CN117233306A - 一种金丹附延颗粒指纹图谱建立及其成分含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药制剂技术领域，具体涉及一种金丹附延颗粒指纹图谱建立及其成分含量测定方法，该方法先制备供试品溶液和对照品溶液，然后将供试品溶液和对照品溶液分别用HPLC进行测定，记录色谱图并进行比对，指认共有峰，建立金丹附延颗粒指纹图谱。本发明通过优化供试品溶液制备工艺和HPLC色谱条件，成功建立了金丹附延颗粒指纹图谱，且能同时检测金丹附延颗粒中10种有效成分，该方法准确、可靠、操作简单，可为该制剂质量控制提供依据，还可为完善金丹附延颗粒的质量标准，为提高该品种有效性奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂技术领域，具体涉及一种金丹附延颗粒指纹图谱建立及其成分含量测定方法，更具体地涉及一种金丹附延颗粒HPLC指纹图谱建立及其10种成分含量测定方法。
背景技术
金丹附延颗粒由牡丹皮、金银花、败酱草、大血藤、赤芍、莪术、延胡索（制）、薏苡仁、没药（制）、桃仁、桂枝、香附、当归等十三味药制成，具有清热利湿，活血化瘀，行气止痛之功效，主要主治慢性盆腔炎证属湿热内蕴的治疗。在治疗慢性盆腔炎方面，该品种相比抗生素疗法以及中药灌肠等疗法，具有患者依从性好、治愈率高、不易复发等优势。
金丹附延颗粒药味众多、生产工艺复杂，虽然有薄层鉴别及丹皮酚含量测定等方法，但缺乏对产品一致性和质量稳定性整体质量监控方案，质控手段有待进一步提高。
指纹图谱作为评价中成药制剂批间均一性的重要方法，同时多组分含量测定是近年来主要提倡开展的含量测定方法，将两者有机地结合在一起，对有效控制制剂批间均一性和有效性具有重要作用。
基于以上因素，建立一种金丹附延颗粒HPLC对照指纹图谱同时测定其中主要成分含量的方法很有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种金丹附延颗粒指纹图谱建立及其成分含量测定方法，该方法准确、可靠、操作简单，可为该制剂质量控制提供依据，还可为完善金丹附延颗粒的质量标准，为提高该品种有效性奠定基础。
本发明提供一种金丹附延颗粒指纹图谱建立方法，包括以下步骤，
（1）供试品溶液的制备：取金丹附延颗粒适量，研细，取5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理10min-30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（2）对照品溶液的制备：取没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、芍药苷、丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸各40μg、含芍药苷100μg、含丹皮酚65μg的混合对照品溶液，即得；
（3）指纹图谱的建立：将供试品溶液和对照品溶液分别用HPLC进行测定，记录色谱图并进行比对，指认共有峰，建立金丹附延颗粒指纹图谱。
进一步地，上述技术方案步骤（1）和步骤（2）中，甲醇浓度为75%。本技术方案中采用75%甲醇对样品进行提取，有利于提高提取效率，得到的色谱峰峰高且峰型好。
进一步地，上述技术方案步骤（1）中，所述超声处理的功率为500W，频率为40kHz。本技术方案中，通过对样品采用超声处理，提取效果更好，有利用得到更好的色谱峰和峰型。
进一步地，上述技术方案中，步骤（3）中，HPLC的色谱条件为：
色谱柱为Waters Symmetry C18，250mm×4.6mm，5μm；
流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，进行梯度洗脱；
检测波长为250nm-280nm，优选为254nm；
流速为1mL/min；
柱温为25℃-35℃，优选为30℃；
进样量为10μＬ；
理论板数按绿原酸峰计算应不低于10000。
本发明通过优化色谱条件，各成分分离效果好，基线平稳，各峰响应值较均衡，峰型好。
进一步地，上述技术方案中，梯度洗脱的程序为0～5min，7％乙腈；5～15min，7％～10％乙腈；15～50min，10％～30％乙腈；50～60min，30％～60％乙腈；60～65min，60％～70％乙腈；65～66min，70％～90％乙腈；66～70min，90％乙腈。
进一步地，上述技术方案步骤（3）中，将供试品溶液色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”与对照品溶液色谱图进行相似度评价，当相似度＞0.9时，表明金丹附延颗粒批件均一性良好。
进一步地，上述技术方案中，步骤（3）中，所述共有峰为10个，其中，峰1为没食子酸，保留时间为4.947min、峰2为原儿茶酸，保留时间为10.150min、峰3为新绿原酸，保留时间为12.223min、峰4为绿原酸，保留时间为19.470min、峰5为隐绿原酸，保留时间为21.800min、峰6为芍药苷，保留时间为29.053min、峰7为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸，保留时间为38.923min、峰8为3,5-O-二咖啡酰奎宁酸，保留时间为39.807min、峰9为4,5-O-二咖啡酰奎宁酸，保留时间为42.300min、峰10为丹皮酚，保留时间为58.317min。
本发明还提供一种金丹附延颗粒成分含量测定方法，取金丹附延颗粒样品按上述金丹附延颗粒指纹图谱建立方法中供试品溶液制备方法、HPLC测定条件进样测定，计算样品中成分含量。
进一步地，上述技术方案中，金丹附延颗粒由牡丹皮、金银花、败酱草、大血藤、赤芍、莪术、延胡索（制）、薏苡仁、没药（制）、桃仁、桂枝、香附、当归十三味药制成的颗粒制剂。
相对于现有技术的有益效果：
1.本发明通过优化HPLC色谱条件，成功建立了金丹附延颗粒指纹图谱，可为完善金丹附延颗粒的质量标准，提高该品种有效性奠定基础。
2.本发明还可同时检测金丹附延颗粒中没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、芍药苷、丹皮酚10种有效成分的含量，为金丹附延颗粒制剂的质量控制提供依据。
3.本发明指纹图谱建立方法准确、可靠、操作简单，检测方法精密度高，专属性、稳定、重复性好。
附图说明
图1为本发明实施例1中15批金丹附延颗粒HPLC叠加图谱（S1-S15）及对照图谱R；
图2为本发明实施例1中混合对照品色谱图；
图3为本发明金丹附延颗粒HPLC色谱图；
图4为本发明空白样品溶液色谱图；
图5为本发明实施例2中专属性试验色谱图；
图6为本发明实施例3中金丹附延颗粒（甲醇提取）HPLC色谱图；
图7为本发明实施例3中金丹附延颗粒（乙醇提取）HPLC色谱图；
图8为本发明实施例3中金丹附延颗粒加热回流30min的HPLC色谱图；
图9为本发明实施例3中金丹附延颗粒超声提取10min的供试品HPLC色谱图；
图10为本发明实施例3中金丹附延颗粒超声提取60min的供试品HPLC色谱图；
图11为本发明实施例3中金丹附延颗粒供试品流动相乙腈-0.1%冰醋酸指纹图谱；
图12为本发明实施例3中金丹附延颗粒供试品流动相乙腈-0.1%甲酸指纹图谱；
图13为本发明实施例3中金丹附延颗粒供试品溶液在280nm下的HPLC色谱图；
图14为本发明实施例3中金丹附延颗粒供试品在300nm下的HPLC色谱图；
图15为本发明实施例3中金丹附延颗粒供试品在326nm下的HPLC色谱图；
图16为本发明实施例3中金丹附延颗粒供试品在柱温为25℃下的HPLC色谱图；
图17为本发明实施例3中金丹附延颗粒供试品在柱温为35℃下的HPLC色谱图；
图18为本发明实施例3中金丹附延颗粒供试品在色谱柱为②Agilent 5TC(2) C18下的HPLC色谱图；
图19为本发明实施例3中金丹附延颗粒供试品在色谱柱为③Phenomenex LunaC18下的HPLC色谱图。
其中，峰1为没食子酸、峰2为原儿茶酸、峰3为新绿原酸、峰4为绿原酸、峰5为隐绿原酸、峰6为芍药苷、峰7为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、峰8为3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、峰9为4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、峰10为丹皮酚。
具体实施方式
本发明的上述各项技术特征和在下文（如实施案例）中具体描述的各项技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，但本发明不仅仅局限于这些实施例，同样这些实施例也不以任何方式限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例涉及的制剂若无特别说明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。
下面结合图示和实施例对本发明作进一步详细描述：
实验仪器和试剂：
1、仪器
戴安UltiMate3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞公司）；Agilent 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；岛津LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津制作所）。Sartorius Secura125-1CN电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；Mettler Toledo ML204电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。Milli-QDirect 16 纯水系统（美国Millipore 公司）；KQ-500E型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅[国华（常州）仪器制造有限公司]。
2、试药试剂
没食子酸（纯度：91.5%，批号：110831-201906）、原儿茶酸（纯度：97.7%，批号：110809-201906）、绿原酸（纯度：96.3%，批号：110753-202119）、芍药苷（纯度：94.6%，批号：110736-202145）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸（纯度：95.9%，批号：111782-202208）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸（纯度：94.9%，批号：111894-202205）、丹皮酚（纯度：99.8%，批号：110708-201908）均购自中国食品药品检定研究院；新绿原酸（纯度：98.0%，批号：240008-202005）购自上海永鸿生物科技有限公司；隐绿原酸（纯度：98.0%，批号：AF9080321）购自成都埃法生物科技有限公司；3,4-O-二咖啡酰奎宁酸（纯度：98.0%，批号：3089）购自上海诗丹德科技有限公司。乙腈（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司），磷酸（色谱纯，上海麦克林生化科技股份有限公司），水为Milli-Q制备的超纯水，其余试剂均为分析纯。牡丹皮、金银花、败酱草、大血藤、赤芍、莪术、延胡索（制）、薏苡仁、没药（制）、桃仁、桂枝、香附、当归饮片由江西华太药业有限公司提供。金丹附延颗粒为江西华太药业有限公司提供，批号分别为221114、221115、221117、221123、221124、221201、221202、221203、221204、221021、221022、221024、221105、221106、221107，编号分别为S1-S15。
实施例1：金丹附延颗粒指纹图谱建立
1、溶液的制备
对照品溶液：取没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、芍药苷、丹皮酚对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1mL含没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸各40μg、含芍药苷100μg、含丹皮酚65μg的混合对照品溶液，即得。
供试品溶液：取本品适量，研细，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，称定重量，超声处理30min（功率500W，频率40kHz），放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2、色谱条件
色谱柱为Waters Symmetry C18，规格为250mm×4.6mm，５μｍ；以乙腈（A）和0.1%磷酸溶液（B）为流动相，进行梯度洗脱，洗脱程序如表1所示；检测波长：254nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：10μＬ。
表1 梯度洗脱程序
3、指纹图谱方法学考察
3.1精密度试验：取同一金丹附延颗粒（S4）供试品溶液，按“2”项下色谱条件连续进样6次，记录各共有峰保留时间和峰面积，计算各共有峰保留时间RSD均小于0.2％，峰面积RSD均小于1.0％，表明仪器精密度良好。
3.2稳定性试验：取同一金丹附延颗粒（S4）供试品溶液，按“2”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样，记录各共有峰保留时间和峰面积，计算各共有峰保留时间RSD均小于0.2％，峰面积RSD均小于2.5％，表明供试品溶液在24ｈ内稳定性良好。
3.3重复性试验：取同一金丹附延颗粒样品（S4），按“1”项下方法制备６份供试品溶液，按“2”项下色谱条件进样测定，记录各共有峰保留时间和峰面积，计算各共有峰保留时间RSD均小于0.3％，峰面积RSD均小于1.9％，表明该方法重复性良好。
3.4指纹图谱的建立及色谱峰的指认：取15批金丹附延颗粒，按“1”项下方法制备供试品溶液，按“2”项下色谱条件进样，记录色谱图，分别在戴安Chromeleon色谱工作站（版本7.2.10）设定积分参数，对主要色谱峰进行积分。逐个以CDF数据文件的形式，导出谱图的CDF文件。将导出的上述15批色谱图的CDF文件，分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”（2012年版），剪切掉前3min的溶剂峰，通过评价系统建立了15批样品叠加图、对照指纹图谱（如图1所示）。共确定10个共有峰，通过与混合对照品色谱图（如图2所示）比对，对10个共有峰进行了指认，依次：峰1为没食子酸、峰2为原儿茶酸、峰3为新绿原酸、峰4为绿原酸、峰5为隐绿原酸、峰6为芍药苷、峰7为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、峰8为3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、峰9为4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、峰10为丹皮酚，如图３所示。
3.5相似度评价：采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”（2012年版），计算15批金丹附延颗粒色谱图与对照指纹图谱相似度，相似度结果如表2所示，可以看出，其相似度在0.939-1.000之间，表明金丹附延颗粒批间均一性良好。
表2 15批金丹附延颗粒相似度计算结果
4、空白样品试验
取金丹附延颗粒的辅料，制成阴性空白溶液，采用“2”色谱条件，进样10μL，记录色谱图，如图4所示。结果显示阴性空白溶液在色谱图中未出现与供试品溶液相应的色谱峰，不会有干扰。
实施例2：金丹附延颗粒10种成分含量测定方法
1、溶液的制备：同实施例1。
2、色谱条件：同实施例1。
3、含量测定及方法学考察
3.1线性关系考察：取没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、芍药苷、丹皮酚对照品适量，精密称定，加75%甲醇溶解并制成每1mL各含没食子酸243.2μg、原儿茶酸118.10μg、新绿原酸236.9μg、绿原酸256.1μg、隐绿原酸248.6μg、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸262.9μg、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸232.3μg、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸245.1μg、芍药苷520.3μg、丹皮酚530.5μg的混合对照品贮备液。分别精密量取上述混合对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1、2、4mL至5mL量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列标准溶液1号～6号，另外对照品贮备液作为7号标准溶液。按“2”项下色谱条件测定，记录色谱图。以线性溶液系列浓度为横坐标（x），对应的峰面积为纵坐标（y）作线性回归方程，各成分线性方程及线性范围如表3所示，可以看出，r均大于0.999，各成分在各自范围内线性关系良好。
表3 10种成分的线性方程及线性范围
3.2精密度试验：精密吸取“1”项下混合对照品溶液10μL，按“2”项下色谱条件连续进样测定6次，得出没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芍药苷、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、丹皮酚对照品的峰面积RSD值分别为0.25%、0.51%、0.38%、0.18%、0.68%、0.88%、0.93%、0.40%、0.21%、0.08%。
3.3专属性实验：取处方各味饮片，按处方工艺及供试品前处理方法制成各自单味饮片供试品溶液。精密吸取“1”项下混合对照品溶液和单味饮片供试品溶液各10μＬ，按“2”项下色谱条件进样测定，通过对照品和单味饮片供试品色谱峰保留时间比对，检测10种成分分别来自处方中的具体药味，结果如表4所示。根据结果分析，其中多个成分在不止一个药味中存在，不含有10种成分中任何一种的药味为薏苡仁、莪术。因此，取薏苡仁、莪术，按工艺及供试品前处理方法制成阴性样品溶液。精密吸取混合对照品溶液、金丹附延颗粒供试品溶液、阴性样品溶液各10μＬ，测定，专属性试验色谱图如图5所示。结果显示，该方法阴性无干扰。
表4 10种成分归属处方中的药味列表
3.4稳定性试验：取金丹附延颗粒（S4），按“1”项下方法制备供试品溶液，按“2”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样测定，计算没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芍药苷、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、丹皮酚色谱峰峰面积RSD值，如表5所示，结果分别为1.78%、0.75%、1.17%、1.20%、2.44%、1.40%、1.71%、1.90%、1.64%、1.50%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
表5 稳定性试验峰面积考察结果
3.5重复性试验：取金丹附延颗粒（S4），按“1”项下方法制备６份供试品溶液，按“2”项下色谱条件进样测定，得出没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芍药苷、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、丹皮酚含量RSD值如表6所示，结果分别为1.62%、1.59%、1.85%、1.54%、1.85%、1.04%、1.68%、1.62%、1.34%、1.41%（n=6），表明供试品制备方法重复性良好。
表6重复性试验峰面积考察结果（n＝6）
3.6加样回收率试验：取含量已知的金丹附延颗粒（S4）2.5g，其中没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芍药苷、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、丹皮酚的含量分别为：0.5250、0.0399、0.4275、0.9498、0.3930、1.4000、0.1845、0.1302、0.2080、2.4926mg/g。按照样品中个组分量1∶1的比例精密加入各对照品溶液，平行６份，按“1”项下方法制备供试品溶液，按“2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算回收率，10种成分平均加样回收率分别为98.32％、97.34％、96.23％、102.3％、97.34％、101.23%、99.21%、98.43%、99.12%、98.34%，RSD分别为1.32%、1.45%、1.75%、2.13%、2.32%、1.09%、1.46%、2.01%、1.98%、1.73%（n=6），表明该方法回收率良好。
3.7样品含量测定：取15批金丹附延颗粒供试品溶液，按“2”项下色谱条件进样测定，计算样品中10种成分的含量，结果如表7所示。其中，没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芍药苷、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、丹皮酚的含量分别为0.5019～0.6224mg/g、0.0356～0.0522mg/g、0.3843～0.5128mg/g、0.8438～1.1436mg/g、0.3679～0.4751mg/g、1.2129～1.5883mg/g、0.1471～0.2063mg/g、0.0940～0.1317mg/g、0.1525～0.2307mg/g、2.3420～2.7955mg/g。
表7 15批金丹附延颗粒中10个成分的含量测定结果（mg/g，n=3）
实施例3：供试品溶液制备方法及色谱条件优化
1、提取溶剂的选择
取金丹附延颗粒S4（批号：221123）适量，研细，取三份，各约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、75%甲醇、乙醇50mL，称定重量，在功率500W，频率40kHz下超声处理30min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。在相同的方法下测定，通过比较确定最佳的提取溶剂。色谱图分别如图6、图3、图7所示，其中乙醇提取色谱峰少，且小，提取不完全，而采用75%甲醇提取较甲醇提取主要色谱峰高更高，提取效率高，且峰型较好。因此，选75%甲醇为制备金丹附延颗粒供试品的提取溶剂。
2、提取方式的选择
取金丹附延颗粒S4（批号：221123）适量，研细，取二份，各约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，称定重量，分别用超声处理（功率500W，频率40kHz）30min、回流提取30min，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。在相同的方法下测定，通过比较确定最佳的提取方式，色谱图分别如图3和图8所示。其中，采用超声提取色谱图中主要色谱峰高更高，且峰型较好。因此，选超声处理作为制备金丹附延颗粒供试品的提取方式。
3、提取时间的选择
取金丹附延颗粒S4（批号：221123）适量，研细，取三份，各约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，称定重量，分别用超声处理（功率500W，频率40kHz）10min、30min、60min，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。在相同的方法下测定，通过比较确定最佳的提取时间，色谱图分别如图9、图3和图10所示。其中，采用超声提取10min和30min色谱图无显著差异，且峰型良好，而超声处理60min后多个色谱峰峰面积变小，为了确保良好的提取效率，同时防止化学成分在提取过程中降解。因此，选超声处理30min作为制备金丹附延颗粒供试品的最优提取时间。
4、流动相的选择
取金丹附延颗粒S4（批号：221123）适量，按实施例1供试品溶液制备方法制备，以C18色谱柱对以下流动相进行了比较流动相①乙腈（A）-0.1%磷酸（B），②乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），③乙腈（A）-0.1%甲酸（B），以实施例1中梯度洗脱程序进行梯度洗脱，色谱图分别如图3、图11、图12所示，比较上述3个流动相虽然均实现了分离，但其中以流动相①分离效果最好，而以流动相②分离的，峰2、峰3分离效果不佳；以流动相③分离的，大部分峰的响应低于流动相①，且峰7和峰8不能完全分离。因此，选择流动相①为金丹附延颗粒供试品流动相。
5、检测波长的选择
取金丹附延颗粒S4（批号：221123）适量，按实施例1供试品溶液制备方法制备，注入液相色谱仪分析，并按实施例1色谱条件，其中检测波长以254nm、280nm、300nm、326nm进行比较，色谱图分别如图3、图13、图14、图15所示。其中，以254nm为检测波长，色谱信息更加丰富，基线较平稳，各峰的响应值较均衡，能相对全面反应样品中的组分信息，特别是响应较低的峰2峰、峰6峰面积较其它波长下更大。因此，选择254nm为金丹附延颗粒供试品检测波长。
6、色谱柱柱温的选择
取金丹附延颗粒S4（批号：221123）适量，按实施例1供试品溶液制备方法制备，注入液相色谱仪分析，其中柱温分别为25℃、30℃、35℃，其色谱图的分离分别如图16、图3、图17所示。其中柱温35℃时，色谱峰分离效果不佳，特别是峰4、峰5在35℃时将附近杂质峰包入其中，影响结果准确性；柱温25℃时，峰8可能包了杂峰进去。而柱温为30℃时，金丹附延颗粒HPLC色谱图分离效果最佳。因此，选择30℃作为金丹附延颗粒指纹图谱的柱温。
7、色谱柱的选择
取金丹附延颗粒S4（批号：221123）适量，按实施例1供试品溶液制备方法制备，注入液相色谱仪分析，分别以色谱柱①Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5μm）、②Agilent 5TC(2) C18（4.6mm×250mm，5μm）、③Phenomenex Luna C18（4.6mm×250mm，5μm）进行分析，色谱图分别如图3、图18、图19所示。可以看出，采用②Agilent 5TC(2) C18柱，峰4与峰5之间的杂峰消失，峰4明显峰前沿，表明峰4很有可能包了其它峰，对结果判断可能产生不利影响；采用③Phenomenex Luna C18柱，峰4不能与杂峰完全分离，对结果判断可能产生不利影响，考虑到不同色谱柱对保留时间的影响。因此，选择①Waters Symmetry C18色谱柱为金丹附延颗粒指纹图谱测定用色谱柱。
综上所述，本发明通过优化HPLC色谱条件，成功建立了金丹附延颗粒HPLC指纹图谱，共确定10个主要共有峰，对这10个共有峰均进行了归属，能同时测定10种有效成分；15批金丹附延颗粒图谱与对照指纹图谱相似度为0.939～1.000，表明各批次样品所含化学成分种类基本一致，样品间有较好的均一性；该检测方法准确、可靠、操作简单，可为该制剂质量控制提供依据。
最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种金丹附延颗粒指纹图谱建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取金丹附延颗粒适量，研细，取5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理10min-30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（2）对照品溶液的制备：取没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、芍药苷、丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸各40μg、含芍药苷100μg、含丹皮酚65μg的混合对照品溶液，即得；
（3）指纹图谱的建立：将供试品溶液和对照品溶液分别用HPLC进行测定，记录色谱图并进行比对，指认共有峰，建立金丹附延颗粒指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的金丹附延颗粒指纹图谱建立方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中，甲醇浓度均为75%。
3.根据权利要求1所述的金丹附延颗粒指纹图谱建立方法，其特征在于，步骤（1）中，所述超声处理的功率为500W，频率为40kHz。
4.根据权利要求1所述的金丹附延颗粒指纹图谱建立方法，其特征在于，步骤（3）中，HPLC的色谱条件为：
色谱柱为Waters Symmetry C18，250mm×4.6mm，５μｍ；
流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，进行梯度洗脱；
检测波长为250nm-280nm；
流速为1mL/min；
柱温为25℃-35℃；
进样量为10μＬ；
理论板数按绿原酸峰计算应不低于10000。
5.根据权利要求4所述的金丹附延颗粒指纹图谱建立方法，其特征在于，HPLC的色谱条件为：
色谱柱为Waters Symmetry C18，250mm×4.6mm，５μｍ；
流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，进行梯度洗脱；
检测波长为254nm；
流速为1mL/min；
柱温为30℃；
进样量为10μＬ；
理论板数按绿原酸峰计算应不低于10000。
6.根据权利要求4或5所述的金丹附延颗粒指纹图谱建立方法，其特征在于，梯度洗脱的程序为0～5min，7％乙腈；5～15min，7％～10％乙腈；15～50min，10％～30％乙腈；50～60min，30％～60％乙腈；60～65min，60％～70％乙腈；65～66min，70％～90％乙腈；66～70min，90％乙腈。
7.根据权利要求1所述的金丹附延颗粒指纹图谱建立方法，其特征在于，步骤（3）中，将供试品溶液色谱图分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件与对照品溶液色谱图进行相似度评价，当相似度＞0.9时，表明金丹附延颗粒批间均一性良好。
8.根据权利要求1所述的金丹附延颗粒指纹图谱建立方法，其特征在于，步骤（3）中，所述共有峰为10个，其中，峰1为没食子酸，保留时间为4.947min、峰2为原儿茶酸，保留时间为10.150min、峰3为新绿原酸，保留时间为12.223min、峰4为绿原酸，保留时间为19.470min、峰5为隐绿原酸，保留时间为21.800min、峰6为芍药苷，保留时间为29.053min、峰7为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸，保留时间为38.923min、峰8为3,5-O-二咖啡酰奎宁酸，保留时间为39.807min、峰9为4,5-O-二咖啡酰奎宁酸，保留时间为42.300min、峰10为丹皮酚，保留时间为58.317min。
9.一种金丹附延颗粒成分含量测定方法，其特征在于，取金丹附延颗粒样品，按权利要求1-8任一项所述的金丹附延颗粒指纹图谱建立方法，计算样品中成分含量。
10.根据权利要求9所述的金丹附延颗粒成分含量测定方法，其特征在于，金丹附延颗粒由牡丹皮、金银花、败酱草、大血藤、赤芍、莪术、延胡索、薏苡仁、没药、桃仁、桂枝、香附、当归十三味药制成的颗粒制剂。
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