CN103059299B

CN103059299B - 一种复合型msod及其生产工艺

Info

Publication number: CN103059299B
Application number: CN201310022761.2A
Authority: CN
Inventors: 李文曦; 董志强
Original assignee: SHIJIAZHUANG DEVELOPMENT ZONE DESAI CHEMICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HEBEI XIETONG ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2033-01-22
Also published as: CN103059299A

Abstract

本发明公开了一种复合型MSOD及其生产工艺，复合型MSOD包括聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸锰，聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸锰的摩尔比为30:1~50:1。复合型MSOD的生产工艺包括以下步骤：A、聚琥珀酰亚胺的制备；B、聚琥珀酰亚胺的水解，生成聚天冬氨酸钾溶液；C、调节聚天冬氨酸钾溶液的pH值；D、复合，向聚天冬氨酸钾溶液中加入可溶性锰盐，控制温度和时间；E、降温至常温，放料分装。本发明的复合型MSOD适用于农业生产中，不但能增强农作物的抗逆性，而且能促进农作物对肥料及其他营养元素的吸收。且该生产工艺简单、生产成本低，易于实现工业化。

Description

一种复合型MSOD及其生产工艺

技术领域

本发明涉及一种超氧化物歧化酶模型化合物，尤其涉及一种复合型MSOD及其生产工艺。

背景技术

随着全球环境的恶化，干旱、盐胁迫、高低温胁迫等逆境对作物生产的影响日益严重。在盐碱、干旱、冰冻、涝渍、热害、病虫害和重金属离子等逆境条件下植物体内会产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），这种活性氧的积累会导致植物细胞膜的损坏，核酸和蛋白质等生物大分子的降解，从而使植物生产受阻，甚至死亡。逆境胁迫引起的活性氧的积累可以通过抗氧化酶系统来消除，即植物抗胁迫能力的提高与植物体内的抗氧化酶系统有关。植物体内的抗氧化酶系统主要有：超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPX）等。

其中，超氧化物歧化酶（SOD）作为一种重要的活性氧清除酶，被认为是植物体中一种非常重要的抗氧化酶，它广泛存在于生物体中，几乎参与了生物体中所有的对抗各种逆境胁迫的生理生化反应，其活性水平对植物抗逆性有着重要影响，它能保护植物，抵抗外界环境的胁迫。可见，在胁迫条件下对植物施加外源SOD是提高植物抗逆性能的有效途径，但是天然超氧化物歧化酶（SOD）具有分子量大、不易渗透细胞膜、在生物体内半衰期短、具有异体抗原性及价格昂贵等缺点，在实际应用过程中受到很大限制。

近年来国内外的学者根据天然超氧化物歧化酶（SOD）的活性部位结构设计和合成了超氧化物歧化酶模型化合物（Models of superoxide dismutasem，MSOD），以弥补天然SOD的不足。CN 100347180C公布了一种以氨基酸短肽为配体的模拟SOD化合物及其制备方法，该发明以氨基酸短肽为配体的模拟SOD化合物具有以下化学式：

其中，M选自Mn、Mg或其他过渡金属元素中的一种；X为0~2；n为5~7。其制备方法包括以下步骤：（1）第一阶段，制备氨基酸螯合物：将L-天冬氨酸或D,L-天冬氨酸中的一种和金属化合物按2.0:0.8~2.0:1.5的摩尔比，在水溶液中于40~100℃反应2~8小时后进行提纯处理；（2）第二阶段，制成短肽为配体的模拟SOD化合物：将来自步骤（1）的提纯后产物于160~260℃再缩聚反应2~10小时，即得到白色或浅棕色模拟SOD化合物。该发明得到的模拟SOD化合物为单一化合物，虽然具有较高的生物活性和水溶性，以及良好的稳定性，但是在农业中应用时需要将其配制成溶液，使用步骤繁琐，且功能也较为单一，仅致力于增强农作物的抗逆性能。此外，该发明的制备过程中需要提纯处理，容易产生三废，造成环境污染。

高分子通报2004年第4期中的《聚天冬氨酸铁（II）、聚天冬氨酸锰（II）配合物合成与清除作用》（李金等），公开了聚天冬氨酸铁配合物和聚天冬氨酸锰配合物的制备方法，具体为：取聚琥珀酰亚胺（平均分子量约为3000）溶于氨水中，用盐酸调节溶液pH值为4；另取硫酸亚铁或取硫酸锰溶于蒸馏水。将两种溶液混合，恒温60℃，搅拌4h后取出，冷却至室温，用乙醇洗涤，抽滤后将固体产物用蒸馏水溶液洗涤，然后再用乙醇沉淀提纯。该制备方法得到的也是一种单一型的固体MSOD，且制备过程中需要经过多次提纯，不但步骤繁琐，还易产生污染。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种适用于农业肥料中应用的、不但具有提高农作物抗逆性，而且在逆境条件下也利于农作物对肥料及其它营养成分吸收的复合型MSOD及其生产工艺。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种复合型MSOD，包括聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸锰，所述聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸锰的摩尔比为30:1~50:1。

一种复合型MSOD的生产工艺，包括下述步骤：

A、聚琥珀酰亚胺的制备：将工业级固体L-天冬氨酸加热到200℃~250℃直接聚合，聚合时间为2.0h~3.0h，得到聚琥珀酰亚胺；

B、水解：将步骤A所制得的聚琥珀酰亚胺加入到水解釜，然后向水解釜中加入水，搅拌均匀后再向水解釜中加入氢氧化钾，控制温度在50℃~80℃，水解时间为1.5h~5.0h，得聚天冬氨酸钾溶液，物料加入量按质量份数计为：聚琥珀酰亚胺10份，水20份~25份，氢氧化钾5份~6份；

C、溶液pH值调节：向水解釜中加入酸性溶液，调节步骤B所得的聚天冬氨酸钾溶液的pH值至6.5~7.0；

D、复合：向聚天冬氨酸钾溶液中加入可溶性锰盐，搅拌，使可溶性锰盐溶解，控制温度在50℃~80℃，恒温0.5h~1.5h，聚天冬氨酸钾溶液和可溶性锰盐的配比按质量份数比计为：100份:0.75份~100份:2份；

E、降温至常温，放料分装。

本发明的进一步改进在于：所述步骤C中用于调节溶液pH值的酸性溶液为硝酸、甲酸、乙酸、磷酸中的一种。

本发明的进一步改进在于：所述可溶性锰盐为硫酸锰、氯化锰、硝酸锰中的一种或几种的混合。

由于采用了上述技术方案，本发明所取得的技术进步在于：

本发明复合型MSOD适用于农业生产，不但具有良好的抗逆性，而且在逆境条件下也利于农作物对肥料及其他营养成分的吸收。复合型MSOD与聚天冬氨酸锰相比具有更为优良的抗逆性和促进农作物营养成分吸收的作用，与聚天冬氨酸钾相比也具有更为优良的促进农作物营养成分吸收作用和抗逆性，有助于增加农作物产量和改善农作物品质。本发明复合型MSOD对超氧阴离子自由基的抑制率与天然SOD相当，其活性水平为天然SOD活性水平的75.56%~77.49%；当将其添加入肥料中时，不仅能明显提高农作物抵抗外界逆环境胁迫的能力，增强农作物的抗旱、抗寒、抗渍和抗早衰性能；而且由于复合型MSOD中含有相当量的聚天冬氨酸钾，还能有效促进农作物根系的生长，提高农作物对肥料中营养元素的吸收、提高肥料的利用率，节约化肥，以及提高农作物种子的发芽率和出土率。

本发明复合型MSOD的生产工艺简单、生产成本低，易于实现工业化；且生产过程中无废弃物排放，对环境无污染；此外，本发明制得的复合型MSOD为液体型，可直接作为肥料添加剂使用，无需进行再次溶解，使用简便。

本发明复合型MSOD的生产工艺中通过添加酸性溶液对溶液的pH值进行调节，可有效避免水解步骤中残留的氢氧根离子与后续添加的可溶性锰盐结合形成不溶性的氢氧化锰。此外，为避免酸性溶液对环境、土壤的破坏，所用酸性溶液可优选对环境无害的甲酸、乙酸、磷酸。

附图说明

图1为本发明复合型MSOD和聚天冬氨酸的NMR图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细描述。

实施例1

将100g工业级固体L-天冬氨酸放入500ml圆底烧瓶中，在240℃油浴加热搅拌聚合，反应时间为2.0h，物料颜色变深为棕色，然后停止加热和搅拌，降温，取出物料并称重，得到聚琥珀酰亚胺71.5g，收率71.5%。

将50g聚琥珀酰亚胺加入250ml烧瓶中，然后向烧瓶中加入125g水，搅拌后向烧瓶中缓慢加入25g氢氧化钾，控制温度在50℃，水解2.0h，得到聚天冬氨酸钾溶液198g。

用硝酸调节溶液pH值为6.5，然后加入2.5g一水合硫酸锰，搅拌使其充分溶解，控制温度在60℃，恒温1.0h后，降温至常温，得到复合型MSOD199g，其中聚天冬氨酸钾与聚天冬氨酸锰的摩尔比为30:1。

经检测，该复合型MSOD溶液中的固含量为40%，用氮蓝四唑（NBT）法检测1mL酶液的活力为72150U。

采用1H-NMR（D2O）对实施例1所制得的复合型MSOD进行定性表征。表征结果如图1所示。其中，A为聚天冬氨酸的NMR图，B为实施例1所制得的复合型MSOD的NMR图。由于锰和钾的存在，造成B图出现核磁共振弛豫现象，致使其峰裂分出现异常，但是其峰的位移及峰型与A图基本一致，说明MSOD的主要结构仍为聚天冬氨酸。

实施例2

将150g工业级固体L-天冬氨酸放入500ml圆底烧瓶中，在250℃油浴加热搅拌聚合，反应时间为2.0h，物料颜色变深为棕色，然后停止加热和搅拌，降温，取出物料并称重，得到聚琥珀酰亚胺108g，收率72.0%。

将80g聚琥珀酰亚胺加入500ml烧瓶中，然后向烧瓶中加入160g水，搅拌后向烧瓶中缓慢加入46.5g氢氧化钾，控制温度在60℃，水解3.5h，得聚天冬氨酸钾溶液280g。

用乙酸调节溶液pH值为6.8，然后加入2.1g无水氯化锰，搅拌使其充分溶解，控制温度在70℃，恒温1.5h后，降温至常温，得到复合型MSOD281g，其中聚天冬氨酸钾与聚天冬氨酸锰的摩尔比为50:1。

经检测，该产品固含量为41.3%，用氮蓝四唑（NBT）法检测1mL酶液的活力为71350U。

实施例3

将150g工业级固体L-天冬氨酸放入500ml圆底烧瓶中，在225℃油浴加热搅拌聚合，反应时间为2.5h，物料后颜色变深为棕色，然后停止加热和搅拌，降温，取出物料并称重，得到聚琥珀酰亚胺105g，收率70.0%。

将80g聚琥珀酰亚胺加入500ml烧瓶中，然后向烧瓶中加入180g水，搅拌后向烧瓶中缓慢加入44g氢氧化钾，控制温度在80℃，水解5.0h，得聚天冬氨酸钾溶液300g。

用磷酸调节溶液pH值为7.0，然后加入6g四水合硝酸锰，搅拌使其充分溶解，控制温度在50℃，恒温0.5h后，降温至常温，得到复合型MSOD305g，其中聚天冬氨酸钾与聚天冬氨酸锰的摩尔比为33:1。

经检测，该产品固含量为40.5%，用氮蓝四唑（NBT）法检测1mL酶液的活力为72350U。

实施例4

将150g工业级固体L-天冬氨酸放入500ml圆底烧瓶中，在200℃油浴加热搅拌聚合，反应时间为3.0h，物料后颜色变深为棕色，然后停止加热和搅拌，降温，取出物料并称重，得到聚琥珀酰亚胺106g，收率70.7%。

将80g聚琥珀酰亚胺加入500ml烧瓶中，然后向烧瓶中加入175g水，搅拌后向烧瓶中缓慢加入48g氢氧化钾，控制温度在70℃，水解1.5h，得聚天冬氨酸钾溶液300g。

用乙酸调节溶液pH值为6.6，然后加入5g四水合硝酸锰，搅拌使其充分溶解，控制温度在80℃，恒温1.5h后，降温至常温，得到复合型MSOD304g，其中聚天冬氨酸钾与聚天冬氨酸锰的摩尔比为44:1。

经检测，该产品固含量为40.6%，用氮蓝四唑（NBT）法检测1mL酶液的活力为71864U。

实施例5

将150g工业级固体L-天冬氨酸放入500ml圆底烧瓶中，在230℃油浴加热搅拌聚合，反应时间为2.2h，物料后颜色变深为棕色，然后停止加热和搅拌，降温，取出物料并称重，得到聚琥珀酰亚胺107g，收率71.3%。

将80g聚琥珀酰亚胺加入250ml烧瓶中，然后向烧瓶中加入170g水，搅拌后向烧瓶中缓慢加入42g氢氧化钾，控制温度在80℃，水解4h，得到聚天冬氨酸钾溶液287g。

用甲酸调节溶液pH值为6.7，然后加入4g四水合硝酸锰和1g四水合硫酸锰，搅拌使其充分溶解，控制温度在65℃，恒温1.0h后，降温至常温，得到复合型MSOD295g，其中聚天冬氨酸钾与聚天冬氨酸锰的摩尔比为38:1。

经检测，该产品固含量为40.3%，用氮蓝四唑（NBT）法检测1mL酶液的活力为73180U。

实施例6(工业放大)

将50kg工业级固体L-天冬氨酸加入到盘式干燥器中，在250℃油浴加热搅拌聚合，反应时间为2.0h，物料颜色变深为棕色，然后停止加热和搅拌，降温，取出物料并称量，得到聚琥珀酰亚胺36kg，收率72%。

将255kg聚琥珀酰亚胺加入到1m³的反应釜中，加水605kg，搅拌，缓慢分三次加入148kg氢氧化钾，控制温度在52℃，水解4h，得到聚天冬氨酸钾溶液1005kg。

用磷酸酸调节溶液pH值为6.5，然后加入12kg一水合硫酸锰，搅拌使其溶解，控制温度在60℃，恒温1.0h后，降温至常温，得到复合型MSOD 1017kg，其中聚天冬氨酸钾与聚天冬氨酸锰的摩尔比为37:1。

经检测，该产品固含量为40.1%。用氮蓝四唑（NBT）法检测1mL酶液的活力为71385U。

取实施例1~6所制得的复合型MSOD，在1~10mg/kg范围内测定了其抑制超氧阴离子自由基歧化反应效果，计算出了其对超氧阴离子自由基的抑制率和活力，并与天然SOD进行比较，其结果如下表1所示。

表1复合型MSOD活性测试结果

注：上表中的结果是对每一测定样同时称取三份试样进行平行测定后所取的算术平均值；上表中的活力为：每毫克组织蛋白或复合MSOD在1ml反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD的量即为1个SOD活力(U)。

由表1结果可知，复合型MSOD对超氧阴离子自由基的抑制率与天然SOD相当，其活性水平为天然SOD活性水平的75.56%~77.49%。

实施例7（复合型MSOD在农业上的应用）

小麦应用试验

试验用肥料

第一组：添加0.01~20mg/kg实施例6所制备的复合型MSOD的底肥和追肥；

第二组：添加0.01~20mg/kg聚天冬氨酸钾的底肥和追肥；

第三组：添加0.01~20mg/kg聚天冬氨酸锰的底肥和追肥；

第四组：不添加其它任何成分的底肥和追肥。

试验用小麦田

第一组：10亩；

第二组：5亩；

第三组：5亩；

第四组：5亩。

将第一组肥料用于上述第一组小麦田中，即用添加有复合型MSOD的底肥在小麦播种后进行施肥，将添加有复合型MSOD的追肥在小麦返青时施肥；将第二组肥料用于第二组小麦田中，即用添加有聚天冬氨酸钾的底肥在小麦播种后进行施肥，将添加有聚天冬氨酸钾的追肥在小麦返青时施肥；将第三组肥料用于第三组小麦田中，即用添加有聚天冬氨酸锰的底肥在小麦播种后进行施肥，将添加有聚天冬氨酸锰的追肥在小麦返青施肥；将第四组肥料用于第四组小麦田中，即用不添加其它任何成分的底肥在小麦播种后进行施肥，将不添加其它任何成分的追肥在小麦返青时施肥，其结果如下表2所示。

表2小麦试验结果

试验组别	穗粒数/个	亩穗数/万	千粒重/g	亩产量/kg	增产率/％
						第一组	36.7	47.2	38.6	623.6	11.2
第二组	35.7	46.8	38.4	587.8	4.8
						第三组	36.2	46.7	37.5	579.3	3.3
第四组	35.2	46.5	37.4	561.0	-

注：上述四组肥料中所有的底肥和追肥及其它管理均相同。

由上表2可知，施加过含有复合型MSOD的底肥和追肥的麦田较施加过不添加任何其它成分的底肥和追肥的的麦田，其亩穗数增加1.5%，每穗粒数增加4.3%，每千粒重增加3.2%，实际增产9.2%；且施加过添加复合型MSOD的底肥和追肥的麦田较施加过添加聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸锰的底肥和追肥的麦田，其亩穗数分别增加0.86%和1.07%，每穗粒数分别增加2.8%和1.4%，每千粒重分别增加0.52%和2.9%，实际增产6.1%和7.6%。可见，本发明复合型MSOD能增加小麦的出苗率、增强其抗旱性、抗病性和对微量元素的吸收，并最终增加小麦亩产和品质。

黄瓜应用试验

试验用肥料

第一组：添加0.01~20mg/kg实施例3所制备的复合型MSOD的追肥；

第二组：添加0.01~20mg/kg聚天冬氨酸钾的追肥；

第三组：添加0.01~20mg/kg聚天冬氨酸锰的追肥；

第四组：不添加其它任何成分的追肥。

试验用黄瓜田

第一组：3亩；

第二组：1亩；

第三组：1亩；

第四组：1亩。

将第一组肥料用于上述第一组黄瓜田中，即用添加有复合型MSOD的追肥在黄瓜开花前进行叶面喷施1次；将第二组肥料用于第二组黄瓜田中，即用添加有聚天冬氨酸钾的追肥在黄瓜开花前进行叶面喷施1次；将第三组肥料用于第三组黄瓜田中，即用添加有聚天冬氨酸锰的追肥在黄瓜开花前进行叶面喷施1次；将第四组肥料用于第四组小麦田中，即用不添加其它任何成分的追肥在黄瓜开花前进行叶面喷施1次，其结果如下表3所示。

表3黄瓜试验结果

试验组别	平均株高/cm	叶片发病率/％	结果率/％	亩产量/kg	增产率/％
						第一组	186.7	7.9	96.3	8846.7	13
第二组	182.6	12.6	93.2	8096.0	3.4
						第三组	175.3	7.9	96.1	8284.1	5.8
第四组	170.4	23.6	84.9	7829.6	-

注：上述四组肥料中的追肥及其它管理均相同。

由上表3可知，喷施过添加有复合型MSOD的追肥的黄瓜与喷施过不添加其它任何其它成分的追肥的黄瓜相比，平均株高增加9.6%，叶片发病率降低66.5%，结果率增加13.4%，实际增产12.9%；喷施过添加有复合型MSOD的追肥的黄瓜与喷施过添加有聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸锰的追肥的黄瓜相比，平均株高增加2.2%和6.5%，叶片发病率降低37.3%和0%，结果率增加3.3%和0.2%，实际增产9.3%和6.8%。可见，本发明复合型MSOD能增强黄瓜的抗病性、增加其结果率。

Claims

1.一种复合型MSOD，其特征在于：包括聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸锰，所述聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸锰的摩尔比为30:1~50:1。

2.一种复合型MSOD的生产工艺，其特征在于：包括下述步骤：

E、降温至常温，放料分装。

3.根据权利要求2所述的复合型MSOD的生产工艺，其特征在于：所述步骤C中用于调节溶液pH值的酸性溶液为硝酸、甲酸、乙酸、磷酸中的一种。

4.根据权利要求2所述的复合型MSOD的生产工艺，其特征在于：所述可溶性锰盐为硫酸锰、氯化锰、硝酸锰中的一种或几种的混合。