黄色油状物溶于10ml无水甲醇中，再加入100ml无水甲苯，然后减压蒸出甲醇及甲苯。如此反复三次，得白色粉末1.6克即为G1.0产物。产率85.6％。

实施例三、上述半代产物的制备：将整代产物的甲醇溶液置于三口圆底烧瓶中，在冰浴、氮气保护、电磁搅拌下，用注射器缓缓滴入摩尔数为整代产物外围胺基摩尔数2.4倍的丙烯酸甲酯，然后用注射器滴入催化量的甲醇钠的甲醇溶液，在室温下避光搅拌72小时。水泵30℃下减压蒸去甲醇及过量丙烯酸甲酯，用少量甲醇溶解，加入乙醚，倾出上层清液。重复数次，减压抽干，得黄色粘稠状物即为所需半代聚酰胺-胺树型高分子。产率约为94％。

实施例四、上述整代产物的制备：将半代产物的甲醇溶液置于一个滴液漏斗中，在冰浴、氮气保护、电磁搅拌下，缓缓滴入大量过量的无水乙二胺中(乙二胺摩尔数为半代产物外围酯基摩尔数的50-100倍)，室温下避光搅拌72小时。水泵30℃下减压蒸去甲醇及少量乙二胺，然后在30℃下，真空度为1mmHg下减压蒸除过量乙二胺。得到的黄色粘稠状物用10ml无水甲醇，100ml无水甲苯浸泡，然后在30℃下减压蒸干甲醇及甲苯。如此再重复一次，抽干后得黄色粘稠状物即为所需整代聚酰胺-胺树型高分子。产率约为98％。

实施例五、上述各代树型分子的体外细胞毒性：在含100μl培养液的96孔细胞培养板中培养HeLa细胞，细胞浓度为20000个/孔，置于37℃、5％CO₂潮湿培养箱中培养24小时。取上述树型分子G4.0-G8.0各10毫克，分别溶于5毫升培养液中，用0.45μm的超滤器过滤除菌，然后用培养液稀释成不同浓度(0.001mg/ml-2mg/ml)，加入到培养了一天的细胞中(同时作阴性对照和空白对照)，继续培养48小时。培养至44小时的时候，每孔加入四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液(5mg/ml)20μl，置于37℃、5％CO₂潮湿培养箱中培养完最后的4小时。然后倾出上层清液，每孔加入100μl DMSO。在Bio-Rad 550酶标仪上读取570nm处吸光值。树型高分子的细胞毒性用HeLa细胞的细胞存活率(Viability)表示：

Viability(％)＝(A_test-A₀)/(A_control-A₀)×100％

A_test为不同树型分子浓度下所测的吸光值，A₀为空白对照所测的吸光值，A_control为阴性对照所测的吸光值。结果如图3所示，其中横坐标为树型高分子浓度(Dendrimerconcentration，mg/ml)，纵坐标为细胞存活率(Cell viability，％control)，图3中线1、2、3、4分别为G4.0、G5.0、G6.0、G7.0、G8.0聚酰胺-胺树型高分子的浓度-细胞存活率关系曲线。

Claims (9)

1.一种聚酰胺-胺树型高分子，它们是下列以间苯三甲酸为核的三向型聚酰胺-胺树型高分子：1.5代树型高分子、2.0代树型高分子、2.5代树型高分子、3.0代树型高分子、……7.5代树型高分子、8.0代树型高分子；其中，

1.5代树型高分子的结构式为

2.0代树型高分子的结构式为

2.5代树型高分子的结构式为

依此类推可得出后续各半代及各整代树型高分子结构式，直到8.0代树型高分子的结构式，即用-CH₂CH₂COOCH₃替代整代树型高分子分枝末端-NH₂上的-H即为后半代树型高分子，用-NHCH₂CH₂NH₂替代半代树型高分子分枝末端上的-OCH₃即为后续整代树型高分子。

2.权利要求1所述聚酰胺-胺树型高分子的制备方法，其特征是：将0.5代树型分子间苯三甲酸三甲酯与过量乙二胺经酰胺化反应制得1.0代树型高分子；1.5代树型高分子由1.0代树型高分子与过量的丙烯酸甲酯在甲醇钠的催化作用下进行Michael加成反应制备；2.0代树型高分子由1.5代树型高分子与过量乙二胺经酰胺化反应制得；……；7.5代树型高分子由7.0代树型高分子与过量的丙烯酸甲酯在甲醇钠的催化作用下进行Michael加成反应制备；8.0代树型高分子由7.5代树型高分子与过量乙二胺经酰胺化反应制得。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是：上述整代的酰胺化反应与半代的Michael加成反应均在0～50℃、氮气保护下进行。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：上述酰胺化反应与Michael加成反应均在甲醇中进行。

5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：在上述整代的酰胺化反应中，乙二胺用量为半代树型高分子反应物外围酯基摩尔数的50-100倍。

6.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：在上述半代的Michael加成反应中，丙烯酸甲酯的用量为整代树型高分子反应物分枝末端-NH₂上的-H摩尔数的1.1～1.5倍。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：在进行上述半代的Michael加成反应之前，先将整代树型高分子反应物用体积比为无水甲醇∶无水甲苯＝1∶10的无水甲醇/无水甲苯混合溶剂浸泡，再在30℃、真空度为1mmHg下减压蒸干。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是：在上述整代的酰胺化反应中将半代树型高分子反应物缓缓滴加到乙二胺中。

9.权利要求1所述聚酰胺-胺树型高分子用作基因转移载体及生物可降解药物控制释放载体。

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