CN102295773B

CN102295773B - 一种富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯及其制备方法

Info

Publication number: CN102295773B
Application number: CN201110144682XA
Authority: CN
Inventors: 王艳
Original assignee: Anhui BBCA Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Anhui BBCA Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-05-31
Filing date: 2011-05-31
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2031-05-31
Also published as: CN102295773A

Abstract

本发明提供了一种新的高分子化合物——富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯及其制备方法。本发明首先通过1，3-偶极环加成反应合成中间体N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷，使富勒烯上连上一个乙二醇臂，然后使其和氨基、羧基都被保护的天门冬氨酸反应，得到富勒烯天门冬氨酸苄酯，脱去氨基的保护基后，用游离氨基作为引发剂，引发天门冬氨酸苄酯-NCA开环聚合，得富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯。富勒烯分子是一种由碳原子自身结合而形成的闭合网状笼形结构，其特殊笼形结构使其在化学，物理，生物学等领域都具有很好的研究价值，聚肽作为一种生物材料具有良好的生物相容性，可调控的生物降解速度，易于修饰等优点，而富勒烯的引入也使得聚合物具有更好的特性，包括机械性和热学性等。

Description

一种富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种富勒烯表面引入高分子生物聚合物的高分子化合物，具体地说，涉及一种富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯及其制备方法，该化合物大大提高了富勒烯在极性溶液中的的溶解度，且具有良好的抗氧化活性。

背景技术

从1990年开始，对于富勒烯在清除自由基功能方面的研究就有很大的发展，许多的科学研究都证实富勒烯是一种很强效自由基清除分子，换句话说，它是一个很强的抗氧化剂。我们都知道自由基的清除对人体的健康来说是相当重要的一环，除了疾病的预防与治疗外，这种抗氧化的自由基清除作用还跟人体的老化有密不可分的关系，就像目前医药界常常说的，想要不变老，体内及外在皮肤的自由基的清除与自由基形成的预防绝对是不可忽略的工作，而且研究表明，富勒C60对于自由基的清除，皮肤细胞的活化，杀伤肿瘤细胞等，都有相当的作用。

聚天门冬氨酸具有良好的生物亲和性和生物降解性，作为药物载体可提供药物缓释性、靶向性，提高药物水溶性，降低药物不良反应，从而提高疗效。将聚天门冬氨酸作为膜材料引入微胶囊的制备，有望获得一种具有介入治疗性效果的药物载体，作为水不溶性的植物化疗药物的载体，可提高这类药物的生理药理活性，增强动力学稳定性，提高疗效，降低细胞毒性，增强对肿瘤细胞的靶向性和选择性。富勒烯具有清除自由基、切割DNA、抑制酶活、杀伤肿瘤细胞、保护神经等生物学效应，将聚天门冬氨酸接枝在富勒烯上制备而成的材料将有可能兼具富勒烯与聚天门冬氨酸的双重优良性质，在今后生物医药及化妆品等领域将有潜在的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯，该化合物大大提高了富勒烯在极性溶液中的的溶解度，且具有良好的抗氧化活性。

本发明的另一目的是提供该化合物的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯，其结构式为：

其中，n为4-10。

本发明的富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯的制备方法，其具体包括如下步骤：

1)2-(2-氨乙氧基)-乙醇和2-溴乙酸苄酯通过氨解反应合成N-取代氨基乙酸苄酯；

2)N-取代氨基乙酸苄酯经催化氢解反应合成N-取代氨基乙酸；

3)C60，多聚甲醛和N-取代氨基乙酸通过1，3-偶极环加成反应合成N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷；

4)N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷和α-氨基、α-羧基均被保护的天门冬氨酸Boc-ASP-oBzl在HOBT，DMAP，DIC催化下合成富勒烯天门冬氨酸苄酯，脱保护后得到氨基游离的富勒烯天门冬氨酸苄酯；

5)天门冬氨酸苄脂和四氢呋喃反应合成天门冬氨酸苄酯-NCA；

6)步骤5)制备的天门冬氨酸苄酯-NCA和步骤4)的氨基游离的富勒烯天门冬氨酸苄酯通过聚合反应合成富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯。

其中，步骤1)中，在氩气保护下进行反应，2-(2-氨乙氧基)-乙醇和三乙胺及2-溴乙酸苄酯等量反应，室温下搅拌3-5小时，且反应有机相要用蒸馏水和饱和食盐水各萃取3次，加无水硫酸钠静置干燥过夜。

步骤2)中，利用10％钯碳作为催化剂，在氢气中室温搅拌15-20小时。

步骤3)中，在氩气保护下，C60与N-取代氨基乙酸及多聚甲醛(摩尔比为1∶1∶1)，120-140℃油浴、回流、磁力搅拌反应16-18h，产物用4∶1(v/v)甲苯/乙酸乙酯洗脱。

步骤4)中，先α-氨基、α-羧基均被保护的天门冬氨酸Boc-ASP-oBzl、(1-羟基-苯并-三氮唑)HOBt和DIC(N，N-二异丙基二亚胺)在室温反应30-60分钟；然后加入N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷和DMAP(4-N，N-二甲基吡啶)，室温反应24-48h，旋蒸后过柱；用200-300目硅胶填充柱，以5∶1(V/V)甲苯/乙酸乙酯为洗脱剂进行分离。

脱氨基保护反应采用加入50％TFA/DCM，室温反应30-60分钟。

步骤5)中，反应物在干燥氩气中，加热至50-60℃时加入引发剂三光气，产物用石油醚沉淀。

步骤6)中，氨基游离的富勒烯天门冬氨酸苄酯作为引发剂，溶于二氯甲烷中，与新鲜制备的天冬氨酸苄脂-NCA在40℃下聚合14-18小时，反应液在无水乙醇进行沉淀。

本发明制备过程中每步骤均在氩气的保护下进行。

本发明的富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯的合成路线为：

其中，1为N-取代氨基乙酸苄酯，2为N-取代氨基乙酸，3为N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷，4为富勒烯天门冬氨酸苄酯，5为富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯。

本发明首先通过1，3-偶极环加成反应合成中间体N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷，使富勒烯上连上一个乙二醇臂，然后使其和氨基、羧基都被保护的天门冬氨酸反应，得到富勒烯天门冬氨酸苄酯，脱去氨基的保护基后，用游离氨基作为引发剂，引发天门冬氨酸苄酯-NCA开环聚合，生成一种新的富勒烯聚合物，即富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯。富勒烯分子是一种由碳原子自身结合而形成的闭合网状笼形结构，其特殊笼形结构使其在化学，物理，生物学等领域都具有很好的研究价值，聚肽作为一种生物材料具有良好的生物相容性，可调控的生物降解速度，易于修饰等优点，而富勒烯的引入也使得聚合物具有更好的特性，包括机械性和热学性等。

本发明富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯在生物医学、化学、材料学等领域有许多良好的应用。

附图说明

图1为N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷的UV-VIS谱图；

图2为N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷的MALDI-TOF-MS谱图；

图3为富勒烯封端聚天冬酸苄酯MALDI-TOF-MS谱图；

图4为富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯的UV-Vis谱图；

图5为富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯的红外光谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷

1.N-取代氨基乙酸苄酯的合成-氨解作用

在三口圆底烧瓶中，氩气保护下，加入用90mL二氯甲烷溶解的2-(2-氨乙氧基)-乙醇(2.5mL，25mmol)和三乙胺(2.5mL)，在0℃下加入用10mL二氯甲烷溶解的2-溴乙酸苄酯(2.5mL，15.9mmol)，用恒压分液漏斗1小时内缓慢滴加，充分搅拌，然后在室温下搅拌反应4小时。将反应有机相分别用蒸馏水和饱和食盐水各萃取3次，加无水硫酸钠静置干燥过夜，之后过滤、旋蒸，得灰黄色粘稠油状物，即N-取代氨基乙酸苄酯(1.5g，产率37％)。

2.N-取代氨基乙酸的合成-催化氢解作用

将N-取代氨基乙酸苄酯(1.5g，5.92mmol)溶于170mL无水乙醇，移入250mL单口圆底烧瓶中，通氩气除去空气后，加入112mg 10％Pd/C，通氢气，室温下磁力搅拌反应20h，过滤除去催化剂钯碳，旋蒸得黄色粘稠油状物，即N-取代氨基乙酸(0.79g，产率82％)。

3.N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷的合成-1，3-偶极环加成反应

称取C60(500mg，0.694mmol)加入装有无水甲苯(300mL)的500mL三口圆底烧瓶中，超声30分钟，使之充分溶解。然后固定回流装置，在氩气保护下，加入N-取代氨基乙酸(113mg，0.692mmol)(用少量乙醇溶解)和多聚甲醛(62.5mg，0.577mmol)，130℃油浴、回流、磁力搅拌反18h。产物进行硅胶柱层析分离，用4∶1(v/v)甲苯/乙酸乙酯洗脱，收集相同组份，旋蒸得到黑色粉末，即N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷(153mg，产率52％)。其谱图见图1和图2。

本发明的质谱采用Bruker EIFLEX-Ⅲ基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)，样品经二氯甲烷溶解。氢谱采用Bruker DMX300核磁共振仪，以CDCl₃为溶剂，四甲基硅烷为内标，其中¹H-NMR频率400MHz。傅利叶红外光谱FT-IR采用Perkin Elmer Spectrum BX红外光谱仪，溴化钾KBr压片法制样。紫外-可见吸收光谱UV-VIS采用北京普析通用仪器TU-1901双光束紫外-可见分光光度计测量，以二氯甲烷为溶剂，波长范围200-700nm。

中间体N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷的表征

MALDI-TOF质谱图如图1所示，在m/z 850处有一个较强的分子离子峰，产物分子量的理论值为851。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)谱图见图2，a’和b’处于相同的化学环境，因其周围没有其他氢原子存在，在4.58ppm处产生一个单峰，a’和b’氢大幅度向低场移动，原因是这两个氢上的碳都是与强吸电性的C60相连而致；d’、e’中间连一个氧原子-O-，后接一个亚甲基-CH₂-，化学环境类似，但是由于受其不同间隔原子的影响，二者相互耦合在3.83ppm处产生多重峰，且化学位移值e’＞d’；c’氢上的碳原子与氮原子-N-相连，化学位移值低于d’氢(其碳原子与-O-相连)，在3.40ppm处裂分成三重峰；f’与一个活性羟基(-OH)相连，较c’(与-N-相连)而言，化学位移值向低场移动，在4.09ppm处裂分成三重峰。

实施例2富勒烯天门冬氨酸苄酯

取α-氨基、α-羧基均被保护的天门冬氨酸Boc-ASP-oBzl 0.35mmol110mg，(1-羟基-苯并-三氮唑)HOBt 45mg，用(N-二甲基甲酰胺)DMF 1ml和二氯甲烷10ml溶解，加DIC(N，N-二异丙基二亚胺)65uL混匀后氩气保护室温反应45分钟；然后加入0.035mmol N-取代的3，4-富勒烯吡咯烷和10mg DMAP(4-N，N-二甲基吡啶)，氩气保护下室温反应48h，旋蒸后过柱；用200-300目硅胶填充柱，以5∶1(V/V)甲苯/乙酸乙酯为洗脱剂进行分离；旋蒸、真空干燥后得到BOC保护的富勒烯天门冬氨酸苄酯。然后BOC保护的富勒烯谷氨酸苄酯加入50％TFA/DCM，室温反应30分钟，旋蒸除去溶剂，得固体即为氨基游离的富勒烯天门冬氨酸苄酯(37.05mg，产率95％)。

实施例3富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯

1.天门冬氨酸苄酯-NCA的合成

在干燥的500ml三颈瓶中，加入2g天门冬氨酸苄脂和25ml经分子筛除水的四氢呋喃，通入干燥氩气，加热至50℃时加入1.5g三光气。反应溶液变澄清后停止加热，将反应液倒入石油醚中，得到白色沉淀物，过滤，真空干燥得到粉末状固体天门冬氨酸苄酯-NCA(0.9g，产率36％)。

2.富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯的合成

取0.25g新鲜制备的天门冬氨酸苄酯-NCA，加入25mL苯置于100mL三颈瓶中，通入氩气，加热至40℃，取0.02g氨基游离的富勒烯天门冬氨酸苄酯，溶于二氯甲烷中，引发聚合，反应18h后，将反应液倒入无水乙醇中终止反应，得到絮状棕色沉淀，真空干燥后得到富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯(0.093g，产率37.2％)。其谱图具体见图3-5。

由MAILD-TOF质谱图可知，如图3所示，富勒烯封端聚天冬氨酸苄酯是由分子量从1132到2981左右，具有各种不同聚合度的分子所组成，且离子峰呈现较规则的正态分布，峰值以220Da和130Da递增，与天冬氨酸苄酯和天冬氨酸的质量数220和130相吻合。富勒烯封端聚天冬氨酸苄酯的分子量可以使用公式Mr＝1070+220N计算，其中Mr是聚合物相对分子量，1070是引发剂富勒烯天冬氨酸苄酯的分子量，220是单体天冬氨酸苄酯的分子量，N为单体的个数。利用此公式计算分析可知，实验得到的是单体聚合度从4到10的富勒烯封端聚天冬氨酸苄酯。

富勒烯封端聚天冬氨酸苄酯可很好的溶于甲苯、二氯甲烷中，将其溶于二氯甲烷中得到UV-Vis光谱，如图4所示，富勒烯封端聚天冬氨酸苄酯除具备富勒烯封端的天冬氨酸苄酯的特征吸收峰258nm外，还存在天冬氨酸苄酯-NCA的特征吸收峰229nm。

FTIR光谱中，如图5所示，富勒烯封端聚天冬氨酸苄酯具有天冬氨酸苄酯-NCA的诸多吸收峰，696.81是苯环C-H面外变形振动，1541.17、3295.86是N-H的伸缩振动，1625.38是酰胺C＝O基团的伸缩振动，3033.64是苯环C-H的伸缩振动。图中没发现富勒烯的特征光谱，可能的原因是富勒烯的量比较少，被其他峰遮蔽。

实施例4用MTT法测定富勒烯封端聚天冬氨酸苄酯对Hela细胞的生长的抑制作用

1.实验原理

由于活细胞线粒体内存在琥珀酸脱氢酶，它可将黄色的MTT试剂(四甲基偶氮唑蓝)水解还原成不溶于水的蓝色甲攒颗粒，其吸收波长和光吸收值都有较大的改变。因为线粒体脱氢酶的含量与细胞的数目成正相关，所以蓝色颗粒的多少可以代表细胞的相对数量。又由于死细胞中的琥珀酸脱氢酶失去活力，MTT并不能被还原成蓝色的甲攒颗粒。所以通过在酶标仪上测定细胞裂解液的光吸收值，就可以反映出活细胞的相对数量。

2.实验方法

(1)接种细胞：取一瓶已养满Hela细胞的细胞培养瓶，胰蛋白酶消化，计数后用10％血清的DMEM稀释为20000个细胞/ml的细胞悬液，接种于2块96孔细胞培养板中，每孔接种100μl细胞悬液，尔后置于5％的二氧化碳、37℃的培养箱中培养一天使细胞贴壁完全。

(2)富勒烯封端聚天冬氨酸苄酯工作液的配制：分别从产物的储存液中取出20μl，40μl，80μl，100μl分别加入1ml的3％胎牛血清的DMEM培养基，配制成浓度分别为20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，100μg/ml的工作液。

(3)实验过程：培养好的细胞弃掉培养基，每孔加入配制好的工作液200μl，将药物处理的细胞分为两组：一组是加药组；另一组是不加药组。在96孔板中，每12个孔为一种浓度的药物，对照组按同样的浓度添加，继续培养24小时后，每种药物浓度的12个孔中加入10μL事先配制好的5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h后加入100μL的SDS裂解液，立即转移至96孔酶标仪中(310μL/孔)，在Bio-Rad550型酶标仪上测量各孔在570nm处的光吸收值。

3.结果

本实验检验了不同剂量的富勒烯封端聚天冬氨酸苄酯浓度对HeLa细胞的生长影响，根据细胞增殖抑制率＝(未加药物处理的对照组吸光值-药物处理组的吸光值)/未加药物处理的对照组吸光值计算，使用Bio-Rad550型酶标仪上测量各孔在570nm处的光吸收值，结果见表1。

结果显示了随着药物剂量的加大，其对HeLa细胞生长的抑制作用逐渐加强，在20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml时，抑制率分别达到50.7％，63.9％，87.5％，当浓度达到且在100μg/ml时，细胞的抑制率也达到最高，抑制率为94.7％，此时基本上所有的Hela均已被抑制，丧失生理活性。因此可以推测，富勒烯封端聚天冬氨酸苄酯对生物体内的宫颈癌细胞的抑制作用也同样会呈现出这样的关系，但线性应该有所改变，所以此化合物作为药物载体在医药领域将具有很大的应用。

表1

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯，其结构式为：

其中，n为4-10。

2.权利要求1所述的富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1）2-(2-氨乙氧基)-乙醇和2-溴乙酸苄酯通过氨解反应合成N-取代氨基乙酸苄酯；

2）N-取代氨基乙酸苄酯经催化氢解反应合成N-取代氨基乙酸；

3）C60，多聚甲醛和N-取代氨基乙酸通过1,3-偶极环加成反应合成N-取代的3,4-富勒烯吡咯烷；

4）N-取代的3,4-富勒烯吡咯烷和α-氨基、α-羧基均被保护的天门冬氨酸Boc-ASP-oBzl在HOBT，DMAP，DIC催化下合成富勒烯天门冬氨酸苄酯，脱保护后得到氨基游离的富勒烯天门冬氨酸苄酯；

5）天门冬氨酸苄脂和四氢呋喃反应合成天门冬氨酸苄酯-NCA；

6）步骤5）制备的天门冬氨酸苄酯-NCA和步骤4）的氨基游离的富勒烯天门冬氨酸苄酯通过聚合反应合成富勒烯封端的聚天门冬氨酸苄酯；

其中，步骤4）中，先α-氨基、α-羧基均被保护的天门冬氨酸Boc-ASP-oBzl、（1-羟基-苯并-三氮唑）HOBt和DIC（N,N-二异丙基二亚胺）在室温反应30-60分钟；然后加入N-取代的3,4-富勒烯吡咯烷和DMAP（4-N,N-二甲基吡啶），室温反应24-48h，旋蒸后过柱；用200-300目硅胶填充柱，以5:1甲苯/乙酸乙酯为洗脱剂进行分离；所述脱保护采用加入50%TFA/DCM，室温反应30-60分钟；

步骤5）中，天门冬氨酸苄脂和四氢呋喃在干燥氩气中，加热至50-60℃时加入引发剂三光气，产物用石油醚沉淀。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中，在氩气保护下进行反应，2-(2-氨乙氧基)-乙醇和三乙胺及2-溴乙酸苄酯等量反应，室温下搅拌3-5小时。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤2）中，采用10%钯碳作为催化剂，在氢气中室温搅拌15-20小时。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤3）中，在氩气保护下，C60与N-取代氨基乙酸及多聚甲醛等摩尔反应，120-140℃油浴、回流、磁力搅拌反应16-18h。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤6）中，氨基游离的富勒烯天门冬氨酸苄酯与天冬氨酸苄脂-NCA在40-60℃下聚合14-18小时。