发明内容
本发明提供了一种以氨基酸短肽为配体的模拟SOD化合物。
上述的模拟SOD化合物具有以下化学式:
通式(I)中的M选自Mn、Mg或其他过渡金属元素中的一种,优选的,M选自Mn、Fe、Ni、Zn或Mg中的一种,更优选的M为Mn;n是短肽聚合物的结构单元数,一般控制其为5~7,这样可以使得上述短肽聚合物分子量控制在2000左右;X是水分子数,根据反应条件的不同而会略有差异,一般X为0~2。
所指的氨基酸短肽可以是天冬氨酸短肽,但不仅限于此,也可以是其他氨基酸短肽,或二种及以上多种氨基酸短肽的共聚物。
本发明还提供了一种上述模拟SOD化合物的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)第一阶段,制备氨基酸螯合物纯品:将L-天冬氨酸或D,L-天冬氨酸中的一种和金属化合物按2.0∶0.8~2.0∶1.5的摩尔比,在水溶液中于40~100℃反应2.0~8.0小时后进行提纯处理;
(2)第二阶段,制成短肽为配体的模拟SOD化合物:将来自步骤(1)的提纯后产物于160~260℃再缩聚反应2.0~10.0小时,即得到白色或浅棕色模拟SOD化合物。
上述的金属化合物可以选自二氧化锰、氧化亚锰、硫酸锰、氯化锰、碳酸锰中的一种或选自铁、镍、锌、镁的类似化合物的一种。
本发明还提供了一种上述模拟SOD化合物的制备方法,该方法包括将天冬氨酸金属螯合物于160~260℃缩聚反应2.0~10.0小时,即得到白色或浅棕色模拟SOD化合物。优选的,天冬氨酸金属螯合物为天冬氨酸锰。
本发明还提供了一种上述模拟SOD化合物的应用,本发明将浓度为0.1~10mg/kg模拟SOD化合物水溶液。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的说明,并对下述实施例的产物进行了元素分析、分子量测定、红外光谱测定以及活性测定,并对实施例5的产物进行了稳定性测定。其中利用了Flash EA 1112型元素分析仪进行了元素分析:采用了美国Waters公司凝胶渗透色谱仪进行了分子量测定,该色谱仪的色谱柱:ultrahydrogel linear 6~13μm(7.8×300mm)GPC column,泵:515HPLC pump,检测器:示差折光检测器-717Autosample;采用了Nicolet-210FTIR进行红外光谱测定。
实施例1
称取天冬氨酸锰30.0g,倒入装有120ml蒸馏水的250ml三角瓶中,在80℃下搅拌至完全溶解成透明溶液,经适当精制处理后,在180~205℃进行缩聚反应4~5h。最终形成白色粉末状固体。产率93.92%。
C H N
元素分析(%) 计算值 30.11 3.79 8.78
实测值 29.75 4.15 8.69
生物活性测定 (氯化NBT法) (见表1,2)
红外光谱测定 3151~3424cm-1强吸收(-NH伸缩振动,氢键)
1579.63cm-1强吸收(酰胺C=O,-NH变形振动)
1395.78cm-1(-COO-伸缩振动)
凝胶色谱分析 重均分子量
MW=1906
实施例2
称取L-天冬氨酸60.0g,倒入装有240ml蒸馏水的已预热至60℃的500ml三口瓶中,搅拌,升温至85℃,加入氧化亚锰18.81g,保温反应4.5小时,物料呈淡红色,PH=6.8。经适当精制处理后,在180~210℃进行缩聚反应5.5h,得白色粉末状固体。产率90.78%。
C H N
元素分析(%) 计算值 30.11 3.79 8.78
实测值 30.03 3.97 8.74
生物活性测定 (氯化NBT法) (见表1,2)
红外光谱测定 3134~3424cm-1强吸收(-NH伸缩振动,H键)
1585.30cm-1强吸收(酰胺C=O,-NH变形振动)
1400.41cm-1(-COO-伸缩振动)
凝胶色谱分析 重均分子量
MW=1726
实施例3
称取L-天冬氨酸27.0g,倒入装有200ml蒸馏水的1L三口瓶中,升温至80~90℃,分批加入11.7g碳酸锰在90℃保温,反应4~5h,经适当精制处理后,为透明液体,在180~220℃缩聚反应3~5h,得浅黄色粉末状固体。产率93.03%。
C H N
元素分析(%) 计算值 33.92 2.83 9.90
实测值 33.12 3.24 9.31
生物活性测定 (氯化NBT法)(见表1,2)
红外光谱测定 3265~3419cm-1强吸收(-NH伸缩振动,H键)
1587.76cm-1 强吸收(酰胺C=O,-NH变形振动)
1402.20cm-1 (-COO-伸缩振动)
1713.46cm-1 (酰亚胺基峰)
凝胶色谱分析 重均分子量
MW=2480
实施例4 (放大试验)
称取L-天冬氨酸270g,倒入装有1200ml蒸馏水的3L三口瓶中,升温至80~90C,分批加入117g碳酸锰,在90℃保温,反应4~5h,经适当精制处理后,为透明液体,在180~220℃缩聚反应3~5h,得浅黄色粉末状固体。产率95.36%。
C H N
元素分析(%) 计算值 33.92 2.83 9.90
实测值 33.12 3.42 9.77
生物活性测定 (氯化NBT法) (见表1,2)
红外光谱测定3276.81cm-1 强吸收(-NH伸缩振动,H键)
1587.07cm-1 强吸收(酰胺C=O,-NH变形振动)
1400.97cm-1(-COO-伸缩振动)
1717.60cm-1 (酰亚胺基峰)
凝胶色谱分析 重均分子量
MW=2360
实施例5(放大试验)
称取天冬氨酸锰400.0g,倒入装有1600ml蒸馏水,已予热至60℃的3000ml三口瓶中,搅拌、升温至80℃,保温、搅拌至物料完全溶解成透明溶液,经适当精制处理后,在180~195℃缩聚反应5.5h,得白色粉末状固体。产率96.06%。
C H N
元素分析(%) 计算值 30.11 3.79 8.78
实测值 30.29 3.95 8.89
生物活性测定 (氯化NBT法) (见表1,2)
红外光谱测定 3148~3424cm-1强吸收(-NH伸缩振动,H键)
1588.17cm-1 强吸收(酰胺C=O,-NH变形振动)
1396.81cm-1 (-COO-伸缩振动)
凝胶色谱分析重均分子量
MW=1900
采用了氮蓝四唑(NBT)光照法对上述实施例中模拟SOD的活性进行了测定,所用仪器为UV--4802型(UNICO)可控温紫外可见光分光光度计。
按照农业上应用的模拟SOD浓度1~10(mg/kg)测定其抑制超氧阴离子自由基(·O2 -)歧化反应的结果,计算出了模拟SOD的抑制率和活力。同时与天然SOD作了对照,由表1可知,在实际使用浓度范围内,模拟SOD与天然SOD的抑制率相近,由表2可知模拟SOD活性达到天然SOD活性50~70%的水平。
表1天然SOD和模拟SOD对超氧阴离子自由基的抑制率
项目 |
10(mg/kg)抑制率(%) |
1(mg/kg)抑制率(%) |
测定值 |
平均值 |
测定值 |
平均值 |
天然SOD |
88.7 87.2 87.2 |
87.6 |
81.1 81.7 81.1 |
81.3 |
实施例1 |
93.1 91.9 92.6 |
92.5 |
74.6 75.3 74.6 |
74.8 |
实施例2 |
91.0 91.8 91.1 |
91.3 |
73.1 71.4 73.3 |
72.6 |
实施例3 |
90.1 90.6 91.1 |
90.6 |
75.8 76.1 76.4 |
76.1 |
实施例4 |
90.5 90.8 91.1 |
90.8 |
84.6 83.9 85.3 |
84.6 |
实施例5 |
90.1 92.0 92.1 |
91.4 |
78.5 79.3 80.4 |
79.4 |
注:上表中是对每一测定样均同时称取三份试样作平行测定,取其算术平均值为结果。
表2天然SOD与模拟SOD的比活力
样名 |
比活力(U/mg) |
模拟SOD比活力/天然SOD比活力(%) |
天然SOD |
4464.3 |
- |
实施例1 |
2340.8 |
52.43 |
实施例2 |
2455.8 |
55.01 |
实施例3 |
2723.3 |
61.00 |
实施例4 |
3272.3 |
73.30 |
实施例5 |
2847.4 |
63.78 |
上表中的活力为:每毫克组织蛋白或模拟物在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力(U/mg prot)。
此外,还对实施例5中的模拟SOD化合物进行了稳定性测试。为了获得活力稳定性数据,对1份制备完毕的模拟SOD立即测定活性,并快速将另一份试样封存于密闭塑料袋中,在常温常压条件下贮存3个月,然后重新测定其抑制率(见表3)。由表3可知,密闭、常温常压贮存3个月再进行抑制率测定结果在允许误差之内。
表3模拟SOD稳定性
项目 |
新产品立即测定抑制率(%) |
贮存3月后测定抑制率(%) |
10(mg/kg) |
1(mg/kg) |
10(mg/kg) |
1(mg/kg) |
实施例5 |
92.4 |
78.5 |
91.3 |
79.4 |
实施例6(有关本发明模拟SOD化合物在农业上的应用)
采用实施例5所制备出模拟Mn-SOD化合物,将其制备成浓度30%溶液,稀释至0.1~10mg/kg Mn-SOD制剂的水溶液,然后对棉花苗期及生长期进行浇灌和喷施,与对照组相比,其结果如下:
棉花试验结果:试验5亩棉田用上述Mn-SOD制剂先后喷施4次,第一次喷施是在棉苗长到10cm时,第二次苗长到50~80cm时,第三次是在棉花现蕾期,第四次是在棉花花铃期,与2亩对照组相比较,其管理、土壤、底肥、追肥条件都相同。
喷施浇灌过Mn-SOD制剂的棉田对棉花枯萎病、黄萎病具有防治作用,没有一株棉花死亡,而没喷施浇灌Mn-SOD制剂的有1/3发生枯萎病、黄萎病,棉苗死亡。
试验组别 |
棉花株高(cm) |
每亩平均结桃数 | 死亡株数 | 早熟天数 |
亩产量(kg) |
增产百分率% |
喷施浇灌Mn-SOD制剂溶液 | 90 | 30~40 | 无死亡 | 10天 | 350 | 40 |
没喷施浇灌Mn-SOD制剂溶液 | 80 | 20~30 | 死亡1/3 | - | 250 | - |
从上述实施例来看:产品经元素分析证实,其组成与通式(1)相符;经氯化NBT法测定其生物活性,活力达到2000U/mg prot以上,与天然SOD相比,可达到天然SOD活性的50~70%;经凝胶色谱测定可知,其分子量在1700至2500之间;经红外光谱和核磁共振测试结果证实,产物分子链上确实存在相当数量的肽键;经北京疾病预防与控制中心毒理学试验证实(No.L0328号检测报告),急性经口毒性试验LD50》5000mg/kgBW,本发明的模拟Mn-SOD化合物急性毒性分级标准判定为微毒。
本发明的模拟SOD化合物的生物活性较高,活性的稳定性较好,至少在三个月之内抑制率可以维持不变;分子量较低(2500以下),有利于透过生物体细胞膜;并且以天冬氨酸短肽为配体从而在分子链上保留一定数量憎水性基团,增强了其脂溶性;此外本发明的模拟Mn-SOD化合物属于微毒,因此本发明的模拟SOD化合物具有广泛的应用前景。